JPH04117299A - 細菌検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細菌を寒天培地上で培養し、還元系発色試薬
を用いて検出する方法に関する。

［従来技術］ 食品及び医療業界等において、細菌の生菌数を測定する
ことは食品及び関連設備等環境全般の細菌による汚染状
況を知ると共に、食中毒の予防ならびに衛生管理、指導
の上で重要である。

従来、細菌の生菌数を測定する方法としては、標準寒天
培地等の固形培地を用いて検体がら採取した細菌を培養
し、出現したコロニーを肉眼で測定する方法等がある。

また、コロニーの測定を容易にするために培地中に還元
系発色試薬、例えば２．３．５−　トリフェニルテトラ
ゾリウムクロライド（ＴＴＣ）等を添加して、細菌の産
生する脱水素酵素により発色試薬が還元されコロニーが
出現した部分を赤紫色に呈色させてコロニーを測定する
方法も知られている。

しかしながら、従来用いられている検査用固形培地では
、細菌の培養に２０〜４８時間の長時間を要するために
、迅速な検査が要求される実際の検査には十分対応でき
ないという大きな問題点があった。また、細菌の検出を
より容易にするために添加されている発色試薬の中には
、細菌の増殖を阻害する作用があるものや色調変化が鮮
明でないものもあり、迅速な測定には余り好ましくない
ことも分かっている。例えば、ＴＴＣは、培地に添加し
た場合コロニーが赤紫色を呈して測定し易い利点がある
が、反面細菌の増殖を若干阻害する作用がある。特に、
ブドウ球菌等のグラム陽性球菌に対して阻害作用が著し
いことが分かっている。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、細菌の培養が短時間で行なえ
、かつ簡便で高感度に細菌を検出することができる細菌
の検査方法を提供することである。

［問題点゛を解決するための手段コ 本発明者らは、鋭意研究の結果、トリブチケースソイ寒
天培地及び肉汁加寒天培地の混合培地で検体中の細菌を
培養させると、短時間で増殖させることができることを
見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、トリプチケースソイ寒天培地及び
肉汁加寒天培地から成る寒天培地で細菌を培養した後、
還元系発色試薬を含有する支持体を該寒天培地上に重層
し、還元系発色試薬の色調の変化により細菌を検出する
ことを特徴とする細菌検出方法を提供する。

［発明の効果］ 本発明の細菌検査方法により、細菌を簡便、迅速にかつ
高感度に検出することができる。また、広範囲の種類の
細菌を検出することが可能であるので一般的な検査には
非常に有用である。

［発明の詳細な説明］ 本発明の細菌検出方法において用いる寒天培地（以下２
本寒天培地と言う）は、トリプチケースソイ寒天培地と
肉汁加寒天培地とを混合比９：ｌ〜４：６、好ましくは
６．４〜５：５で混合したものを用いることができる。

従来−射的に用いられている標準寒天培地と細菌の増殖
性を比較した場合、トリプチケースソイ寒天培地はコロ
ニー数は多いが個々のコロニーが小さいという欠点があ
り、肉汁加寒天培地は個々のコロニーは大きいがその数
が少ないという欠点を有していた。

しかしながら、両培地を上記の割合で混合して得られる
本寒天培地は、コロニーの増殖性、大きさ共に細菌の検
出には十分なものである。

さらに、本寒天培地には、細菌の増殖をさらに促進させ
て培養時間を短縮し、迅速に検査を行なうために細菌増
殖促進効果を有する物質を添加することができる。増殖
促進物質としては、従来用いられているビタミン類、Ｔ
ＣＡ回路関連物質、各種アミノ酸等を用いることができ
るが、本発明においてはピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グ
ルタミンを用いることが特に好ましい。ピルビン酸ナト
リウムを添加する場合、添加濃度は好ましくは０００１
〜０．０５重量％、より好ましくは０．００５〜０．０
１重量％である。添加濃度が０．００７５重量％より高
くなると若干の増殖阻害が認められる。ピルビン酸ナト
リウムは寒天培地を調製する時に一緒に加えてから滅菌
することができる。また、Ｌ−グルタミンを添加する場
合は、添加濃度は好ましくは０．０７５〜０．１重量％
である。添加量が０．１重量％を越えるとＬ−グルタミ
ンが瀉解しにく（なるので好ましくない。し−グルタミ
ンは滅菌済の培地に無菌的に加えることができる。

本寒天培地は３７〜３８℃で７〜８時間培養することが
好ましい。８時間以上培養してもコロニー数にはほとん
ど変化が見られない。

本発明において、本寒天培地で増殖し、目視で確認でき
ないコロニーを高感度に検出するために還元発色試薬を
含有させた支持体を培地上に載せ、細菌の産生ずる脱水
素酵素で還元発色試薬が還元され色調が変化することで
コロニーをより正確に測定することができる０本発明に
用いられる還元系試薬としては、ＴＴＣ、レザズリンナ
トリウム、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムク
ロライド（ＩＮＴ）等を挙げることができる。中でもＩ
ＮＴは色調変化（無色から赤紫色に変化する）が明瞭で
検出感度に優れているので最も好ましく用いられる。

還元系試薬は、吸水性のある支持体に適当な溶媒に溶解
して含浸させるかあるいは粉末状のものを接着剤で塗沫
して用いることができる。支持体としては、吸水性のあ
ろ紙又は合成樹脂性のフィルムが好ましく用いられるが
、これらに限定されるものではない。例えば、ＩＮＴを
用いる場合、ＩＮＴを０．１〜５　ｍｇ／＋１の濃度に
水又は適当な緩衝液に溶解し、ろ紙に染み込ませた後乾
燥させて用いることができる。特に、ＩＮＴをＭ／１０
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，Ｏ）に濃度０．８ｍｇ／ｗ
＋１で溶解して用いる時、最も高感度に細菌を検出する
ことができる。また、ＩＮＴは粉末のまま乳鉢等で細か
くすりつぶした後、接着剤で合成樹脂性フィルムに塗沫
して用いることもできる。この場合、フィルム及び接着
剤の材質は還元性物質に対して不活性であれば構わない
が、アクリル系の接着剤や塩化ビニル系のフィルムを使
用し、フィルム当たり１０〜１００　ｔｃｇ７ｃｍ”　
、好ましくは３０ｕｇ／ｃｍ”塗沫するのが望ましい。

本発明の細菌検査方法は、検体として食品関連では食材
、調理した食品、加工品、調理に使用する器具、器材、
調理に従事する人の手指等を対象として行なうことがで
きる。また、医療関連では、院内の机、床、患者、医療
従事者の手指等が挙げられる。検体が固体の場合、寒天
培地を直接密着させるか或は寒天培地を滑らせて細菌を
採取し、検体が液体状の場合は至適量を寒天に滴下した
後コンラージ棒で均一に拡散させて細菌を採取すること
ができる。

次に、本発明の細菌検査方法を具体的に説明するが、こ
れに限られるものではない。

まず、トリプチケースソイ寒天培地、肉汁加寒天培地及
び細菌増殖促進物質としてピルビン酸ナトリウムを精製
水に加えて加熱滅菌した後、Ｌ−グルタミン溶液を無菌
的に添加してシ々−レに分注、放冷して固化する。寒天
培地は検体から細菌を採取し３７〜３８℃で７〜８時間
培養した後、シャーレを取り出してＩＮＴを含有させた
ろ紙を寒天培地上に重層して５分間放置する。シャーレ
の底からＩＮＴの色調変化を観察する。細菌が存在すれ
ばろ紙が無色から赤紫色に発色する。

定量する場合は、細菌の存在を示す赤紫色の斑点を計数
し、コロニー数とする。

「実施例コ 以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本
発明の実施例はこれらに限られるものではない。

叉１１１ニ トリプチケースソイ寒天培地（ＢＢＬマイクロバイオロ
ジーシステム社製）２０ｇ及び肉汁加寒天培地（オクソ
イド社製）２０ｇを精製水ＩＰ！に加え１２１℃で１５
分間加熱滅菌した後、シャーレ（直径３．５ｃ＋ｓ　）
に４．５ｗ＋１ずつ分注し、放冷固化させた。比較培地
として標準寒天培地（日水製薬株式会社製）３５ｇを精
製水ｌＩ２に加え同様にして滅菌、分注した。３６人の
両手指をそれぞれの寒天培地に擦り付けて菌を採取した
後、３７℃で８時間培養した。シャーレを取り出し培地
上にＩＮＴ含有フィルムを重層し５分間放置した後、出
現したコロニー数を数えた。シャーレ当たり１０個以上
のコロニーが出現したものを陽性として各培地の歯検出
の陽性率を求めた。同様の試験を２度行なった。その結
果を表１に示す。

なお、ＩＮＴ含有フィルムは日東電工社製白色フィルム
にＩＮＴを３０μｇ／ｃｍ”の割合で塗沫したものを用
いた。

表１から明らかなように、本発明による方法での歯検出
陽性率は約５６％、標準寒天培地を用いた場合は約３５
％であり、本発明の方法が優れていることが分かる。

表 叉ＩＵ九２ 実施例１の本寒天培地に、ピルビン酸ナトリウムをそれ
ぞれ０．０．００１．０．０（１２５，０，（１０５０
、００７５，０，０１，０，０５重量％添加する以外は
実施例１と同様にして寒天培地を作製した。次に、予め
菌のコロニー形成単位ｆｃＦＵ／ｆｆ１ｌｌを約５００
ＣＦＩＩ／ｍｌに滅菌食塩水で調整した指標菌１　（黄
色ブドウ球菌）、２（表皮ブドウ球菌）、３（表皮ブド
ウ球菌）を各々滅菌ろ紙（直径３　ｃｍ）に０２ｍ１ず
つ滴下し、該ろ紙を各寒天培地に密着させて菌を接種し
た後、３７℃で８時間培養した。培養後、シャーレを取
り出し実施例１と同様にして出現したコロニー数を数え
、シャーレ３枚の平均値を求めた。その結果を表２に示
す。

表２からピルビン酸ナトリウムを添加することにより菌
の検出率が高くなることが分かる０反面ピルビン酸ナト
リウム濃度が０．０７５％より高くなると菌の増殖が若
干悪くなる傾向が見られた。

表 叉１１引旦 実施例１と同様にして調製、滅菌した寒天培地を５５℃
に保温しておき、Ｌ−グルタミンを無菌的に０．０．０
７５．０，０１．００５．０．１重量％ずつ添加、溶解
した後、各々シャーレ（直径３．５ｃｍ　）に分注し放
冷同化した。得られた寒天培地は実施例２と同様にして
指標菌を接種、培養し、出現したコロニー数を数え、シ
ャーレ３枚の平均値を求めた。その結果を表３に示す。

表３より、Ｌ−グルタミンを添加することにより細菌の
増殖が促進されることが分かる。

表 実ｍ 指標菌ｌのみを接種することを除いて実施例１と同様に
して寒天培地にて培養した。培養５．６．７．８．１０
．１５．２４．４８時間後にシャーレを取り出し、ＩＮ
Ｔ、ＴＴＣ又はレザズリンナトリウム含有ろ紙を重層し
５分間放置した後、還元系発色試薬の色の変化又は目視
で判定してコロニー数を数え、シャーレ３枚の平均値を
求めた。なお、ＩＮＴ、ＴＴＣ及びレザズリンナトリウ
ム含有ろ紙の調製は次のように行なった。

すなわち、Ｍ／１０トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に
ＩＮＴを０．８＋ｎｇ／ｍｌ　、ＴＴＣを０．８■ｇ／
ｍｌ　、レザズリンナトリウムを０．３２ｍｇ／＋ｏｌ
の濃度で溶解した各液にろ紙を浸漬した。

結果を表４に示す。

還元系発色試薬としてＩＮＴを用いる時、細菌の検出感
度が最も良いことが分かる。

表 叉Ｊｌ旦 実施例１で調製した寒天培地にピルビン酸ナトリウム０
．０７５％及びＬ−グルタミン０．１％を加えることを
除いて実施例４と同様にして指標菌ｌを接種、培養した
。比較寒天培地として実施例１で用いた標準寒天培地を
用いた。培養５．６．７．８．１Ｏ１１５，２４，４８
時間後にシャーレを取り出し、実施例１で使用したＩＮ
Ｔ含有フィルムを重層し５分間放置した後、コロニーの
数を数え、シャーレ３枚の平均値を求めた。結果を表５
に示す。

本発明の検出方法を用いた方が細菌の増殖が早く、迅速
に細菌の検出ができることが分かる。

表 塞ＪＪＬ旦 実施例５で調製した本寒天培地及び標準寒天培地で３６
人の両手から菌を採取し、３７℃で８時間培養した。培
養後、シャーレを取り出し実施例５で用いたＩＮＴ含有
フィルムを重層して５分間放置した。出現したコロニー
の数を数え、シャーレ当たり１０個以上のコロニーが出
現したものを陽性とした。同様の検査を２度行なった。

その結果を表６に示す。

本発明の検出方法での陽性率は６７〜６８％、標準寒天
培地を用いた方法での陽性率は３３〜３６％であり、本
発明の検出方法の方が細菌の検出率が高いことが分かる
。

表 実１１引ユ 実施例５で調製した本寒天培地及び標準寒天培地に表７
に示す市販の各種食材を検体として菌を採取し３７℃で
８時間培養した。培養後、シャーレを取り出し、実施例
５で用いたＩＮＴ含有フィルムを重層して５分間放置し
た。出現したコロニーの数を数えた。結果を表７に示す
。

表７から、本発明の検出方法の方がより細菌数を正確に
検出できることが分かる。

表 衷１ｕ九旦 実施例６で調製した本寒天培地に表８に示す各種好気性
菌をブイヨンで培養し、シャーレ当たり１００個程度の
菌数になるように希釈して接種した。３７℃で８時間培
養した後、シャーレを取り出し、実施例５で用いたＩＮ
Ｔ含有フィルムを重層して５分間放置した。出現したコ
ロニーの数を数えた。結果を表８に示す、なお、検出さ
れたコロニーの数により次のように検出感度を評価した
。

＋十＋：コロニー数５０以上 ＋＋：コロニー数２数階５〜 ４９ココロー数１１〜２４ 一：コロニー数１０以下 表８から、本発明の検出方法は一般的に検査対象となる
好気性菌全てについて検出が可能であり、検出感度も高
い優れた方法であることが分かる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）トリプチケースソイ寒天培地及び肉汁加寒天培地
   から成る寒天培地で細菌を培養した後、還元系発色試薬
   を含有する支持体を該寒天培地上に重層し、還元系発色
   試薬の色調の変化により細菌を検出することを特徴とす
   る細菌検出方法。
2. （２）上記寒天培地中に細菌の増殖を促進する物質を含
   有することを特徴とする請求項１記載の細菌検出方法。
3. （３）細菌を増殖する物質がピルビン酸ナトリウム及び
   Ｌ−グルタミンであり、添加濃度がそれぞれ０．００１
   〜０．０５％、０．０７５〜０．１％であることを特徴
   とする請求項２記載の細菌検出方法。
4. （４）還元系発色試薬が３−（ｐ−ヨードフェニル）−
   ２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈテト
   ラゾリウムクロライドであることを特徴とする請求項１
   ないし３のいずれか１項に記載の細菌検出方法。
5. （５）還元系発色試薬を含有する支持体が吸水性のある
   紙又は合成樹脂性フィルムであることを特徴とする請求
   項１ないし４のいずれか１項に記載の細菌検出方法。