JPH0414032B2

JPH0414032B2 -

Info

Publication number: JPH0414032B2
Application number: JP58212284A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiko Suyama; Kunihiko Takagi
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1983-11-10
Filing date: 1983-11-10
Publication date: 1992-03-11
Also published as: JPS60103964A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規な抗血栓性材料に関するもので
ある。

人工血管、シヤントチユーブ、カテーテル、カ
ニユーラ、人工腎臓、人工心臓、人工弁、人工
肺、血流量や血中ガス濃度測定のため血管に挿入
する各種センサーなどのように直接血液と接触す
る形で使用される医用材料分野においては、血液
と接触することによつて惹起される材料表面での
血栓形成をいかにして抑えるかが大きな問題とな
つている。これは、形成された血栓が血液中に流
れ出出る事により各種の重大な障害を惹き起こす
からである。

生体内では、血液凝固系においてフイブリンは
絶えず一定の割合で形成されると同時に、いつた
ん形成されたフイブリンは、線溶系（フイブリン
溶解系）において絶えず溶解していくことによつ
て平衡状態が保たれている。

しかし、たとえば血液が異物と接触するなど、
何らかの原因によつてこの平衡状態が破れると、
血液凝固系における一連の複雑な酵素反応により
最終的にはフイブリノーゲンが不溶性のフイブリ
ンに変化して血栓形成をひきおこすこととなるの
である。直接血液と接触する形で使用される医
用材料として高分子材料が多く使用されている
が、抗血栓性の高分子材料を得る方法としては、
(1)材料の表面エネルギーをできるだけ低くして不
活性にする、(2)表面に負荷電を与える、(3)親水性
の部分と親油性の部分とのミクロドメインをもつ
不均一構造とする、(4)高含水率のハイドロゲル構
造とするなどにより血液成分との相互作用を弱め
ることにより高分子材料自体を抗血栓性とする方
向と、(5)ヘパリンなどの血栓形成を阻害する物質
を表面に固定化する、(6)形成された血栓の溶解を
促進する物質であるストレプトキナーゼやウロキ
ナーゼを材料の表面に固定化するなどの血栓形成
を阻害する物質を利用する方向、さらには(7)人工
血管や人工心臓弁などに用いられているように人
工材料の上に生体自身の細胞の表面被覆を作る、
(8)コラーゲンや動物の心のう膜、生体弁などに代
表される生体物質を用いるなどの生体自身の利用
の方向の３つに大別される。

これらの方法の中で、製造することが比較的容
易で、しかも優れた材料特性を有する高分子材料
にその特性を損なうことなく抗血栓を付与するこ
とができる方法として、血栓形成を阻害する物質
を材料の表面に固定化する方法が注目され、実用
化されつつある。

しかし、これらの方法の中で血液と材料が接触
したときにヘパリンが材料表面から血液中に徐放
されることにより血栓形成を防止することを目的
としたヘパリン固定化の抗血栓性材料は、徐放の
結果、材料表面にヘパリンが存在しなくなれば、
その効果はそれ以上期待できないという長期間使
用時の不安が存在する。

一方、綿溶系酵素であり、プラスミノーゲンア
クチベーターであるウロキナーゼを材料表面に固
定化する方法は、材料表面に固定化されたウロキ
ナーゼが触媒的作用でプラスミノーゲンから血栓
溶解酵素であるプラスミンを生成させることを狙
つたものであり、ウロキナーゼの失活や阻害因子
がない限り、半永久的な効果が期待されるが、実
際にはウロキナーゼの失活がおこつたり、あるい
は阻害因子が存在するためかその効果は永久的な
ものではない。したがつて、有効期間を長くする
ためには、例えば材料表面に多量のウロキナーゼ
を固定化することが必要であるが、そのためには
材料の特性が失われるほどの厳しい固定化処理条
件を必要としたり、あるいは好ましい特性を有す
る材料ではあるがこのような多量のウロキナーゼ
を固定化することができないため実用に供しない
場合が多くなるという欠点を有していた。

本発明者らは、固定化のために厳しい処理条件
を必要とせず、固定化のための材料が限定され
ず、かつ長期間の抗血栓性を有する材料を提供す
べく鋭意研究の結果、本発明に到達したものであ
る。

すなわち、本発明は組織プラスミノーゲンアク
チベーターが表面に固定化されていることを特徴
とする抗血栓性材料である。

本発明の抗血栓性材料は、ウロキナーゼが固定
化されている抗血栓性材料よりもはるかに高い抗
血栓性を有し、人工血管、シヤントチユーブ、カ
テーテル、カニユーラ、人工腎臓、人工心臓、人
工弁、人工肺あるいは血流量や血中ガス濃度など
の測定のため血管中に挿入するセンサーなどに利
用することができ、その場合、長期間血栓形成の
抑制が行われるので、本発明の意義は非常に大き
いものである。

本発明における組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターとは、ウロキナーゼを除くプラスミノーゲ
ン活性化因子の総称である。1915年にFleischer
とLoebは組織片が血液凝塊を溶解することを見
出したが、この現象はプラスミノーゲンの活性化
によることがわかり、その後、このようなプラス
ミノーゲンを活性化する因子は各種組織に存在す
ることが見出され、組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターと総称されるようになつたものである。
組織プラスミノーゲンアクチベーターは肝臓以外
のほとんど全ての臓器（特に胎盤、副腎、甲状腺
に多い）に存在する各種臓器内プラスミノーゲン
アクチベーター、涙、唾液、乳汁、胆汁などの分
泌中に見出される分泌液中のプラスミノーゲンア
クチベーター、血管内皮、特に静脈内皮に存在す
る血管内皮プラスミノーゲンアクチベーター、赤
血球に存在するプラスミノーゲンアクチベータ
ー、中性好性顆粒白血球に存在する好中球プラス
ミノーゲンアクチベーターなどがあげられ、これ
らの組織プラスミノーゲンアクチベーターはウロ
キナーゼとは構造を異にするばかりではなく、作
用の仕方がウロキナーゼとは異なるものである。
すなわち、組織プラスミノーゲンアクチベーター
はフイブリンに強い親和性があり、生体内にフイ
ブリンが生成されるとそれに吸着される。一方、
プラスミノーゲンもフイブリンに対して親和性が
あるので吸着される。そして、このフイブリン上
で吸着されたプラスミノーゲンが吸着された組織
プラスミノーゲンアクチベーターにより活性化さ
れてプラスミンを生成しフイブリンを溶解してい
く。このように、反応が主としてフイブリン分子
上で行われるということはフイブリンに対して強
い親和性のないウロキナーゼの場合とは異なり、
いつたん生成したフイブリンを溶かす作用はウロ
キナーゼよりはるかに大きいものである。この組
織プラスミノーゲンアクチベーターを工業的規模
で取得するには、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターを生成する能力を有する組織あるいは細胞
を培養し、この培養液から単離精製することによ
つて行われる。このような組織プラスミノーゲン
アクチベーターを精製する能力を有する細胞とし
ては、卵巣、肺、甲状腺、腎臓、前立腺などの腫
瘍細胞、メラノーマ、ラウス肉腫により形質転換
された腺維芽細胞、ヘラ細胞と腺維芽細胞などが
あげられる。また、遺伝子組み替え技術により、
ヒト細胞の組織プラスミノーゲンアクチベーター
を産生する遺伝子を大腸菌に組み込み、この大腸
菌を用いて組織プラスミノーゲンアクチベーター
を工業的規模で得ることも可能である。

本発明において組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターを固定化するために用いられる材料として
は、組織プラスミノーゲンアクチベーターを吸着
することのできるもの、あるいは組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターをイオン結合又は共有結合
で結合することのできる官能基を有するもの、さ
らには化学的処理によつてそのような官能基を導
入することのできるもの、あるいは表面にコーテ
イング処理を施すことによつてこのような官能基
を導入することのできるものであればどのような
材料でも用いることができる。

これら材料表面に組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターを固定化するには、線溶系酵素の固定化
についてすでに知られている多くの固定化の方法
が利用できる。例えば、特開昭51−81876号公報、
同52−90688号公報（以上ポリアミド）、特開昭51
−95472号公報、同51−103190号公報、同52−
10378号公報（以上ポリエステル）、特開昭53−
79964号公報（ハロゲン原子を有する樹脂）、特開
昭53−82900号公報（シリコン樹脂）、特開昭53−
106778号公報（ポリウレタン）、特開昭53−
120883号公報（セルロース及びその誘導体）、特
開昭53−129480号公報（ポリビニルアルコール及
びその誘導体）、特開昭53−88390号公報、同54−
26394号公報（以上固体表面）などに記載の線溶
系酵素の固定化方法を利用すればよい。また、ガ
ラス、金属、セラミツクスなどの表面に固定化す
る場合は、有機高分子の皮膜をその表面に形成さ
せたのち、上記のごとき方法を用いることによつ
てその表面に組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーを固定化することが可能である。

そして、本発明の抗血栓性材料の表面に固定化
された組織プラスミノーゲンアクチベーターの線
溶活性は、例えば発色合成基質による方法
（SimadaHら、Thrombos Haemostas，46 507
（’81）〕やフイブリン平板の溶解度の大きさを測
定するフイブリン平板法〔金井、金井編著「臨床
検査法提要」改訂第27版（金原出版）VI−110〕
を応用して測定可能である。後者の方法において
は、試料片をフイブリン平板上におき37℃で24時
間放置したのち試料片のまわりのフイブリン膜の
溶解窓の大きさより線溶活性を評価するが、本発
明の抗血栓性材料はこの方法で測定した場合に溶
解窓が認められる。

以下、実施例によつて本発明をさらに具体的に
説明する。なお、実施例中のウロキナーゼ及び組
織プラスミノーゲンアクチベーターの酵素活性
（単位）は標準フイブリン平板法〔Astrap，T.
and Miillertz，S.Arch.Biocem.40 346〜351
（’52）〕で測定し、標準ウロキナーゼ標本を用い
てIuに換算し、単位としたものである。

実施例１エチレン−酢酸ビニルコポリマー（酢酸ビニル
含量25wt％）からなる内径1.5mm、外径2.5mm、長
さ20cmのチユーブの内外面に以下の(1)，(2)及び(3)
の処理を施すことによつて固定化用のチユーブを
得た。

(1) 水を20wt％含むメタノール溶液に水酸化ナ
トリウムを15wt％となるように溶解させた溶
液を用いて50℃で２時間処理を行うことにより
チユーブ表面をケン化したのち十分水洗浄を行
う。

(2) 続いてアミノセタノール2vol％及び1N塩酸
50vol％を含有する水溶液を用いて58℃で６時
間処理を行うことによりチユーブ表面にアミノ
基を導入したのち十分水洗浄を行う。

(3) マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体
を4wt％含有する脱水アセトン溶液を用いて25
℃で１時間処理することによりチユーブ表面に
酸無水物基を導入させたのち脱水アセトンで十
分洗浄を行い、６時間減圧乾燥を行う。

以上の処理を行うことによつて得られたチユー
ブを、1/10Ｍ酢酸バツフアーが10vol％添加され、
組織プラスミノーゲンアクチベーター（メラノー
マ由来のセルラインの培養液中に分泌されたもの
を分離精製した比活性84000Iu／mgのもの）を
1200単位含有する生理食塩水溶液を用いて７℃で
72時間処理を行つたのち、十分に水洗洗浄し減圧
乾燥することにより、組織プラスミノーゲンアク
チベーターが表面に固定化されたチユーブを得
た。このチユーブを３mmの長さに切り、フイブリ
ン平板にて線溶活性を測定したところ、溶解窓の
大きさは452mm²であつた。

比較のため、上記の場合と同一素材、同一寸法
のチユーブを上記の場合と同様に(1)、(2)及び(3)の
処理を行つたのち1/10Ｍ酢酸バツフアーが10vol
％添加され、ウロキナーゼを1200単位含有する生
理食塩水溶液を用いて７℃で72時間処理を行い、
十分水洗洗浄し減圧乾燥することによりウロキナ
ーゼを固定化したチユーブを得た。

上記のようにして得られた２種類のチユーブの
抗血栓性を以下のようにして評価した。すなわち
雄の家兎の右側の大腿動脈及び左側の大腿静脈を
剥離し、未梢側を結紮したのちハサミでＴ字型に
切開を入れた個所にそれぞれのチユーブを挿入し
結紮してＡ−Ｖシヤントを形成し、毎日観察する
ことにより回路内に血栓ができて閉塞する日数を
調べたところ、ウロキナーゼを固定化したチユー
ブの場合は16日で閉塞したが、組織プラスミノー
ゲンアクチベーターを固定化したチユーブの場合
は36日間開存していた。

また、ウロキナーゼの使用量を８倍量の9600単
位使用して得たウロキナーゼ固定化チユーブの抗
血栓性を同様に調べたが、開存日数は19日であり
抗血栓性の改善は著しいものでなく、上記組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター固定化チユーブに
比較してまだ劣つたものであつた。

実施例２シリコーン製チユーブ（内径1.5mm、外径2.5
mm、長さ20cm）に、下記の(1)及び(2)の処理を施す
ことによつて固定化用のチユーブを得た。

(1) シリコーンレジンKR101−10（信越シリコー
ン株式会社製）及びKE−45−TS（信越シリコ
ーン株式会社製）のそれぞれ10部（重量部、以
下同じ）をトルエン50部及びメチルエチルケト
ン50部の混合溶媒に溶解させた溶液中に、チユ
ーブを２分間浸漬後引き上げて風乾し、ついで
100℃で60分間減圧乾燥を行う。

(2) ついで、このチユーブを無水マレイン酸−メ
チルビニルエーテル共重合体0.6部及び分子量
400のポリエチレングリコール0.3部をアセトン
99.1部に溶解させた溶液に15秒間浸漬後引き上
げて100℃において、180分間減圧乾燥を行う。

以上の(1)及び(2)の処理を施すことによつて得ら
れたチユーブを、1/10Ｍ酢酸バツフア−が10vol
％添加され、実施例１で使用したものと同じ組織
プラスミノーゲンアクチベーターを600単位を含
有する生理食塩水溶液を用いて７℃で72時間処理
を行い、十分に水洗洗浄したのち減圧乾燥するこ
とにより、組織プラスミノーゲンアクチベーター
が表面に固定化されたシリコーンチユーブを得
た。このチユーブを３mmの長さに切り、フイブリ
ン平板法で測定した溶解窓の大きさは316mm²であ
つた。

比較のため、上記の場合と同じシリコーンチユ
ーブを上記の場合と同様に(1)及び(2)の処理を施し
たのち1/10Ｍ酢酸バツフアーが10vol％添加され、
ウロキナーゼを600単位含有する生理食塩水溶液
を用いて７℃で72時間処理して十分水洗洗浄後減
圧乾燥することによりウロキナーゼを表面に固定
化したシリコーンチユーブを得た。

これらチユーブの抗血栓性を実施例１と同じ方
法で評価したところ、組織プラスミノーゲンアク
チベーターを表面に固定化したシリコーンチユー
ブの開存日数は31日であつたが、ウロキナーゼを
表面に固定化したシリコーンチユーブの開存日数
は14日であつた。

実施例３ポリ塩化ビニル製チユーブ（内径1.5mm、外径
2.5mm、長さ20cm）を無水マレイン酸−メチルビ
ニルエーテル共重合体0.04部及び分子量400のポ
リエチレングリコール0.06部をアセトン99.9部に
溶解させた溶液に30秒間浸漬し、次いで引き上げ
て80℃で60分間加熱処理する操作を２回繰り返す
ことにより固定化用のチユーブを得た。

このチユーブを実施例１と同様にして組織プラ
スミノーゲンアクチベーターを1200単位含有する
溶液で処理することによつて、組織プラスミノー
ゲンアクチベーターが表面に固定化されたポリ塩
化ビニルチユーブを得た。このチユーブを３mmの
長さに切り、フイブリン平板法で測定した溶解窓
の大きさは480mm²であつた。

比較のため、上記の場合とチユーブを用いて比
較例１と同様にしてウロキナーゼを1200単位含有
する溶液で処理することによつて表面にウロキナ
ーゼが固定化されたポリ塩化ビニルチユーブを得
た。

それぞれのチユーブについて実施例１と同じ方
法で抗血栓性を評価したところ、組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターの固定化されたチユーブの
場合の開存日数は30日であつたが、ウロキナーゼ
固定化チユーブの場合の開存日数は15日であつ
た。

Claims

【特許請求の範囲】

１組織プラスミノーゲンアクチベーターが表面
に固定化されていることを特徴とする抗血栓性材
料。