JPH04158800A - 非ａ非ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法及び検出用試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出
方法並びに検出用試薬に関する。詳しくは血液伝播性非
Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするＤＮＡ配列
の全部又は一部を用いることを特徴とする血液伝播性非
Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法並びに検出用試薬
に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ウィル
ス性肝炎のうちＡ型及びＢ型についてはすでにそのウィ
ルスが発見され免疫学的な方法による診断も可能となっ
ており、これらのウィルスに対するワクチンも開発され
ている。しかしながらＡ型でもなくＢ型でもないいわゆ
る非Ａ非Ｂ型といわれる肝炎に関しては病因ウィルス量
が生体内で極めて微量であるため実体が明らかにされて
いないのが現状である。血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎は輸
血後肝炎の９０％以上を占め、輸血をうけた人の１０〜
２０％にこの肝炎が発症する〔実験医学７巻、１９６−
２０１（１９８９）　）。

血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎に関連した抗原蛋白質の検索
はいくつかの研究者により患者の血液を材料として展開
されている６例えばＣｈｏｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ。

２４４巻、３５９−３６２　（１９８９）　）及びヨー
ロッパ出願公開０３１８２１６　Ａｌにより血液伝播性
非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血液をチンパンジーに移入して感
染させた後その血清からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡが
ら調製されるｃＤＮＡライブラリーより非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルス遺伝子の一部を単離した旨の報告がなされてい
る。このウィルス遺伝子断片を基にして作られた免疫学
的手法による診断試薬を用いて我国の血液サンプル試験
の結果非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに感染した血液を６０〜
７０％の確率で診断できるとの報告もされている（厚生
省肝炎研究連絡協議会報告１９８９．３．１３）。

一方、特開昭６４−２５７６には、非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血液をチンパンジーに移入して感染させた後、その肝細
胞からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを用いて非Ａ非Ｂ型
肝炎特異的抗原蛋白質遺伝子をクローン化した旨述べら
れている。

前者においては診断試薬の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス感染
血液に対する診断確率が低いこと、又該報告者がその論
文中でも述べている如くクローン化された遺伝子が血液
伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の想定塩基数に比
べ充分な数でないこと、血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスは２種以上存在する可能性のあることなどを考え合
せると得られた知見はきわめて不十分なものである。

後者においてはクローン化された遺伝子がヒト非Ａ非Ｂ
型肝炎特異的である直接的証拠が示されていない。

上記いずれの場合にもチンパンジーを介して得られたＲ
ＮＡが使用されており、ヒト血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎
ヒト患者から直接的にＲＮＡを抽出したものではないた
め、クローン化されたＤＮＡがヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスの遺伝子を忠実に反映しているか否か明らかでな（
、確度の高い診断試薬さらにはワクチン開発が要望され
ていることを考えると新たなアプローチが必須である。

そのひとつとして本発明者の１人はすてに非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血液より直接ＲＮＡを抽出し、本発明人が後述す
る方法を用いてその成果を報告している〔実験医学７巻
、１９６−２０１（１９８９）　）。

本発明者は鋭意研究を行った結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者
の肝細胞、または血液から直接ＲＮＡを抽出し、このＲ
ＮＡに基づいて血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋
白質をコードするＤＮＡのクローニングに成功し、それ
らのＤＮＡを大腸菌にて発現することに成功した。この
様にして得られた非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質は、
血液試料あるいは組織試料を用いて、これらの抗原蛋白
質に対する抗体を測定することによる非Ａ非Ｂ型肝炎の
診断に有用な試薬となる。

一方、Ｂ型肝炎においてはウィルス抗原蛋白質に対する
抗体の出現時期、あるいはその量は患者の経過により異
なり、また抗原蛋白質の種類においても異なる。−船釣
に、感染初期には抗体の出現はなく、約３カ月以降にＨ
Ｂｃ（Ｂ型肝炎ウィルスコア蛋白）　、ＨＢｅ（Ｂ型肝
炎ウィルスエンベロープ蛋白）に対する抗体が出現し、
さらに数カ月後、ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）
抗体が出現すると言われている（鈴木宏編、肝炎、南雲
堂、１９８９）。

非Ａ非Ｂ型肝炎においても、ある特定の抗体の出現とそ
の抗原遺伝子の存在が必ずしも一致しないと言う報告が
ある（Ａ、ＪＪｅｉｎｅｒらＬａｎｃｅｔ　３３５巻１
頁（１９９０）　；　Ｊ、Ａ、ＧａｒｓｏｎらＬａｎｃ
ｅｔ　３３５巻１４１９頁（１９９０）　）。

以上のことを考慮すると、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの存
在を直接確かめることによる、非Ａ非Ｂ型肝炎の確定診
断法の開発が望まれる。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者は非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在を直接判
定する手段として、本発明者がクローニングに成功した
ＤＮＡクローンの塩基配列に基づくプローブ及び／又は
プライマーを利用することにより、非Ａ非Ｂ型肝炎特異
的遺伝子の検出が可能との知見を得、それに基づき本発
明を完成した。

即ち本発明はプライマーを用いた特異的な遺伝子増幅法
とプローブを用いたハイブリダイゼーション（二本鎖形
成）法による非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出法にお
いて、第１表に示すファージクローンのいずれかに挿入
されているｃＤＮＡの塩基配列又はその一部をプローブ
及び／又はプライマーとして用いることを特徴とする非
Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法及びそのための試
薬に関する。

（具体的な説明〕 本発明におけるプローブ及び／又はプライマーを用いた
非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出法は、核酸の分子ハ
イブリダイゼーション（二本鎖形成）の原理（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　Ｔ、等Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）に基づい
ている。

この方法によれば、変性させた核酸試料に外来性ヌクレ
オチドＩＭ　（プローブ）を導入した際、これらの変性
した核酸と相補的な配列部分に外来性プローブが結合し
二本鎖を生じる。この反応はその核酸がＲＮＡでもＤＮ
Ａでも原理的には同じである。しかし、生した二本鎖の
安定性の程度は、この二本鎖内の核酸配列の相補性の程
度により異なる。従って効率よく非Ａ非Ｂ型肝炎特異的
遺伝子の検出を行なうには、検定される核酸試料に対し
て極めて特異的に二本鎖形成するプローブ及び／又はプ
ライマーを用いることが重要となる。

二本鎖形成の条件はこの分野において用いられている参
考書等（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃ１ｏｎｉｎｇ９．４７．　１１．４５．　　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）　）に詳細に述べられている
が、いずれにしても用いるプローブ又はプライマーが検
定される核酸試料の塩基配列に特異的であり、鎖長が十
分長ければ、他の類縁核酸配列とは区別して特異的かつ
安定な二本鎖形成が達成され、例えばプローブに標識さ
れた物質（色素、化学発光物質あるいは放射性物質）を
適宜測定して、与えられた核酸試料中に特異的な核酸配
列の存在を確定することができる。

非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスあるいは特異的核酸は、血液や
組織中に極微量にしか存在しないと言われている。この
ような微量の核酸を同定する場合、それらの核酸を直接
上記の如くのプローブにて検出することは回能が伴う。

従ってこのような場合、特異的な配列からなるプライマ
ーを用いて標的とする核酸を増幅したのち、プローブと
二本鎖形成することにより、より鋭敏に目的核酸を同定
することができる。また、前記の如きプライマーを用い
て標的とする核酸を十分に増幅したのち、エチジウムブ
ロマイド等を用いて核酸を染色することにより目的の核
酸を同定することもできる。このような核酸の遺伝子増
幅法は既にいくつかの方法が知られており（実験医学Ｖ
ｏ１．８　Ｎｏ、９（１９９０）羊土社ＰＣＲとその応
用）、それらの遺伝子増幅方法を適用できる。

本発明者は、先にも述べた如く、非Ａ非Ｂ型肝炎内来肝
癌患者の肝細胞及び血液試料を基にして非Ａ非Ｂ型肝炎
特異的抗原蛋白をコードするＤＮＡクローン６１個を単
離することに成功している。

これらのＤＮＡクローンは第１表に示すとおりであり、
それぞれファージに挿入して組換えファージλＩＣとし
て微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託
してあり、更にその一部はブダペスト条約に基づき国際
寄託しである。

以下余白 １−上−１ λＨＣ４３２１０８９７ λＨＣ４３６１０８９８ λＨＣ５１２１０８４１２９５１ λＨＣ５２２１０８４２ λＩＣ５２４１０８４３ λＨＣ５２６１０８４４ λＨＣ２２０６１０８４５２９５２ λＨＣ２２０７１０８４６２９５３ λＩＣ２２１１１０８７６２９５６ λＨＣ２２１６１０８７７２９５７ λＨＣ２２１７１０８５２ λＩＣ２２２０１０８５３２９５４ λＨＣ２２２５１０８５４ λＨＣ２４０４Ｃ１０８９９ λＨＣ２４０５Ｂ　　　　　　　１０９００λＩＣ２４
１０Ａ　　　　　　　１０９０５茅−」−一部（続き） λＨＣ２４１００１０９３４ λＨＣ２４１３１０９１９ λＩＣ２４１４Ａ　　　　　　　１０９０６λＨＣ２４
２４Ａ　　　　　　　１０９１１λＨＣ２５０１１０９
２０ λＨＣ２５０２１０８４７ λＩＣ２５０５１０９２１ λＨＣ２５０７１０９３５ λＨＣ２５０８１０８５９ λＩ（Ｃ２５０９１０９３６ λＨＣ２５１２１０８８２ λＦＩＣ２５１４１０８６０ λＨＣ２５１６１０８６１ λＩ（Ｃ２５３３１０９０７２９６３ λＨＣ２５３４１０９３７ λＨＣ２５３５１０８８３ 里−」−一部（続き） λＨＣ２６０３８１０９２２ λＨＣ２６０７１０９０９２９６４ λＩＣ２２３０１０９１６２９６６ λＨＣ２２３２１０９３０２９６８ λＨＣ２２３９１０９３１ λ）ＩＣ２２４０１０８５５ λＨＣ２２４１１０８５６ λＦＩＣ２２４２１０８５７ λＩＣ２２４３１０８７８ λＨＣ２２４４１０８７９２９５８ λＨＣ２２４６１０８５８２９５５ λＩＣ２２４８１０８８０２９５９ λＩＣ２２４９１０９１７ λＦＩＣ２２５０１０９０４ λＨＣ２２５２１０８８１ λｌ（Ｃ２２５５１０８８９ λｌ（Ｃ２２５６１０８９０２９６０ １−」−一部（続き） λＨＣ２２５８１０８９１２９６１ λ）ＩＣ２２５９１０８９２ λＨＣ２２６３１０８９３ λＨＣ２２６４１０９３２ λＨＣ２２６５１０９３３ λＨＣ２２６８１０８９４ λＩＣ２２７０１０８９５２９６２ λＨＣ２２７１１０８９６ λＨＣ２６０８１０９２３ これらの各クローンに含まれるｃＤＮＡのコードする蛋
白質の血清学的反応は、きわめて非Ａ非Ｂ型肝炎特異的
であったことから、これらのクローンに含まれるＤＮＡ
配列は非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス自身の一部か、密接に関
連した核酸であるといえる。従って、第１表に示すクロ
ーンのいずれかに含まれるＤＮＡ配列またはその一部あ
るいはこのＤＮＡに対応するＲＮＡは、ＤＮＡ−ＤＮＡ
、　ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイ
ゼーションに基づく非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出
法において、きわめて特異性の高いプローブになりうる
。また第１表のクローンのいずれかに含まれるＤＮＡ配
列の一部およびそれらの相補鎖は、遺伝子増幅法におけ
るプライマーとなる。

これらのファージクローンの内、国際寄託されている１
８株については、そのｃＤＮＡ挿入部の塩基配列が第１
図〜第１８図に示されている。これらの配列の相互の相
同性を比較し相同性の高いｃＤＮＡの塩基配列を並置し
たものを第１９図Ａ及び第１９図Ｂに示す、この様な塩
基配列の比較から、これらのクローンは、限られた一定
の領域をコードしていることが明らかである。例えば、
クローンλＩ（Ｃ２２５６゜λＨＣ２２０７およびλＨ
Ｃ２２４４は一部分で重なっており、またλＨＣ２２３
２、λ）ＩＣ２２３０、λＨＣ２２０６。

λＨＣ２２５８、λＨＣ２２４８、λＨＣ２２２０、λ
ＨＣ２２１６。

λＩＣ２２４６及びλＩＣ２２１１はほとんど重なって
いる。

しかしながら、このクローンの塩基配列が対応している
部分は、それらの塩基配列が必ずしも同一ではなく、か
なりの変異が存在する。従って、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的
遺伝子を検出するためのプローブ又は肝炎特異的遺伝子
増幅用のプライマーとしては、できるだけ広範な変異体
とハイブリダイズし得るプローブ又はプライマーを使用
するのが好ましい。このためには、各クローンの上記配
列の内、変異の少ない塩基配列部分を用いればよい。

この様な塩基配列部分を選択するには、例えば第９図Ａ
及び第９図Ｂ中の対応する２種類以上の塩基配列が示さ
れている領域において、任意に２種類の塩基配列を選択
してそれらの間の塩基配列の相同性を調べ、上記２種類
の塩基配列をどのように選択しても相同性が所定の値以
上である様な領域を選択すればよい。この欅な相同性の
程度は８０％以上であり、好ましくは９０％以上であり
、そしてさらに好ましくは９５％以上である。上記の様
な条件を満たす相同性領域の長さは一般に２５ｍｅｒ以
上であり、好ましくは３０ｍｅｒ以上である。

この様な観点から、プローブ用の塩基配列を選択すれば
、例えば、第９図Ａにおいては、λＩＣ２２５６とλＨ
Ｃ２２０７の共通部分として、塩基番号３００番から３
４３番、３４８番から４１２番、４１４番から４４２番
、４５３番から４８５番、及び４９８番から５２６番、
また、λＤＣ２２５６、λＨＣ２２０７及びλＩ（Ｃ２
２４４の共通部分として、６７８番から７０３番、７１
４番から７３９番、７８３番から８４７番、さらには８
５４番から８８４番の塩基配列が挙げられる。さらに、
２７７番から３０７番の配列においては、２９９番の塩
基がλＨＣ２２５６ではＴ１λＨＣ２２０７ではＡとな
っている。また７５０番から７８１番の配列においては
、７５８番の塩基がλＨＣ２２５６ではＣ１λＨＣ２２
０７およびλＨＣ２２４４ではどちらもＴとなっている
。この場合、前者の場合は２９９番の塩基がＡ、また後
者の場合は７５８番の塩基がＴとなるようなプローブを
作製して用いても、３０ｒｓｅｔのプローブならばミス
マツチの率が約３，３％となり、λＨＣ２２５６は十分
に検出可能である。同様に、第１９図Ｂに示した９クロ
ーンの領域において、同じ様な考え方を適用すると、こ
れらの９クローンの塩基配列上に３０ｒｓｅｔ以上の長
さですべて共通の一致した配列は存在しない。しかしな
がら、１番から３０番の３０■ｅｒの配列、２２番から
５０番の２９■ｅｒの配列、６７番から１１３番の４７
■ｅｒの配列、１５５番から１９１番の３７■ｅｒの配
列、２２６番から２６６番の４１ｉｅｒの配列、２９６
番から３３２番の３１■ｅｒの配列、３４０番から３７
１番の３２１１１ｅｒの配列、３６１番から４４３番の
８３■ｅｒの配列などは比較的変異が少ない。比較的変
異の少ない配列としてはこれらの他、取り方によって例
えば２３５番から２６９番の配列も比較的変異の少ない
配列として取ることができるので、上記に示した配列は
一例であることが容易に理解される。これらの配列の中
で、例えば、２２番から５０番の配列を見ると、２７番
の位置ではλＨＣ２２４６のみがＡとなっており他のク
ローンではＧ、３１番ではλＩＣ２２４８゜λＨＣ２２
２０およびλＨＣ２２１６がＴとなっており他はＣ１３
３番ではλＨＣ２２１１のみがＡで他はＧとなっている
。各クローンの間ではお互いに１塩基の違いになってい
ることから、ミスマツチの率は約３．４％におさまるの
で、たとえ完全に一致した共通配列がな（でもプローブ
として十分機能する。

また６７番から１０３番の配列において、プローブとし
てλＨＣ２２０６の配列を選ぶと各クローン間ではそれ
ぞれｌ塩基の違いとなるので、３０ｒｓｅｔ以上の長さ
を持つ有効なプローブを作ることができる。

各クローン間で同し位置にいくつかの変異が起こってい
るような場合には、該当する位置に５−フルオロウラシ
ル（５−ＦＵ）あるいはイノシン（１）塩基を入れるこ
とにより、ハイブリダイゼーションに影響を与えずに、
プローブの機能を維持することができる（Ｙ、Ｔａｋａ
ｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　８２巻１９３１−１９
３５頁（１９８５）　；　Ｔ、Ｋｏｄａｍａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　３４３巻５３１頁（１９９０）　）　、この様
な手法を応用すると、プローブとなりうる場所の範囲は
さらに広げることができる。例えば、第１９図Ａ及びＢ
中の対応する２種類以上の塩基配列が並記されている領
域において、これらの塩基配列相互間で塩基が異る場合
、その異る塩基のいずれが一方を５−フルオロウラシル
又はイノシンにより置換するとして、任意に選択された
２種類の塩基配列間の相同性がいずれの２種類の塩基配
列を選択しても８０％以上であるような２５■ｅｒ以上
の領域を選択し、この領域に属する前記５−フルオロウ
ラシル又はイノシンで置換された塩基配列を有するＤＮ
Ａを用いることができる。この場合、４個以下の塩基の
置換によって上記の条件を満たす領域を用いることが好
ましい。この様な例として、３０１番から３３０番の配
列を例にとると、３０６番、３０９番、３１８番、及び
３２４番に５−ＦＬ、ｌあるいはＩを入れ、３０＋ｓｅ
ｔのプローブを作ることができる。

さらに各クローンの塩基配列の一部分は当然のことなが
ら、それらのクローンを検出するための最適のプローブ
であるが、プローブの長さが充分であれば、ｌ塩基や２
塩基の違いのある標的塩基配列を検出することができる
。もちろん、このようにして選んだプローブの塩基配列
は非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的であることが前提であり、プ
ライマーの選択についても同様に考えられる。プローブ
あるいはプライマーに利用する塩基配列中の塩基の変異
の程度は、特異的な診断に利用することがらプローブあ
るいはプライマーの塩基配列の１０〜１５％以内（すな
わち相同性が８５〜９５％以上）にしておくことが望ま
しい。

実際に、これらのプローブを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎を診
断するには、試料中の核酸とハイブリット形成をしたプ
ローブを検出することが必要であり、そのためにプロー
ブにはしかるべき標識が施されていなければならない。

標識にはさきに述べたように、３２ｐによる放射標識の
ほか、非放射標識もよく知られており（高橋豊三著、Ｄ
ＮＡブローブー技術と応用−、シーエムシー、１９８８
）　、ハイブリダイゼーションの効率を損なわないよう
にして、非放射標識化のための工夫がプローブに施され
ている。例えば、ＤＮＡプローブの塩基配列の塩基と塩
基の間に、化学発光物質あるいは蛍光色素などが結合で
きるような特殊なリンカ−を挿入し、検出効率の高いプ
ローブを作製することもできる（Ａｒｎｏｌｄら、Ｃ１
１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５巻１５８８　
（１９８９）　）。

標的とするＲＮＡあるいはＤＮＡがきわめて微量にしか
存在しないような試料では、それらのＲＮＡあるいはＤ
ＮＡを直接、プローブで検出することは困難な場合があ
る。このような場合、さきに述べたように標的塩基配列
を含む領域を遺伝子増幅して検出することができる。遺
伝子増幅される領域は通常１００塩基以上の長さを持つ
領域で、プライマーを用いて酵素化学的に遺伝子増幅さ
れる。

プローブあるいはプライマーを構築する場合の一つの目
安として、上述の如き指標を示したが本発明にあっては
、必ずしもこの考え方に従うものではなく、この考え方
に合致しないプローブあるいはプライマーであっても、
非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出に使用しうる。第１
９［ｍＡ及び第１９図Ｂに示した各クローンの中から、
好ましいプローブの例を第２表に示した。また、好まし
いプライマーの例としては第３表に示した各塩基配列及
びその相補鎖の塩基配列を挙げることができる。

なお、第２表に示された各プローブの塩基配列中、５で
示された位置は発色物質、蛍光物質、又は化学発光物質
による検出を行う際にその物質を結合するためのリンカ
−挿入位置の例である。これ以外の位置に挿入してもよ
い。

リンカ−はＮｌ２基又はＣ０ＯＨ基等を含み、これらの
基に発色物質、蛍光物質、化学発光物質などを結合させ
ることにより非放射性物質標識プローブを作製できる。

リンカ−は一般に市販されているものが使用でき、例え
ば「アミノモディファイア−Ｕ　Ｊ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃ
ｈ社）「アミノリンクｌ１ｌ（アプライド・ハイオシス
テムズ社）が挙げられる。０ｐによる放射標識プローブ
の場合は５で示したリンカ−はなくてもよい。

以下余白 茅−」し−表 １−」し−表（続き） 名称の末尾にＲの付くものは下流から上流の、Ｒのない
ものは上流から下流のプライマーである。

非Ａ非Ｂ型肝炎特異的な核酸の同定を行うため、血液試
料や組織試料中から核酸を抽出する方法は、例えば前出
’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）’などにも記載され広（知ら
れており、本発明の実施に何ら困難を伴うものではない
。

以下に実施例によって本発明を説明するが、こ熟によっ
て本発明が限定されるものではない。

１ｍ１１　　　　’　　　び　　　　よ　　のＲＮＡ（
７）血清及び肝組織よりのＲＮＡの抽出は、チオシアン
酸グアニジン（ＧＴＣ）を用いてＰ、Ｃｂｏｍｃｚｙｎ
ｓｋｉ等の方法（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｌｌｌｉｓｔｒｙ　１６２巻１５６頁１９８７年）に従
って行った。

血清１ｄに１６０ｐ／の５０％ポリエチレングリコール
４０００と５　Ｍ　ＮａＣｌ　４０ｉｄを加えて混合し
、４°Ｃ１時間静置後、遠心により沈殿を得た。この沈
殿もしくは肝組織１００■を溶液Ｄ（４ＭＧＴＣ１２５
ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７，０，０，５％ザルコシ
ル、１００、ｍＭ２−メルカプトエタノール、）３００
Ｉｌ！に溶解させ、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）　４
５ｍ、水飽和フェノール３００Ｊｌｌ、及びクロロホル
ム・イソアミルアルコール（４９：１）６０Ｉｔｌを加
えてＲＮＡを抽出した。遠心後、水層に２０ｎ／ＩのＧ
ｌｙｃｏｇｅｎ　１　＃と２．５倍量のエタノールを加
えて、−２０°Ｃに静置した後、遠心により沈殿を得た
。この沈殿を８０％エタノールで洗浄することによりＲ
ＮＡを得た。また、血清１００ＩにＣＴＣ溶液１ｉを混
合することによってもＲＮＡを得た。

非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を含む組換えファージのうち、λＨＣ２２３２。

λ）ＩＣ２２３０、λＨＣ２２０６、λＨＣ２２５Ｂ　
、λＨＣ２２４８。

λＨＣ２２２０、λＩＣ２２４６、λＨＣ２２１１及び
λＨＣ２２１６は、ｃＤＮＡの塩基配列に高い相爾性が
認められる。

これらｃＤＮＡに対応する遺伝子を検出するため、各ｃ
ＤＮＡの塩基配列で特に相同性の高い頭載より、下記の
塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマー及びプロー
ブとして合成した。合成はＤＮＡ自動合成機（アプライ
ドバイオシステムズ社；　３８０Ａ型）を用いて行った
。

プライマー（ＰＲ） ＰＲ１：　５　’　−ＣＴＧＣＡＣＡＧＧＴＡＣＧＣＴ
ＣＣＧＧＣ−３’（λＨＣ２２３２に挿入されたｃＤＮ
Ａの３１−５０の塩基配列）ＰＲ２：　５　’　−ＣＴ
ＣＣＴＧＣＧＧＧＡＴＧＡＧＧＴＣＡＣ−３’（λＨＣ
２２３２に挿入されたｃＤＮＡの６１−８０の塩基配列
）ＰＲ３：　　５　’　　−ＧＧＣＧＣＡＧＡＣＡＡＣ
ＴＧＡＣＴＡＧＣ−３’（λＨＣ２２３２に挿入された
ｃＤＮＡの２５０−２６９の塩基配列）ＰＲ４：　５　
’　−ＣＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡ−３
’（λＨＣ２２３２に挿入されたｃＤＮＡの３４０−３
５９の塩基配列）プローブ（ＰＢ） Ｐａ　１　：　５　’　−ＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧ
ＴＧＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＡＴｆ、−３’（λＨＣ
２２５８に挿入されたｃＤＮＡの１１６−１４５の塩基
配列）実施例１にて調製されたＲＮＡとランダムプライ
マー０．５鱈を混合し、常法（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒ
ｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に従い、６５°Ｃ，５分
間アニーリングを行ったのち逆転写酵素（宝酒造）１０
０ユニツトを用いて３７°Ｃ１１時間反応させ、−本鎖
相補Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｓｃＤＮＡ　）を合成した。得られ
た５ｃＤＮＡにプライマーｒＰＲＩＪ及びｒＰＲ４Ｊを
それぞれ１００１００ｐ加え、ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅａ＋　（宝酒造）によりＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ法による遺伝子増
幅を行なった。反応は９２°Ｃ３分間の加熱後、９２°
Ｃ２分間、４０°Ｃ２分間、７２°Ｃ２分間の反応を３
０−４０サイクル繰り返し行なった。

上記ＰＣＲ反応液１０μノを１００″Ｃ１５分間加熱後
急冷し、ハイブリダイゼーション緩衝液（６０ＩＩＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、　１６０ｍＭ　Ｎ
ａＣｌ、　６．７ｎ＋Ｍ　ＭｇＣＩｚ）　、５　’端ｆ
ｆｚｐラベル化プローブを加え、６０°Ｃ１１５分間加
熱した。コノ混合液を１０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（
ｐ）１７．５　）、３００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡにて平衡化５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５（ファル
マシア）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、Ｐ
ＣＲ法に遺伝子増幅の期待される非Ａ非Ｂ型肝炎特異的
遺伝子に対応する約３３０塩基のＤＮＡ分画を分取し、
その放射活性を測定した。

その結果、同様に処理した健常人の血清由来ＲＮＡにお
いては検出されながった放射活性が非Ａ非Ｂ型肝炎患者
の血清並びに肝組織より抽出したＲＮＡを用いた場合に
は、特異的に検出され、特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型
肝炎特異的遺伝子の存在が確認された。

また、上記ＰＣＲ反応液にプライマーｒＰＲ２Ｊ及びｒ
ＰＲ３Ｊを加え、同様にして３０−４０サイクルの遺伝
子増幅を行なった。得られた反応液を８％ポリアクリル
アミドゲルを用いて電気泳動し、泳動後、エチジウムブ
ロマイドで染色した。その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の
血清並びに肝組織より抽出したＲＮＡを用いた場合に、
特異的にプライマーｒＰＲ２Ｊ及びｒＰＲ３Ｊによって
遺伝子増幅される約２００ｂｐのバンドが見られたが、
同様に処理した健常人の血清由来ＲＮＡにおいては検出
されなかったことにより、非Ａ非Ｂ型肝炎患者に特異的
に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在が確認
された。

非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を含む組換えファージのうち、λＨＣ２２５６。

λＩＣ２２４４、及びλＨＣ２２０７のｃＤＮＡに対応
する遺伝子を検出するため、実施例２と同様にプライマ
ー及びプローブとして、下記の塩基配列のオリゴヌクレ
オチドを合成した。

プライマー（ＰＲ） ＰＲ５：　　５　　’　　−ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＧＧ
ＧＴＴＡＴＧＧＡＧＣ−３’（λＩＣ２２５６に挿入さ
れたｃＤＮＡの７０−９１の塩基配列）ＰＲ６：　５　
’　−ＡＧＴＣＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡ
−３’（λＨＣ２２５６に挿入されたｃＤＮＡの４４７
−４６８の塩基配列）ＰＲ７：　５　’　−ＴＧＣＣＣ
ＴＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧ　−３’（λＩＣ２
２５６に挿入されたｃＤＮＡの１３９−１６０の塩基配
列）ＰＲ８：　５　’　−ＣＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＣ
ＡＴＡＡＴＧＣＧＴ−３’（λ）ＩＣ２２５６に挿入さ
れたｃＤＮＡの３１５−３３６の塩基配列）プローブ（
ＰＢ） ＰＢ２　　：　　５　　’　　−ＴＧＡＴＡＧＣＧＴＴ
ＣＧＣＴＴＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＣＧＴ−３’（
λＩＣ２２５６に挿入されたｃＤＮＡの２７７−３０７
の塩基配列）実施例１にて調製されたＲＮＡとランダム
プライマー０．５可を混合し、実施例２と同様にして５
ｃＤＮＡを合成した。得られた５ｃＤＮＡにプライマー
ｒＰＲ５，及びｒＰＲ６Ｊを加え、実施例２と同様にし
て遺伝子増幅を行なった後、プローブｒＰＢ２Ｊとハイ
ブリダイズさせ、増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝
子の検出を試みた。その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者より
抽出されたＲＮＡを用いた場合に特異的に放射活性が検
出され、特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝
子の存在が確認された。

また、上記ＰＣＲ反応液にプライマーｒＰＲ７Ｊ及びｒ
ＰＲ８Ｊを加え、同様にして３０−４０サイクルの遺伝
子増幅を行なった。得られた反応液を８％ポリアクリル
アミドゲルを用いて電気泳動し、泳動後、エチジウムブ
ロマイドで染色した。その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の
血清並びに肝組織より抽出したＲＮＡを用いた場合に、
特異的にプライマーｒＰＲ７Ｊ及びｒＰＲ８，によって
遺伝子増幅される約１５０ｂｐのバンドが見られたこと
により、特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝
子の存在が確認された。尚、同様に処理された健常人血
清由来のＲＮＡを用いた場合には１５ｂｐのバンドは認
められなかった。

実施例３で遺伝子増幅を行った反応液総量の１０分の１
を９５゛Ｃ１５分間熱処理した後急冷し、これに第２表
で示したプローブＣＰ５（プローブの塩基配列中５はリ
ンカ−（アミノモディファイア−■／Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ
社）の位置を示し、このリンカ−にアクリジニウムエス
テルが標識されている。）をハイブリダイズ溶液（０，
Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
６，０）、　１　ｄ　ＥＤＴＡ）　テ希釈したものを加
え、６゜Ｃで３０分間インキュベートした。これに０．
１　Ｍホウ酸ナトリウム（ｌｌＨ７，６）２００Ｊｌｌ
を加え、６０’ｃテ１０分間インキュベートし、目的物
とハイブダイズしないプローブのアクリジニウムエステ
ルを加水分解したのち、日２０□及びＮａＯＨ溶液を加
え、ルミノメータ−により、化学発光量を測定した（参
照、前出のＡｒｎｏｌｄらの文献）。この結果非Ａ非Ｂ
型肝炎患者血清及び肝組織より抽出したＲＮＡを用いて
検出を行ったところ、特異的に化学発光が測定され非Ａ
非Ｂ型肝炎特異的遺伝子を鋭敏に検出することができた
が、同様に処理された健常人血清由来ＲＮＡにおいては
、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在を示す化学発光は
認められなかった。

〔発明の効果〕

以上の如く、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的蛋白質をコードする
ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて調製したオリゴヌクレオ
チドをプライマー及びプローブとして用いることにより
、非Ａ非Ｂ型肝炎患者より抽出したＲＮＡ中に含まれる
非Ａ非Ｂ型肝炎特異的な遺伝子を検出することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はファージクローンλＩＣ２２１１中の挿入部の
塩基配列を示す。 第２図はファージクローンλＩＣ２２４６中の挿入部の
塩基配列を示す。 第３図はファージクローンλＨＣ５１２中の挿入部の塩
基配列を示す。 第４図はファージクローンλＨＣ２２０６中の挿入部の
塩基配列を示す。 第５図はファージクローンλ）Ｉｃ　２２０７中の挿入
部の塩基配列を示す。 第６図はファージクローンλＩＣ２２１６中の挿入部の
塩基配列を示す。 第７図はファージクローンλＨＣ２２２０中の挿入部の
塩基配列を示す。 第８図はファージクローンλＨＣ２２３０中の挿入部の
塩基配列を示す。 第９図はファージクローンλＩＣ２２３２中の挿入部の
塩基配列を示す。 第１０図はファージクローンλＨＣ２２４４中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１１図はファージクローンλＩＣ２２４８中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１２図はファージクローンλＩＩＣ２２５６中の挿入
部の塩基配列を示す。 第１３図はファージクローンλＨＣ２２５８中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１４図はファージクローンλＩＣ２２７０中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１５図はファージクローンλＨＣ２４１ＯＣ中の挿入
部の塩基配列を示す。 第１６図はファージクローンλＩＣ２５３３中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１７図はファージベクターλＨＣ２６０７中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１８図はファージベクターλＩＣ２６１０中の挿入部
の塩基配列を示す。 第１９図Ａ及び第１９図Ｂはファージベクターλ）ＩＣ
２２３２、同２２３ｏ、同２２ｏ６、同２２５８、同２
２４８、同２２２０、同２２４６、同２２１１および同
２２１６の挿入部の塩基配列の相同性を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１表に示すファージクローンのいずれかに挿入さ
   れているｃＤＮＡ又はその一部をプローブとして用いる
   ことを特徴とするＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ又は
   ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに基づく血液伝
   播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法。 ２、プローブが第１図〜第１８図に示すいずれかの塩基
   配列を有するＤＮＡ又はその一部であることを特徴とす
   る請求項１記載の血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝
   子の検出方法。 ３、プローブが第１図〜第１８図に示す塩基配列のうち
   、互いに相同性の高い部分であることを特徴とする請求
   項１記載の血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検
   出方法。 ４、第１９図Ａ及びＢ中の対応する２種類以上の塩基配
   列が示されている領域において、任意に選択された２種
   類の塩基配列間の相同性がいずれの２種類の塩基配列を
   選択しても８０％以上である２５ｍｅｒ以上の領域に属
   するいずれかの塩基配列を有するプローブを用いる、請
   求項１に記載の血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子
   の検出方法。 ５、第１９図Ａ及びＢ中の対応する２種類以上の塩基配
   列が示されている領域において、これらの塩基配列相互
   間で塩基を異にする部位の該塩基を５−フルオロウラシ
   ル又はイノシンにより置き換えた場合に、任意に選択さ
   れた２種類の塩基配列の相同性がいずれの２種類の塩基
   配列を選択しても８０％以上である２５ｍｅｒ以上の領
   域に属する、該５−フルオロウラシル又はイノシンによ
   り置き換えられた塩基配列を有するプローブを使用する
   ことを特徴とするＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ又は
   ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに基く血液伝播
   性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法。 ６、第１表に示すファージクローンのいずれかに挿入さ
   れているｃＤＮＡの塩基配列の一部をプライマーとして
   用いることを特徴とする核酸配列増幅方法に基づく血液
   伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法。 ７、プライマーが第１図〜第１８図に示すいずれかの塩
   基配列又はその一部であることを特徴とする請求項６記
   載の血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法
   。 ８、プライマーが第１図〜第１８図に示す塩基配列のう
   ち、互いに相同性の高い部分であることを特徴とする請
   求項６記載の血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の
   検出方法。 ９、第１９図Ａ及びＢ中の対応する２種類以上の塩基配
   列が示されている領域において、任意に選択された２種
   類の塩基配列間の相同性がいずれの２種類の塩基配列を
   選択しても８０％以上である１５ｍｅｒ以上の領域に属
   するいずれかの塩基配列を有するプライマーを用いる、
   請求項６に記載の血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝
   子の検出方法。 １０、第１９図Ａ及びＢ中の対応する２種類以上の塩基
   配列が示されている領域において、これらの塩基配列相
   互間で塩基を異にする部位の該塩基を５−フルオロウラ
   シル又はイノシンにより置き換えた場合に、任意に選択
   された２種類の塩基配列の相同性がいずれの２種類の塩
   基配列を選択しても８０％以上である１５ｍｅｒ以上の
   領域に属する、該５−フルオロウラシル又はイノシンに
   より置き換えられた塩基配列を有するプライマーを使用
   することを特徴とする核酸配列増幅方法に基づく血液伝
   播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法。 １１、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプローブ及
   び／又は請求項６〜１０のいずれか１項に記載のプライ
   マーを含んで成ることを特徴とする血液伝播性非Ａ非Ｂ
   型肝炎特異的遺伝子検出用試薬。