JPH04197176A - 酵母プロテインジスルフィドイソメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）由来のプロティンジスルフィドイソメ
ラーゼ（ＰＤｒ）及びその製造方法並びに該酵素をコー
ドする遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

ＰＤＩは適当な条件下で、蛋白質のジスルフィド結合の
シャフリングすなわち異性化に導くチオール−ジスルフ
ィド交換反応を触媒し、蛋白質基質とチオール−ジスル
フィドのレドックス電位（酸化還元電位）に依存して蛋
白質のジスルフィド結合形成、異性化または還元を行わ
せる。小さな単一のドメインからなる蛋白質（例えば、
リボヌクレアーゼＡ）、複数のドメインからなる蛋白質
及び複雑なヘテロオリゴマー（例えば、免疫グロブリン
やプロコラーゲン）を含めて、還元蛋白質から天然のジ
スルフィド結合形成をＰＤＩが触媒するという報告は多
数ある（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、　Ｒ，Ｂ。

Ｎａｔｕｒｅ　３２９．　１９６１．　１９８７）。

蛋白質分子内及び分子間のジスルフィド結合形成は、蛋
白質分子の高次構造形成及びオリゴマー形成のための集
合にとって非常に重要な反応である。細胞内では、この
ジスルフィド結合は翻訳に共役して、あるいは翻訳直後
にＥＲ（小胞体）内腔で急速に起こる。この反応は、プ
ロティンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）によって
触媒されると考えられている。ＰＤＩは、蛋白質の分子
内及び分子間のジスルフィド結合の異性化を触媒し、天
然型の構造を作り出す。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、チオー
ル：ジスルフィド結合の相互交換反応を触媒することに
より、蛋白質のジスルフィド結合の形成、異性化、還元
を行わせる。蛋白質生合成過程でジスルフィド結合を有
する蛋白質の正確なフォールディングまたは集合に明ら
かにＰＤＩを要求することは、ＰＤＩを含めて可溶性の
ＥＲ内腔蛋白質を欠くが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成され
た蛋白質の移行やプロセシングを行う能力はなお有する
イヌ膵臓ミクロソームを使うと、翻訳と共役した小麦貯
蔵蛋白質であるＴ−グリアデインのジスルフィド結合形
成が起こらず、この系に生成したＰＤＩを加え、ミクロ
ソームを再構成するとこの欠損が回復し、ジスルフィド
結合した蛋白質が生じることから示された（Ｂｕｌｌｅ
ｉｄ、　Ｎ、Ｊ、　＆　Ｆｒｅｅｄ＋ｍａｒ＋、　Ｒ，
Ｂ、Ｎａｔｕｒｅ３３５、’６４９−６５１．１９８８
）。ＰＤＩと合成されつつある蛋白質との間の直接の相
互作用は、ｉｎ　ｖｉｖｏ架橋形成により、免疫グロブ
リン鎮との間で起きることが証明されている（Ｒｏｔｈ
、　ＲｌＡ、＆　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｓ、Ｂ。

Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ　２６．４１７９−４１８
２．１９８７）。

ＰＤＩは、ジスルフィド交換反応の触媒本体としての機
能の他に、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐｉｈｌ
ａｊａｎｉｅｍｉ、　Ｔ、、　Ｈｅ１ａａｋｏｓｋｉ、
　Ｔ１Ｔａ５ａｎｅｎ。

Ｋ、、　Ｍｙｌｌｙｌ、　Ｒ，、Ｈｕｈｔａｌａ、　Ｍ
、−Ｌ、、　Ｋｏｉｖｕ、　Ｊ、＆Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ
、　Ｋ、１．ＥＭＢＯＪ、　６．６４３−６４９．１９
８７　；Ｋｏｉｖｕ、　Ｊ、、　Ｍｙｌｌｙｌ、　Ｒ，
、Ｈｅ１ａａｋｏｓｋｉ、　Ｔ、。

Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ、　Ｔ１Ｔａ５ａｎｅｎ、　
Ｋ、　＆　Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ。

Ｋ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２．６４４７−
６４４９．１９８７）及びトリグリセリド転移蛋白質複
合体のサブユニットとして存在しくＷｅｔｔｅｒａｕ、
　Ｊ、Ｒｏ、　Ｃｏｍｂｓ、　Ｋ、Ａ、。

５ｐｉｎｎｅｒ、　Ｓ、Ｎ、＆　Ｊｏｉｎｅｒ、　Ｂ、
Ｊ、ＪＢＣ２６５，９８００−９８０７、１９９０）　
、さらにはＰＤＩに極めて高度に相同的な蛋白質として
、グリコジル化サイト結合蛋白質（Ｇｅｅｔｈａ−Ｈａ
ｂｉｂ、　Ｍ、、　Ｎｏ１ｖａ、　Ｒｏ、　Ｋａｐｌａ
ｎ。

Ｈ，Ａ、＆　Ｌｅｎｎａｒｚ、　Ｗ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　
５４．１０５３−１０６０．１９８８）、トリヨード−
Ｌ−チロニン結合蛋白質（Ｃｈｅｎｇ。

Ｓ、−Ｙ、、　Ｇａｎｇ、　Ｑ、−Ｈｏ、　Ｐａｒｋｉ
ｓｏｎ、　Ｃ０，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ。

Ｅ、Ａ、Ａｐｐｅｌｌａ、　Ｅ、、　Ｍｅｒｌｉｎｏ、
　Ｇ、Ｔ、＆　Ｐａ５ｔａｎ。

１、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２．１１２２１−
１１２２７．１９８７）　、ヨードチロエン−５′−モ
ノ脱ヨード化酵素（Ｂｏａｄｏ。

Ｒ，Ｊ、、　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｄ、Ａ、＆　Ｃｈｏ
ｐｒａ、　１．Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１５５．１
２９７−１３０４．１９８８）などが報告されている。

このように機能の各々異なる蛋白質（あるいは、そのサ
ブユニット）として存在することは、ＰＤＩが多機能分
子としての性質を有し、真核生物において広範な生物学
的反応に関与していることを示唆している。一方、ＰＤ
Ｉと相同的な活性部位（ＷＣＧＰＣＫ）を有するリボヌ
クレオチド還元酵素のための電子供与体であるチオレド
キシンは、ジチオール機構により多くの蛋白質のジスル
フィドの還元を触媒するが、大腸菌からヒトまで広く分
布しており、酵母菌のチオレドキシンもすでに同定され
ている。さらに、この活性部位に相同な配列は、性腺刺
激ホルモンであるルトロピン（１ｕｔｒｏｐ　ｉｎ）の
βサブユニットやフォリトリピン（ｆｏｌｌｉｔｒｏｐ
ｉｎ）のβサブユニットにも存在し、精製されたヒツジ
のフォリトロピンとウシのルトロピンは、還元されて変
性させられたりボヌクレアーゼを再活性化することを指
標にしたチオレドキシン活性のアッセイ系において、モ
ル換算でチオレドキシンよりも強い活性を示した。この
ように、ホルモンによって誘発されるレセプターの活性
化にジチオール−ジスルフィド交換及び酸化還元反応が
役割を果たしていることが提唱されている（Ｂｏｎｉｆ
ａｃｅ、　Ｊ、Ｊ、　＆　Ｒｅ１ｃｈｅｒｔ、　Ｊｒ、
Ｌ、［Ｅ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４７．６１−６４．１９９０）。

さらに、ラットのホスホイノシチドに特異的なホスホリ
パーゼＣのイソ酵素Ｉ型が精製されそのアミノ酸配列が
決定されたが、この分子中には、チオレドキシンの活性
部位に相同な配列（ＡＰＷＣＧＩ（ＣＫ）が２カ所含ま
れている（Ｂｅｎｎｅｔｔ、　Ｃ，Ｆ、、　Ｂａ１ｃａ
ｒｅｋ。

ＪｌＭ、、　Ｖａｒｒｉｃｈｉｏ、　Ａ、＆　Ｃｒｏｏ
ｋｅ、　Ｓ、Ｔ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４゜２６８−２７
０．１９８８）。この酵素はレセプター刺激により活性
化され、ホスファチジルイノシトール４゜５−ビスリン
酸に作用して２つのセカンドメツセンジャーである１、
２−ジアシルグリセロールとイノシトール１．４．５−
三リン酸に分解するもので、シグナル伝達において重要
な役割を果たしている酵素である。活性部位に相同な配
列は多分不安定なイノシトチドホスホチオール中間体を
形成することによってホスホイノシチドのホスホジェス
テラーゼによる加水分解に重要な役割を果たしているか
または、制御蛋白質（例えばＧＴＰ−結合蛋白質）との
相互作用にチオール依存的な酸化還元反応が関与してい
る可能性が指摘されている。これらのことは、保存され
ているＷＣＧＩＩ／ＰＣＫ配列を持つ多くの蛋白質が、
構造的のみならず少なくとも反応作用の上からは機能的
にも関連したスーパーファミリーを構成していることを
示唆している。

ジスルフィドイソメラーゼとしてのＰＤＩは、哺乳動物
のものが同定されており、分子−約５７ｋＤａｌのポリ
ペプチド鎖が重合した酸性度の高いｐ■（４，２−４，
３）を有するホモダイマーである。

（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、　ＲｏＢ、、　Ｈａｗｋｉｎｓ、
　Ｈ，Ｃ８，Ｍｕｒａｎｔ、　Ｓ、Ｊ。

＆　Ｒｅ１ｄ、　　Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｃ、Ｔｒ
ａｎｓ、１５．　９５−９９゜１９８８）。ラット肝臓
のＰＤＩのｃＤＮＡがクローニングされており、そのヌ
クレオチド配列からアミノ酸配列が推定されたが、ＰＤ
Ｉ蛋白質はその分子内に２種類の相同的なドメインを有
し、そのうちの１つがチオレドキシン分子内に存在する
配列と高度に相同的であった。この相同領域は、２個の
シス残基を含み、チオレドキシン分子においてはこの２
個のシス残基は酸化還元対として機能することが知られ
ている（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、Ａ、、　Ｓｏｄｅｒｂｅｒ
ｇ。

Ｂ、０．、　Ｅｋｌｕｎｄ、　Ｈ９＆　Ｂｒａｎｄｅｎ
、Ｃ，１，ＰＮＡＳ　７２゜２３０５−２３０９．１９
７５）。チオレドキシンとＰＤＩの類似性はこの配列上
の相同性のみならず、機能上でも見いだされている。チ
オレドキシンはインスリンなどの蛋白質のジスルフィド
還元を触媒したり、還元され変性させられた、または酸
化されてはいるが、間違って対を作ったジスルフィドを
含んでいるｓｃｒａｍｂｌｅｄ　リボヌクレアーゼから
の効率のよいリフォールディングを触媒する（Ｐｉｇｉ
ｅｔ、　Ｖ、Ｐ。

＆　５ｃｈｕｓｔｅｒ、　Ｂ、Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３゜７６４３−７６４
７．’　１９８６）が、これらはＰＤＩの活性として知
られたものである（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、Ａ、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ。

２５４、　９６２７−９６３２．　１９７９　；Ｌａｍ
ｂｅｒｔ、Ｎ、＆　Ｆｒｅｅｄｍａｎ。

ＲｌＢ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２１３．２３５−
２４３．１９８３）　、チオレドキシンのこの作用と類
似しているのは、ＰＤＩのシスティンの２つの対の機能
で、これらはジスルフィド結合形成において協同的に働
くことができるとも考えられている。合成されつつある
ポリペプチド鎖におけるジスルフィドの形成は酸化を行
う分子と並置された関与する２つのシスティン残基の存
在を必要とする。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（Ｃｒｅｉｇｈ
ｔｏｎ。

Ｔ、Ｅ、、　　Ｈｉｌｌｓｏｎ、Ｄ、Ａ、　＆　Ｆｒｅ
ｅｄｍａｎ、　　ＲｏＢ、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｒｉａｌ、　１４２．４３−６２．１９８０）は、還元
された蛋白質はまず酸化されたＰＤＩと反応し、ミック
スされたジスルフィドを形成し、これらのミックスされ
たジスルフィドは次いで分子内ジスルフィド交換反応を
受はジスルフィド結合と還元されたＰＤＩを生じるとい
う機構を提唱した。それから、酸化されたＰＤＩは対を
なす酸化システム（例えば、酸化型グルタチオン）によ
って産生され、この過程は最終的な構造が得られ、ジス
ルフィドが熱力学的な制約のためおよび／または物理的
に接近できなくなるために多分もはや反応しなくなるま
で続くであろう。ＰＤＩはそれ自身会合してダイマーと
なる（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、　ＲｌＢ、ＴｌＢ５肌４３８
−４４１．１９８４）ので活性部位のジスルフィドを含
む配列はジスルフィド相互交換の効率のよい触媒作用を
許す酸化している微小環境を合成されつつあるポリペプ
チド鎖に提供するのかもしれない（Ｅｄ＋ｍａｎ、　Ｊ
、Ｃ，。

Ｅｌｌｉｓ、　Ｌ、、　Ｂｌａｃｈｅｒ、　ＲｏＷ、、
　Ｒｏｔｈ、　Ｒ，＾、＆　Ｒｕｔｔｅｒ。

Ｗ、Ｊ、Ｎａｔｕｒｅ　３１７．２６７−２７０．１９
８５）。ＰＤＩには活性部位を含む２つのドメインが見
つかっているが、各々のドメインはスルフヒドリル基ま
たはジスルフィド結合と反応できるので、適切なジスル
フィド結合形成のための条件は、相互作用する蛋白質の
そのものが持っている本質的なフォールディングエネル
ギーが２つのＰＤＩ活性部位を一緒に配置させるように
させ、その結果ジスルフィド結合の相互交換を促進する
事である可能性も指摘されている。

ＰＤＩは分子内及び分子間のジスルフィド結合の異性化
を触媒し、天然の高次構造を持った蛋白質（及び集合体
）を生じさせると考えられているが、多くの蛋白質は、
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＤＩが存在しないにもかかわらず
、適切なジスルフィド結合を形成することができる。ま
た、いくつかの蛋白質では加えられたＰＣＩによるジス
ルフィド形成促進のレベルはバックグラウンドの数倍に
しかならないことも知られている（Ｔｅａｌｅ、　Ｊ、
Ｍ、＆　Ｂｅｎｊａｍｉｎ。

Ｄ、Ｃ９ＪＢＣ２５１，４６０３−４６０８，１９７６
）。さらに、しばしばほとんど化学量論的な量のＰＤＩ
が最適な反応速度を実現するために必要とされる。これ
らのことは、基質となる蛋白質の種類によって、ＰＤＩ
の触媒活性が変化する、すなわち基質特異性が存在する
か、ＰＤＩと対をなす酸化システムがｉｎ　ｖｉｖｏに
存在することによってその触媒作用が効率化されている
可能性を示唆するものである。

またジスルフィドイソメラーゼ活性が低い場合には、蛋
白質分子内及び分子間でのジスルフィド異性化速度が低
く、従って適切なジスルフィド結合を有する蛋白質の形
成の効率が低いことが予想される。種々の真核生物由来
の蛋白質（特に分泌蛋白質類）が、大腸菌内で不溶化分
子集合体を形成する原因の１つがこのジスルフィドイソ
メラーゼ活性の低さにあると考えることも可能である。

大腸菌では、ジスルフィド還元酵素としてチオレドキシ
ンを含むが、チオレドキシンはジスルフィド還元酵素と
してはＰＤＴよりも強力であるが、イソメラーゼとして
の効率はよくない。

また、還元された状態の環境が蛋白質合成の場として与
えられた場合には、適切なフォールディングのために必
要とされるジスルフィド結合の形成は阻害されるであろ
う。このような環境は、例えば、コンパートメントがな
いような原核生物の細胞内で生じる。このような点を考
えると、原核生物細胞と真核生物細胞では、ジスルフィ
ド結合形成に関わる因子とそれを可能にさせる環境とが
異なると言えるであろう（Ｓｃｈｅｉｎ、　Ｃ０Ｈ，（
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７．　１１４１−１１
４９．　１９８９）（Ｈａｒｔｌｅｙ、　　Ｄ、Ｌ。

＆　Ｋａｎｅ；　Ｊ、Ｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｔ
ｒａｎｓ、　１６．　１０１−１０２゜１９８８））。

また、分子内ジスルフィド結合は、分泌蛋白質に高頻度
にみられることから、分泌能の高い細胞あるいは組織に
おいてジスルフィド異性化を介したジスルフィド結合活
性が高いことが予想され、実際にラットの種々の組織の
相対的なＰＤｒｍＲＮＡ含量の比較（肝臓〉膵臓、腎臓
〉肺〉精巣、膵臓〉心臓〉脳の順）からこのことが強く
示唆されている（Ｅｄ＋ｎａｎら、１９８５）　、さら
に、ＰＤｒ含量は細胞や組織に種類によって異なるばか
りでなく、いくつかの系で発生の間にその量が変化する
ことも知られている（Ｂｕｌｌｅｉｄ、　Ｎ、Ｊ、　＆
　Ｆｒｅｅｄｍａｎ。

ＲｌＢ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３５．６４９−６５１．１
９８８）。組換えＤＮＡ技術を用いて、有用な蛋白質（
その多くは分泌性の蛋白質である）を産生させようとす
るとき、その蛋白質に適した条件でジスルフィド結合の
形成をおこなわせる必要がある。そのためには、宿主細
胞内の環境（適切なコンパートメント）が実現しなけれ
ばならないであろうし、その環境（コンパートメント）
に親和性の高いジスルフィド形成（ジスルフィド異性化
）酵素が多量に存在しなければならないであろう。これ
ら二つの点は組換えＤＮＡ技術を用いて、ジスルフィド
結合を有する蛋白質を効率よ（産生させる際に最も注意
しなければならない点と考えられる。大腸菌のような原
核細胞ではこれらのことは容易には実現させることがで
きない。組換えＤ　Ｎ　Ａ技術を用いて有゛用蛋白質を
産生させるのに、頻繁に用いられる真核生物は酵母菌で
あり、酵母菌のジスルフィド形成酵素を同定・分析し、
基質特異性（親和性）、比活性、そのほかの生化学的性
質、局在性などを調べることにより、酵母菌におけるジ
スルフィド形成システムの特徴を見つけ、これを利用し
て、より効率のよいジスルフィド結合を含む蛋白質の産
生を図ることは、極めて有用なことであると考えられる
。

現在まで、チオレドキシン以外の酵母菌のジスルフィド
形成酵素の同定は報告がない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、蛋白質のジスルフィド結合を異性化す
る酵母由来のプロティンジスルフィドイソメラーゼ（Ｐ
ＤＩ）、及びその製造方法並びに該蛋白質をコードする
遺伝子を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

従って本発明は、次の性質： （１）ジスルフィド結合の異性化を触媒する；（２＞　
ＮａＤｏｄＳＯ，−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて約７０．０００の分子量を示す；（３）等電点電
気泳動において約４．１の等電点を示す； （４）エンドグリコシダーゼＨ処理により分子量が約６
３．０００となる；及び （５）ジスルフィド異性化活性の至適ｐＨが約８．７５
である； を有する酵母由来の蛋白質を提供する。

本発明はさらに、上記蛋白質を酵素から単離することを
特徴とする該蛋白質の製造方法を提供する。

本発明はまた、上記蛋白質をコードする遺伝子を提供す
る。

〔具体的な記載〕

本発明のプロティンジスルフィドイソメラーゼ酵素の製
造のため又は該酵素をコードする遺伝子の調製のために
使用される酵素としてはサツカロミセス（シニ珈■二匹
朋）属に属する酵母が挙げラレる。例えば、サツカロミ
セス・セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
任意の種が使用され、具体例としてＳ、ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　４８２２株が例示される。

酵素菌体から目的とする酵母蛋白質を得るには、酵素の
精製のための常法を用いることができる。

例えば、目的とする酵母菌のジスルフィド異性化酵素は
小胞体（ＥＲ）内腔に存在することが予想される。この
ため、酵母菌細胞をフレンチプレス、ビードビータ−な
どで破砕し、遠心後得られた沈澱をアルカリで抽出し、
その抽出液から硫安分画、ＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｃｅｌ
などの陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィ
ー、疎水性ＨＰＬＣ，ゲル濾過ＨＰＬＣ，などを組み合
わせることにより、精製する。なお、この精製過程にお
いてジスルフィド結合の異性化反応をモニターする方法
として、通常行われている還元して得た変性リボヌクレ
アーゼＡを変性溶液中で酸化させたもの（スクランブル
トリボヌクレアーゼＡ）に各精製段階で得られた分画を
加え、適切なジスルフィド結合が形成される該酵素のヌ
クレアーゼ活性を測定し、ジスルフィド異性化触媒活性
を算定する方法を用いることができる。酵素の精製のた
めの具体的な方法は実施例１に記載する。

本発明の酵素蛋白質の性質は実施例２において記載する
。上記のようにして得られた精製酵素のアミノ酸配列を
部分的に決定し、そのアミノ酸配列に基いてオリゴヌク
レオチドプローブを作製し、常法により作製された酵母
ゲノムライブラリー又は酵母ｃ［１ｌｌｉＡライブラリ
ーをスクリーニングすることにより該酵素をコードする
ＤＮＡが得られる。

こうして得られたＤＮＡの塩基配列を第１５図に示す。

また、本発明の酵素のアミノ酸配列は、該酵素蛋白質を
コードする遺伝子の塩基配列から、第１５図に示すよう
に推定される。しかしながら、本発明の酵素は、酵母菌
由来の示された１種類の酵素に限定されるのではなく、
アミノ酸配列の内１個又は複数個のアミノ酸が、欠失、
付加、置換等により変更されているが、なお本来の活性
を有する酵素をも包含する。

〔発明の効果〕

本発明の精製された酵母ＰＤＩは、直接蛋白質のジスル
フィド異性化反応により、不適切なジスルフィド結合を
持つ蛋白質（多分蛋白質として不活性であると思われる
）に適切なジスルフィド結合をもたせ、活性型コンフォ
メーションをとらせることに利用できる。また、ＰＤＩ
は種々の他の蛋白質と相互作用することが予想されたり
、さらには、特定の機能を有する蛋白質複合体の１成分
となったりするので、これらの蛋白質の同定・精製や生
物学的性質の研究にも利用できる。精製ＰＤＩはモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体を作製するための抗
原としても利用できる。これらの抗体は、ＰＤＩの酵素
学的性質、細胞内及び組織内分布、などを調べるのに利
用でき、更にＰＤＩと相互作用する蛋白質の同定にも利
用できる。

酵母ＰＤＩ遺伝子は、該蛋白質を組換えＤＮＡ技術によ
り、種々の宿主細胞を用いてＰＤＩを大量に生産するた
めに利用できる。また、基質特異性、基質親和性、比活
性、熱や溶媒などに対する安定性、相互作用して分子複
合体を形成する相手の蛋白質の種類、などが変化した該
蛋白質誘導体を作製するのにも利用できる。さらに、５
′隣接配列は種々の転写制御に関連した要素配列を含む
ので、他の遺伝子の発現のための転写制御配列としても
利用できる。さらに、該遺伝子を、該蛋白質が高次構造
形成を促進する有用蛋白質と同じ宿主細胞内で発現させ
ることにより、望ましい高次構造を有する該有用蛋白質
を効率よく生産させる手段をも提供する。

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１．酵母ＰＤＩの精製 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　ＡＨ２２株）をＹＰＤ培地（酵母エキス１０　ｇ
　／　Ｒ、ペプトン２０ｇ／ｌ、グルコース５０ｇ／ｎ
）で培養し、ウェット重量で２．７００　ｇの酵母細胞
を得た。これにエチレンジアミン四酢酸（ＩＥＩ）ＴＡ
）を含む、１ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニル溶液を
同重量加え、ジルコニウムビーズを用いてビードビータ
−で破砕した。

これを遠心分離法により上清と沈澱に分画し、その沈澱
に更に１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１ｍＭ弗化フェニルメ
チルスルホニル溶液を同重量加えて懸濁後、遠心分離法
により再度上清と沈澱に分画した。この沈澱に同重量の
０．２Ｍホウ酸、０．２Ｍ塩酸カリウム、１０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ溶液を加えて懸濁した後０．２規定の水酸化ナト
リウムを加え、ｐＨを８．０に合わせた。これを４℃で
２時間振盪した後、遠心分離法により上清と沈澱に分画
した。

この上清に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを
加え、４℃で一晩撹拌した後遠心分離法により上清と沈
澱に分画した。この上清に更に８０％飽和になるように
硫酸アンモニウムを加え、２時間４℃で撹拌した後遠心
分離法により上清と沈澱に分画した。この沈澱に５０ｍ
Ｍホウ酸−５０ｍＭ塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８，０）を徐々に加え可溶化した。

この可溶化した試料を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５のゲル
濾過カラム（φ２．６０ｍ　ｘ８７ｃｍ）に掛け、１０
ｍＭホウ酸−１０ｍＭ塩化カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液（９Ｈ８，０）で流速４２　ｍｌ　／　ｈ　ｒで
溶出した。最初のピークに相当する分画を集め、その分
画をＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｃｅｌカラム（２，６ｃｍＩ
、　Ｄ、Ｘ３８ｃｍ）　ｌ：結合サセタ後、そ分離を１
０ｍＭホウ酸−１０ｍＭ塩化カリウム−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８，０）中の塩化ナトリウム濃度を０か
ら０．５Ｍに上昇させる事により行った。

流速は１７　ｍｌ　／　ｈ　ｒであった。各分画につい
てプロティンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性
を下記の方法で測定し、第１図に示されるようなイオン
交換カラムによる溶離図を得た。

活性のピークに相当する分画を集め分子量３万排除の濾
過膜を用いて限外濾過法により濃縮した。

この試料をＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬの疎水性カ
ラム（φ７．５ｃｍＸ１．７ｃｍ）に掛け、０．０５％
のアジ化ナトリウムを含む１０ｍ１Ｊ　！ｊン酸ナナト
リウム緩衝液ｐＨ６，５）中の硫安濃度を０．４２Ｍか
ら段階的！、：０．２６Ｍ　、　０．０９Ｍ１そしてＯ
Ｍと下げることにより溶出した。各分画には直ちに３７
１０体積の０ｏ０５％アジ化ナトリウムを含む５００ｍ
Ｍ　Ｕン酸二ナトリウム溶液を加えてｐＨを８以上に上
げた。この時の流速は８４０　ｒｎｌ！　／　ｈ　ｒで
あった。この疎水性カラムによる溶離を第２図に示す。

０．０９Ｍ、Ｉ）Ｍの硫安溶液によって溶出された分画
を集め分子量３万排除の濾過膜を用い限外濾過法により
濃縮した。この試料をＰｈｅｎｙｌ　５ＰＷの疎水性カ
ラム（φ７．５ｍｍＸ７．５ｃｍ）で再クロマトし、０
．０５％のアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６，５）中の硫安濃度を０．４２Ｍ
からＯＭに下げて溶出した。この時の流速は６０ｒｎｌ
／ｈｒであり、各分画に直ちに３７１０体積の０．０５
％のアジ化ナトリウムを含む５００ｍＭ　’）ン酸二ナ
トリウム溶液を加えた。この疎水性カラムによる溶離を
第３図に示す。この精製ステップにより、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＯ３）−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動及び逆相カラムを用いた高性能液体クロマトグラフィ
ーによる純度検定で単一成分にまで精製された。

ＰＤＩの測定はＮ、　Ｌａｎｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ
、Ｆｒｅｅｄｍａｎ（１９８３ＨＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、　２１３　：２３５−２４３）の方法を以下のように
変更して行った。サンプル量は０．４４−とじ、０．１
艷の０．５ｍＭジチオスレイトール溶液を加え５．５−
３０．５分反応させた。これに０．０５．ｍｌのスクラ
ンブルド・リボヌクレアーゼ溶液（最終濃度１．５１オ
）を加え、１５．５−３０．５分（「反応時間」と呼ぶ
）反応させた。その後４５℃で平衡化させた０、２３■
の酵母ＲＮＡを含む１．９９ｍ１！の５０ｍＭ　）リス
・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５０，２５ｍＭの塩化カリウム
、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む）に０．０１ｍｆの
サンプルを加え、４５℃で２６０１ｍでの吸光度（Ａ２
ａｏ）を０．２分毎に２分間測定し初速を求めた。リボ
ヌクレアーゼＡの溶液を作り同様にＡ２６０の吸光変化
の初速を求め検量線を書いた。初速をリボヌクレアーゼ
Ａの濃度に換算し、反応時間あたりの活性を求めた。

その結果酵母のＰＤＩＯ比活性は、ｐＨ８，７５で２４
４Ｘ１０”　Ｕ／■であり、ウシＰＤＩの値２６９Ｘ１
０’　Ｕ／■（至適ｐ８７．５での測定値）とほぼ等し
いことが明らかとなった。

実施例２．酵母ＰＤＩの特性決定 （１）分子量の測定 実施例１で得られた酵母ＰＤＩの分子量を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミド濃度勾配ゲル（４〜２０％）電気泳動に
より測定した。分子量標準としてホスフォリラーゼｂ（
分子量９４．０００）　、ウシ血清アルブミン（６７、
０００）、オボアルブミン（４３，０００）、カーボニ
ックアンヒドラーゼ（３０，０００）　、大豆トリプシ
ンインヒビター（２０，１００）　、及びα−ラクトア
ルブミン（１４，０００）を用いた。第４図に示す通り
、約７０、０００ダルトンの分子量が得られた。

（２）等電点の測定 実施例１で得られたＰＤＩの等電点（ｐＩ）をＬＫＢ社
Ａ＋ｎｐｈｏ　ｌ　ｉｎｅ等電点電気泳動マニ二アル記
載の方法に従い等電点電気泳動法により測定した。

標準としてヒトカルボニックアンヒドラーゼＢ（ｐｒ＝
６．５５）　、ウシカルボニックアンヒドラーゼＢ　（
５，８５）、β−ラクトクロプリンＡ　（５，２０）、
大豆トリプシンインヒビター（４，５５）　、及びグル
コースオキシダーゼ（４，１５）を用いて測定した結果
第５図に示す通り、ＰＤＩは約４．１の単一の等電点を
示した。

（３）逆相カラムにおける単一性 実施例１で得られたＰＤｌ　１６１Ａｒを凍結乾燥し、
０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液に溶かした後高性能
液体クロマトグラフィーのアクアポアＲＰ３００の逆相
カラム（φ２．１關Ｘ３０ｍ山）に掛け０．１％トリフ
ルオロ酢酸溶液のアセトニ）　ＩＪル濃度を０から１０
０％に上げて分離した。第６図に結果を示す。

ＰＤＩは保持時間２２．５分近辺に単一のピークを示し
ている。

（４）活性のｐＨ依存性 実施例１で得られたＰＤＩの活性のｐＨ依存性を実施例
１の活性測定法で調べた。用いた緩衝液は５０ｍＭ　）
　ＩＪス塩酸である。第７図に示す如＜　８．７５近辺
が至適ｐＨである。

（５）エンドグリコシダーゼＨによる糖鎖の切断実施例
１で得られたＰＤＩに糖鎖が結合しているかどうかを見
るためにエンドグリコシダーゼＨを働かせた時の分子量
の変化を調べた。約１ＯＩＩＩ！のＰＤＩを含むｌ１１
１の試料に１０ｕの０．１２％５０５−５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，５）　、ＩＯＪの２−メルカプトエタノ
−Ｊｌ／　−５９ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）、及び
７５Ｉの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）を加えた後
、３分間１００℃で熱した。室温に戻した後４ｍｕのエ
ンドグリコシダーゼＨを４Ｊ１１の２０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８，５）に溶かした物を加え、３７℃
で１９時間反応させた。反応後の試料と反応前の試料を
５ｐＳ−ポリアクリルアミド濃度勾配ゲル（１〇−２０
％）電気泳動させ、（１）と同じ分子量標準を用いて分
子量を測定した。第８図に示すように反応後の試料は約
６３にダルトンであり、約７にダルトンの糖鎖が切断さ
れた事が示唆された。

（６）精製酵母ＰＤＩのＮ−末端配列 精製酵母ＰＤＩをアプライド４７７Ａプロテインシーク
エンサーによりアミノ末端配列の分析を行なったが、何
ら有意なアミノ酸を同定できなかった。

したがって、酵母ＰＤＩのアミノ末端は何らかによって
修飾されブロックされているものと考えられる。

（７）部分アミノ酸配列の決定 ２００にの酵母ＰＤＩに９００Ｒの臭化シアンを加え、
７０％の蟻酸中で二昼夜処理することにより分解を行っ
た。分解生成物を逆相カラムＡｑｕａｐｏｒｅＲ−３０
０（２，１ｒｔｍφＸ３ｃｍ、アプライド・バイオシス
テムス）により分離・精製した。この場合、４５分間に
わたる０．１％トリフルオロ酢酸又は０．１％ペンタフ
ルオロ酪酸中０〜１００％アセトニトリルの濃度勾配を
用い、２００Ｊ／分の流速で溶出を行い、１８個のペプ
チドピークを得た。

これらのペプチド断片の内７断片のアミノ酸配列を４７
７Ａ自動シーケンサ−（アプライド・バイオシステムス
）により分析した結果、次のアミノ酸配列が得られた。

■　＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ　−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｘ　−１１ｅ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ■　Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−１１
ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｘ　−Ａｓｐ−Ｖａｌ−
Ｘ　−Ａｓｎ■　ｌ１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ■　Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｘ　−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘ
　−Ａｌａ−Ｇｌｕ ■　Ｘ　−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−１
１ｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈ
ｅ■　Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−１１ｅ−Ａ
ｓｐ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｔｌｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ■　Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−＾１ａ−１１ｅ−Ｈｉｓ−５ｐ （８）Ｎ−末端アミノ酸配列 （７）で得られた１８個のペプチドピークのうちＮ−末
端断片と推定されるペプチド約１００１００ｐをＬｙｓ
ｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬）　５　
Ｘｌ０−’ＡＵと反応させ２本のペプチド断片を得た。

このペプチド断片の内１断片のアミノ酸配列を４７７Ａ
自動シーケンサ−（アプライド・バイオシステムス）に
より決定した結果数のアミノ酸配列が得られた。

Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−１１ｅ−この結果は実施例４
で得られたヌクレオチド配列の第７５６塩基から第７８
５塩基までから推定されるアミノ酸配列（Ｎ−末端側か
ら３７−４６番目のアミノ酸配列）と一致し、使用した
臭化シアン分解ペプチドフラグメントがＮ−末端断片を
含むことが強く示唆された。したがって、単離された酵
母ＰＤＩのＮ−末端は、ＤＮＡ配列から推定されるアミ
ノ酸配列において、上記のペプチドのアミノ末端１ｅｕ
３ｆｆよりアミノ末端側に存在すると考えられる。

（９）アミノ酸組成 ３本の加水分解管に各々６Ｉ１ｇの精製酵母ＰＤＩと０
．５ｍｌの６ＮＨＣ１を加え、脱気・封管して１１０℃
にて２４時間加水分解した。この加水分解物を減圧乾燥
した後、アミノ酸分析機几Ｃ−３００（日本電子）でア
ミノ酸組成を測定した。この結果を第１表に示す。

以下余白 第１表 （１）　　カッコ内の数値は決定されたアミノ酸配列か
ら得られたアミノ酸数を示す。

（２）　推定されたアミノ酸配列中には、５つのＶａｌ
−Ｖａｌ結合と７つの１ｉｅ−Ｖａｔ又はＶａｔ−４Ｌ
ｅ結合が存在している。

実施例４゜酵母ＰＤＩ遺伝子を含むクローンのスクリー
ニング 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒａｖｉｓｉ
ａｅ）のＰＤＩ遺伝子を含むクローンのプラークハイブ
リダイゼーションによるスクリーニングのため、酵母へ
８２２株の染色体ＤＮＡを５ａｕ３Ａ　Ｉで部分分解し
て得られた断片をもちいＥＭＢＬ　３をベクターとして
作製された酵母ゲノムライブラリィ−を用いた。ＥＭＢ
Ｌ組換え体ファージを大腸菌ＬＥ３９２を宿主として感
染させ、形質転換プラーク計２　ＸＩＯ’個をＬＢ寒天
培地上に形成させた。組換えＤＮＡをメンブランフィル
タ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）に移した
後、３２ｐ放射性同位元素で標識した合成オリゴヌクレ
オチド４種の混合物（比活性≧１１０７ｃｐ／ｘｒ）を
プローブとして用いスクリーニングした（Ｂｅｎｔｏｎ
及びＤａｖｉｓ　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．　１８０−
１８２（１！１１７７）フ。この４種のプローブは実施
例３に記載されている精製酵母ＰＤＩの臭化シアン分解
物のうちの１つ（ペプチド■）のアミノ酸配列に基いて
合成した。その配列を次に記載する。

ペプチド　：　ＭＥＴ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−１１
ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ プローブ１　：　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＣＡＡＣＡＴＴ
　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　Ａ
ＡＧ プローブ２　：　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＣＡＡＣＡＴＴ
　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＣＣＴＴＧ　ＡＡ
Ｇ プローブ３　：　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＣＡＡＣＡＴＣ
ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＡＡ
Ｇ プローブ１　：　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＣＡＡＣＡＴＣ
ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＣＣＴＴＧ　ＡＡＧ この混合プローブの合成は自動ＤＮＡシンセサイザーに
より行い、標識はＣｒ−”Ｐ〕ＡＴＰとポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いておこなった。

具体的には、ＩＲの合成りＮＡ、５０μＣｉの〔γ−”
Ｐ）ＡＴＰ水溶液（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　、５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　＜ｐＨ７，５）　、１０ｍ
Ｍ　１ｉ１ｇＣ’１２．１０：Ｌ二ｙトＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造）を含む１０１１１の溶液を３
７℃で１時間反応後、未反応のヌクレオチドをＮｉｃｋ
−ｃｏｌｕｍｎ（７７／Ｉ／？シア）を用い、メーカー
のプロトコールに従って除き、３２ｐで標識されたＤＮ
Ａを得た（　Ｉ　ＸＩ（１”ｃｐｍ／ｇ　［ｌＮ＾／４
ＱＯｔｄ）。

ハイブリダイゼーションは以下の様に行った。

ＤＮＡを固定した膜をハイブリダイゼーション液（６ｘ
ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）　、５　ｘデン
ハート液（０，１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィ
コール、０．１％ポリビニルピロリドン）、２０％ホル
ムアミド、５％デキストラン、０．５Ｒ変性サケ精子Ｄ
ＮＡ）　）　１０ｒｄ中で、３７℃にて１時間保温した
。次に液を、プローブを最終濃度ｌＸ１０”ｃｐｍ／Ｗ
ｌｌになるように加えたハイブリダイゼーション液１０
ｍｇと交換し、３７℃にて一夜保温した。液を捨て、膜
を６ｘ　ｓｓｃで５分間、４７℃で洗い、さらに６　Ｘ
５ＳＣで３０分間、４７℃で洗った。膜を風乾後、Ｘ−
＾Ｒフィルム（コダック社）に−８０℃にて一夜感光さ
せた後、常法に従って現像した。以後、特にことわらな
い限り、ハイブリダイゼーションはこの条件下で行った
。

陽性のシグナルを与えた５個のファージクローンの２個
のクローンから（ＥＭＢＬ−ＰＤＩ２０とＥＭＢＬ−Ｐ
ＤＩ２３　）ＤＮＡを調製し［”Ｂｌａｔｔｎｅｒら５
ｃｉｅｎｃｅ　２０２．１２７９（１９７８））　、こ
れを拐ｖ■　（宝酒造；１０ユニット／ｐｌ＞とりｄＩ
ＩＩ　にツポンジーン；１２ユニット／Ｊ）で消化し、
消化物のサザーンプロットを合成プローブとハイブリダ
イズさせた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　ＪｌＭｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　５０３−５１７（１９７５））　、　Ａ
ｐａ　ＩとＨｉｎｄＩＩＩによる消化は次の様に行った
。ＤＮＡ　１　ｇ、　ン己、Ｉ　１　ｔｉ、及び１０ｘ
ＡｐａＩ緩衝液Ｃ１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（
ｐＨ７，５）、７０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、７０ｍＭ　　２
−メルカプトエタノール〕２Ｉに滅菌蒸留水を加えて２
０ｄとした。３７℃、１時間保温してＡｐａ　Ｉによる
切断を完了させた。つぎにその反応液に、５０００１Ｍ
　ＭａＣｌ　　２　ＪＳＩ（ｉｎｄＩＩＩ　１〆を加え
、３７℃、１時間保温してＨｉｎｄｌｌＩによる切断を
完了させた。ハイブリダイズさせたフラグメントは上記
２個のクローンから得られ、両方とも０．８ｋｂの長さ
であった。

また、このクローンのＤＮＡヲＥｃｏＲＩ　　にッポン
ジーン；１２ユニット／１１１）とＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、消化物のサザーンプロットを合成プローブとハイ
ブリダイズさせたｌ”５ｏｕｔｈｅｒｎ、　ＪｌＭｏｌ
、Ｂｉｏｌ、５０３−５１７　（１９７５）　）。到四
ＲＩと几ｉｎｄ　ｍによる消化は以下の様に行った。Ｄ
ＮＡ　　Ｉ　Ｒ，ＥｃｏＲＩ　１１、ＨｉｎｄＩＩＩＩ
ｌｌ及び１０　ｘ　ＥｃｏＲＩ　Ｍ衝液ＣＩ　Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ　・ＨＣＩ　（ｐ）Ｉ７、５　）　、１００ｍＭ　
ＭｇＣｌ２．５００ｍＭ　ＮａＣ１：Ｉ　２　ｙｉ：滅
菌蒸留水を加えて２０ｕとした。３７℃、１特開保温し
てＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ［による切断を完了させた。

なお、特にことわらない限り、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌｌ
）によるＤＮＡの消化はこの条件下で行った。ハイブリ
ダイズしたフラグメントはＥＭＢＬ−ＰＤｒ２０クロー
ン由来のＤＮＡの消化物で３．５　ｋｂＳＥＭＢＬ−Ｐ
ＤＩ２３クローン由来のＤＮＡの消化物で８ｋｂの長さ
であった。

このうち、ＥＭＢＬ−ＰＯＩ２０のＤＮＡ由来の３．５
ｋｂの長さのフラグメントをｐ［Ｉｃ１１９ベクターに
サブクローニングした（このサブクローンをｐＥＨ（１
１９＞と呼ぶ）。具体的には以下の様に行った。ＥＭＢ
Ｌ−ＦＤ！２０のＤＮＡをＥＣＯＲＩと１ｉｎｄｌｌ）
消化後、常法に従って〔たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ、　
Ｊ、、　　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　＆Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　５ｅｃｏ
ｎｄ　Ｂｄｉｔｉｏｎ　ｐｐ６．３−６．１９．　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ□Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９ｇ９）　）　、アガロースゲル
（０，８％アガロース、０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅ
ｔａｔｅ。

０．００２ＭεＤＴ＾）を用いたアガロースゲル電気泳
動法により３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロー
スゲルより切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ”（８１０１
０１社）を用いてメーカーのプロトコールに従って、Ｄ
ＮＡフラグメントを抽出した。次にあらかじめＥｃｏＲ
ｌとＨｉｎｄｌｌ［で消化しておいたｐＵｃ１１９ベク
ターと抽出したＤＮＡフラグメントを用いて、Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ処理を以下の様に行った。ベクターＤＮＡ
　１．＊。

ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメント、１０
ｘリガーゼ緩衝液１”６６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ
　（ｐＨ７，’５　）。

６６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、　１００ｍＭ　［ｌＴＴ　、
　１ｍＭ　ＡＴＰＩ　２　Ａ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ
１Ｉｄ（宝酒造、４００ユニット／ｍ）に滅菌蒸留水を
加えて２０Ｊとし１６℃で２時間保温した。この７４　
ＯＮ＾リガーゼ処理後の酵素反応混合物を用いて大腸菌
ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを常法に従って形質転換し、アンピシ
リン耐性を標識として形質転換体を選択した。目的とす
るプラスミドを含有するクローンを例えばミニプレバレ
ージョン法によす形質転換体から抽出したＤＮＡを種々
の制限酵素で切断して電気泳動法により分析する方法〔
たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ、　　Ｊ、、　　Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ、　　ε、Ｆ、、　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｔ
。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ’ｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　５ｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉ
ｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）　Ｅにより
選択した。そして選択されたクローンを培饗し、菌体か
ら常法にしたがってプラスミドＤＮＡを抽出することに
より、所望の組換えプラスミド、ｐＥＨ（１１９）を増
幅・回収した。なお、特にことわらない限り、サブクロ
ーニングに用いたアガロース電気泳動法、ＤＮＡフラグ
メントの抽出、Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ処理、目的とする
クローンの選択法、及び目的とするプラスミドの増幅・
回収は上記の方法で行った。尚、ｐＥＨ（１１９）を含
有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ
ｌ−Ｂｌｕｅ（ｐＥＨ（１１９））は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌等第１１８０９号（Ｆ［ＥＲ
Ｍ　Ｐ−１１８０９）として寄託された。

マタ、ＥＭＢＬ−ＰＤＩ２３りｏ−ン由来ノＤＮＡをＡ
ｐａ　ｒとＸｈｏＩ（宝酒造；１２ユニツＩ−／ｐｌ”
）で以下の様に消化した。ＤＮＡ　　１　ｚ、　Ａｐａ
　Ｉ　１１、及び１０ＸＡｐａＩ緩衝液Ｃ１００ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、７０ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２．７０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール〕２
１１１に滅菌蒸留水を加えて２０１１１とした。３７℃
、１時間保温してん己■による切断を完了させた。つぎ
にその反応液に、Ｉ　Ｍ　Ｎａ［’ｌ　　２ｄ　、　Ｘ
ｈｏ　Ｉ　１　ｐｌを加え、３７℃、１時間保温してμ
ｑｏＩにより切断を完了させた。

なお、特にことわらない限り、Ａｐａ　ＩとμｔｏＩに
よるＤＮＡの消化はこの条件下で行った。消化物のサザ
ーンプロットを合成プローブと）λイブリダイズさせた
ところｌ”５ｏｕｔｈｅｒｎ、　ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ
、、　５０３−５１７（１９７５）　］　、４ｋｂのフ
ラグメントにノ＼イブリダイズした。

この４ｋｂの良さのフラグメントを電気泳動後、アガロ
ースゲルより切り取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴｌ″（Ｂ
Ｉ０１０１社）を用いて、ＤＮＡフラグメントを抽出し
た。次にあらかじめ拐ヒエとＸｈｏ　Ｉで消化しておい
たｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｎにＳ＋ベクター（ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社）と抽出したＤＮＡフラグメントを用
いて、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ処理をおこなった。このＴ
４　ＤＮＡ　’Ｊガーゼ処理後の酵素反応混合物を用い
て大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅに常法に従って形質転換し、
アンピシリン耐性を標識として形質転換体を選択し、目
的とするプラスミドを含有するクローン（ｐＡＸ（＋）
）を選択した。

そして選択されたクローンを培養し、菌体から常法にし
たがってプラスミドＤＮＡを抽出することにより、所望
の組換えプラスミド、ｐＡＸ（＋）　、を増幅・回収し
た。尚、ｐＡＸ（＋）を含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（ｐＡＸ（＋）
）は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌等第１
１８１０号（Ｆ［ＥＲＭ　Ｐ−１１８１０）として寄託
された。

この２つのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を第９図
に示す。

なお、制限酵素地図の作製のために用いた各々の制限酵
素によるＤＮＡの消化は以下に述べる条件下で行った。

ＥｃｏＲＩ　、　ＨｉｎｄＩＩＩ、及びμｔｏＩによる
ＤＮＡの消化：ＤＮＡ　１〜、制限酵素ｌｌ１１１及び
１０ｘ［ＥｃｏＲＩ緩衝液〔Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ
　（ｐＨ７，５）。

１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、５００ｍＭ　ＮａＣ１）　
２　ｊｌｌに滅菌蒸留水を加えて２０ｍとした。３７℃
、１時間保温して切断を完了させた。Ａｐａ　Ｉ及び５
ａｃＩ（宝酒造；１２ユニット／パ）の場合は１ＱｘＥ
ｃｏＲＩ緩衝液の代りに１０ｘＡｐａ　Ｉ緩衝液を使用
した。また、Σａｌｌ　にッポンジーン；１５ユニット
／ｌ１ｌ）及びＰｓｔＩ（宝酒造；１２ユニット／ｍ）
の場合は、１ＱｘＥｃｏＲＩ緩衝液の代りに１０ｘＳａ
ｌＩ緩衝液Ｃ１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ
７、５）　、７０ｍＭ　ＭｇＣ１ａ、１．７５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，７０ｍＭ　２−メルカプト三タノール、２ｍＭ　
ＥＤＴ＾、０．１％ウシ血清アルブミン〕を使用した。

なお、特にことわらない限り、これらの制限酵素による
ＤＮＡの消化はこの条件下で行った。

実施例５．酵母ＰＤＩ遺伝子の塩基配列の決定塩基配列
の決定のために、ｐＡＸ（＋）プラスミドＤＮＡより、
（１，３ｋｂの長さの旧ｎｄＩＩＩフラグメントをｐ［
Ｉｃ１１８ベクターに以下の様にサブクローニングした
〔このサブクローンをｐｌ（）ｌ　（１１８）と呼ぶ〕
。ｐＡＸ（＋）プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消
化後、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電
気泳動法により分子量によって分離した＝０．３ｋｂの
長さのフラグメントをアガロースゲルより切り出し、Ｇ
ＢＮＥＣＬＥＡＮ”（ＢＩＤ　１０１社）を用いて、Ｄ
ＮＡフラグメントを抽出した。次にあらかじめＨｉｎｄ
ｌＩで消化しておいたｐＵｃ１１８ベクターと抽出した
ＤＮＡフラグメントを用いて、Ｔ４　ＤＮＡ　ＩＪガー
ゼ処理をおこなった。このＴ４　ＤＮ＾リガーゼ処理後
の酵素反応混合物を用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを常
法に従って形質転換し、アンピシリン耐性を標識として
形質転換体を選択し、目的とするプラスミドを含有する
クローンを選択した。そして選択されたクローンを培養
し、菌体から常法にしたがってプラスミドＤＮＡを抽出
することにより、所望の組換えプラスミド、ｐＨＨ（１
１８）、を増幅・回収した。以後、特にことわらない限
り、制限酵素処理を除くサブクローニングの方法は、こ
れらの条件下で行った。

マタ、ｐＡＸ（＋）プラスミ）’ＤＮＡより、０．９ｋ
ｂの長さの旧ｎｄＩ［［−３ａｔ　Ｉフラグメントをｐ
［Ｉｃ１１９ベクター及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉ
ＩにＳ＋ベクターにサブクローニングした〔それぞれの
サブクローンを、ｐＨ８（１１９）、　ｐＨ３（＋）と
呼ぶ〕。旧ｎｄＩＩＩとＳａｌ　ＩによルｐＡＸ（＋）
プラｘ　ミ）’ＤＮＡ５ｐ［Ｊｃ１１！ＩｌｌターＤＮ
Ａ、及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋ベクタ
ーＤＮＡの消化は以下の様に行った。ＤＮＡ　ＩＲ，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ　１ｐｉＳＳａｌ　Ｉ　１ｐｇ、及び１０
ｘＥｃｏＲＩ緩衝液２Ｉに滅菌蒸留水を加えて２ｏＩｌ
ｌとした。３７℃、１時間保温して切断を完了させた。

また、Ｊ）ＡＸ（＋）　フラスミトＤＮＡヨ？）、０．
６ｋｂの長さのＳａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメント
をｐ［Ｉｃ１１９ベクター及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
　ＩＩにＳ＋ベクターにサブクローニングした〔それぞ
れのサブクローンを、ｐＳＰ（１１９）、　ｐｓｐ　（
＋）と呼ぶ〕。Ｓａｔ　ＩとＰｓｔ　■によるｐＡｘ（
＋）ブ５ｘ　ミ）’ＤＮＡ、　ｐＵｃｌ１９ヘクター、
及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋　ベクター
の消化はＤＮＡ　　ＩＲ。

Ｓａｌ　Ｉ　ＩＪｌｌ、　ＰｓｔＩ　ｌｌ１ｌ及び１０
ｘ　Ｓａｌ　Ｉ緩衝液２Ｉに滅菌蒸留水を加えて２０ｍ
とした後、３７℃にて１時間保温することにより行なっ
た。

また、ｐＥＨ（＋）プラスミドＤＮＡより、１．３ｋｂ
の長さのＫｐｎ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメントをｐ
Ｕ［：１１９ベクター及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉ
Ｉ　ＫＳ＝ベクターにサブクローニングした〔それぞれ
のサブクローンを、ｐＫＨ（１１９）、　ｐＫＨ（＋）
と呼ぶ〕。Ｋｐｎ■とＨｉｎｄＩ［ＩによるｐＥＨプラ
スミドＤ　Ｎ　Ａ　、　ｐＵ［：１１９ベクター、及び
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ−１−ベクターの消
化はＤＮＡ　　１．ｇｑ臣■ｌｌ１１１肪ｄＩＩ１１ｕ
、及び１０ｘ拍ＲＩ緩衝液２Ｉに滅菌蒸留水を加えて２
０１１１とした後、３７℃、１時間保温することにより
行なった。

次に塩基配列決定のために、ｐＫＨ（１１９）プラスミ
ドＤＮＡを用いて、Ａｐａ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグ
メント部分（０，８ｋｔｌ）のＡｐａ　Ｉ部位からの欠
失を以下の様に行なった。ｐＫＨ（１１９）プラスミド
ＤＮＡ５Ｒ。

」四Ｉ　（宝酒造；１２ユニット／Ｊｉ）１１１１、ジ
四■（宝酒造；１２ユニット／　１ｔｌ）　　１　ｔｔ
ｌＳｌｏ　ｘ　Ａｐａ　Ｉ緩衝液２Ｉに滅菌蒸留水を加
えて２０１１１とし、３７℃で１時間保温した後、６５
℃にて１０分で酵素を失活させた。次に、εｘｏ■緩衡
液Ｃ３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ８、０）　
、１００ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍ
Ｍ　　２−メルカプトエタノール）８０ｄおよびＥｘｏ
ｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ（宝酒造；５０ユニツ１−／
ｕｌ”）　　ｌｄを反応液に加え３７℃で保温した。時
間をおって反応液１０ｕ１ずつを、あらかじめ氷冷して
おいたＭＢ緩衝液Ｃ４０ｍＭ　Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ（
ｐＨ４，５）　、１００ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　２ｎ
Ｃ１，，１０％グリセリン］　　１００＃中に加えてい
き、この操作を全量が無くなるまで繰り返した。その後
、この反応液を６５℃、５分で保温しεｘｏｎｕｌｅａ
ｓｅ　ｍを失活させた。氷冷後、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　
Ｎｕｃｌｅａｓｅ　（宝酒造；３０ユニット／ｌｉｔ＞
１ｔｉｌを加え、３７℃、３０分保温した。反応液をＴ
　Ｅ　［：１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，
５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　〕で飽和したフェノール１０
０Ｊ１１で抽出し、さらにフェノール／クロロホルム（
１／１　。

ｖ／ｖ）１００１１１で抽出後、エタノール５００Ｉを
加え、遠心により沈澱を回収した。７０％エタノールで
洗浄後、真空乾燥した。２０１１１の滅菌蒸留水を加え
、このＤＮＡ溶液のみでＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ処理を行
なった。このＴ４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ処理後の酵素反
応混合物を用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを常法に従っ
て形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存して常法により
形質転換体を選択し、目的とするプラスミドを含有する
クローンを例えばミニプレバレージョン法により形質転
換体から抽出したＤＮＡを種々の制限酵素で切断して電
気泳動法により分析する方法〔たとえばＳａｍｂｒｏｏ
ｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　＆Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　５ｅ
ｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１
９８９））により選択した。そして選択されたクローン
を培養し、菌体から常法にしたがってプラスミドＤＮＡ
を抽出することにより、所望の組換えプラスミドｐＤＥ
Ｌ−１及びｐＤＥＬ−２を増幅・回収した。以後、特に
ことわらない限り、制限酵素処理を除く欠失はこの条件
下で行なった。

得られた欠失クローンを第１０図に示す。

また、ｐＫＨ（＋）プラスミドＤＮＡを用いて、Ａｐａ
　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグメント部分（０，８ｋｂ）
のＨｉｎｄｌＩ部位からの欠失を行なった。ｐＫＨ（＋
）プラスミドＤＮＡ５［をＨｉｎｄＩＩＩ　Ｉ　ＪＬ　
Ｐｓｔ　Ｉ　Ｉ　Ｊ、　１０　ｘ旦四ＲＩ緩衝液２Ｉを
含む全量２０Ｊ１１の反応液中で、３７℃で１時間保温
した後、６５℃、１０分で酵素を失活させた。この消化
物を用いて前述の条件で欠失を右こなった。得られた欠
失クローンｐＤＥＬ−３゜ｐＤＥＬ−４及びＩＩＤＥＬ
−５を第１１図に示す。

また、ｐＨ５（１１９）プラスミドＤＮＡを用いて、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ　−３ａｌ　Ｉフラグメント部分（０，８
ｋｂ）のＳａｔ　Ｉ部位からの欠失を行なった。ｐＨ３
（１１９）プラスミドＤＮＡ　５ｘｒ、　Ｓｍａ　Ｉ　
　（宝酒造；１２ユニット／ｄ＞１ｕｌ、Ｓａｃ　Ｉ　
１１．１０ｘＳｍａＩ緩衝液ＤＯＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ８，０）　、７０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、２００ｍ
Ｍ　ＫＣＩ　。

７０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、０．１％ウシ
血清アルブミン〕２ＩＪ１滅菌蒸留水を加え２０Ｉとし
、３７℃で１時間保温した後、６５℃、１０分で酵素を
失活させることにより、ｐＨ３（１１９）プラスミドＤ
ＮＡを消化し、次に欠失操作を行なった。得られた欠失
クローンｐＤＥＬ−６，ｐＤＥＬ−７，ｐＤＥＬ−８及
びｐＤＥＬ−９を第１２図に示す。

また、ｐＨ３（＋）プラスミドＤＮＡを用いて、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ　−３ａｌ　Ｉフラグメント部分（０，８ｋｂ
）のＨｉｎｄＩＩＩ部位からの欠失を行なった。ｐＨ３
（＋）プラスミドＤＮＡを旧ｎｄＩＩＩとＰｓｔ　Ｉで
消化後、ｐＫＨ（＋）プラスミドＤＮＡの欠失を行なっ
たときと同じ条件下で欠失をおこなった。得られた欠失
クローンｐＤＥＬ−１０，ｐＤＥＬ−１１，ｐＤＥＬ−
１２及びｐＤＥＬ−１３を第１３図に示す。

これらのプラスミドを用いて、塩基配列の決定をおこな
った。塩基配列の決定は、ＳＥＱ［ＩＥＮＡＳＥ　ＯＮ
＾５ＥＱＵＥＮＣＩＮＧ　ＫＩＴ　（Ｕ　Ｓ　８社）を
用いて、メーカーのプロトコルに従いおこなった。塩基
配列決定のストラテジーを第１４図に示し、そしてＰＤ
Ｉ遺伝子の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列を第１
５図に示す。

決定されたクローン化ＤＮＡの塩基配列から１つの大き
なオープンリーディングフレームが存在することが分か
った。このクローン中では、二〇オープリーディングフ
レームは６４７個のヌクレオチドからなる５′隣接領域
と２４９個のヌクレオチドからなる３′隣接領域によっ
てはさまれている。

この読み取り枠からコードされる蛋白質は、５２６個の
アミノ酸からなる。

クローン化された酵母ジスルフィド異性化酵素の遺伝子
の配列及びそれから推定された蛋白質のアミノ酸配列か
ら以下のことが確認された。

ｌ）該酵母ジスルフィド異性化酵素は哺乳動物から精製
・同定されたＰＤＩと相同性を示す。

２）＠乳動物のＰＤＩと同様チオレドキシンのジスルフ
ィド還元酵素としての活性部位（ＷＣＧＰＣＫ）と相同
な配列（ＷＣＧＨＣに）が２力所分子内に存在する。

ヒト、ウシ、ラット、酵母ＰＤＩのアミノ酸配列を比較
すると相同性を示す領域はこのヘキサマーよりも広く考
えることができる。すなわち、Ｆ／Ｙ　Ｙ　／ＦＡＰＷ
ＣＧＨＫＸＬＡＰ　（７）配列が相同配列として、各種
のＰＤＩ分子中に２個存在しており、その相対的な配置
も哺乳動物のＰＤＩと酵母のＰＤＩとでは変わらない。

この領域以外には哺乳動物のＰＤＩと酵母のＰＤＩのア
ミノ酸配列の間で高い相同性を示す領域は見いだせない
。さらに、この相同配列以外に存在するシス残基は哺乳
動物ＰＤＩでシグナルペプチド内にあるものも含め３個
、酵母ＰＤＩでは成熟蛋白質分子内に３個あり、哺乳動
物ＰＤＩも酵母ＰＤＩも有するとしてもあと１個のジス
ルフィド結合を有するのみである。ただし、相同配列内
にないシス残基は哺乳動物ＰＤＩと酵母ＰＤＩＯ間では
互いに相同的な位置にはなく、これらのうちの２個がジ
スルフィド結合しているとしても、酵素活性としてのジ
スルフィド異性化に関与していることは考えにくい。

３）カルボキシル末端に酵母の１群のＥＲ内腔蛋白質の
カルボキシル末端に特徴的な配列であるＨＤＥＬが存在
する。哺乳動物のＰＤＩのカルボキシル末端はＫＤＥＬ
である（Ｍｕｎｒｏ、　Ｓ、＆　Ｐｅｌｈａｍ、　Ｈ，
ＲｏＢ。

Ｃｅ１ｌ　４８．８９９−９０７．１９８７）　、　：
＝の特徴的なＥＲ内腔蛋白質のカルボキシル末端の配列
は、これらの蛋白質がＥＲからサルベージコンパートメ
ント（あるいはｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｃｏｍｐａ
ｒｔｍｅｎｔ）に−時的に移行し、またＥＲへと戻って
来ることを保証するシグナルで、ＥＲ内腔からサルベー
ジコンパートメントへ、そしてサルベージコンパートメ
ントからＥＲ内腔への移行にはこのシグナルを認識する
レセプターが関与することが指摘されている（Ｖａｕｘ
、　Ｄ、、　Ｔｏｏｚｅ、　Ｊ、　＆　Ｆｕｌｌｅｒ、
　Ｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４５゜４９５−５０２．１９
９０　；Ｓｅｍｅｎｚａ、　Ｊ、Ｃ，、Ｈａｒｄｗｉｃ
ｋ、に、Ｇ、。

Ｄｅａｎ、　Ｎ、　＆　Ｐｅｌｈａｍ、　ＨｏＲ，Ｂ、
Ｃｅ１ｌ　６１．１３４９−１３５７゜１９９０）　、
同じ酵母類でもＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔ
ｉｓのＥＲ内腔蛋白質であ°るＢ　ｉ　Ｐ　（ＧＲＰ７
８）はカルボキシル末端にＤＤＥＬを持ち（Ｌｅｗｉｓ
、　Ｍ、Ｊ、、　Ｓｗｅｅｔ、　Ｄ、Ｊ。

＆　Ｐｅｌｈａｍ、　）１．Ｒ，Ｂ、Ｃｅ１ｌ　６１．
１３５９−１３６３．１９９０）、一方Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢｉＰ（ＫＡＲ
２蛋白質）は本発明で明らかにされたＰＤＩと同じＨＤ
ＥＬであることが報告されている（Ｒｏｓｅ、　Ｍ、Ｄ
、、　Ｍｉｓｒａ。

ＬｌＭ、、　＆　Ｖｏｇｅｌ、　Ｊ、Ｐ、Ｃｅ１ｌ　５
７．１２１１−１２２１．１９８９　；Ｎｏｒｍｉｎｇ
ｔｏｎ、　Ｋ、、　Ｋｏｈｎｏ、　Ｋ、、　Ｋｏｚｕｔ
ｓｕｍｉ、　Ｙ、。

Ｇｅｔｈｉｎｇ、　Ｍ、−Ｊ、　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ
、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　５７．１２２３−１２３６、　１９
８９）　。さら１こ、Ｋ、１ａｃｔｉｓでは、ＤＤＥＬ
もＨＤＢＬもともに認識され、これらのシグナルを持っ
た蛋白質はどちらもサルベージ経路で移行されるが、Ｓ
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ＤＤＥＬは認識されない
ことが示されている（ｌｅｗｉｓら、１９９０）　、ま
た、ネズミのＥＲ内腔蛋白質の１種である分子量７２ｋ
ＤａｌのＰＤＩと相同的な蛋白質（ＥＲｐ’７２）のカ
ルボキシル末端はＫｆＥＥＬであり（Ｍａｚｚａｒｅｌ
ｌａ、　Ｒ，Ａ、、　５ｒｉｎｉｖａｓａｎ。

Ｍ、、　Ｈａｕｇｅｊｏｒｄｅｎ、　Ｓ、Ｍ、　＆　Ｇ
ｒｅｅｎ、　Ｍ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６５、１０９４−１１０１．１９９０）　、ラットの
ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣの１つのイソ
酵素のカルボキシル末端はＱＤＥＬである（Ｂｅｎｎｅ
ｔｔ、　Ｃ０Ｆ、。

Ｂａ１ｃａｒｅｋ、　ＪｏＭ、、　Ｖａｒｒｉｃｈｉｏ
、　Ａ、　＆　Ｃｒｏｏｋｅ、　Ｓ、Ｔ。

Ｎａｔｕｒｅ　３３４．２６８−２７０．１９８８）　
ｏ膜との相互作用が推定されているが、この蛋白質の局
在部位はまだ決定されていない。カルボキシル末端にあ
るこれらのシグナルＸＥＤＬのＸ残基がサルベージレセ
プター（またはその１成分）によって特異的に認識され
ている可能性がある。また、マラリア原虫であるＰｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＧＲＰ７ｇに
相同な蛋白質のカルボキシル末端はＤＥＬのみが相同的
であり（ＳＤＥＬという配列になっている）、このＥＲ
保留シグナルのＸ残基が正に荷電したアミノ酸でない場
合、この蛋白質の局在にどういう影響を与えるのか、ま
たマラリア原生は哺乳動物とは異なったシグナルを蛋白
質の特定器官保留に使うのか、まだ分かっていない（Ｋ
ｕｍａｒ、　Ｎ、、　５ｙｉｎ、　Ｃ，、Ｃａｒｔｅｒ
。

Ｒｏ、　Ｑｕａｋｙｉ、　１．＆　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｌ
、Ｈ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．６２７７−６２８１．１９８
８＞。

４）遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ末端に２
２アミノ酸からなる疎水性に富む配列があり、いくつか
の配列上の特徴が、シグナルペプチドの特徴に酷似する
ニアミノ末端に非常に近い位置に正電荷を有するアミノ
酸がある（この場合リシン）、それに続いて一連の疎水
性のアミノ酸（脂質二重層膜の長さに及ぶのに充分な数
のアミノ酸が必要らしく、最低９個の疎水性アミノ酸か
らなる）が連なりα−へリックスを形成する（この場合
１３個のアミノ酸からなる疎水性領域がある）、この疎
水性コア領域の後にα−へリックスを壊すアミノ酸（プ
ロリン、グリシン、セリン、スレオニン、など）が続く
　（この場合２個のセリンが疎水性アミノ酸領域に続い
ている）、プロセシングされるシグナルペプチドのカル
ボキシル末端には側鎖の小さなアミノ酸（アラニン、グ
リシン）が位置する（この場合、アラニン）。精製され
た酵母ＰＤＩのアミノ末端はなんらかの形で修飾されて
いることが考えられ、エドマン分解法を用いた配列決定
によっては、その同定はできなかった。

しかし、アミノ末端断片と考えられるペプチドフラグメ
ントのアミノ酸分析を行ったところ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−
Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｕ−
Ｔｙｒ−１１ｅ−なる配列が存在することが確認され、
精製酵母ＰＤＩのアミノ末端は、この配列よりアミノ末
端側であると考えられる。いままで知られているシグナ
ルペプチダーゼの切断点から予測すると、オープンリー
ディングフレームの塩基配列から推定される蛋白質の２
３番目のアミノ酸であるグルタミンが酵母ＰＤＩのアミ
ノ末端アミノ酸である可能性が高い。

従って、オーブンリーディングフレームからコードされ
る蛋白質は、２２個のアミノ酸からなるリーダーペプチ
ドを有する前駆体蛋白質であると考えられる。哺乳動物
のＰＤＩはＥＲ内腔に局在し、細胞質で合成され、その
アミン末端側にあるシグナルペプチドを利用してＥＲへ
移行し、その過程でこのシグナルペプチドは切断除去さ
れることが知られている。また哺乳動物のＰＤＩやＢｉ
Ｐのカルボキシル末端に存在するＫＤＥＬ配列はサルベ
ージ経路に乗ってこれらのＥＲ蛋白質が移動するための
シグナルとして働くことが示されているが、酵母のＢｉ
Ｐ相同蛋白質であるＫＡＲ２蛋白質のカルボキシル末端
にはこのＫＤＥＬと相同的な働きをするＨＤＥＬ配列が
あり、今回我々が同定した酵母ＰＤＩのカルボキシル末
端にも同じＨＤＥＬ配列がある。

さらに、酵母ＰＤＩの成熟蛋白質分子内には、ＥＲ内で
起こるとされているＮ−グリコシレージョンのための認
識配列として機能することが知られているＡｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ　（Ｓｅｒ）配列が多くみられ、実際、精製酵母
ＰＤＩはエンドグリコシダーゼＨ感受性の糖鎖を結合し
ていることも確認されている。これらの事を総合すると
、酵母ＰＤＩはまず、細胞質で２２個のシグナルペプチ
ドを含む５２６個のアミノ酸からなる前駆体として合成
され、次にＥＲへ移行する過程でシグナルペプチドが切
断除去され、ＥＲ内に移行してＮ−グリコシレージョン
を受けるものと考えられる。

５）哺乳動物のＰＤＩにはＮ−グリコシレージョンの際
の認識配列となるＡｓｎ−Ｘ−３ｅｒ　（Ｔｈｒ）配列
が１カ所もないのに対して、酵母ＰＤＩ分子内には５カ
所もあり、エンドグリコシダーゼＨ処理により、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により分子量が
約７．０００減少するという結果と一致して、酵母では
ＰＤＩは糖鎖が結合した糖蛋白質として存在していると
考えられる。エンドグリコシダーゼＨ処理をしても推測
される成熟酵母ＰＤＩ蛋白質の分子量よりもまだ大きい
が、これはエンドグリコシダーゼ処理がまだ不完全であ
るか、またはＮ−グリコシレージョン以外の糖鎖修飾す
なわち０−１１ｎｋｅｄグリコレ−ジョンを受けている
可能性もある。ＨＤＥＬをカルボキシル末端に持つもう
１つのＥＲ内腔蛋白質であるＫＡＲ２蛋白質の場合には
、Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ　（Ｔｈｒ）配列が１カ所もな（
、Ｎ−グリコシレージョンは受けないことが示唆される
。

６）酵母ＰＤＩの遺伝子の５′隣接領域には、転写制御
に関係すると考えられるシスの配列がいくつか存在し、
この遺伝子の発現が複雑な制御を受けていることが示唆
される。まず何よりも特徴的なことは、−２９０から始
まる配列ＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＴが真核生物の熱シヨツ
ク要素配列（）ＩＳＥ）のコンセンサス配列ＴＴＣＮＮ
ＧＡＡＮＮＴＴＣＮＮＧＡＡの中央部分の配列と一致す
ることである。哺乳類のＰＤＩの発現は熱誘導性でなく
、遺伝子の上流にはＨ３Ｅコンセンサス配列と相同な配
列は見いだせない。同様のＩＳＥは、酵母のＥＲ内腔蛋
白質の１種であるＫＡＲ２蛋白質（ＢｉＰ／ＧＲＰ７８
と同じ）の遺伝子の上流にも認められる。これらの事実
は、哺乳動物の一群のＥＲ内腔蛋白質（カルボキシル末
端にＫＤＥＬ配列を持ち、サルベージ経路にのってＥＲ
とサルベージコンパートメントの間を移行する）と異な
り、酵母の一群のＥＲ内腔蛋白質（カルボキシル末端に
ＨＤＥＬ配列を持ち、サルベージ経路にのってＥＲとサ
ルベージコンパートメントの間を移行する）の発現は、
熱誘導性であることが示唆される。

転写の正の制御配列の１つであるＣ、ＣＡＡＴボックス
は−２０２〜−１９８に存在する。酵母の多くの遺伝子
の上流にみられるＣＴのみからなる配列ＣＴブロックは
−２３６〜−２１７に見られる。ＴＡＴＡボックスは−
１２８〜−１０１までの間にＴＡＴＡの配列が連続して
繰り返した特異な構造をしており、このようなＴＡＴＡ
ボックスの構造は、酵母の熱シヨツク蛋白質の１種であ
るｃｈａｐｅｒｏｎ　Ｈ３Ｐ６０の遺伝子の上流域にも
見られ、この場合はより短いＴＡＴＡＴＡＴＡという配
列である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５溶出物をＤＥＡＥ
　５ｅｐｈａｃｅｌ陰イオン交換カラムにより分離した
場合の溶出の状態を示す。 第２図は、前言己ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌからの溶出
液の活性画分をＢ［ＩＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ疎水
性カラムにより分離した場合の溶出の状態を示す。 第３図は、前記ＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラム
からの溶出液の活性画分をＰｈｅｎｙｌ　５Ｐ％１疎水
性カラムを用いる高性能液体クロマ゛トゲラフイーによ
り精製した場合の溶出の状態を示す。 第４図は、酵母ＰＤＩの５ＤＳ−ポリアクリルアミド濃
度勾配ゲル電気泳動図である。 第５図は、酵母ＰＤＩの等電点電気泳動図である。 第６図は、精製された蛋白質がアクアポアＲＰ３００逆
相カラムにおいて均一であることを示す溶出曲線である
。 第７図は、精製された酵素の活性とＩ）Ｈとの関係を示
すグラフである。 第８図は、本発明の酵素蛋白質の糖鎖がエンドグルコシ
ダーゼＨにより除去されることを示す電気泳動図である
。 第９図は、本発明の酵素蛋白質の部分をコードしている
と予想される２個の酵母ゲノムＤＮＡフラグメントの制
限酵素地図を示す。 第１０図〜第１３図は、塩基配列の決定のためにＤＮＡ
断片を短縮した状態を示す。 第１４図は、第９図におけるＡｐａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ
　　（４，０ｋｂ）断片中のｐｓｔ　Ｉから、ＥｃｏＲ
Ｉ　−ＨｌｎｄＩ［Ｉ　（３，５ｋｂ）断片中のＡｐａ
工に近い方のＫｐｎ　Ｉまで（第９図に示すＰｓｔ　Ｉ
　−Ｋｐｎ　Ｉ領域）の塩基配列の決定のストラテジー
を示す。 第１５図は、第９図に示す領域の塩基配列及び対応する
アミノ酸配列を示す。 第２図 保持時間（分） 第３図 第４０ １２　　（者５０ レーン１：分子量マーカー レーン３：エンドグリコシグーゼＨ 処理後のＰＤＩ 弗１３幽 ａｏ　　　　　　　　　の　　　　　　　　１）　　　
　　　　ののＣＩＯＣ’−Ｉ　Ｆ’− トｅ’−６ｏ　　　　　　　ＣＩＯ ←Φ口ｃ−）口のωロロＣ←−く１ ０−のト１０←−囚ヒω−一 ←ω　８１ｍ　（−一（ニー−＾ −−ロ　　ｈ　　　　　ロ　　−　　　　　ω　　Ｑ　
　　　　　４ｅ−４：　Φ　　　　ロ　−　　　　ｃ−
）Ｃ−；　　　　←　へロ　（ロ　Ｃ←　（／ｌ　　　
　？　　Ｉ−Ｌ’　　−一　　〇　　　　　（ロ　　　
　　ＣＪＨ−ｔ：　　　仁　　　　　←　　１←−（Ｊ
ｌ、、　　（ω　（−＜ｔ （−ｃ＋）！：１−（（υＣ０１ 口ｅ　　ｌ−Ｗ　　ＣＪ　ｅｔ　　ω−←Ｖく−　←−
（Ｃ６ヒー　Ｕ ＣＪ　ｕ　　（−（（Ｃ５＞　　Ｃｊ　−ω輻　−＝　
←−←ω　←− ロー（Φ　←ｆＩ！　　←−←「 口＜（（ロ＞＜−ｃ５： Ｃ５：５膿ωψ口←偽りローロ←− ←ａ）ωく・−ロ（Φ−−−の←！ ←−ω＝ｍ　（Ｊ　（ｍ　１＋Ｉ（ｍ　Ｃ＋：Ｉ＋−ロ
ー（コ　　　　　ω　　−ロ　　り　　　　　−一、−
ＬＪ　１（−Ｃ５０（−＠− ＜　１−　　！　（ｊ　　＜　Ｃ／Ｉ　　Ｃ５（Ｊ　　
Ｃｊ　−←Ｃロ←　Ｌ）α　ω−Ｕ ←−←−（ψ　−−←１− ＜−＜本　（＜　　Ｃｊ　（Ｃ！？１　：（Φ　←−←
叱 Ｃ−Ｊｃ　上気　（：　＞　　ＣＪ　１ＣＪ　−くψ （〈　←−＜−＜←　Ｃ５＋＋ ４：ｍ　　Ｃ５コ　ｃ＋）ロ　く−ロロ＜　＞　　１＋
Ｇ　　←ｊ　　Ｃ５１＋　　Ｃ＋＋　”く−　ω−Ｉ＋
−＜（ｃ＋Ｊ＋：１− 霊−！８３３宮珪土二日！目ｇニ 一り　　ζり −ｅ　　　　％　　　　　　　　ＬＪ　　　　−←−耀
！：　定態　−一　上品 ←　　　− ロ〉ｃ＋Ｊロ　く−０口 ４：　　コ　　　　　乙ｊ　　ζ　　　　　Ｃコ　　　
　　Φ　　り　　　　　く　　＝＃３　　乏選　　に３
　　二；　　６−−−　　ζり ４：　　コ　　　　−　　＆、　　　　　ＣＪＩｍ　　
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質： （１）ジスルフィド結合の異性化を触媒する；（２）Ｎ
   ａＤｏｄＳＯ＿４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
   おいて約７０，０００の分子量を示す；（３）等電点電
   気泳動において約４．１の等電点を示す； （４）エンドグリコシダーゼＨ処理により分子量が約６
   ３，０００となる；及び （５）ジスルフィド異性化活性の至適ｐＨが約８．７５
   である； を有する酵母由来の蛋白質。 ２、第１５図に示すアミノ酸配列を有する請求項１に記
   載の蛋白質。 ３、請求項１に記載の蛋白質の製造方法であって、酵母
   菌体から該蛋白質を単離することを特徴とする方法。 ４、請求項１に記載の蛋白質をコードする遺伝子。 ５、第１５図に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列
   を有する、請求項４に記載の遺伝子。