JPH04212059A - クロマトグラフのスペクトル・データ処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は一つまたはそれ以上の化
学化合物を含む混合物の分析に関するものである。詳細
には、本発明はこのような混合物の特性化するためのク
ロマトグラフ装置および分光光度計によって提供される
データの分析に関するものである。さらに詳細には本発
明はスペクトルおよびクロマトグラフのデータに基づい
て個別の化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄ）（ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を識別
する（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ）ための方法および装置
に関するものである。 【０００２】 【従来技術とその問題点】幾つかの化合物から成る混合
物が現代社会において非常な重要性を持つようになった
ことはほとんど疑問の余地がない。このような混合物の
性質と効力は農業、製造業、科学研究および医学などの
分野においていつも関心をもたれている。実際、人体は
化学的混合物が存在しなければほとんど機能することが
できない。したがって、例えば人体あるいは他の化学反
応系において見出される化学的混合物中の成分の同定お
よび濃度を測定することが医学その他の技術の目的であ
ることが多い。この種の分析には数多くのアプリケーシ
ョンがあり多様な製品の品質管理計画や医学的診断技術
の主要な基準を提供する。 【０００３】恐らく少なくとも一つの化合物の混合物を
分析するための最も一般的な方法は、各化合物を単離し
て特性化することを必要とする。クロマトグラフィーは
このような単離を行うための一つの手段を提供する。実
質的にすべてのクロマトグラフによる分離においては、
複数の化合物から成る混合物を含む移動相が固定相（ｓ
ｔａｔｉｏｎａｒｙ　　ｂｕｌｋ　　ｓｔａｔｉｏｎａ
ｒｙ）を通過する。ガスおよび液体クロマトグラフィー
は移動相として夫々ガス、液体が使用される技術の例で
ある。ガスおよび液体クロマトグラフィーの両方につい
ての幾つかの変形が当核技術分野で知られている。所与
の変形からの選択は行われる特定の分離と密接な関係が
あ。例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は
液体移動相が高い圧力の影響下で固定相を通過する技術
であるが、比較的高分子量で分離が困難な化合物の分離
および分析に用途がある。 【０００４】ＨＰＬＣまたはその他の種類のクロマトグ
ラフィーによって分離された化合物は通常は次に１つま
たはそれ以上の化合物に応答する検出器を通過する。フ
レームイオン化、熱伝導、紫外（ＵＶ）／可視装置は通
常使用される検出器の一例である。当業者にとっては明
らかなように、紫外線検出器は所与の化学種が約２００
〜約４００ｎｍの波長を有する電磁波を吸収する度合を
測定するものである。また、化合物に対する検出器の正
の応答は、通常はピークと呼ばれることも当業者にとっ
て周知である。混合物の単離された各成分に対する検出
器の応答は、通常、紙や磁気媒体等上に記録される。ピ
ークの連続的な集り（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　　ａｓｓ
ｅｍｂｌａｇｅ）を記録したものはこの技術分野ではク
ロマトグラムとして知られている。 【０００５】複数の化合物から成る混合物は通常はその
混合物の特徴を表わすクロマトグラムを生成する。しか
しながら、所与の混合物によって生成された特定のクロ
マトグラムは前記クロマトグラムが発生した条件に大き
く依存する。当業者には明らかなように、クロマトグラ
ムに影響を及ぼす原因は溶離剤として使用される溶媒、
クロマトグラフ・システムに用いられる圧力、使用され
る固定相の種類そしてクロマトグラフ装置そのものの種
類等が含まれている。 【０００６】クロマトグラムは混合物の特徴の度合いで
あるため、クロマトグラムはこのような混合物を他の混
合物と識別するために比較されることが多い。例えば、
クロマトグラムから誘導された保持時間はこのような識
別のための１つ基準（ｂａｓｉｓ）を提供する。保持時
間はクロマトグラフ分析の対象となる混合物の個別の化
学成分を分離および検出するために必要な時間的間隔を
示し、そしてこれらは分析の開始から測定される。個別
のピークの高さと面積は二つの化学混合物を比較するた
めのもう一つの基準を提供する。このようなデータに基
づく比較分析は分析された混合物が多くの個別化合物を
含む場合にはより複雑になることが理解できるし、対象
となるクロマトグラムを生成する条件が変動するとさら
に複雑になる。したがって、このような分析は他の独立
した分析方法と組合せる場合にのみ不明確でないと考慮
されていることが多い。 【０００７】したがって、クロマトグラフのデータ分析
はしばしば他の技術と組合されるか、または他の技術に
取って代られる。そのような技術の一つは赤外線、ＵＶ
、可視光線あるいは他の形態の電磁放射の１つまたはそ
れ以上の周波数に露出させ、分離した化合物の応答を測
定することを含む。例えば、紫外線スペクトルのデータ
はＨＰＬＣシステムにおいて分離された化合物に関する
構造的な情報を提供することができる。しかしながら、
残念ながら紫外線スペクトル・データの解析は例えば赤
外線スペクトル・データの解析よりも困難である。 このような難点はスペクトル・データの解析は従来より
混合物の溶離中に選択されたスペクトルの目視による判
定（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）と比較に基づいてきたとい
う事実によって妥協（ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ）されてい
た。ＵＶスペクトルのこのような比較技術は、従来より
スペクトル・プロフィルのいくつかの点だけを用いて同
定を確認していた。 【０００８】しかしながら、かなり最近の全域スペクト
ル（ｆｕｌｌ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）・フォトダイオード
・アレイＵＶ検出器の導入は今までのＵＶスペクトル分
析を大きく変化させた。ダイオード・アレイ分光光度計
はオンライン・スペクトルを生成し、紫外領域および／
または可視領域にわたってデジタル形式でスペクトルを
迅速に収集することができる。これらの装置は、ＨＰＬ
Ｃシステムに接続される際、ガスクロマトグラフィーま
たは他の種類の分離には適さない錯体混合物の分析等に
対して強力なツールを提供する。例えば、液体クロマト
グラフィーの移動相の組成を同じ化学的混合物に対して
変化させ、クロマトグラフ装置から溶出される化合物成
分の順序を変化させる（実際にしばしば変化する）こと
が可能であることは当業者にとって周知である。これら
の化合物に関するピークが記録される順序もそれに対応
して変化する。対象となるピークを同定するためには、
溶媒によってその溶離が変化することをピークのトラッ
キングが重要である。原理的には、ダイオード・アレイ
検出器の使用はこのことを容易にすることができる。 【０００９】しかしながら、ダイオード・アレイＵＶ検
出は制限がないわけではない。例えば、ピークはオーバ
ーラップすることがしばしばあり、各ＵＶスペクトルは
時々唯一の同定を与えるほど十分な差がなくなることが
ある。加えて、ダイオード・アレイ検出器は、通常、単
一のクロマトグラフ分析から大量の情報を生成するので
、手動で、相互作用のあるデータの削減方法はかなり時
間を費すことがわかり、不完全で不正確である。その結
果、ダイオード・アレイ装置の開発は、ＵＶスペクトル
・データを解析するための数学的な技術の開発を促進し
た。このような数学的方法はピークの分離（ｄｅｃｏｎ
ｖｏｌｕｔｉｏｎ）によって、そしてパターン認識技術
によってダイオード・アレイのデータの使用を拡げるた
めに用いることができる。 【００１０】したがって、化学化合物および混合物の分
析におけるダイオード・アレイＵＶ検出器の実現化に当
該技術分野で大きな関心が向けられてきた。このような
技術のほとんど全部の目的は、既知化合物の同様なデー
タをもつ大きなライブラリとそのスペクトルデータを比
較することによって未知化合物を同定することであった
。このフォーマットに従う同定方法は順方向検索（ｆｏ
ｒｗａｒｄｓｅａｒｃｈｅｓ）として知られている。 【００１１】しかしながら、未知のサンプル中に存在す
ると予測されているかあるいは異なる化合物か混合物を
識別することが期待される予め決められた数の既知成分
を確認するためにスペクトルデータの逆方向検索（ｒｅ
ｖｅｒｓｅ　　ｓｅａｒｃｈｅｓ）を行うことも有益で
ある。逆方向検索スペクトル分析は、特定の成分が所与
のサンプル中に存在することが必要であり、しかも他の
付加的成分の存在は望ましくなく、極めて重大となる製
造された化学薬品の品質管理などの領域で利用すること
ができる。 【００１２】 【発明の目的】本発明の目的は化合物よりなる二つの複
数の化学化合物から成る混合物を識別するための方法を
提供することにある。 【００１３】本発明の他の目的はクロマトグラフのデー
タに基づいて化合物よりなる二つの混合物を識別するた
めの方法を提供することにある。 【００１４】本発明のさらに他の目的はスペクトル・デ
ータに基づいて化合物よりなる二つの混合物を識別する
ための方法を提供することにある。 【００１５】本発明の他の目的はこれら混合物に含まれ
る各化合物成分を単離および比較することによって前記
の二つの混合物を識別するための方法を提供することに
ある。 【００１６】本発明のまた別の目的はクロマトグラフお
よびＵＶスペクトルのデータに基づいて二つの化合物を
識別するための方法を提供するにある。 【００１７】 【発明の概要】本発明は、混合物から単離された化合物
に関するクロマトグラフおよび分光光度計のデータを分
析することによって、複数の化学化合物を含むなる第１
の混合物を複数の化学化合物を含む第２の混合物から識
別するための方法および装置に関する。本発明では、化
合物と相関関係を有するスペクトルのマッチング係数（
ｍａｔｃｈ　　ｆａｃｔｏｒ）とピーク・スコア（ｐｅ
ａｋ　　ｓｃｏｒｅ）を提供する。これらのマッチング
係数とピーク・スコアは、混合物間の類似性を示すサン
プル・スコアを計算するために用いられる。 【００１８】本願発明の好適な一実施例では、クロマト
グラフィーを用いて第１および第２の混合物の化合物を
単離し、単離した各化合物成分を１またはそれ以上選択
された波長の紫外放射に一回またはそれ以上露出させ、
各紫外線照射時に、単離された各化学化合物の吸光度を
記録する。そして、単離された化学化合物のそれぞれの
吸光度は最初のデータセットとして処理手段に供給され
る。処理手段によって実施されるその後のステップは、
第１のデータセットに一般マッチング関数を適用するこ
とによって少なくとも一つの一般マッチング係数を提供
し、第１のデータセットに平均化関数を適用することに
よって各選択波長における単離された各化合物に対して
平均吸光度を提供し、第１のデータセットおよび平均吸
光度にオートマッチング関数を適用することによってオ
ートマッチング係数を提供し、第１のデータセットおよ
び平均吸光度にクロスマッチング関数を適用することに
よってクロスマッチング係数を提供し、一般マッチング
係数にマッチング識別因子を適用することによってマッ
チング識別因子を提供することを含む。そして、単離さ
れた化合物についての保持時間、ピーク面積およびピー
クの高さを含む第２のデータ・セットを処理手段へ供給
する。処理手段によって実施される後続のステップは、
第２のデータ・セットに保持時間偏差関数を適用するこ
とによって保持時間偏差を提供し、第２のデータ・セッ
トにピーク面積偏差関数を適用することによってピーク
面積偏差を提供し、第２のデータ・セットにピーク高さ
偏差関数を適用することによってピーク高さ偏差を提供
し、ピーク面積偏差およびピーク高さ偏差に面積および
高さの偏差機能を適用することによって面積および高さ
の偏差を提供し、階層指定手順（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃ
ａｌ　　ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ　　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
）を適用することによってピークを指定し、マッチング
偏差、保持時間偏差および面積と高さの偏差にピーク・
スコア関数を適用することによって単離された化合物に
ついての少なくとも一つのピーク・スコアを提供し、処
理手段によりピーク・スコアにサンプル・スコア関数を
適用することによって少なくとも一つのサンプル・スコ
アを提供し、および少なくとも一つのサンプル・スコア
に基づいて、第２の化合物混合物から第１の化合物混合
物を識別することを含んでいる。 【００１９】 【発明の実施例】本発明は、個別の化合物および単離可
能な混合物に関する数多くの状況に応用することができ
る。例えば、本発明は比較する両方の化学種が未知であ
る場合、好ましくは一つの化学種がよく知られており他
の化学種が未知である場合において実施される。一つの
化学種についての収集された補正データのライブラリが
利用可能であることは特に好ましい。比較される化学種
の両方に関するクロマトグラフのデータが利用できるこ
とも好ましい。クロマトグラフのデータは保持時間、ピ
ーク面積およびピークの高さが含まれる。 【００２０】本発明によれば、複数の化合物を含む混合
物は最初にそれぞれの成分に分離される。このような分
離を行うための好ましい手段はクロマトグラフ使用によ
るものである。液体クロマトグラフが好適であるが、ど
のような型式のクロマトグラフも本発明の実施に利用す
ることが可能である。本発明に従って分析される混合物
の複数の化合物を分離するために高性能液体クロマトグ
ラフ（ＨＰＬＣ）を使用することが特に好ましい。 【００２１】分離された化合物は１つまたはそれ以上の
選択された波長の紫外線放射に少なくとも一回は露出（
ｅｘｐｏｓｅ）され、各露出時の分離された化合物の夫
々の吸光度を記録する。このような露光（ｅｘｐｏｓｕ
ｒｅ）により得たデータの信頼性はこのような露光が行
われる回数と使用する波長の数値と共に向上する。 【００２２】記録されると、このデータは処理手段へ与
えられる。本発明の実施に適した処理手段は、例えばヒ
ューレット・パッカード・カンパニー製のＨＰ９０００
Ｓｅｒｉｅｓ３００Ｐａｓｃａｌ　　Ｗｏｒｋｓｔａｔ
ｉｏｎ（Ｃｈｅｍ　　Ｓｔａｔｉｏｎ）または命令をコ
ンパイルし実行する能力を有する任意の等価なコンピュ
ータなどの計算装置より構成されている。こらの命令は
パスカルまたは本発明に用いられるアルゴリズムを実行
する能力を有する任意の等価な言語などのプログラム言
語で与えられなければならない。処理手段は、さらに、
キーボードなどの入力デバイスとビデオ・ディスプレイ
またはプリンタなどの出力デバイスを含む。好適な処理
手段は、また磁気ディスクまたはテープなどの１つまた
はそれ以上のデータ記憶デバイスを含む。処理手段はま
たＯＳ（オペレーティング・システム）または適切なプ
ログラム言語のソースコードを発生させるためのプログ
ラミング環境と、コンパイラまたはこのようなソースコ
ードを実行可能なプログラムに変換する他の手段と共に
含む。 【００２３】データは記録された通りに正確に処理手段
に供給されるか、当業者にとって周知の様々な手段によ
って準備されるか前処理される。このような準備または
前処理の例は、波長キャリブレーション（ｃａｌｉｂｒ
ａｔｉｏｎ）平滑化（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）及び高速フ
ーリエ変換等のデータの変換などがある。 【００２４】本発明では、処理手段によって実行される
アルゴリズムが開示されている。好適な一実施例では、
このようなアルゴリズムは十分に特徴づけられたキャリ
ブレーション標準（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　　ｃ
ａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　　ｓｔａｎｄａｒｄｓ）から入
手可能なスペクトルおよびクロマトグラフ・データに基
づいてＨＰＬＣ分離において成分を同定するときに経験
する問題に関するものである。これはスペクトルのマッ
チング係数（ｓｐｅｃｔｒａｌ　　ｍａｔｃｈｉｎｇｆ
ａｃｔｏｒｓ）の測定に関する。例えば、スペクトルの
マッチング係数は以下のように定義される。 （１）ＭＦＳ　＝１０００（１−ｒ２　）ここでは、Ｍ
ＦＳ　はスペクトルのマッチング係数を表わし、ｒは式
（２）で示される相関係数である。 【式１】 ここでは、ｘおよびｙはそれぞれ同一波長における比較
スペクトルから得られた吸光度であり、Σは総和関数で
あり、ｎｆは選択された波長の数である。他のスペクト
ル・マッチング関数、例えば下に示す関数も本発明に使
用することができることは当業者にとって明らかである
。 （３）ＭＦＳ　＝１０００・ｒ２　 【００２５】スペクトル・マッチング係数は完全なマッ
チング（突合わせ）（ｍａｔｃｈｉｎｇ）の場合の０か
ら相関が欠損している場合の１０００までの範囲にある
。一般のマッチング係数、オートマッチング（ａｕｔｏ
ｍａｔｃｈ）係数およびクロスマッチング（ｃｒｏｓｓ
ｍａｔｃｈ）係数は、スペクトル・マッチング係数の一
例である。例えば、一般のマッチング係数（ＭＦｇ　）
の決定において、ｒは第１および第２の化学化合物に関
する個別のスペクトルの吸光度間の相間より求められた
相関係数である。 【００２６】当業者では明らかなように、前述の一般的
マッチング係数に関する一つの問題は、正のマッチング
（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　　ｍａｔｃｈ）と負の（ｎｅｇａ
ｔｉｖｅ）マッチングを区別するための有意の制限値が
ないことである。 【００２７】第１および第２の化合物についてスペクト
ルの複数のコピーを得た後、ある特定の選択されたマッ
チングのスペクトル・マッチング係数を比較する。例え
ば第１の化合物の個別スペクトルのすべてのマッチング
に対するマッチング係数をその化合物の平均スペクトル
と比較する。加えて、第２の化合物の個別スペクトル全
てのマッチングに対するマッチング係数をこの化合物に
対応する平均スペクトルと比較する。このような個別ス
ペクトルと平均スペクトルの比較は、本願発明において
はオートマッチング関数として知られており、このよう
にして得られたマッチング係数をオートマッチング係数
（Ｍａ）としている。 【００２８】本発明の一実施例によれば、次にクロスマ
ッチング係数は、（１）第２の化合物の平均スペクトル
に対して第１の化合物の個別スペクトル全てをマッチン
グさせ、（２）第１の化合物の平均スペクトルに対して
第２の化合物の個別スペクトル全てをマッチングさせる
ことによって得られる。一つの化合物の個別スペクトル
を他の化合物の平均スペクトルと比較することによって
得られるマッチング係数をクロスマッチング係数（Ｍｘ
　）としている。 【００２９】オートマッチングおよびクロスマッチング
からの結果を分析するに際、既知のｔテスト（ｓｔｕｄ
ｅｎｔ’ｓ　　ｔ−ｔｅｓｔ）が利用することができる
。 本発明で用いるｔテストは、オートマッチング係数の平
均値とクロスマッチング係数の平均値間の差（Ｄ）値か
ら求める。ｔテストは、このＤ値は重要で、すなわち２
つの平均値が異なるという確率を与える。これらの平均
値が異なる場合には、第１の化合物および第２の化合物
は異なる化学種を表すものであると確信することができ
る。 【００３０】一実施例では、マッチング識別関数（ｍａ
ｔｃｈ　　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　　ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ）は次のように定義される。 （４）ＭＴｄｉｓ　＝Ｄ／Ｔ（ＤＦ，ｐｒｏｂ）ここに
おいて、ＭＴｄｉｓ　はマッチング識別因子（ｄｉｓｃ
ｒｉｍｉｎａｔｏｒ）、Ｄはオートマッチング関数とク
ロスマッチング関数から導き出された平均マッチング係
数の差、ＤＦは第１および第２の化合物の個別スペクト
ルの数から計算される自由度であり、Ｔ（ＤＦ，ｐｒｏ
ｂ）は応用の自由度が与えられたときにｔ値が異なるこ
とより２つの平均値に差が生じる確率（ｐｒｏｂ，％）
の所望の度合に要求されるｔ値である。前記の確率は９
９％であることが好ましい。当業者には理解されるよう
に、ＭＴｄｉｓ　は幾つかの要因、例えば使用するスペ
クトルのデータ・ポイントの数、個別スペクトルに存在
するノイズ、マッチングの前にスペクトルに加えられる
前処理、および、もちろん二つの比較される化合物間の
類似度に依存する。もちろん、ＭＴｄｉｓ　が１に等し
い場合、第１の化合物と第２の化合物が異なる実際の確
率は所望の確率に等しい。ＭＴｄｉｓ　が１よりも小さ
い場合には、実際の確率は望ましい確率よりも小さく、
ＭＴｄｉｓ　が１よりも大きい場合には、実際の確率は
望ましい確率よりも大きい。 【００３１】本発明によれば、所与の標準においては固
定のＭＴｄｉｓ　を導出するように意図される。このよ
うな誘導により、完全な統計的分析を必要とすることな
く標準スペクトルと未知スペクトルにおける個別のマッ
チングの有意であるテストをすることができる。 【００３２】所与のスペクトルマッチング係数が０に等
しくない場合には、二つのスペクトル間の相関によって
生じる残差（ｒｅｓｉｄｕａｌ　　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ
）の分析によってそのマッチング係数の特性を示す他の
値を得ることができる。記録された各波長についてのス
ペクトルＸの相関値からスペクトルＹについての吸光度
の値を推定するように「ベストフィット回帰ライン」（
ｂｅｓｔ−ｆｉｔ　　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　　ｌｉｎ
ｅ）がスペクトルＸとＹの相関について計算されるなら
ば、各波長の残差がスペクトルＹの実際の吸光度とスペ
クトルＸとの相関から推定されるスペクトルＹの実際の
吸光度と見本Ｙの値との差によってが正または負差であ
ることは当業者では十分に理解されることである。増加
する波長の関数として研究するときには、残差は０の上
下に（正または負に）変動する。 【００３３】二つのスペクトルが体系的に異なるならば
、残差は回帰ラインをゆっくりと横切るように移動する
傾向がある。他方、残差が回帰ラインの付近でランダム
に分布しているならば、まだマッチング係数で、ノイズ
のみによって不明りょうなスペクトル・マッチングを示
すこととなる可能性がある。したがって、本発明の一実
施例によれば、交差数（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ　　ｎｕｍ
ｂｅｒ，ＣＮ）は次のように定義される。 （５）ＣＮ＝Ｃ／（Ｎ−１） ここにおいて、Ｃは増加する波長によってソートされる
際、残差の符号が変わる回数、Ｎはマッチングに用いら
れるスペクトル・データ・ポイントの数である。ＣＮの
最大値は１であって、ＣＮは決して０に極めて接近する
ことはあり得ない。ＣＮがより高い値であると、所与の
スペクトルマッチング係数における０からの偏差は、ラ
ンダムなノイズ起因するもので、比較するスペクトルの
体導的な差に起因するものではないことを意味する。ス
ペクトルＸとＹを交換して前記の交差数を誘導すること
も可能である。このように、決して同じ特徴を示すこと
がない僅かに異なる値を得る。 【００３４】相関手順は、同一波長における吸光度の数
値を利用するので、波長において誤差を有するスペクト
ルの比較は誤まったマッチング係数を導き出す結果とな
る可能性がある。だから、比較する二つのスペクトルに
ついての波長の指定（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）が正確で
あることは、スペクトル・マッチング係数を決定すると
きに特に好ましい。正確な波長指定を提供するための一
つの手段は、問題となる二つのスペクトルを得るために
用いる条件と同一の、移動相、カラム、ハードウェア・
キャリブレーションおよび測定器などの条件のもとで同
じ標準に基づいてスペクトルを得る。このようなスペク
トルのとりかたは内標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ）を使用す
ることにより達成することが可能である。 【００３５】このようにして得られた標準スペクトルは
次に他の関連スペクトルのキャリブレーションを行うた
めに用いられる。他のスペクトルに対応してスペクトル
の左または右にシフトする波長変動の関数として二つの
標準スペクトルにおけるスペクトル・マッチング係数を
分析することによって、波長指定の差を実験的に決定す
ることができる。図１ａ、図１ｂ、図１ｃに示されるよ
うに、最大のマッチング係数は、二つの未知スペクトル
間の波長の不正確さを補正するために必要な波長シフト
において得られるべきである。各ＵＶ吸光度を、その表
示、絶対値として利用することができると同時に本発明
の一実施例では、測定した際の波長と関連して知られて
いる分散によって各吸光度の値を逆に重みづけ（ｗｅｉ
ｇｈｔｉｎｇ）して相関を任意に実施することができる
。このような手順によって信頼できないとして知られる
スペクトル領域をより少ない重みづけでマッチング・プ
ロセスの再現性を改善することができる。 【００３６】一般マッチング係数、オートマッチング係
数およびクロスマッチング係数を個別に、あるいは互い
に関連させて利用することにより化合物を特定の目的の
ために識別することができる。例えば、一般マッチング
係数だけで二つの化合物間の類似の度合を示すには十分
であることもある。他の場合には、一般マッチング係数
だけでは決定的ではなく、化合物を効果的に識別するた
めにはオートマッチング係数かクロスマッチング係数、
あるいはその両方を考慮することが必要なこともある。 【００３７】本発明の実施例においては、本発明は未知
サンプルにおいて所与の標準に対してピーク毎に基づい
て（ｐｅａｋ−ｂｙ−ｐｅａｋ　　ｂａｓｉｓ）最良の
マッチングを決定するためにＵＶスペクトル・データと
ともにクロマトグラフによるデータを分析する方法をも
提供する。この点に関して、パラメータ、すなわち保持
時間偏差（ＲＴｄｅｖ　）、ピーク面積偏差（ＡＲｄｅ
ｖ　）、ピーク高さ偏差（ＨＴｄｅｖ　）および面積と
高さの偏差（ＡＨｄｅｖ　）は以下の関数によって定義
される。 （６）ＲＴｄｅｖ　＝｜ＲＴ１　−ＲＴ２　｜／ＲＴｌ
ｉｍ　（７）ＡＲｄｅｖ　＝｜ＡＲ１　−ＡＲ２　｜／
ＡＲｌｉｍ　（８）ＨＴｄｅｖ　＝｜ＨＴ１　−ＨＴ２
　｜／ＨＴｌｉｍ　（９）ＡＨｄｅｖ　＝（ＡＲｄｅｖ
　＋ＨＴｄｅｖ　）／２ここにおいて、サブスクリプト
１および２はそれぞれ期待データと実際のデータまたは
任意の二つの化合物に対応するデータを示しており、ｌ
ｉｍは示された量に対する実験的に、そうでなければ定
義された制限された変動性を示す。 【００３８】したがって、ピーク指定アルゴリズムは、
組にされてさらに分析される化合物に対応するピークを
選択するために様々のパラメータを使用する階層方法（
ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）を用いる。本発明の一実施
例においては、マッチング識別因子を増加させることに
よって随意の保持時間のウインドウ内の各標準に対する
すべての未知ピーク候補が評価される。もし最小のマッ
チング識別因子を有するピーク候補と次に大きいマッチ
ング識別因子を有するピーク候補が１以上異なるならば
、最小のマッチング識別因子を有するピーク候補は正の
同定と考えられる。この差が１以下の場合には、もし次
に大きい保持時間偏差が１以上異なるならば、次に、保
持時間偏差が考慮され、最小の保持時間偏差を有するピ
ークが正のマッチングであると考えられる。もし保持時
間偏差の分析より統計的に有意な結果を得られない場合
、面積および高さの偏差について同様にして分析する。 もしこの点で正の同定に到達しなかったならば、ＣＮは
最大のＣＮを有する候補がマッチングとして選択される
。 【００３９】標準スペクトルと未知スペクトルとの間の
ピーク指定は方向が正確でなければならない。すなわち
各標準スペクトルは一つの未知スペクトルによってのみ
マッチングすることができ、その逆も同様成立しなけれ
ばならない。したがって、二つの異なる標準ピークが同
じ未知ピークによってマッチングされる場合には、最良
のマッチングされる未知候補を決定するために用いられ
る同じ規準に基づいて標準ピークの優先順位を本発明に
従って確立しなければならない。 【００４０】好結果のピーク指定の後、標準と未知サン
プルのピークにおいてある画定した、正確な関係が成立
する。これは、標準サンプルの各ピークを未知サンプル
に対して指定するピークが多くても一つあるか、大抵は
一つもないという明確な相互関係である。その結果、ピ
ーク指定については二つの可能性があり、それは（１）
標準サンプルにおけるすべてのピークがそれらに指定さ
れる未知サンプルの一つのピークを有し、そして未知サ
ンプルはどの標準にも対応しない特別のピークを全く有
しないかまた他の別のピークのみを有すること、あるい
は（２）標準サンプルにおけるピークのすべてが未知ピ
ークに指定されるわけではなく、未知サンプルはどの標
準サンプルにも対応しない特別のピークを全く有しない
かまたは他の別のピークのみを有することである。 【００４１】本願発明の一実施例では、次に良好に指定
されたピーク全ての組について、ピーク・スコア（ｐｅ
ａｋ　　ｓｃｏｒｅ）を以下に従って計算する。 （１０）ＰＳ＝〔（ｆｍ　・ＭＴｄｉｓ　）＋（ｆｒ　
・ＲＴｄｅｖ　）＋（ｆａ　・ＡＨｄｅｖ　）〕／ＮＦ
ここでは、ｆｍ　、ｆｒ　、ｆａ　はマッチング識別因
子、保持時間偏差、面積と高さの偏差のための可変重み
づけ係数（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ　　ｆａｃｔｏｒｓ）で
、ＮＦは経験的に導き出された正規化係数で、使用する
パラメータの数に等しく典型的には３である。 【００４２】所与のピーク・マッチングにおける信頼を
さらに示すものとして、候補ピークと次に良好なマッチ
ングとのピーク・スコアの差を利用することができる。 不明確なマッチングを解明するために、あるいは比較す
る幾かのまたはすべての値を含めないために保持時間偏
差、面積と高さの偏差、および交差係数を用いる順序を
逆にすることもできる。例えば、サンプル毎に応答が変
化する可能性があることが知られているならば、応答マ
ッチングを利用しないことは最もである。一方、同じサ
ンプルを異なるクロマトグラフ条件で用いて分析するな
らば、保持時間偏差は無意味となり、面積と高さの偏差
がピークのトラッキング（追跡）に利用することが可能
になる。このような考え方はそれぞれの特定の分析およ
びそれに関する事実に密接に依存していることが理解さ
れる。 【００４３】本発明の一実施例においては、アルゴリズ
ムを修正することによって未知サンプルのクロマトグラ
フのピークが実際には一つ以上の成分を含んでいる可能
性が説明される。このような実施例において、各候補ピ
ークは多成分分析法を用いてあらかじめ選択された保持
時間ウインドウ内に生じる標準ピークすべての存在を確
認する。一つを除いてすべての標準ピークは測定された
濃度における未知スペクトルから差し引かれ、その結果
得た補正スペクトルを前述のように残った標準ピークに
対してマッチングを行なう。 【００４４】一旦、ピーク・スコアが定義されると、サ
ンプル・スコア（ｓａｍｐｌｅ　　ｓｃｏｒｅ，ＳＳ）
は次のように画定される。 （１１）ＳＳ＝〔ΣＰＳ＋（Ｐ１　・ＥＰ）＋（Ｐ２　
・ＭＰ）〕／Ｎ ここにおいて、個別のピーク・スコアは未知と良好にマ
ッチングするすべての標準ピークを加算し、ＥＰは標準
中に存在しない別のピークであって係数Ｐ１によって重
みづけされたものであり、不明ピーク（ｍｉｓｓｉｎｇ
　　ｐｅａｋ，ＭＰ）はペナルティ・スコアＰ２　によ
って重味づけされており、そしてＮは予想される標準ピ
ークの合計数である。サンプル・スコアに対する合理的
な信頼性の制限に到達するために十分に特性化された基
準物質のサンプル・スコアを分析することができる。未
知サンプルのスコアを次に比較し、標準との類似性をサ
ンプル・スコアの差によって示すことができる。 【００４５】本発明のＨＰＬＣによって生成されるクロ
マトグラムに適用して説明しているが、ここに記載する
理論および方法は他の公知の方法、例えばガスクロマト
グラフィーやＨＰＬＣ以外の液体技術、例えばキャピラ
リ・ゾーン電気泳動法などによって生成されたクロマト
グラムにも同等に適用することができる。 【００４６】また、本発明を実施に伴うスペクトル・デ
ータは、ＵＶ、可視光線、蛍光、赤外線、ラマン、原子
吸光、核磁気共鳴およびマススペクトル等の様々なデバ
イスから誘導されるものを意図している。任意のこのよ
うな分光デバイスには、再現性のある波長を有する電磁
放射を提供することが好ましい。紫外放射線の一般的に
高い再現性と、一つのＵＶ波長における吸収が隣接する
波長における吸収と関連するという一貫した特徴を有す
ることにより、ＵＶデバイスを使用することは特に好ま
しい。これは、例えば核磁気共鳴スペクトロスコーピー
において経験されるディスクリートな帯域を持つスペク
トルと対照的である。 【００４７】本発明のその他の目的、利点および新規な
特徴は、組換え体ＤＮＡ誘導ヒト成長ホルモン（ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ−ＤＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ　　ｈｕｍ
ａｎｇｒｏｗｔｈ　　ｈｏｒｍｏｎｅ，ｒ−ｈＧＨ）の
トリプシンによる消化からのペプチド・フラグメントの
同定に関する具体的な例を以下に詳述することにより、
当業者には明確になるであろう。１９９０年のＪｏｕｒ
ｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙの４
９９号　　第２２１頁に記載されている論文を参照され
たい（「ＡｕｔｏｍａｔｅｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎ　　
ｏｆ　　Ｔｒｙｐｔｉｃ　　Ｄｉｇｅｓｔ　　Ｆｒｏｍ
　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｇｒｏ
ｗｔｈ　　Ｈｏｒｍｏｎｅ　　ＵｓｉｎｇＵｌｔｒａｖ
ｉｏｌｅｔ　　ＳｐｅｃｔｒａＮｕｍｅｒｉｃ　　Ｐｅ
ａｋ　　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）。 【００４８】ｒ−ｈＧＨのトリプシンによる消化物の調
製 【００４９】１．０ｍｇのｒ−ｈＧＨに５０μｌの冷却
した過ギ酸（９割（ｐａｒｔｓ）の８８％ギ酸と１割の
３０％過酸化水素）を添加し、この混合物を０℃で１時
間反応させることによってｒ−ｈＧＨのサンプルを酸化
させた。 【００５０】サンプルは１００ｍＭの酢酸ナトリウム、
１０ｍＭのトリス塩基および１ｍＭの塩化カルシウムを
含む緩衝溶液中で１対１００のトリプシン（トリプシン
対ｒ−ｈＧＨの重量化）を添加してｐＨ８．３で３７℃
において０から２時間の時間で消化させた。サンプル１
ｍｌ当り１００μｌのリン酸を添加し（ｐＨ３以下）全
て合わせて４時間後には酸性化させて、直ちに分析また
は２〜８℃で３日間貯蔵した。４時間後にはｒ−ｈＧＨ
の消化は完了した。 【００５１】ＨＰＬＣによる分離 【００５２】ＨＰＬＣによる分離はヒューレット・パッ
カード・カンパニー製の１０９０ＭＨＰＬＣシステムを
用いて行った。このシステムは、ＤＲ５ポンピングシス
テム、自動注入およびサンプリングシステム、加熱カラ
ム・コンパートメントおよびダイオードアレイ検出器等
を備えており、ＨＰ７９９９４Ａ　　ＣｈｅｍＳｔａｔ
ｉｏｎによって制御される。 【００５３】トリプシン・フラグメントを分離するため
に二つのグラジエント・システムを使用した。システム
Ｉはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の０．１％の水溶液を
溶媒Ａとし、溶媒Ｂとしてアセトニトリル中に０．８％
溶解させたＴＦＡ溶液を使用した。オーブン設定温度を
４０℃とし、１ｍｌ／分の流量で０〜１２０分間におい
てＢを０％から６０％のリニアなグラジエントでおこな
った。システムＩＩは溶媒ＡとしてｐＨ２．８５の５０
ｍＭのリン酸ナトリウムの水溶液を、溶媒Ｂとしてアセ
トニトリルを使用した。オーブンの設定温度を４０℃と
し、１ｍｌ／分の流量で１２０分にわたって溶媒Ｂを０
％から４０％のリニアなグラジエント・プロファイルで
おこなった。両方のグラジエント・システムでは、Ａｌ
ｌｔｅｃｈ　　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ製の、粒子径５μ
ｍ、ボア１００゜Ａのシリカゲルが充てんされた１５ｃ
ｍ×０．４６ｃｍのＮｕｃｌｅｏｓｉｌＣ１８逆相カラ
ムを使用した。図２はＴＦＡグラジエント・システムに
よって分析されたｒ−ｈＧＨ基準標準から誘導されたト
リプシン・ペプチド混合物の典型的なクロマトグラムを
示す。 【００５４】データ処理 【００５５】すべての分析について、スペクトルは２０
０〜３５０ｍｍの範囲にわたって１秒間隔で得た。さら
に、クロマトグラフ信号は、どの場合にも基準波長を３
５０ｎｍとして２２０、２３０、２５４、２７４、２８
０および２９２ｎｍの波長で記録した。生（ｒａｗ）デ
ータを磁気媒体に貯蔵し、ビルド・インされているスペ
クトル・ライブラリ機能および、付加的評価ソフトウェ
アを用いるＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎで処理した。前記の
評価ソフトウェアはＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎで使用可能
な高レベルのコマンド言語を利用してこの目的のために
つくられたものである。 【００５６】スペクトル・マッチング 【００５７】二つのＵＶスペクトルの数学的各点におけ
る（ｐｏｉｎｔ−ｂｙ−ｐｏｉｎｔ）が比較（ＣＯＭＰ
ＡＲＥ）コマンドを備えたＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎで実
行した。この比較は図４ａ、図４ｂに示されており、ペ
プチドのスペクトルＴ１３、Ｔ１４を比較している。各
波長において二つのペプチド・スペクトルについての吸
光度の値が横座標および縦座標にプロットされており、
図４ｂに示されるようにその結果得た散布図に線形回帰
を使用している。相関係数の二乗に１，０００を掛けた
ものを二つのスペクトルに対するマッチング係数として
定義している。図４ａに示されている二つのペプチドが
芳香族アミノ酸残基の性質において異なり、この残基は
Ｔ１３についてはフェニルアラニンでありＴ１４につい
てはチロシンである。これらのスペクトルは目視による
比較の場合でさえも明瞭に異なり、したがってマッチン
グ係数は９１９という低い数値を有する。 【００５８】図３ａ、図３ｂ、３ｃは、Ｔ１３を芳香族
アミノ酸を全く含まないペプチド・フラグメントＴ１２
と比較するときに、マッチング係数がどのような影響を
受けるかを示している。対応するスペクトルは非常によ
く似ており、マッチング係数は９９７（図３ｂ参照）ま
で増加して同等のスペクトルに期待される値に近づく。 【００５９】スペクトル・キャリブレーション・ライブ
ラリのコンパイル 【００６０】ｒ−ｈＧＨのトリプシン・マップにおける
様々なフラグメントの標準スペクトルのライブラリを次
にコンパイルした。この目的のため、基準標準を４回注
入し、グラジェント・システムＩ（ＴＦＡベース）およ
びＩＩ（リン酸塩ベース）と共に分析した。そして結果
得られたデータファィルを処理した。 【００６１】２２０ｎｍにおけるシグナルの積分後、す
べての積分したピークに対して頂点スペクトル（ａｐｅ
ｘ　　ｓｐｅｃｔｒａ）を同定した。それらのスペクト
ルはピークのどちら側かの二つのベースライン・スペク
トルから内挿した基準スペクトルを差引くことによって
溶媒バックグラウンドについて補正した。その結果得ら
れたピークスペクトルを次にライブラリ・ファイルに記
憶させ、これは所与のサンプルのスペクトル特性をすべ
て含むことによりサンプル・ライブラリと呼ぶ。 【００６２】用いた２点基準補正はグラジエント・シス
テムＩの場合には特に重要である。なぜなら、それはＴ
ＦＡではグラジエント・エルーション過程中にアセニト
リルの濃度が増加するにつれてスペクトル特性に著しい
変化が起るためである。図５ａ、５ｂは、フラグメント
Ｔ９の未補正の上昇傾斜（ｕｐｓｌｏｐｅ）、下降傾斜
（ｄｏｗｎ　　ｓｌｏｐｅ）、頂点スペクトルが標準Ｔ
９スペクトルとどのように著しく異なるかを示すもので
ある。図５ｂに示されるようにベースライン補正の後で
は、これらの三つのスペクトルはいずれも標準スペクト
ルに密接にマッチングしていた。 【００６３】次に、第１の標準から各ピークの頂点を中
心とする±０．５分の保持時間ウインドウを、他の三つ
の各標準から最もよくマッチングするスペクトルを見出
すために利用した。四つの標準のすべてに共通なスペク
トルを次に平均化、正規化、平滑化を施し、キャリブレ
ーション・ライブラリと呼ばれる新規なスペクトル・ラ
イブラリへ移動させた。トリプシン・マップの各ピーク
については、このライブラリ・ファイルはＵＶスペクト
ルと、面積、高さ、保持時間およびスケーリング係数（
ｓｃａｌｉｎｇ　　ｆａｃｔｏｒ）の値を含み、すべて
の値は四つの標準実行の平均に基くものである。Ｃｏｌ
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍの第９５頁に記載されたＷ．Ｓ．Ｈａｎｃｏｃｋ
らによる論文では、トリプシン・フラグメントは、アミ
ノ酸分析および高速原子衝撃質量分光法によって決定し
ている。最初のトリプシン・フラグメントの前および最
後のトリプシン・フラグメントの後に溶離されるピーク
のライブラリ・エントリ（ｅｎｔｒｙ）および全面積ま
たは全高さの１％以下の面積または高さを有するピーク
のエントリは除外した。上記の論文では、マイナーなピ
ークの大部分はｒ−ｈＧＨと関係するものではなく、お
そらくトリプシンから誘導される、あるいはベースライ
ン・ノイズまたは溶媒不純物などの他の干渉による非特
異的なバックグラウンドである。 【００６４】ＴＦＡシステムの最終的なキャリブレーシ
ョン・ライブラリは４０個のエントリを含み、そのうち
の１９個は既知のトリプシン・フラグメントを表わすも
のである。最終形態におけるリン酸塩ライブラリは３１
個のエントリ（ｅｎｔｒｉｅｓ）を含む。これらの二つ
のキャリブレーション・ライブラリは後続のすべての実
験において用いた。 【００６５】異なる標準実行からのデータの相関性はク
ロマトグラフの良好な再現性に大いに依存することに注
意しなければならない。図６においては、グラジェント
・システムＩＩによって分析した四つの反復試験からの
クロマトグラフ・トレース（クロマトグラム）はグラジ
ェントの最終段階までさえも装置の優れた性能を示すよ
うに重なり合っている。保持時間の変動を統計的に分析
した結果、キャリブレーション・ライブラリに含まれる
すべてのピークに対する平均標準偏差は、グラジェント
・システムＩおよびＩＩについてそれぞれ０．０２７分
（１．６秒）および０．０２１分（１．３秒）であるこ
とが示された。キャリブレーション・ライブラリの再現
性と選択性の決定 【００６６】キャリブレーション・ライブラリに含まれ
ているスペクトル・データの有用性を決定するマッチン
グ係数の二つの重要な特性は、感度と選択性であるので
、ある程度の定量的な指針を得るためにこれらの特性を
系統的に研究することが決めた。ＴＦＡはモディファイ
ヤとして使用されたときにリン塩酸よりも液体クロマト
グラフ検出器およびポンプに対してより大きな問題を提
起するので、グラジェント・システムＩを用いて結果を
得た。 【００６７】マッチング係数の再現性は任意の二つのス
ペクトルにおける類似性に対する絶対的な制限を決定し
、その結果としてスペクトル・マッチングの感度を決定
する。二つのスペクトルはこれら２つのマッチングの平
均と標準偏差が同等のスペクトルの繰返しマッチングに
よって得たものと著しく異なる場合についてのみ異なる
と判断することができる。正の同定に対する判定基準と
してマッチング係数カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）を用い
るだけでは不十分である。所与のマッチング係数の有意
性を決定するためには、それ以上の統計的な情報が必要
である。各ペプチドの代表的なスペクトルを得るために
、１１個の異なる注入から誘導されたＴ１３あるいはＴ
１４のスペクトルを平均した。次に、個別スペクトルの
全てをすべて、それらの各平均とマッチングし（図４ｃ
に示したオートマッチング）、その結果得たマッチング
係数分布を、平均Ｔ１４スペクトルに対して個別のＴ１
３スペクトルのマッチングから得られたものと比較し、
その逆も行なった（図４ｃに示したクロスマッチング）
。オートマッチング係数の平均とクロスマッチング係数
の平均はかなり異なる。クロスマッチング係数の９１８
．６という平均値は確かにその相違点をよく示している
ことがわかる。さらに重要なことは、図３ｃに示すよう
に各平均の上または下の三つの標準偏差の信頼区間（ｃ
ｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）は重なり
合わないが、大きなギャップを示している。したがって
、Ｔ１３は高い信頼度をもってＴ１４から識別すること
ができる。 【００６８】図４ｃはＴ１３およびＴ１２に対するオー
トマッチング係数とクロスマッチング係数をそれぞれプ
ロットしたものを示す。これらのペプチドは平均クロス
マッチング係数の９９７．２５というスコアから理解さ
れるようにスペクトル特性が非常に類似している。それ
にもかかわらず、オートマッチング係数とクロスマッチ
ング係数の信頼区間の間にはやはり明瞭なギャップがあ
り、極度に類似した化合物を区別することができること
を示している。統計的な用語で言えば、ｔテストを図４
ｃのデータに適用すると、ｔ値は５７であり、オートマ
ッチング係数とクロスマッチング係数について得られた
平均値が実際に異なるという確率は９９．９９％以上と
いう結果を得た。 【００６９】Ｔ１３とＴ１４を比較するためのｔテスト
（図３ｃ）の結果は、ｔ値が５４２でスペクトルが異な
る確率が１００％であった。四つの脂肪族ペプチド（Ｔ
７、Ｔ８、Ｔ１１、Ｔ１２）の間の類似性を示すｔ値は
統計的に確実な差異を示すのに十分な１３〜１３３の範
囲にあった。１１という母集団の大きさでは二つの平均
値が異なる確率を９９．９９％以上にするためにはｔ値
は少なくとも６．２であることが必要なことは当業者に
とって容易に理解される。 【００７０】グラジエントＩを用いた四つの標準試験の
マッチング係数の再現性を分析した。これらのマッチン
グ係数は９９８．７６〜１０００．００の範囲にあり、
標準偏差は０．００１以下から１．３０６までであるこ
とを見い出した。この結果はスペクトルの同定のために
はマッチングの非常に厳重な判定規準を使用できること
を示した。ピーク濃度が低下するにつれてマッチング係
数の変動性が増大するし、ｒ−ｈＧＨからのトリプシン
・フラグメントの相対濃度はほぼ一定であるので、一定
のマッチングしきい値を用いるよりもキャリブレーショ
ン・ライブラリ中のエントリについての個別のマッチン
グ判定規準を明確にするように決定した。正のマッチン
グと考えるためには未知スペクトルは所与の標準につい
ての平均マッチング以下の三つの標準偏差のしきい値以
上のマッチング・スコアを持っていなければならない。 これにより、正確なマッチングのみ指定（ａｓｓｉｇｎ
）される確率は９９．８％であった。 【００７１】キャリブレーション・ライブラリの選択性
を確立するために、キャリブレーション・ライブラリ中
の各標準を代表的なサンプル・ライブラリからのあらゆ
るエントリとマッチングし、潜在的なミスマッチングの
数を決定した。該ミスマッチングをあらかじめ確立され
た信頼性の制限内のマッチング係数を有する一つ以上の
マッチング候補が見出される標準エントリとして定義す
る。幾つかの実施例によれば、所与の標準近辺の保持時
間ウインドウを画定し、検索候補の数を制限することに
よって選択性を著しく向上させることができる。例えば
、±１分の保持時間ウインドウを用いた場合、僅か３つ
の標準についてだけ不正確なマッチングを見つけた。 これらミスマッチングはすべて３〜６ミリ吸光度単位（
ｍＡＵ）のピーク高さを有するマイナーなピークであり
、既知のｒ−ｈＧＨのトリプシン・フラグメントに相当
するものは一つもなかった。±０．５分のウインドウで
は、ミスマッチングは見出されなかった。したがって、
適切な保持時間ウインドウを選択するとｒ−ｈＧＨのキ
ャリブレーション・ライブラリはあらゆるフラグメント
の正確な同定を可能にするというように結論することが
できる。 【００７２】標準のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェ
アおよびこれと同様な性質を有するピーク認識は保持時
間にのみ基づくクロマトグラフのデータ処理のための他
の市販されるソフトウェア等の従来からのピーク同定を
行うキャリブレーション手法によれば、±０．５分の保
持時間ウインドウ内で、５〜８個の標準に対してミスマ
ッチングが発生する結果となった。ウインドウが±１分
にまで増加すると、ほとんどすべての標準がミスマッチ
ング・ピークを示した。 【００７３】ピークスコアの定義およびそのアプリケー
ション 【００７４】クロマトグラフの条件は常に安定であると
は限らないので隣接するピーク間の分解能が変化したり
、あるいはトリプシン・マップに新しいピークが現れる
ことがある。このような不安定性はスペクトル・マッチ
ングを用いた場合でも未知ピークの正の同定を困難にす
る。しかしながら、本願実施例からわかるようにピーク
・スペクトルの他に各ピークについて他の定量的な情報
が入手できるし、標準と未知ピークとの間の各マッチン
グに対して同様なスコアを指定する方法が確立された。 図７はこのようなスコアを構成するために役立つ様々な
パラメータの変動性を示している。相対標準偏差に基づ
いて、マッチング係数に最大の信頼を置くことができる
ことは明白である。保持時間情報とピークの面積および
高さは、それぞれマッチング係数の偏差と比較して１桁
および２桁大きい偏差を示している。 【００７５】図７における統計的な情報から、ピーク・
スコアは経験的に次のように導き出すことができる。 （１２）ＰＳ＝〔１０・ＭＴｄｉｓ　＋ＲＴｄｅｖ　＋
０．１（ＡＲｄｅｖ　・ＨＴｄｅｖ　）〕／１１．２こ
こにおいて、非現実的に高いデルタ値を避けるために以
下の最小値を決定した。即ち、ＭＴｄｉｓ　について０
．１、ＲＴｄｅｖ　について０．０５分、ＡＲｄｅｖ　
およびＨＴｄｅｖ　について１％である。このようにし
て、式（１２）はスペクトル・マッチングはピーク認識
のための最も重要なパラメータであって、このため大き
く重みづけされる事実を説明している。たとえ他のすべ
てのパラメータが完全なマッチングを示したとしても、
マッチング係数の大きな偏差は問題のピークが間違って
同定されたことを示すものである。１１．２というスケ
ーリング係数は全ての重みづけ係数の合計であり、単位
重み当たりのピークスコアを正規化したものである。 【００７６】定義によれば、完全なピーク・スコアは０
であり、スコアが１のときには正のマッチングを見のが
さない確率が９９．８％であるが、通常は標準と未知と
の間に多少の類似性を示すものである。キャリブレーシ
ョン・ライブラリを構成するために使用する四個のサン
プル・ライブラリのすべてのエントリに対するピーク・
スコアは０．００２〜０．４６５の範囲にあり平均スコ
アは０．０５１であった。スコアは制限がないので、２
またはそれ以上のスコアが全体にミスマッチングされた
ピークを示すことが、幾分独断的に決定されている正の
マッチングがスコア２という結果になる確率は０．００
０００２％以下であることは、当業者充分理解されるで
あろう。 【００７７】サンプルスコアを使った消化の自動評価【
００７８】キャリブレーション・ライブラリからのピー
クが未知サンプルの所与のピークによっていかによくマ
ッチングされるかを知った後、次のステップは未知サン
プル中の全てのピークと、一つのキャリブレーション・
サンプル中のピークにおける全体的な類似性を説明する
採点方法を確立することである。以前に定義されたサン
プル・スコアは、見逃したキャリブレーション・ピーク
およびサンプル中に見出された余分のピークの計算も考
慮に入れる。その上、スコアをキャリブレーション・ラ
イブラリ中のエントリ数とは独立するように正規化する
。ライブラリが修正されると正規化が問題になる。２以
上のピーク・スコアをミスマッチングとして定義してき
たが、すべてのピーク・スコアは見逃されたピークとミ
スマッチされたピークが同じピーク・スコアを有するよ
うに２に頭切り（ｔｒｕｎｉａｔｅｄ）する。特別のピ
ークに対する１のペナルティ・スコアはこの点では全く
経験的なものであり、他の可能なアプローチはペナルテ
ィに別のピーク寸法を反映させることである。 【００７９】完全なサンプル・スコアは正確に０として
容易に定義されると同時に合格スコアと不合格スコア間
の制限を構成する判定規準に関して決定が行われなけれ
ばならない。有意な制限は異なる多くの成長ホルモンお
よびトリプシンによる変動性とクロマトグラフの全般的
変動性を考慮するために基準標準の典型的なサンプル・
スコアの統計分析を通じて画定しなければならない。 【００８０】図８の（Ａ）では、キャリブレーション・
ライブラリを構成するために使用した四個のサンプル・
ライブラリ（サンプル１，Ａ〜Ｄ）および、同じ基準標
準から得られたが異なる量を注入した追加サンプル（サ
ンプル２，３，Ａ〜Ｄ）のサンプル・スコアを示す。予
想されたように、１００Ｍｇで注入されたキャリブレー
ション・サンプル（サンプル）自体は０．０７６または
それ以下の非常に良好なスコアを示し、その平均値は０
．０５０であり、四つの反復試験の間には著しい類似性
が認められた。 【００８１】５０Ｍｇの注入（サンプル２）のサンプル
・スコアが平均値０．７９８まで増加したことは、部分
的にはクラマトグラフ条件におけるドリフトに起因する
ものであり、その結果として幾つかのピークについて分
解能の変化が起きたものである。共溶離フラグメントＴ
１４ａとＴ１４ｃが二つのピークに分離して、それぞれ
キャリブレーション・ライブラリに含まれていた複合ス
ペクトルとは異なるスペクトルを有していた。部分的に
分解されたピーク対Ｔ１１とＴ１０ｃ２（図２）は全く
分離されなかった。その結果どのフラグメントも同定す
ることができない。また、最低濃度のフラグメント（Ｔ
１９）はこの比較的小さいサンプルサイズでは検出され
なかった。 【００８２】２００Ｍｇの注入（サンプル３）は０．４
４３の平均スコアを示し、１００Ｍｇのサンプルと５０
Ｍｇのサンプルの中間の数値だった。５０Ｍｇの注入に
よって生ずる同じ問題のピークからサンプル・スコアの
増加が起る。５０Ｍｇおよび２００Ｍｇの注入の両方に
おいて、見逃された付加的な標準ピークはすべて未知の
小さいピークであった。これは、サンプルに関してこれ
らの同定されないピークの重要性はさらに詳細に究明さ
れる必要がある。 【００８３】リン酸塩グラジエント・システム（グラジ
エント・システムＩＩ）について同様なデータを図８の
（Ｂ）に示す。また、四つのキャリブレーション・サン
プル（サンプル１）は０．０６４かそれ以下の非常に低
いスコアを示し、スコアの平均値は０．０３６である。 基準物質を含むが、異る時間で分析した別のサンプル（
２）では、０．６７１と比較的高いスコアを示している
。このスコアはグラジエント・システムＩにより基準物
質を５０Ｍｇおよび２００Ｍｇ注入したものについて得
られたスコアの範囲内にある。さらに精密に検査した結
果、ここにおいてもピーク分解能の変化がサンプル・ス
コアに悪影響を及ぼすことが分った。 【００８４】標準サンプルと異なることが知られている
サンプルについて得たサンプル・スコアの種類について
データを提供するために、トリプシンによる消化の前に
酸化したｒ−ｈＧＨのサンプルを潜在的な劣化経路を予
測するために分析した。図８の（Ｂ）に示すサンプル３
，Ａ〜Ｄにおいて明らかなように、１．６９２という平
均サンプル・スコアは基準物質について得られるスコア
よりもかなり高く、酸化ｒ−ｈＧＨと天然のｒ−ｈＧＨ
との間の差を反映している。さらに、四つのサンプルに
ついての再現性は非常に良好で、酸化されたサンプルの
反復注入における類似性を示す。 【００８５】この理論的なスコアを従来の目視的方法に
よる評価と関係づけるために、図９には酸化されたｒ−
ｈＧＨ消化物のクロマトグラムを示している。酸化によ
って消失したピークおよび新しいフラグメントとして現
われ、天然のｒ−ｈＧＨには見られなかったピークは明
確にラベル化することができる。 【００８６】このように、図９のクロマトグラムは矢印
で示される標準フラグメンテーション・パターンとはか
なり異なることは明白であるが、本発明は不正確なピー
ク・マッチングの可能性を減少させる上である程度の明
瞭な以下の利点を提供する。（１）全体的な評価手順は
オペレータの介在の必要なしに最終サンプル・スコアの
取得を自動化することができる。（２）採点手順は完全
にディジタルでおこなわれ、したがって観測者による偏
向がない。 【００８７】図１０〜１３では、本願発明に用いられる
アプリケーションを説明している。入力プログラムある
いはサブプログラムに供給される場合、該入力はオペレ
ータにより会話型（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）モードで
供給することができるか、または適切な情報を含むファ
イルから直接に取出すことがてきることを理解すべきで
ある。 【００８８】サブプログラム−ライブラリ作成（図１０
）では本発明に記載された二つのデータ・セットに対し
て生（ｒａｗ）データの減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を
実施する。ステップ１０１において、ユーザによる入力
で、入力ファイル、出力ファイル、波長選択、積分（ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）パラメータ等の名称となるこの
サブプログラムが指定される。 【００８９】ステップ１０２で検索したファイルはダイ
オードアレイ検出器によって生成された情報に適切な波
長および時間の関数としての吸光度データを含む生デー
タ・ファイルである。このようなフォーマットは原則と
してファイル・フォーマットの翻訳（ｉｎｔｅｒｐｒｅ
ｔａｔｉｏｎ）のためのローレベル・ルーチンが利用で
きることを条件として、サブルーチンによって処理する
ことができる。本発明の好適な実施例では、生データの
フォーマットはヒューレット・パッカード・カンパニー
製のダイオードアレイ検出器によって作り出されたもの
である。 【００９０】生データが磁気媒体から検索された後、ク
ロマトグラフのピーク応答を特徴づける適切な信号をス
テップ１０３でピーク・データの分析のために選択する
。典型的なピーク応答は、関心のあるすべての化合物が
特定の波長または波長範囲における吸光度を示すように
選択された特定の波長または波長範囲における時間の関
数としての吸光度である。しかしながら、記録した波長
範囲あるいはその波長の部分的範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅ
）にわたって平均吸光度または最大吸光度を、所与の時
点におけるピーク応答として使用することができる。 【００９１】信号を決定すると、ＨＰ　　ＣｈｅｍＳｔ
ａｔｉｏｎ上で実施される標準積分アルゴリズムまたは
クロマトグラフのデータ処理に通常使用されるものと類
似の性質を有する他のアルゴリズムを使用することによ
って、ステップ１０４でサブプログラムはこの信号に対
応するすべてのピークを見い出す。ピーク発見ステップ
の結果、ピークの始端、終端、頂点（保持時間）、面積
および高さ、およびステップ１０５における変数Ｐによ
って決まる現れるピークの数を決定する。 【００９２】ステップ１０６においては、このサブプロ
グラムの後続で生成される関連ピーク・データを後で受
入れるライブラリ・ファイルを作る。このライブラリ・
ファイルは典型的にはサンプル・ライブラリと呼ばれて
いる。次に、カウンタ（ｃｏｕｎｔｅｒ）をステップ１
０７において値１に初期設定し、カウンタによってイン
デックスをつけられたピークの頂点スペクトルはステッ
プ１０８でサブプログラムによって見い出される。そし
て、適切な基準スペクトルをステップ１０９で選択し、
通常は、溶媒のバックグラウンドだけしか存在しないピ
ークの始端部および終端部を主として選択する。 【００９３】特に隣接するピークと十分に分離されてい
ない場合、選択のための他の判断規準を用いることもあ
る。用いる基準スペクトルの数も利用されるクロマトグ
ラフ・システムの特性に従って変化する。 【００９４】ステップ１１０においては、カレント・ピ
ーク（ｃｕｒｒｅｎｔ　　ｐｅａｋ）のピークスペクト
ル特性を得るために、基準スペクトルが用いて頂点スペ
クトルから好ましくないバックグラウンド吸光度を取除
く。このバックグラウンド補正を構成するために幾つか
の異なるアプローチが利用できるが、好ましいモードは
頂点スペクトルの保持時間に基準スペクトルの直線内挿
を用い、頂点スペクトルから内挿スペクトルを差し引く
。もう一つのアプローチは、例えば、溶媒バックグラウ
ンドの主成分分析とそれに続く線形最小２乗減算（ｌｉ
ｎｅａｒ　　ｌｅａｓｔ　　ｓｑｕａｒｅ　　ｓｕｂｔ
ｒａｃｔｉｏｎ）を含む。 【００９５】ステップ１１１においては、サブプログラ
ムの範囲外であらかじめ決められた一定の波長の量で波
長軸を左右にシフトさせることによってピーク・スペク
トルに光学的波長キャリブレーションを実施することが
できる。このバックグラウンド補正は、異なる装置から
異なるサンプルのデータまたは同じ装置で長時間にわた
って誘導する場合には、一義的に重要である。 【００９６】ステップ１１２においては、ピーク・スペ
クトルに可能な数理的処理を幾つでも適用することがで
きる。このような処理の例は、平滑化（ｓｍｏｏｔｈｉ
ｎｇ）、より高い桁の偏差形成、より良好な分解能を得
るための波長軸のスプライニングまたはスペクトルの任
意の変換などである。 【００９７】ピーク・スペクトルはステップ１１３にお
いてサンプル・ライブラリに移動され、積分ステップ（
１０４）中に決定したカレント・ピークの他のピーク・
データをステップ１１４に移動させる。最後に、ステッ
プ１１５ではカウンタをインクリメントし、ステップ１
１６におけるピークＰの数をチェックする。もし他のピ
ークを処理する必要があるならば、サブプログラムはス
テップ１０８に戻り、そうでなければサブプログラムの
実行を終了する。 【００９８】ライブラリ比較サブプログラム（図１１）
は各サンプルについてのサンプル・ライブラリの形でサ
ブプログラムに与えられる任意の二つのサンプル間の詳
細なマッチングの大部分を行う。このサブプログラムの
実行に際して、第１のサンプルは第２のサンプルによっ
てマッチングされるべき基準サンプルまたは標準サンプ
ルと考える。しかしながら、第１のサンプルは第２のサ
ンプルと同様に完全な未知のものでも可能である。サン
プル・ライブラリはまた、ライブラリ作成サブルーチン
によって処理したサンプルの単一の分析から得られたデ
ータか、あるいは同じサンプルの多数の分析から得られ
たデータを含むことができ、後者はライブラリ作成サブ
プログラムによって生成されたサンプル・ライブラリか
らの標準ライブラリ作成サブプログラムによって相関さ
れるものである。 【００９９】ステップ２０１においては、このサブプロ
グラムに適切なユーザ・パラメータが要求される。ユー
ザ・パラメータは、用いるサンプル・ライブラリの名称
およびマッチング工程の特徴を記述するパラメータを含
む。 【０１００】ステップ２０２においては、第１の（基準
）サンプル・ライブラリを磁気媒体から検索し、Ｌ１と
呼ぶ。このライブラリに記憶されるピークの数を決定し
、ステップ２０３における変数Ｐ１を指定する。 【０１０１】ステップ２０４および２０５は、第２のサ
ンプル・ライブラリについて前述の二つのステップを繰
返し、ライブラリの名称をＬ２に、そしてピークの数を
Ｐ２と指定する。 【０１０２】ステップ２０６は保持時間補正よりなり、
これによって基準サンプルにおいて確定され、基準サン
プル・ライブラリに貯蔵された保持時間で起きることが
予測される基準ピークを第２のサンプルにおいて実際に
得た保持時間に対して比較する。第２のサンプルの保持
時間に対して適切な補正が行われると第１のサンプルの
保持時間に対応する。種々の可能な手順のどの一つでも
この補正工程で使用することができ、これらのうちで最
も単純なものは予測される保持時間と実際の保持時間と
の間の部分的線形適合（ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ　　ｌｉｎ
ｅａｒｆｉｔ）である。この補正が必要ではないことを
当業者にとって容易に認識することができる。ステップ
２０７においては、第１および第２のサンプルのピーク
面積とピーク高さをいくつかの方法で正規化する。二つ
の可能な方法は、いずれかのサンプルのすべてのピーク
の全面積および高さに対して、これらのパラメータに対
して任意に選択された一定値を得るためにすべてのピー
クをスケールする正規化、あるいは選択された基準ピー
クの面積および高さに対して正規化する方法であり、正
規化とはこれらの基準ピークについて任意の選択された
一定値を得るためにすべてのピークが比較されることを
意味する。二つのサンプルに適用されたクロマトグラフ
による分離の特性に応じて、このステップは必ずしも必
要ではない。 【０１０３】次に、ステップ２０８において二つのカウ
ンタを初期設定し、現在マッチングされるべきピークの
ためのカウンタを１に設定し（ｉ）、他のカウンタ（ｋ
）はマッチング値のテーブル中に記憶される最大１０個
までのカレント・ピークに対して見い出されたマッチン
グの数を計数する。 【０１０４】ステップ２０９においては、現在ｉと指標
されたピークについての関連ピーク・データをＬ１から
検索し、カレント・ピークの保持時間を中心とする保持
時間ウインドウをステップ２１０において構成する。こ
の保持時間ウインドウは第１および第２のサンプルの分
離に用いられるクロマトグラフ・システムの認識によっ
て決定され、第１のサンプルの分析によってかかる全時
間まで延長することができる。第２サンプルのピークの
ための第２のピーク・カウンタ（ｊ）はステップ２１１
において１に初期設定し、ｊと指標されたピークについ
てのデータをステップ２１２においてＬ２から検索する
。ステップ２１３において、ピークｊがステップ２１０
において規定された保持時間ウインドウ内にあるかどう
かを試験する分岐点が設定されている。もしそうでなけ
れば、ステップ２２１まで行くように制御される。そう
でなければ、サブプログラムはステップ２１４へと続き
、ここではＬ１中のピークｉおよびＬ２中のピークｊか
らのデータについてＭＴｄｉｓ　およびＣＮを計算する
。 【０１０５】ＭＴｄｉｓ　およびＣＮの計算は、各ピー
クに利用できる情報量、例えば、第１または第２のサン
プル、あるいはその両者についての多数の、または平均
の、または個別のスペクトル等に依存し、本願明細書の
他の部分に記載された幾つかの異なる方法で行うことが
できる。ステップ２１５においては、式（４）〜（８）
において定義された偏差のどれか一つのあるいは全部を
Ｌ１内のピークｉとＬ２内のピークｊについての適連す
るデータから計算出する。 【０１０６】次に、ステップ２１６においては、見い出
されたマッチングの数（ｋ）をマッチングの最大数に対
して比較し、このマッチング数（ｋ）は定数１０を任意
に設定するが他の任意の有意な数値に変更することがで
きる。もし１０位下のマッチング数が見い出されたなら
ば、マッチング・カウンタはステップ２１９においてイ
ンクリメントされる。そうでなければ、カレント・ピー
クに対するマッチングは現在記憶されているどれよりも
良好であると考えられる。最低のスコアを有するマッチ
ングはステップ２１８において削除され、実行はステッ
プ２２０へ進行する。そうでなければ、ステップ２２１
に移されるよう制御される。 【０１０７】ステップ２２０においては、ステップ２１
６の二つの分岐（ｂｒａｎｃｈｅｓ）およびステップ２
１７のイエス分岐は再び収れんし、カレント・ピークに
ついてのマッチング情報が適当な位置のマッチング・テ
ーブルに挿入される。 【０１０８】ステップ２２１においては、Ｌ２における
カレント・ピークのためのカウンタｊをインクリメント
し、ステップ２２２においてＬ２におけるピークの総数
Ｐ２に対して試験をおこなう。もしｊがＰ２を超えるな
らば、サブプログラムはステップ２２３へと続き、そう
でなければ、Ｌ２からの次のピークをステップ２１２へ
戻り、処理する。 【０１０９】ステップ２２３においては、Ｌ１内のピー
クのためのカウンタｉをインクリメントし、ステップ２
２４においてＬ１内のピークの総数Ｐ１に対して試験す
る。もしｉがＬ１を超えるならばサブプログラムをステ
ップ２２５へと続行させ、そうでなければＬ１からの次
のピークをステップ２０９へ戻らせ、処理する。 【０１１０】ステップ２２５においては、Ｌ１内のすべ
てのピークとマッチング・テーブルにおけるすべてのマ
ッチングとの間で、本発明に記載する階層指定手順（ｈ
ｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　　ａｓｓｉｇｕｍｅｎｔ　　
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によってすべての矛盾を解決する
ようにピーク指定（ｐｅａｋ　　ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ
）を行なう。Ｌ２からの１以下のピークをＬ１の各ピー
クへ指定し、Ｌ２からのピークをＬ１からの一以上のピ
ークへ指定することはない。 【０１１１】いったんピーク指定が完了すると、式（１
０）において定義されたピーク・スコアＰＳを段階２２
５で見い出したマッチングされたピークの各対について
、ステップ２２６で計算し、サブプログラムを終結する
。 【０１１２】すべてのピークについてのデータ・セット
１および２、および個別ライブラリからのオリジナル・
データから得た統計的情報を含む標準ライブラリに到達
するために、標準ライブラリ作成プログラム（図１２）
が一つまたは幾つかのサンプル・ライブラリからのデー
タを相関するために用いる。 【０１１３】ステップ３０１においては、ユーザ入力が
要求されており、変数Ｌに指定される。ユーザー入力は
ファイルの名称、処理するサンプル・ライブラリの数な
どの情報を含んでいる。 【０１１４】次に、ステップ３０２においては、相関に
おいて利用されるテンポラリ・スクラッチライブラリ、
ＴＥＭＰを作成する。このライブラリは最初に第１のサ
ンプル・ライブラリ内のすべてのピークに関するピーク
・データを含んでいる。 【０１１５】ステップ３０３において、カウンタを２に
初期設定し、ステップ３０４において、サンプル・ライ
ブラリの総数Ｌに対して試験する。もしカウンタがＬを
超えるならば、相関工程は完了しステップ３１３で、統
計的な処理が開始される。そうでなければ、サブプログ
ラムはステップ３０５に進行する。 【０１１６】ステップ３０５においては、ｊと指標づけ
されたカレント（ｃｕｒｒｅｎｔ）ライブラリを、前述
のサブルーチン「ライブラリ比較」を使用してＴＥＭＰ
と比較する。ライブラリ比較を援用すると基準ライブラ
リとしてのＴＥＭＰ中のピークとカレント・サンプル・
ライブラリ中のピークとの間の指定を行うこととなる。 もしライブラリ比較によって戻されたピーク・スコアが
ユーザによって選択されたしきい値を超えるならば所与
のピークの対の間のピーク指定は正と考えられる。ＴＥ
ＭＰからのピークに指定されなかったカレント・ライブ
ラリ内のピークは、ステップ３０６におけるすべての関
連ピーク・データとともに取除く。 【０１１７】ステップ３０７では、第２のカウンタｊを
ｉの現在値よりも１小さい値に初期設定する。ステップ
３０８からステップ３１１は、現在のサンプル・ライブ
ラリ内のピークによってマッチングされなかったＴＥＭ
Ｐ中のすべてのピーク、あるいはすでに処理されたすべ
てのサンプル・ライブラリ内に相当するピークを削除す
る。したがって、ステップ３１１の後で、現在までのす
べてのサンプル・ライブラリおよびライブラリＴＥＭＰ
は、１対１の基準ですべて相関関係があるピークの同じ
数を含んでいる。 【０１１８】もしステップ３０８における試験が０以上
であれば、サブプログラムはステップ３０９に進み、こ
こではＴＥＭＰ中のマッチングしなかったピークに対応
するすべてのピークをｊと指標されたサンプル・ライブ
ラリにおいて削除する。ステップ３１０においては、ｊ
は減少し、ｊの試験が０になるまで実行はステップ３０
８に戻る。この場合にはサブプログラムはステップ３１
１へと続く。この時点において、サブプログラムはステ
ップ３１１におけるＴＥＭＰ自体からのマッチングされ
なかったピークを削除し、ステップ３１２においてカウ
ンタｉをインクリメントさせてステップ３０４に戻る。 【０１１９】ステップ３１３より、相互に関連するすべ
てのサンプル・ライブラリの統計的な処理が開始される
。もし試験がすべてのライブラリが処理されてしまった
（すなわち、カウンタｉがＬの数値を超える）ことを示
すならば、プログラム制御はステップ３０４からこのス
テップに移される。 【０１２０】ステップ３１３においては、ＴＥＭＰおよ
びすべてのサンプル・ライブラリ中に残るピークの数を
決定し、変数Ｐに指定する。後続の処理ステップによっ
て生成されるデータを受入れるために、ステップ３１４
において新しいライブラリ・ファイルを作成する。この
ファイルは、サブプログラムによって作成される標準ラ
イブラリである。カウンタｉをステップ３１５において
再び１に初期設定し、１と指標をつけられたピークにつ
いてのピーク・スペクトルを各サンプル・ライブラリか
らステップ３１６における標準ライブラリへ移す。平均
スペクトルを個別ピーク・スペクトルから計算し、ステ
ップ３１７において標準ライブラリに記憶させる。 【０１２１】各サンプル・ライブラリからのカレント・
ピークについての個々のピーク・デルタをステップ３１
８において標準ライブラリに移した。これに続いて各カ
テゴリーにおいてピーク・データの平均値を求め、これ
らのデータをステップ３１９において記憶させる。 【０１２２】ステップ３２０においては、個別のスペク
トルおよび平均スペクトルから適切なスペクトルマッチ
ングＭａをすべて計算し、ステップ３２１において標準
ライブラリへ移す。 【０１２３】次に、ステップ３２２においてカウンタを
インクリメントし、ピークＰの総数に対して試験が行わ
れる。もしｉがＰを超えるならば、プログラムは完了す
る。そうでなければ、次のピークがステップ３１６へ戻
り、処理が施される。 【０１２４】サンプル・スコア、プログラム（図１３）
は、同一または異なる装置において、同一または異なる
クロマトグラフ条件によって分析された任意の二つのサ
ンプル間の類似性を示す全般的なサンプル・スコアに到
達するためのものである。このような手順は、二つのサ
ンプル中に存在する同様な化合物から誘導したと考えら
れる二つのサンプルのピークを同定する。 【０１２５】全般的な手順は、第１および第２のサンプ
ルについて定義し反復試験の数（Ｒ１　，ｒｅｐｌｉｃ
ａｔｅｓ）、Ｒ２　についての生データがそれぞれ利用
可能であることを仮定している。これはこれらのデータ
がサンプル・スコアの実行と同時に生成される可能性を
妨げない。このような同時に生成されることは全体的な
サンプル採点手順を完全に自動制御することを可能にす
る。 【０１２６】ステップ４０１では、全般的なマッチング
手順に特別のユーザー入力が必要である。このような入
力は、ファイル名、ライブラリ比較のためのマッチング
判定規準、標準ライブラリ作成によるサンプル・ライブ
ラリの相関性の判定規準およびサンプル・スコアを計算
するために利用される重みづけ係数等の項目を含んでい
る。 【０１２７】ステップ４０２では、第１サンプルの特徴
を有し反復試験のためのデータを含む標準ライブラリ（
Ｓ１）を供給することができる。もしこのライブラリが
利用できるならば、プログラムの実行はステップ４１０
に移される。そうでなければ、ステップ４０３〜ステッ
プ４０９で標準ライブラリが作成される。 【０１２８】ステップ４０３においては、第１のサンプ
ルについての反復試験の数に関する入力が要求され、変
数Ｒ１　に指定される。次に、カウンタをステップ４０
４で１に初期設定し、カウンタによって指標づけされた
第１のサンプルの反復分析のための生データをステップ
４０５において検索する。その時の反復試験についての
サンプル・ライブラリを作成するためにステップ４０６
においてライブラリ作成サブルーチンを呼出す。ステッ
プ４０７においてカウンタがインクリメントされ、ステ
ップ４０８で試験されるより多くの反復が処理されるな
らばプログラムはステップ４０５に戻る。そうでなけれ
ば、標準ライブラリ作成は、サブプログラム個別のサン
プル・ライブラリから標準ライブラリＳ１を生成するた
めの次のステップ４０９において呼出される。 【０１２９】ステップ４１０では、第２のサンプルの特
徴を有し、反復試験Ｒ２　についてのデータを含む標準
ライブラリ（Ｓ２）を供給することができる。もしこの
ような標準が利用できるならば、プログラムの実行はス
テップ４１８に移される。そうでなければ、ステップ４
１１からステップ４１７で標準ライブラリを作成する。 【０１３０】ステップ４１１では、第２のサンプルにつ
いての反復試験の数に関する入力を必要とし、変数Ｒ２
　に指定する。次に、ステップ４１２においてカウンタ
を１に初期設定し、カウンタによって指標づけされた第
２のサンプルの反復試験分析についての生データをステ
ップ４１３で検索する。現在の反復についてのサンプル
・ライブラリを作成するため、ステップ４１４ではライ
ブラリ作成サブルーチンを呼び出す。ステップ４１５で
は、カウンタがインクリメントされ、ステップ４１６に
おいて試験されるより多くの反復が処理されるならば、
プログラムはステップ４１３へ戻る。そうでなければ、
個別サンプル・ライブラリから標準ライブラリＳ２を作
成させるために、次のステップ４１７において標準ライ
ブラリ作成サブプロぐラムを呼び出す。 【０１３１】ステップ４１８においては、ライブラリ比
較サブプログラムを用いて標準ライブラリＳ１およびＳ
２をマッチングさせる。その結果、ピーク指定のステッ
プ４１９の出力と第１サンプルの各ピークについてのピ
ーク・スコアを得る。個別のピーク・スコアからステッ
プ４２０において式（１１）に基づいて総サンプル・ス
コアを算出することができる。ステップ４２１は適当な
装置にサンプルスコアを出力し、ステップ４２２におい
ては、最終レポートが作成される。このレポートは、二
つのサンプルが同一であるかどうかを決定するために、
問題にしている二つのサンプルからのサンプル・スコア
についてあらかじめ得られた再現性および信頼区間に関
する情報を関連づけることができる。この時点でプログ
ラムの実行は終了する。 【０１３２】 【発明の効果】以上説明するように、本願発明では、例
えば高速液体クロマトグラフによって分離された各化学
化合物成分のＵＶスペクトル・データを一般、オート、
クロスマッチング等のスペクトル・マッチング関数及び
バックグランド補正により正確に識別することができる
。 【０１３３】また、既知物質のスペクトル・テータを含
む標準ライブラリ更新しながらスペクトルの各パラメー
タの偏差及びピークのマッチング等によりピーク・スコ
ア、サンプル・スコアを求め、未知成分のスペクトル・
データを標準ライブラリと比較することにより未知成分
を同定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】高速液体クロマトグラフによって得たクロマ
トグラム。

【図１ｂ】吸光度シフトが生じた図１ａと同じ化学化合
物のクロマトグラム。

【図１ｃ】図１ａと図１ｂを補正するためのマッチング
係数を求めるグラフ。

【図２】グラジエント・システムＩで分析したｒ−ｈＧ
Ｈのクロマトグラム。

【図３ａ】２つのペプチドのＵＶスペクトルを示すクロ
マトグラム。

【図３ｂ】図３ａの２つのトリプシン・ペプチド（Ｔ１
２，１３）の同波長における吸光度を示す図。

【図３ｃ】図３ａの２つのトリプシン・ペプチドのスペ
クトルに対するマッチング係数を求めるグラフ。

【図４ａ】２つのペプチド（Ｔ１３，Ｔ１４）のＵＶス
ペクトルを示すクロマトグラム。

【図４ｂ】図４ａの２つのペプチドの同波長における吸
光度を示す図。

【図４ｃ】図４ａの２つのペプチドのスペクトルに対す
るマッチング係数を求めるグラフ。

【図５ａ】補正していないトリプシン・ペプチドのスペ
クトルと標準スペクトルを示す図。

【図５ｂ】バックグランド補正を施したトリプシン・ペ
プチドのスペクトルを示す図。

【図６】グラジエント・システムＩＩによるトリペプシ
ン・マップの再現性を表わすクロマトグラム。

【図７】ｒ−ｈＧＨのトリペプシンによる消化物の保持
時間，ピーク面積，ピーク高さの標準偏差及びマッチン
グ係数に示す表。

【図８】グラジエント・システムＩを用いて分析したト
リプシン消化物（Ａ）およびグラジエント・システムＩ
Ｉを用いて分析した負の酸化トリプシン消化物（Ｂ）の
サンプル・スコアを示す表。

【図９】グラジエント・システムＩＩを用いて酸化ｒ−
ｈＧＨを分析したトリプシン・マップのクロマトグラム
。

【図１０】本発明の一実施例であるライブラリ作成のフ
ローチャート。

【図１１】本発明の一実施例であるライブラリ比較のフ
ローチャート。

【図１２】本発明の一実施例である標準ライブラリ作成
のフローチャート

【図１３】本発明の一実施例であるサンプル・スコアを
得るフローチャート。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（イ）から（ホ）を含むクロマトグラ
   フのスペクトル・データ処理方法。 （イ）クロマトグラフによって溶離された化学化合物成
   分を１つまたは複数の波長の紫外線に露出させ、（ロ）
   前記紫外線に照射された化学化合物成分の吸光度を検出
   、記録し、 （ハ）第１と第２の化学化合物成分の前記各吸光度のデ
   ータ・セットを処理手段に送り、 （ニ）前記処理手段で前記のデータ・セットに少なくと
   も１つのスペクトラム・マッチング関数を与え、（ホ）
   前記マッチング係数に基づいて前記第１と第２の化学化
   合物成分を識別する。
2. 【請求項２】請求項１において、前記データ・セットに
   加える前記スペクトル・マッチング関数は以下にしたが
   って求めることを特徴とするクロマトグラフのスペクト
   ル・データ処理方法。 ＭＦＳ　＝１０００（１−ｒ２　） ここで、ＭＦＳ　はスペクトラム・マッチング係数、ｒ
   　は選択された波長における第１　の化学化合物成分の
   吸光度と同じ波長における第２の化学化合物成分の吸光
   度に関する相関関数。
3. 【請求項３】請求項２において、相関関数ｒは以下にし
   がって求めることを特徴ととするクロマトグラフのスペ
   クトル・データ処理方法。 ｒ＝［（ΣＸＹ）−（ΣＸ）（ΣＹ）／ｎｆ］／［｛Σ
   Ｘ２　−（ΣＸ）２　／ｎｆ｝｛Σｙ２　−（Σｙ）２
   　／ｎｆ｝］１／２　 ここで、ｘ、ｙはそれぞれ同じ波長における第１と第２
   の化学化合物成分の吸光度、ｎｆは選択した波長の数。
4. 【請求項４】請求項２で求められた前記データ・セット
   の各スペクトル・マッチング係数とに対して各々の平均
   吸光度をマッチングさせるオートマッチング関数を用い
   るステップを含むことを特徴とするクロマトグラフのス
   ペクトル・データ処理方法。
5. 【請求項５】請求項２で求められた前記データ・セット
   の各スペクトル・マッチング係数を異なる化学化合物成
   分の平均吸光度とマッチングさせるクロスマッチング関
   数を用いるステップを含むことを特徴とするクロマトグ
   ラフのスペクトル・データ処理方法。