JPH04148697A - 固相化プライマーを用いる逆転写酵素の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、被検液中の逆転写酵素の決定方法および体液
中の逆転写酵素中和抗体測定による被検者のレトロウィ
ルス感染の確認法に関する。

［従来の技術］ 従来、逆転写酵素の活性測定としては、天然型ＲＮＡ又
はアデニンリボポリヌクレオチド（以下、ポリＡと略す
ことがある）とオリゴデオキシチミンヌクレオチド（以
下、オリゴｄＴと略すことがある）とを用い、基質とし
てトリチウム化デオキシチミジン５°−トリホスフェー
ト（以下、（’Ｈ）ｄＴＴＰと略称することがある）を
用い、反応液中の逆転写酵素活性を利用してオリゴｄＴ
を伸長させ、これをフィルターで濾過し、フィルター中
の放射活性を測定する方法が報告されている（　　Ｄａ
ｖｉｄ　　　Ｂａ１ｔｉａ＋ｏｒｅ　　　Ｎａｔｕｒｅ
、　　２２６．　１２０９−１２１１、　（１９７０）
　；　　Ｈｏｗａｒｄ　Ｍ、　Ｔｅｇｕｉｎ　＆　５ａ
ｔｏｓｈｉＮｉｚｕｔａｎｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２
６．１２１１−１２１３．（１９７０））。

そして更に、上述の逆転写酵素活性の測定方法を利用し
たレトロウィルスの一種であるエイズウィルスの感染を
診断する方法が報告されている〔特ｒ４超６３−２５２
２５３号公報〕。

従来、　６２にバイオ医薬的研究及び組換えＤＮＡテク
ノロジーに用いられる多くの操作は、通常同位体水素（
’Ｈ）、リン（”Ｐ）、炭素Ｍ’Ｃ）、ヨウ素（１２’
Ｉ）等で放射標識されたポリヌクレオチドの使用に大き
く依存している。　そして、このような放射性化合物は
、たとえ核酸又は他の科学的に又は臨床上興昧ある分子
が極めて微量で存在していても、それらを検出し、監視
し、局在化し、又は単離することが可能であるので、有
用な指示プローブとして使用されている。

しかしながら、放射性物質の使用には厳しい制約があり
重大な欠点が伴っている。　すなわち、まず第一に、放
射性物質を取り扱う人は、潜在的に高レベルの放射線に
曜されかねない危険があるので、放射性同位体の製造、
使用、後処理の間、倉入すな安全策を講じ維持しなけれ
ばならないという問題点があった。

第二に、放射性ヌクレオチドは高価なものであり、一般
の使用においては経費が高くなるという問題がある。　
第三に、必要な感度を得るには、高い比放射能の放射性
物質を用いなければならないが、比放射能の高い放射性
物質はそれに対応して半減期が短く、貯蔵寿命が限られ
ており使用に制約が加えられるという問題があった。

そこで、放射性物質に替えて非放射性の標識物質を用い
る方法が検討されているが、例えば、鳥型ミエローマ由
来の逆転写酵素を用い、鋳型として天然型ｍＲＮＡ、プ
ライマーとしてオリゴｄＴ及び基質としてビオチン化デ
オキシウリジン５′−トリホスフェート（以下、ビオチ
ン化ｄＵＴＰと略すことがある）を用いて反応せしめた
ところ、ビオチン化ｄＵＴＰは何ら基質として利用され
ず、オリゴｄＴの伸長は見られず、逆転写酵素の活性測
定に利用し得ないことが報告されており［Ｐｅｎｎ１ｎ
ａ　Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ、　Ａｌｅｘ　Ａ、　Ｗａｌｄｒ
ｏｐ　＆Ｄａｖｉｄ　Ｃ，Ｗａｒｄ　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｅｔ、　　ＵＳＡ。

７８、６６３３−６６３７．　（１９８１）　］　、ビ
オチン化ヌクレオチドは逆転写合成酵素の活性測定には
適用できないとされていた。

本発明者らは先に、放射性同位体を用〜いない逆転写酵
素活性の測定系を得べく、鋭意研究を行なった結果、特
定の鋳型ＤＮＡおよびプライマーを用いれば逆転写酵素
の存在下においてビオチン化ｄＵＴＰは基質として利用
され、逆転写酵素活性が容易に測定しうることを見出し
た。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、上記の方法にもまだいくつか問題があり、その
改善が求められていた。すなわち、上記方法では操作手
順に煩雑な点があり、また、反応開始後、測定が可能と
なるまでに若干の時間がかかるという問題があり、操作
手順が簡便で、短時間で測定可能な方法の確立が求めら
れていた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑み更に研究を行なった結
果、固相化プライマーを使用すれば上記の問題点を解消
することができ、簡便かつ迅速に逆転写酵素活性が測定
しうろことを見出し本発明を完成した。

即ち、本発明は、少なくとも、水性媒体中で、人為的に
調製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡ、
該アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な
固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよび
ビオチン化デオキシウリジントリホスフェートとを被検
液の存在下反応せしめ、該反応の反応生成物と未反応の
ビオチン化デオキシウリジントリホスフェートを分離し
た後、反応生成物もしくは未反応のビオチン化デオキシ
ウリジントリホスフェートの量を測定することを特徴と
する被検液中の逆転写酵素の決定方法である。

また本発明は、少なくとも、水性媒体中で、人為的に調
製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡ、該
アデニンリボポリヌクレオチド鋳ｕＲＮＡに相補的な固
相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビ
オチン化デオキシウリジントリホスフェートとを被検体
液および逆転写酵素の存在下反応せしめ、該反応の反応
生成物と未反応のビオチン化デオキシウリジントリホス
フェートを分離した後、反応生成物もしくは未反応のビ
オチン化デオキシウリジントリホスフェートの量を測定
し、この量から被検体液中の逆転写酵素中和抗体価を求
めることを特徴とする被検者のレトロウィルスの感染確
認法である。

本発明において、鋳型として用いられるＲＮＡは、人為
的に調製されたアデニンリボポリヌクレオチドである（
以下、このようなＲＮＡをポリＡと略称することがある
）。

ポリＡは、例えば、遺伝子操作技術若しくは化学合成技
術を用いて合成することにより人為的に調製され、特に
好ましい態様としては１００〜５００塩基からなるポリ
Ａを挙げることができ、通常有利に利用できるものとし
ては、平均鎖長２５５塩基程度のポリＡが例示される。

固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド（以下
、固相化オリゴｄＴと略すことがある）はブライマーと
して作用するもので、好ましい態様としては、１１塩基
以上のデオキシチミジンのオリゴマーであり、長いもの
ほど好ましいが、通常有利に利用できるものとして例示
されるものは、平均鎖長１５塩基ないし２１塩基程度の
固相化オリゴｄＴである。

この固相化オリゴｄＴは、オリゴデオキシチミンヌクレ
オチド（オリゴｄＴ）を固相に固定化したものである。

固相としては、特に限定はされないが、ガラス粒子、セ
ルロース、ポリスチレン等の天然または合成高分子の担
体等が用いられる。

このうち合成高分子担体の例としては、例えば、スチレ
ンや置換基としてスルホン酸基、カルボキシル基、アミ
ノ基を有するスチレン（以下、スチレン誘導体モノマー
という）の単一重合物もしくは共重合物であるポリスチ
レンや、スチレンまたはスチレン誘導体モノマーとメチ
ルスチレン、エチルスチレン、クロルスチレン、エチレ
ン、プロピレン、アクリル酸、アクリル酸メチルエステ
ル、アクリル酸エチルエステル、メタクリル酸、メタク
リル酸メチルエステル、メタクリル酸エチルエステル、
アクリロニトリル、アクリルアミド、マレイン酸、フマ
ル酸、ブタジェン、クロルブレン、イソプレン、塩化ビ
ニル、塩化ビニリデン、酢酸ビニル、ビニルトルエン、
ジビニルベンゼンなどとの共重合体、ポリビニルトルエ
ン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸
、ポリアクリロニトリル、ポリビニルピロリドン、ポリ
酢酸ビニルアクリレート、塩化ビニル−アクリレートな
どとの共重合体などが挙げられる。また、二の合成高分
子担体は、その表面を非イオン界面活性剤で前処理した
ものであっても良い。

特に好ましいものとしては、スチレン、クロルスチレン
、アクリル酸、ビニルトルエン、メタクリル酸メチルエ
ステルの重合または共重合体が例示される。

これらの固相にオリゴｄＴを固定化する方法としては、
吸着法および化学結合法のいずれをも利用することがで
きるが、より高い感度を得られる点で化学結合法が好ま
しい。

特に、オリゴｄＴの５”末端側で固相に化学結合せしめ
る方法が好ましく、例えば、アミン基を有するポリスチ
レンやポリペプチド等のアミン基を有するかこれを導入
した固相のアミノ基にオリゴｄＴの５°末端に存在する
リン酸残基を縮合剤等の存在下活性化し、アミン基とリ
ン酸基を縮合する方法、例えば１−エチル−３−（３−
ジメチルアミンプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の縮
合剤の存在下、好ましくは１−メチルイミダゾールを添
加して縮合せしめれば良い。

また、他の方法として、例えば、カルボキシル基を有す
るスチレン等のカルボキシル基を有しまたはこれを導入
した固相のカルボキシル基に対し、オリゴｄＴの５°末
端のリン酸残基に上記縮合剤により予めアミン基を結合
導入せしめ、次いで、カルボキシル基とアミン基を脱水
縮合せしめる方法が挙げられる。

さらに、スルホン酸基や水酸基、ジメチルアミン基等の
官能基を有するかまたはこれを導入した固相とオリゴｄ
ＴまたはオリゴｄＴの５゛末端を適当な官能基となし、
適当なスペーサーを用いて両者を結合しても良い。

形状としても特に限定されず、ボールや粒子状、繊維状
の表面や、プレート、容器等の壁面に固相化したもので
あっても良い。

固相化オリゴｄＴの単位面積当たりの固相への結合量は
、通常は、５．０　　ｐｍｏｌ／Ｃｍ２の結合量までに
は最高の吸光度を与え、それ以上の結合量においても測
定可能であるが結合量が多すぎると感度の面および経済
性の面から好ましくなく、好ましくは０．１５〜５．０
ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲が例示される。

基質として用いられるビオチン化デオキシヌクレオシド
トリホスフェート（以下、ビオチン化ｄＵＴＰあるいは
標識基質と略称することがある）は、例えば、ピオチン
基とウラシルデオキシヌクレオシド基がアリールアミン
等の適当なスペーサーを介して結合した化合物があげら
れ、具体的な化合物例としては、例えば、５−　（Ｎ−
（Ｎ−ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミ
ノアリールツーデオキシウリジントリフオスフェート（
ピオチン化−１１−ｄＵＴＰ）　、５−　（Ｎ−（Ｎ−
（ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−γ−アミノブ
チリル〕−３−アミノアリール〕−デオキシウリジント
リフオスフェート（ビオチン化−１６−ｄＵＴＰ）等の
ようにビオチニル基が適当なスペーサーを介してｄＵＴ
Ｐと結合された化合物である。ビオチン化−１１−ｄＵ
ＴＰ及びピオチン化−１６−ｄＵＴＰは、市販されてい
る化合物であり、また、それ以外の化合物も特開昭５７
−２０９２９７号公報等の公知文献に記載の方法に準じ
て容易に調製される。

ピオチン量測定のために用いられる試薬およびその組成
物としては、一般にピオチン量を測定するために用いら
れるものを採用することができ、例えばＦＩＴＣ（フル
オレラセンイソチオシアネート）蛍光検出用組成物、パ
ーオキシダーゼ検出用組成物、酸性ホスファターゼ検出
用組成物、アルカリホスファターゼ検出用組成物、泗−
ガラクトシダーゼ検出用組成物等が挙げられる。

ＦＩＴＣ蛍光検出用組成物としては、例えば、兎ＩｇＧ
ビオチン抗体およびＦＩＴＣ結合山羊抗兎ＩｇＧ抗体か
らなる組成物並びにＦＩＴＣ結合アビジン等が挙げられ
、また、パーオキシダーゼ検出用組成物としては、例え
ばストレプトアビジン−ピオチン化西洋わさびパーオキ
シダーゼ複合体、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液および
オルトフェニレンジアミンおよび過酸化水素からなる組
成物が挙げられる。　更に、酸性ホスファターゼ検出用
組成物としては、例えばストレプトアビジン−ピオチン
化酸性ホスファターゼ複合体、リン酸緩衝液等の適当な
Ｉｉ所液、パラニトロフェニルホスフェート等の発色基
質あるいは４−メチルウンベリフェリルホスフェート等
の蛍光基質からなる組成物等が、アルカリホスファター
ゼ検出用組成物としては、例えばストレプトアビジン−
ピオチン化アルカリホスファターゼ複合体、トリス塩酸
！！衝液等の適当な緩衝液およびパラニトロフェニルホ
スフェート等の発色基質あるいは４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート等の蛍光基質からなる組成物、スト
レプトアビジン化アルカリホスファターゼ、トリス−塩
ｆｉｌｌ衝液等の適当な！ｌ１ｌｉｉ液およびパラニト
ロフェニルホスフェート等の発色基質あるいは４−メチ
ルウンベリフェリルホスフェート等の蛍光基質からなる
組成物が、また、β−ガラクトシダーゼ検出用組成物と
しては、例えば、ストレプトアビジン−β−ガラクトシ
ダーゼ結合体、リン酸緩衝液等の適当な緩衛液および２
−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の発色基質ある
いは４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド等
の蛍光基質からなる組成物等が挙げられる。

これらの組成物は、既に市販されているものを利用して
もよく、また、公知文献を参考にして、種々調製し、ピ
オチン量測定用試薬組成物としても良い。

本発明の被検液中の逆転写酵素を決定する方法を実施す
るには、ポリＡ、固相化オリゴｄＴおよびビオチン化ｄ
ＵＴＰを任意の順序で反応させ、未反応のビオチン化ｄ
ＵＴＰを除去した後、ピオチン化ｄＵＴＰ量を測定すれ
ばよい。

ポリＡ（平均鎖長：２５５塩基）と固相化オリゴｄＴ（
平均鎖長：　２１．５塩基）の量的関係は、固相化オリ
ゴｄＴを１（モル比）としたときに、ポリＡを１１５０
−０．３の比とすることが好ましく、適宜、固相化オリ
ゴｄＴの単位表面積当たりの結合量において好ましいポ
リＡの量とすれば良い。

反応は、被検液、ポリＡ、固相化オリゴｄＴおよび標識
基質としてのビオチン化ｄＵＴＰを、ｐＨ６，５〜８に
調整したトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液
中、３７℃付近で０．５〜２４ｎ間インキュベートし、
系中に存在する逆転写酵素の作用により、前記ビオチン
化ｄＵＴＰをポリＡ−固相化オリゴｄＴのプライマ一部
に結合せしめる。

被検液としては、逆転写酵素の存在、非存在または逆転
写酵素の酵素活性を測定しようとする検液てあれば良く
、例えば、レトロウィルス感染細胞の培養液を挙げるこ
とができる。

更に、ポリＡ−固相化オリゴｄＴと結合したビオチン化
ｄＵＴＰ　（以下、反応生成物ということがある）と未
反応のビオチン化ｄＵＴＰとの分離は、固相化オリゴｄ
Ｔを用いているので、濾過、遠心分離、デカンテーショ
ン等により容易に実施することができる。

基質として利用されたビオチン化デオキシウリジンの量
、すなわち反応ビオチン化ｄＵＴＰ量は、伸長工程を経
てブライマーに結合したビオチン化デオキシウリジンの
ピオチン量をピオチンの測定用試薬を用いて測定すれば
良く、例えば、ピオチン含量の測定用試薬として、スト
レプトアビジン化アルカリホスファターゼ、トリス−塩
酸緩衝液、バラニトロフェニルホスフェートからなる組
成物を用いた場合には、次の様にして実施される。

すなわち、０．１５〜０．５λ（のＮａＣ１を含むｐＨ
７，５〜９．５に調整したトリス塩酸１１ｆｆｉ液に０
．０５〜１０　μｇ／ｍ１’ｌＡ度のストレプトアビジ
ン化アルカリフォスファターゼを含有させて得た溶液に
、ビオチン化ｄＵＴＰの反応した固相担体を１０〜６０
分間浸漬させる。十分量の上述４１面液で少なくとも３
回以上固相担体を洗浄し、次に例えば１ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ
　Ｃ１２を含む５０ｍＭジェタノールアミン−塩酸緩衝
液（ｐＨ９，５〜１０）に１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のパ
ラニトロフェニルホスフェートを溶解させて得た溶液に
、固相担体を０．１〜２時間浸漬させて発色せしめる。

発色■の定■は、波長４０５ｎｍの吸光度を測定すれば
良い。

かくして測定されたビオチン化ｄＵＴＰの結合量は、系
中の逆転写酵素量、すなわち被検液中の逆転写酵素量を
反映するものであるので、これから逆転写酵素量等を決
定することができる。

さらに、より検出感度を上げるために標識基質の他に、
基質としてデオキシチミジントリホスフェート（以下、
ｄＴＴＰと略すこともある）を加えることができる。こ
のような目的のために使用されるｄＴＴＰの量は、通常
、標識基質であるビオチン化ｄＵＴＰｆｉに比して、モ
ル比で２〜２０倍、好ましくは３〜４倍である。

本願方法による逆転写酵素量の決定は、通常０．０００
１〜１ユニット程度の逆転写酵素が決定しうる感度の良
いものである。

また、本発明の体濠中の逆転写酵素中和抗体検出による
被検者のレトロウィルス感染の確認法を行なうに際して
は、被検体液および逆転写酵素存在下、基質として少な
くともビオチン化ｄｔＪＴＰを用い、これをポリＡおよ
びオリゴｄＴと反応させる。この工程は、予め酵素活性
を測定した逆転写酵素含有溶液を通常ｏ、ｏｏｉ〜１ユ
ニット、好ましくは０．００１〜０．０１ユニツトに調
製し、これと被検体液とを混合し、約４°Ｃで通常０．
１〜２ｒｆ間、好ましくは　１０〜６０分間ブレインキ
ュベートした後、更にポリＡと基質としてのビオチン化
ｄＵＴＰを通常０．５〜１００ｔ、ｔλ（、好ましくは
１〜５μλ（含有する、ｐＨ６，５〜８に調整したトリ
ス−塩酸緩衝液等の緩衝溶液が存在する固相化オリゴｄ
Ｔへ加え、約３７°Ｃで０．５〜２４時間程度インキュ
ベートする。

逆転写酵素としては、ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩ
Ｖ）　、ヒト免疫不全ウィルス２型、アカゲザル免疫不
全ウィルス、マウス乳腺腫ウィルス、ヒトＴ細胞白血病
つィルスＩ型、ラウス株トリ肉腫ウィルス、ラウス聞達
ウィルス２型、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）などのレト
ロウィルス等のウィルス粒子を非イオン性界面活性剤、
例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
（トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０）で溶解処理して得
たものを使用することができる。

また、被検体液としては、逆転写酵素に対する抗体をも
つ人体に含有されまたは産生される任意の体液であれば
よく、好ましくは血清である・。

血清は、３０〜５０％飽和硫安で沈澱させたもの、ある
いはＤＥＡＥ、ＱＡＥ−セファデックス等陽イオン交換
樹脂を通過させたものが通常用いられる。

反応および未反応ビオチン化ｄＵＴＰの分離およびそれ
らの量を測定する方法も、前述の逆転写酵素の決定方法
に準じれば良い。

かくして測定系中の反応または未反応ビオチン化ｄｔＪ
ＴＰ量が求められるのであるが、系中の逆転写酵素は被
検体液由来の抗体により失活され、この結果、反応ピオ
チン化ｄＵＴＰ量が減少する。　従って、陽性体液コン
トロールおよび陰性体液コントロールを指標とすること
により体液中の逆転写酵素中和抗体価を測定することが
でき、この抗体価は、その被検体液を持つ被検者のレト
ロウィルス感染の有無のｔｉ認の指標となる。

本発明においても、ポリＡ（平均鎖長：２５５塩基）と
固相化オリゴｄＴ（平均鎖長：　２１．５塩基）の量的
関係は、固相化オリゴｄＴを１（モル比）としたときに
、ポリＡを１１５０〜０．３の比とすることが好ましく
、適宜、固相化オリゴｄＴの単位表面積当たりの結合量
において好ましいポリＡの量とすれば良い。

また、より検出感度を上げるために標識基質のばか更に
基質としてｄＴＴＰを加えることができる。　このよう
な目的のために使用されるｄＴＴＰの量は、通常標識基
質であるビオチン化ｄＵＴＰ量に比しモル比で２倍〜２
０倍、好ましくは３〜４倍である。

本発明方法を有利に実施するためには、例えば ■人為的に調製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳
型ＲＮＡ、 ■鋳型ＲＮＡに相補的な固相化オリゴデオキシチミンヌ
クレオチド、 ■ビオチン化デオキシウリジントリホスフェート、およ
び ■ビオチン量測定用試薬、 を含有してなる逆転写酵素測定用キットを利用すること
ができる。

これらキットは、溶液状態のものであっても良いが、使
用時に脱イオン水、生理食塩水、各種緩衝液等で溶解す
るような凍結乾燥試薬とすることもできる。

［発明の効果］ 本発明方法により、例えばＨＩＶの保持者のリンパ球培
養土清中の逆転写酵素活性を放射性標識を使わずに検出
することが可能となった。また、ＡＩ　ＤＳ発症と密接
に関連のある抗逆転写酵素中和抗体量も放射性物質を使
用せず測定できるようになったので、ＨＩＶキャリヤー
の発症の可能性等を容易に監視することができる。

特に本発明方法は、固相化オリゴｄＴを用いているので
、反応時間が短くてすみ、また、反応生成物と未反応物
の分離が極めて容易であるので、測定時間の短縮、多数
のサンプル数を処理すること等が可能となり、機械化に
好都合である。

また、オリゴｄＴを１（モル比）としてポリＡを０．３
〜１１５０の比とした場合には感度良く、さらにポリＡ
を７〜７０とした場合には更に好ましく測定することが
可能となった。

［実施例］ 以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明は何らこれに限定されるものではない。

実施例　１ 固相化ブライマーを利用した固液相系 による逆転写酵素反応と液相系逆転写 酵素反応との反応速度の比較＝ （１）オリゴｄＴ’＋２−＋ａのアミノ化プレートへの
固定 １００ｍＭ１−、：ｃチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＣＤＩと略す；ペプ
チド研究所製）と１００ｍＭ　　１−メチル−イミダゾ
ール−塩酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ；　　ＩＭＤと略す；Ｓ
ＩＧＭＡ社製）を含む水溶液に、オリゴｄＴ１２−１８
（平均鎖長：１５塩基、平均分子量：　　４，９５０ダ
ルトン；ファルマシア社製）を２００　ｎ　ｇ　／　５
０μｍとなるように溶解し、その５０μｍずつをアミノ
ブレート（底面積：０．３２ｃｍ２；住人ベークライト
社製）ノウエルに分注（反応液が接触するウェルの表面
積は０．６３　ｃ　ｍ２）　Ｌ／、室温で２４時間反応
させた。反応後、この溶液を捨て、 ０．１５ＭＮａＣ１を含む０．１Ｍ　　トリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５，以下、ＴＢＳと呼ぶ）の２００μｍ
でウェルを洗浄し、同じく２回、緩衝液　　２００μｍ
で洗浄し、これを固相化ブライマー（オリゴｄＴ＋２−
＋ａ固定プレート）とした。

（２）固相化ブライマーを用いた逆転写酵素反応 逆転写酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応を行なわせるのに、
２倍凛度の反応緩衝液（１００ｍλイ　トリス−塩酸！
！面液（ｐＨ７，８）、２４　ｍ　Ｍジチオスレイトー
ル、２　、４　ｍ　Ｍ還元型グルタチオン、２０ｒｎＭ
　ＭｇＣｌ２．３２０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭｘチレングリ
コール四酢酸、０．４％　トリトンＸ−１００，４％エ
チレンゲルコールからなる緩衛液）の５０μｌに１Ｍｇ
のポリＡ（平均鎖長：２５５塩基、平均分子量：　　８
６，７００ダルトン；ファルマシア社製）　、０．４回
ｍｏｌのビオチン化−１１−ｄＵＴＰ　（エンゾ社製ン
を添加し、これを上記（１）に記載の如くして得られた
固相化ブライマーのウェルに分取した。次にリン酸緩衝
生理食塩水（ｐＨ７゜４；以下、ＰＢＳと呼ぶ）にて１
５ｍＵ１５０μｍに調製した逆転写酵素（ラウス関連ウ
ィルス２型（ＲＡＶ−２）由来、宝酒造製）を５０μｌ
ウエルに加え、混合した復、３７°Ｃで１．２．３およ
び２４時間作用せしめた。

（３）酵素反応生成物（ビオチン化ＤＮＡ）の定量 上記（２）に記載の如くして得られたそれぞれの反応液
に１０μｌの５Ｍ　ＮａＣ１を添加し、５分間放置後、
０．５ＭＮａＣ１と０．０５Ｍ　ＭｇＣｌ２を含む０．
１Ｍ　　トリス−塩＃１緩ｉ！ｉｉ液（ｐＨ９，５；以
下、洗浄液と呼ぶ）の２００μｌにてウェルを洗浄し、
同じく２回から４回、洗浄液２００μｍで洗浄した。

次いで、洗浄液に溶解した３％牛血清アルブミンの１０
０μｌをウェルに分取し、３７℃で１時間インキュベー
トした。３％牛血清アルブミン液を捨てた復、洗浄液で
１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識スト
レプトアビジン（最終濃度０．０８８μｇ／ｍｌ、ＢＲ
Ｌ社製）の５０，１７１をウェルに分取し、室温で１時
間インキュベートした。

２００μｌの洗浄液にて同様にウェルを３回から５回洗
浄して余分なアルカリ土類金属ターゼ標識ストレプトア
ビジンを除去した後、ウェルに残っているアルカリホス
ファターゼの酵素活性を測定することにより、ビオチン
化ＤＮＡの定量とした。

アルカリホスファターゼの酵素活性の測定は、パラニト
ロフェニルホスフェートを１ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２
を含む５０ｍＭ　ジェタノールアミン−塩酸！！衝液（
ｐＨ９，５）にて１ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、その
５０μｍを各ウェルに加え、３７℃で３０分インキュベ
ートし、次イテ、０．５規定ＮａＯＨの５０μｍをその
反応液へ添加することにより酵素反応を終了させ、アル
カリホスファターゼ活性により呈色した吸収波長４０５
ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｊ−２０００型、イ
ンターメッド社製）にて測定することによって行なった
。

１５ｍＵの逆転写酵素を使用して１時間、２時間、３時
間、及び２４時間反応せしめた時に得られた吸光度を第
１表に示す。

第 表 反応時間　　吸　光度＊ （ｈ） １　　　０．６３９ ２　　　１．５２１ ３　　　１．８６７ ２４　　　２．７７３ ＊　　λ　＝４０５ｎｍ 上記結果が示すように、伸長類反応には時間依存性があ
った。そして、この測定法においては、吸光度０．１以
上にて信頼てきる測定値が得られることが知られている
ので、本発明方法によれば、反応開始後１時間で既に定
量を行なうことができることが理解される。これに対し
、以下に示す参考例１の比較方法（液相系での反応）で
は反応開始後２時間においてやっと測定できた。

この様に固相化ブライマーを使用して逆転写酵素反応さ
せる本発明方法は、液相系での反応の時よりも短い時間
で逆転写酵素の活性を測定することが出来、より優れた
ものであることが明らかである。

参考例　１ 液相系に於ける逆転写酵素反応生成物の経峙変化 実施例１（２）に記載した２倍漬度の逆転写酵素反応緩
衝液５０μｌに、ｌμｇのオリゴｄＴ＋２−＋ｓ、ｏ、
１ｕｇのポリＡ、０．４ｍｍｏｌのビオチン化−１１−
ｄＵＴＰを添加し、そこへ　１５ｍＵのＲＡＶ−２由来
逆転写酵素を加えて全量を１００μｌとし、３７°Ｃで
１．２．３および２４時間の各時間作用せしめた。

この反応液に１０倍量のＩＮ塩酸と０．１Ｍビロリン酸
ナトリウム塩を含む溶液を添加し、撹拌混合した後、１
０分間氷冷した。

この溶液を、ナイロン膜１００ｃｍ２（日本ボール社製
；商品名バイオダイン）を装着した９６穴マニホールド
（ＢＲＬ社製）で吸引、濾過し、伸長操作をせしめたビ
オチン化ＤＮＡ鎖をナイロン膜へと吸着せしめた。

ここで得られたビオチン化ＤＮＡを吸着したナイロン膜
に、Ｉ！衝液液１０．１λ（トリス−塩酸＃！衝液（ｐ
Ｈ７，５）　、０．１５λ（ＮａＣ１とからなる緩衝液
）に３％ＢＳＡを添加し、６５°Ｃで１時間インキュベ
ートした。

該溶液からビオチン化ＤＮＡを吸着したナイ、ロン膜を
取りだし、次に緩衝液１で１０００倍に希釈したアルカ
リホスファターゼ標識ストレプトアビジン溶液中に、ナ
イロン膜１００ｃｍ２当り該溶１７ｍ１の割合で１０分
間装いた。続いて、ナイロン膜を緩衝液　１１００ｍｌ
に１５分間曝し、同じく徨２回ビオチン化ＤＮＡ鎖を吸
着したナイロン膜を緩衝液　１　１００ｍ１に１５分間
曝し洗浄した。

更にビオチン化ＤＮＡ鎖を吸着したナイロン膜を取りだ
し、緩衝液２（０，１Ｍ　　トリス−塩［ｌｆｆ１液（
ｐＨ９，５）　、０．１Ｍ　ＮａＣ１及び５０ｍλ（Ｍ
ｇＣ１２からなる！Ｉ　衛Ｈ）１００ｔｎｌて１０分間
洗浄した。

発色は、０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリ
ウム（ＮＢＴ）と０．１７ｍｇ／　ｍ　ｌの５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドール−リン酸塩（ＢＣＩＰ）
を含む緩衝液２（ナイロン膜１００ｃｍ２当り７．５ｍ
ｌの割合で使用する）中に３０分間１いた。ナイロン膜
上に出現した発色スポットを、デンシトメーター（Ｃ８
−９３０、墨汁製作所製）を用い、波長５５０ｎｍで測
定した。

液相系に於ける逆転写酵素反応の１．２．３および２４
時間に於ける反応生成物の面積強度を第２表に示す。

（以下余白） 第　　　２　　　表 反応時間　面積強度 （ｈ）　　　　（ｘ１０３） １２．３ ２７．３ ３９．２ 二の測定条件においては、面積強度が７×１０３以上で
信頼できる測定が可能である。

従って、液相系の逆転写酵素反応では、反応開始後１時
間ではまだ定量性のある十分な面積強度は得られず、開
始７１２時間から定量可能な面１１強度が得られた。

実施例２ ポリＡならびにポリｄＡを鋳型とした時の逆転写酵素反
応 実施例１（２）に記載した２倍の濃度の反応縁ＷＥ液の
５０μｍに、０．２４量ｍｏｌのビオチン化−１１−ｄ
ＵＴＰおよび０．９６量ｍｏ　１のｄＴＴＰ　（ペーリ
ンガーマンハイム社製）と、鋳型としてｌμｇのポリＡ
またはポリｄＡとを添加し、これを実施例１（１）の記
載に準じて調製したオリゴｄＴ、。−２４（平均鎖長：
　２１．５塩基、平均分子量＝７．０９５ダルトン；フ
ァルマシア社製）固相化プレートのウェルに分取した。

次にＰＢＳにて１　ｍ　Ｕ　／　５０　、ＬＺ　１に調
製したＲＡＶ−２山来逆転写酵素　５０μｌを該ウェル
に加え、混合した佳、３７℃で１８時間インキュベート
して逆転写酵素を作用せしめた。その後、実施例１（３
）に記載した手法で、伸長したビオチン化ＤＮＡを測定
した。鋳型にポリＡおよびポリｄＡを使用して逆転写酵
素を作用せしめた時に得られた吸光度を第３表に示す。

第 表 鋳 芹り 吸 光 度 ＊ ポリ　Ａ　　　　　　１．２５６ ボリｄＡ　　　　　　Ｏ，００４ 傘　　　　λ　＝４０５ｎｍ この様に、ポリｄＡでは逆転写酵素は作用せず、鋳型を
ポリＡにすることで逆転写＃票を特異的に測定すること
が出来た。

実施例３ アミン化プレート上のオリゴｄＴ、。−２４とポリＡの
至適量の検討： （１）オリゴｄ　Ｔ　、、−２４の標識逆転写酵素反応
にとって最も効率の良いブライマーと鋳型の量比を決定
する為に、アミノプレートのウェルに実際に結合したオ
リゴｄ　Ｔｌ９−２４量を以下の方法により調べた。ま
ず、１０量ｇのオリゴｄ　ＴｌＧ−２４を２０Ａｌｌの
水に溶解し、これに１０倍の濃度のカイネーション緩衝
液　（５００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、
１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００ｍＭ２−メルカプトエ
タノール）を２μｍ、１０μＣｉ／μｍの［γ−３２Ｐ
］ＡＴＰを１μｌ、２０ユニツト／μｌＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを１μｍ添加し、３７℃で３０分インキ
ュベートすることにより、オリゴｄ　Ｔ　１０−２４の
５°末端を［γ−３２ｐ］標識した。３０分後、反応生
成物のうち２ｎｇをペーパークロマトグラフ法により展
開しく展開液は３５０ｍＭギ酸アンモニウム）、１紙を
乾燥？＆５等分して原点に放射活性があること、即ちオ
リゴｄＴが［γ−３２Ｐ］標識されていることを確認し
た。展開し、５等分した濾紙を原点から１．２．３．４
．５と番号をつけ、測定したそれぞれの放射活性を第４
表に示した。

第　　　４　　　表 展開画分番号　　放　射　活 （ｃｐｍ） １（原点）　　　　　　４５８７ 性 放射活性の９１％は原点、即ちオリゴｄＴ１９−２４の
局在する画分にあり、オリゴｄＴ、、−２□は［γ−３
２Ｐ］標識されたことが確認された。

また第４表から、 ラベル率＝　９１％ 比活性：　２．３　Ｘ　１０’　ｃ　ｐｍ／μｇと計算
された。

残った反応液に更に３０μｌの水を加えて全量を５０μ
ｌとし、これに等量のフェノール（予め、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭ　　トリス−塩酸！！衝液（ＰＨ７
，５）で飽和させたもの）を加えて撹拌した後、水層を
回収した。これに５μｍの３Ｍ酢酸ナトリウムならびに
　１５０μｍの冷エタノールを加え、−８０℃で１５分
間冷却した。遠心分ｉ１１？！、上清を除き、残ったペ
レットを冷７５％エタノールで２回洗浄した。

（２）オリゴｄＴ＋＊−２ａの７ミノ化プレートへの固
定と結合したオリゴｄＴ＋ｏ−２ａの定量残ったベレッ
ト（標識オリゴｄＴ）を真空乾燥し、水で０．１μｇ／
μｍになる様に溶解し、これを２．ＯＯＯｎｇ１５０μ
ｌ、２００　ｎ　ｇ　／　５０　μｍ、２０　ｎ　ｇ　
／　５０　μｍ、２　ｎ　ｇ　／　５０　ｕ　１および
０．２ｎｇ７５０μｌとなるように実施例１（１）記載
のＣＤＩと　ＩＭＤを含む水溶液で希釈し、その５０μ
ｍをひとつのウェルずっに分断したアミノプレートに分
注し、室温で２４＃間反応させた。反応後、実施例１（
１）の記載通りに洗浄し、ウェルに残った放射活性を測
定した。

各標識オリゴｄＴ量を使用した時にアミノプレートのウ
ェルに残った放射活性と標識オリゴｄＴの比活性（２，
３ｘｌＯ’　ｃｐｍ／μｇ）ならびに平均分子量（７，
０９５ダルトン）から計算されるアミノプレートへ結合
したオリゴｄＴ、。−２４実質量ならびにオリゴｄＴ反
応液が接触するウェルの表面積（０゜６３　ｃ　ｍ２）
から計算される単位面積当りのオリゴｄ　Ｔｌ＜１−２
４の結合モル数を第５表に示す。

第　　　５　　　表 ７Ｂ １．６３７ １３．００３ ２６．５５５ ０．１２ ０．７１ ５．６７ １１．５８ ０．０２７ ０．１５９ １．２６９ ２．５９２ 以上の結果から、アミノプレートの１ウエルに結合した
オリゴｄ　Ｔｌ９−２４量は、添加したオリゴｄＴＩＧ
１−２４量に比例して増加し、オリゴｄ　Ｔ’＋ｏ−２
ａを　２．ＯＯＯｎｇ添加した場合に、２０　ｎ　ｇ　
／　１ウ工ル結合した。

アミノプレートの１ウエルは、底面積 ０．３２　ｃ　ｍ２の円柱型であって、オリゴｄＴ１Ｇ
−２４の結合反応の総液量が５０μｍであることから、
オリゴｄ　ＴｌＧ−２４が結合し得るウェル上の表面積
は０．６３　ｃ　ｍ２となり、オリゴｄ　Ｔ　１９−２
４（平均鎖長：　２１．５塩基）の平均分子量が７，０
９５ダルトンであるから、ウェル単位表面積当りの結合
オリゴｄＴ量は、４．６５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２程度まで
であった。

（３）逆転写酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応に於ける鋳型
と固相化ブライマーの至適量の検討 実施例１（２）で記載した２濃度度の反応緩衝液の５０
μｍに、０．２４量ｍｏｌのピオチン化−１１−ｄＵＴ
Ｐおよび０．９６　ｎｍｏｌのｄＴＴＰと、１０量ｇ、
ｌμｇ、１１００ｎ、Ｌｏｎｇおよびｌｎｇの６量のポ
リＡ（平均鎖長：２５５塩基、平均分子量８６．７００
ダルトン）とを添加し、これを実施例３（２）で判明し
た６量のオリゴｄ　Ｔ　＋　。

−２４が結合した固相化プレートのウェルに分取した。

次にＰＢＳにて０．１ｍＵ１５０μｍに調製したＲＡＶ
−２由来逆転写酵素５０μｌを該ウェルに加え、混合し
た後、３７℃で１８時間インキュベートして逆転写酵素
を作用せしめた。その後、実施例１（３）に記載した手
法で、伸長したビオチン化ＤＮＡを測定した。

各ポリＡ量と固相化オリゴｄ　Ｔ　、、２．量の組み合
わせについて０．１ｍＵのＲＡＶ−２由来逆転写酵素を
３７°Ｃで１８時間作用せしめた時に得られた吸光度を
第６表に示した。

以上の結果から、信頼し得る最低の吸光度（約０．１程
度）を得る為のアミノプレートに結合しているオリゴｄ
Ｔ、。−２４（平均鎖長：　　２１．５塩基、平均分子
量７，０９５ダルトン）の量は、０．７ｎｇ（即ち　　
０．１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）以上、好ましくはＩｏｎｇ
（即ち２．６ｐｍｏｌ／ａｍ２）程度であればよく、そ
れ以上のオリゴｄＴを結合させても吸光度にはあまり差
が見られなかった。

また、この範囲の量の固相化オリゴｄＴ１゜−２４で０
．１程度の吸光度を得る為のポリＡ（平均鎖長：　２５
５塩基、平均分子量二８６．７００ダルトン）の量は１
０１００ｎ即ち１．８３ｐｍｏｌ／ｃｍ２）以上、好ま
しくは１μｇ（即ち１８．３ｐｍｏ　１７ｃｍ２）から
１０μｇ（即ち１８３ｐｍｏｌ／ｃｍ２）であった。こ
れらの事から、逆転写酵素反応に最も好ましい固相化オ
リゴｄ　Ｔ　Ｉｌ＋−２４：ポリＡの組み合わせは、固
相化されたオリゴｄＴ’＋ｅ−２，Ｉを１としてモル比
で１１５０〜０゜３であり、更に好ましくは、７０〜７
であった。

実ＩＮ例４ 上記実施例の結果より得られた至適な条件のひとつであ
る１０ｎｇの固相化オリゴｄ　Ｔ’ｔｏ−ａａと１μｇ
のポリＡの組み合わせに於て、実施例２に従って、３７
℃で１８時間逆転写酵素反応を行なった。

この時、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素の存在量を０．０．
０１．０．１．１および１０ｍＵ（以上、溶沿量は各々
５０μｇ）として各々実施し、その後実施例１（３）に
従って吸光度を測定した時に　第７表に示す吸光度が得
られた。この表から明らかなように吸光度は酵素量に依
存していた。

第 表 逆転写酵素 吸光度 ＊ ０．０　１　　　　　　０．０　１　７０．１　　　　
　　　０．１３８ １　　　　　　　　　１．１７５ １　０　　　　　　　　　２．７　２　４傘　　λ　±
　４０５ｎｍ 実施例５ 逆転写酵素活性阻止抗体の定量 Ｍｏ１ｔ−４細胞（大日本製薬■より購入）をヒト免疫
不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｉｓ＋ｇ＋ｕｎｏ−ｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　；　ＨＩ　Ｖ　）に感染
させ、この細胞を１０％牛脂児血清を添加したＲＰＭｒ
−１６４０培地（ギブコ社１）中、炭酸ガス濃度５％、
３７℃で２週間前後培養した。

培養上清を３０，０００ｒｐｍで１時間遠心してウィル
ス粒子ベレット（１０６個）を取得し、これを０．５％
　トリトンＸ−１００，０，８ｍＭ　ＮａＣ１，０，５
ｍＭ　フェニルメチルスルフォニルフロライド、２０％
グリセリン及び５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，８）と
からなるｌＩ衝新液懸濁し、酵素液とした。

一方、ＨＩＶ感染者から得た血清を５０ｍＭエチレンジ
アミン−酢酸＃を新液（ｐＨ７、Ｏ）にて２０倍に希釈
し、その１ｍｌをＱＡＥ−セファデックスＡ　−５０カ
ラム（ゲルペット１ｍ１）へ通し、その素通り画分４ｍ
ｌを、部分精製した抗進転写酵素抗体として使用した。

最初に、２５μｍの上述した酵素液と２５μｍの抗体原
液、１／１０及び１／１００希釈液あるいはＰＢＳをそ
れぞれ混合し、４°Ｃで３０分間インキュベートした。

実施例２で記述した手法に従って、この混合液中に殊存
している逆転写Ｕ素活性を測定した。その結果第８表に
示すような吸光度が得られ、血清中に存在する抗進転写
酵素抗体が定量された。

第　　　８　　　表 抗体希釈倍率 吸 光 度 ＊ Ｘ　　　　１　　　　　　　　　０．０２８Ｘ　　　１
０　　　　　　　　　０．２５１ｘｌＯＯＯ，６３１ （抗体なし）　　　　　　０．７４４ ＊　　＾＝４０５ｎｍ 実施例６ オリゴｄＴａｉ長の違いによる逆転写酵素反応 鎖長がそれぞれ、８．１０．１２．１５．１２〜１８．
１９〜２４．２５〜３０および２７２のオリゴｄＴ（す
べてファルマシア社製）の２００ｎｇずつを実施例１（
１）に記載した方法でアミノプレートに固定し、実施例
２の条件で１μｇのポリＡを用ＶＸで０．１ｍＵの逆転
写酵素を作用せしめ、実施例１（３）に記載の方法に準
じて伸長したビオチン化ＤＮＡを測定した。

オリゴｄＴの長さと吸光度の程度の関係を第９表に示し
た。オリゴｄＴ鎖の長さ番；応じて吸光度は上昇した。

鎖の長さは、１０以下においては好ましくなく、１２以
上【こお）ｓて好ましい結果であり、従って通常、鎖の
長さは１１以上で用いられることが確認された。

（以下余白） 第 表 オリゴｄＴ　　　　吸　光 度 ＊ の鎖長（ｎ） ８　　　　　　　　　０．００８ １０　　　　　　　　０．０４９ １２　　　　　　　　０．０９２ １５　　　　　　　　０．１０７ １２〜１８　　　　　　０．１１４ １９〜２４　　　　　　０．２０８ ２５〜３０　　　　　０．４８１ ２７２　　　　　　　０．６８７ ＊　　λ＝４０５ｎｍ 実施例７ ｄＴＴＰ添加量によるビオチン化ＤＮ Ａの検出感度の変化 実施例１（１）の記載に準じて固定したオリゴｄＴ＋ｅ
−ａ４固定プレートに、実施例１（２）で記載した２箔
製度の反応ｌ！衝新液５μｍを分取し、ｌμｇ／μｍの
ポリＡを１μｌ加えた。一方、ピオチン化−１１−ｄＵ
ＴＰとｄＴＴＰをその混合モル比でそれぞれ１：０．１
：３．１：４．１　：　５．７．１：９．１　：　１２
．３．１：１９．１：２４．１：２９、に３９．１：４
９および１：９９となるように混合し、これらの混合液
をピオチン化−１１−ｄＵＴＰとｄＴＴＰを併せて最終
濃度が０．３ｍＭになる様に調製した。

これらの０．３ｍＭ　ピオチン化−１１−ｄＵＴＰとｄ
ＴＴＰの混合液をそれぞれ４μｍ（１，２ｎｍｏｌ）ず
つ、前述のオリゴｄＴ、。−２４固定プレートに加え、
反応緩衝液と１μｇポリＡからなる溶液と混合した。

更にＰＢＳで１ｍＵ／　　５０μｌとなる様に調製した
ＲＡＶ−２由来逆転写酵素の５０μｌを各ウェルに加え
、混合した後に３７℃で１８時間インキュベートし、実
施例１（３）の記述に準じてヒニオチン化ＤＮＡを定量
した。

ビオチン化−１１−ｄＵＴＰとｄＴＴＰの各混合モル比
に於ける吸光度を第１０表に示した。

第 表 ビオチン化ｄＵＴＰ　：　ｄＴＴＰ 温合モル比 吸 光 度＊ １　：　０ １　：　３ １：４ １：５．７ １　：　９ １　　：　　１２．３ １　＝　１９ １　＝　２４ １　＝　２９ １　：　３９ １　：　４９ １　：　９９ １．５７５ １．８５９ １．９１０ １．７８０ １．６４９ １．５２０ １．３５１ １．１２４ １．０５２ ０．８９５ ０．７５２ ０．４４２ ＊　λ＝４０５ｎｍ この結果から明らかなように、ビオチン化−１１−ｄＵ
ＴＰとｄＴＴＰの混合モル比がｌ：４の時に最も良い感
度が得られた。

実施例８ オリゴｄＴプライマーを固定したカル ボキシル化プレート上での逆転写酵素 反応 ＤＮＡ合成機（サイクロン、バイオサーチ社製）により
合成した、５°末端のリン酸基にアミン基を修飾したオ
リゴｄＴ２゜２００ｎｇを２５μｌの水に溶解した。こ
れをカルボプレート（住友ベークライト社製）のウェル
に入れた。次に２００ｍＭＣＤＩを含む２００ｍＭ　　
ＩＭＤ、２５μｌをウェルに分取し、液を混合した後、
室温で２４時間インキュベートした。反応後、この液を
捨て、ＴＢＳ　　２００μｍにてウェルを３回洗浄し、
固相化ブライマーとした。

０．１ｍＵ、０．５ｍＵ、１ｍＵおよび１０ｍＵのＲＡ
Ｖ−２由来逆転写酵素を用い、実施例２に記載の方法に
準じて測定した。逆転写酵素量０．１ｍＵ、０．５ｍＵ
、１ｍＵおよび１０ｍＵで伸長鎖反応を行なった時に得
られた吸光度は第１１表に示した通りであり、測定が可
能であった。

第　　　１１　　　表 逆転写酵素 吸　　光　　度 ＊ ０．１　　　　　　　　０．１０４ ０．５０．４８６ １　　　　　　　　　　０．７５８ １０　　　　　　　　　２．５３ ＊　　＾＝４０５ｎｍ 実施例　９ オリゴｄＴ、。−２４を紫外線照射により固相化したマ
イクロプレート上での 逆転写酵素反応 ２００ｎｇのオリゴｄＴ＋ｏ−２，ｌを、０．１λ（Ｍ
ｇＣ１２を含むＰＢＳ　　５０μｌ中に溶解し、これを
マイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に
分取し、室温で２４時間放置した。次いで、この容器を
捨て、波長２５４ｎｍの紫外線を３分間、プレートに照
射してオリゴｄＴ、。−２４をプレート上に固定し、Ｔ
ＢＳ　　２００μｍにてウェルを３回洗浄し、これを使
用して実施例８と同じ条件で逆転写酵素反応を行なった
。逆転写酵素量０．１ｍＵ、０．５ｍＵ、１ｍＵおよび
１０ｍＵで伸長反応を行なった時１こ得られた吸光度を
第１２表に示す。

第　　　１２　　　表 逆転写酵素 （ｍＵ） ０．１ ０．５ 吸　　光　　度　＊ ０．０　１　８ ０．０９１ ０．１４１ １．２　３　９ ＊ λ＝４０５ｎｍ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも、水性媒体中で、人為的に、調製され
   たアデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡ、該アデニ
   ンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な固相化さ
   れたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビオチン
   化デオキシウリジントリホスフェートとを被検液の存在
   下反応せしめ、該反応の反応生成物と未反応のビオチン
   化デオキシウリジントリホスフェートを分離した後、反
   応生成物もしくは未反応のビオチン化デオキシウリジン
   トリホスフェートの量を測定することを特徴とする被検
   液中の逆転写酵素の決定方法。
2. （２）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、オリゴデオキシチミンヌクレオチドの５′末端と固
   相とが化学結合している固相化されたオリゴデオキシチ
   ミンヌクレオチドである請求項第１項記載の決定方法。
3. （３）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、１１塩基以上のヌクレオチド残基からなる請求項第
   １項記載の決定方法。
4. （４）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、０．１５ｐｍｏｌ／ｃｍ＾２〜５．０ｐｍｏｌ／ｃ
   ｍ＾２であり、アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮ
   Ａが、固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   を１としてモル比で１１５０〜０．３の比でハイブリダ
   イズせしめたものである請求項第１項記載の決定方法。
5. （５）反応に際し、さらにデオキシチミジントリホスフ
   ェートを含有せしめることを特徴とする請求項第１項記
   載の決定方法。
6. （６）少なくとも、水性媒体中で、人為的に調製された
   アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡ、該アデニン
   リボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な固相化され
   たオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビオチン化
   デオキシウリジントリホスフェートとを被検体液および
   逆転写酵素の存在下反応せしめ、該反応の反応生成物と
   未反応のビオチン化デオキシウリジントリホスフェート
   を分離した後、反応生成物もしくは未反応のビオチン化
   デオキシウリジントリホスフェートの量を測定し、この
   量から被検体液中の逆転写酵素中和抗体価を求めること
   を特徴とする被検者のレトロウイルスの感染確認法。
7. （７）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、オリゴデオキシチミンヌクレオチドの５′末端と固
   相とが化学結合している固相化されたオリゴデオキシチ
   ミンヌクレオチドである請求項第６項記載の感染確認法
   。
8. （８）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、１１塩基以上のヌクレオチド残基からなる請求項第
   ６項記載の感染確認法。
9. （９）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、０．１５ｐｍｏｌ／ｃｍ＾２〜５．０ｐｍｏｌ／ｃ
   ｍ＾２であり、アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮ
   Ａが、固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   を１としてモル比で１１５０〜０．３の比で混合してハ
   イブリダイズせしめた請求項第６項記載の感染確認法。
10. （１０）反応に際し、さらにデオキシチミジントリホス
    フェートを含有せしめることを特徴とする請求項第６項
    記載の感染確認法。