JPH0398582A - 制限酵素分別精製用ゲル - Google Patents
制限酵素分別精製用ゲルInfo
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- JPH0398582A JPH0398582A JP1234394A JP23439489A JPH0398582A JP H0398582 A JPH0398582 A JP H0398582A JP 1234394 A JP1234394 A JP 1234394A JP 23439489 A JP23439489 A JP 23439489A JP H0398582 A JPH0398582 A JP H0398582A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、制限酵素を特異的に分離するのに使用するゲ
ルに関する。
ルに関する。
（従来技術）
制限酵素は、微生物の生体防御機構として働いたり、遺
伝子組換えの試薬として利用されるなど遺伝子工学の分
野で幅広い作用、用途を有する重要な酵素である。この
ため、制限酵素および他の核酸関連酵素の混合物から所
望の制限酵素のみを分離する精製技術の開発、改良が遺
伝子工学の発展に不可欠となっている。
伝子組換えの試薬として利用されるなど遺伝子工学の分
野で幅広い作用、用途を有する重要な酵素である。この
ため、制限酵素および他の核酸関連酵素の混合物から所
望の制限酵素のみを分離する精製技術の開発、改良が遺
伝子工学の発展に不可欠となっている。
制限酵素を分離精製する手段としては、ヘバリンをアフ
イニティークロマトグデフィーのゲルとして使用するこ
とが有効であることが従来より知られている。
イニティークロマトグデフィーのゲルとして使用するこ
とが有効であることが従来より知られている。
しかし、ヘパリンはゲル化しないため、そのもの単独で
はアフィニティークロマトグラフィーとして使用するこ
とは不可能である。このため、ヘパリンをセファロース
等の担体に固定化することが不可欠であり、製造に手間
とコストがかかるという難点があった。また、ヘパリン
を用いたアフィニティークロマトグラフィーは、混合物
から制限酵素をまとめて吸着するには有効であるが、特
定の制限酵素のみを特異的に吸着することはできなかっ
た。
はアフィニティークロマトグラフィーとして使用するこ
とは不可能である。このため、ヘパリンをセファロース
等の担体に固定化することが不可欠であり、製造に手間
とコストがかかるという難点があった。また、ヘパリン
を用いたアフィニティークロマトグラフィーは、混合物
から制限酵素をまとめて吸着するには有効であるが、特
定の制限酵素のみを特異的に吸着することはできなかっ
た。
（発明が解決しようとする課題）
そこで、本発明は担体に固定化する必要がなくて製造コ
ストが安くてすみ、かつ特定の制限酵素を特異的に吸着
することのできる多糖ゲルを提供することを目的とする
。
ストが安くてすみ、かつ特定の制限酵素を特異的に吸着
することのできる多糖ゲルを提供することを目的とする
。
（課題を解決するための手段）
かかる目的は、κ一カラギーナンゲルおよびｌーカラギ
ーナンゲル等の海藻由来の多糖ゲルからなる制限酵素分
別生成用ゲルを提供する本発明によって達成された。
ーナンゲル等の海藻由来の多糖ゲルからなる制限酵素分
別生成用ゲルを提供する本発明によって達成された。
海藻の熱水抽出物には、制限酵素阻害活性があることが
明らかになっている（特願平１−３１８６５号）。そし
て、この活性は海藻中に含まれる多糖に由来するもので
あり、しかも制限酵素の種類によって阻害活性が異なる
ことがわかっている。
明らかになっている（特願平１−３１８６５号）。そし
て、この活性は海藻中に含まれる多糖に由来するもので
あり、しかも制限酵素の種類によって阻害活性が異なる
ことがわかっている。
本発明者らは、このような事実に基づき、海藻中の多糖
と制限酵素との間には特異的な親和力が存在する可能性
があると考え、海藻中に含まれるゲル化しうる多糖につ
いて様々な制限酵素に対する吸着性を検討した。
と制限酵素との間には特異的な親和力が存在する可能性
があると考え、海藻中に含まれるゲル化しうる多糖につ
いて様々な制限酵素に対する吸着性を検討した。
その結果、多糖の制限酵素に対する吸着性は、多糖と制
限酵素の種類によって異なることが判明した。以下、本
発明の多糖ゲルが有する吸着の特異性について説明する
。
限酵素の種類によって異なることが判明した。以下、本
発明の多糖ゲルが有する吸着の特異性について説明する
。
まず、κ一カラギーナンゲルについては、以下に記載す
る実施例ｌに示すように、ＨｉｎｄＩＩ［を強く吸着し
、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌを弱く吸着することが明ら
かになった。使用頻度の高い５種の制限酵素（Ｂａａ
Ｈ Ｉ， Ｂｇｌ Ｕ、ＥｃｏＲｒ，Ｈｉｎｄ ｍまた
はＰｓｔｌ）を各々、バッファ−を加えた平衡化カラギ
ーナンゲルに混合して３７℃で１時間処理したところ、
κ一カラギーナンゲルは、ＨｉｎｄＩＩＩを強く吸着し
、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌを弱く吸着することが示さ
れた。
る実施例ｌに示すように、ＨｉｎｄＩＩ［を強く吸着し
、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌを弱く吸着することが明ら
かになった。使用頻度の高い５種の制限酵素（Ｂａａ
Ｈ Ｉ， Ｂｇｌ Ｕ、ＥｃｏＲｒ，Ｈｉｎｄ ｍまた
はＰｓｔｌ）を各々、バッファ−を加えた平衡化カラギ
ーナンゲルに混合して３７℃で１時間処理したところ、
κ一カラギーナンゲルは、ＨｉｎｄＩＩＩを強く吸着し
、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌを弱く吸着することが示さ
れた。
同様の検討をよ一カラギーナンゲルについても行ったと
ころ、λ一カラギーナンゲルはＢａｍＨＩは吸着するが
その他の酵素は吸着しないことが明らかになった（実施
例２）。
ころ、λ一カラギーナンゲルはＢａｍＨＩは吸着するが
その他の酵素は吸着しないことが明らかになった（実施
例２）。
また、アラメやカジメ等に由来するフフイダン等の海藻
多糖も、同様に制限酵素に対する特異的な吸着作用を有
する。
多糖も、同様に制限酵素に対する特異的な吸着作用を有
する。
さ−らに比較のため、ヘパリンセファロースについても
同様の検討を行ったが、検討した５種類の制限酵素をす
べて同等に吸着することが示された（比較例）。
同様の検討を行ったが、検討した５種類の制限酵素をす
べて同等に吸着することが示された（比較例）。
以上より、本発明の多糖ゲルは、現在頻繁に使用されて
いるヘパリンセファロースと異なり制限酵素を特異的に
吸着し、アフィニティーゲルとしての有用性が極めて高
いことが示唆された。さらに本発明のκ一カラギーナン
ゲルと１−カラギーナンゲルの間にも特異性に差があり
、前者はＨｉｎｄ■類縁の酵素を強く吸着しＥｃｏＲＩ
およびＰｓｔＩ類縁の酵素を弱く吸着するのに対し、後
者はＢａｍＨ Ｉ類縁の酵素を特異的に吸着することも
示された。
いるヘパリンセファロースと異なり制限酵素を特異的に
吸着し、アフィニティーゲルとしての有用性が極めて高
いことが示唆された。さらに本発明のκ一カラギーナン
ゲルと１−カラギーナンゲルの間にも特異性に差があり
、前者はＨｉｎｄ■類縁の酵素を強く吸着しＥｃｏＲＩ
およびＰｓｔＩ類縁の酵素を弱く吸着するのに対し、後
者はＢａｍＨ Ｉ類縁の酵素を特異的に吸着することも
示された。
本発明の多糖ゲルに対する制限酵素の吸着は、ヘバリン
セファロースの場合よりもに弱く、吸着した酵素の溶離
が比較的容易である。一般には、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムを含む上記のバッファ−でゲルを処理すると、吸着
された酵素が溶離する。
セファロースの場合よりもに弱く、吸着した酵素の溶離
が比較的容易である。一般には、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムを含む上記のバッファ−でゲルを処理すると、吸着
された酵素が溶離する。
本発明の多糖ゲルは各々単独で使用しても、組み合わせ
て使用してもよい。また、本発明の効果を失わない範囲
で他の物質と混合して使用することもできる。
て使用してもよい。また、本発明の効果を失わない範囲
で他の物質と混合して使用することもできる。
また、本発明に係る海藻多糖は、塩化カリウム、硫酸バ
リウム、硫酸カルシウムを含む溶液または冷水中で容易
にゲル化するが、ゲル化の方法は特に制限されない。本
発明のＬ一カラギーナンゲルは比較的容易に粒状に調製
することができるため、アフィニティーゲルとしての応
用範囲が広いものといえる。
リウム、硫酸カルシウムを含む溶液または冷水中で容易
にゲル化するが、ゲル化の方法は特に制限されない。本
発明のＬ一カラギーナンゲルは比較的容易に粒状に調製
することができるため、アフィニティーゲルとしての応
用範囲が広いものといえる。
本発明の多糖ゲルの使用温度は、分離精製したい制限酵
素が失活しない温度である。例えば、工一カラギーナン
ゲルは、４〜３７℃を含む広い温度範囲でＨｉｎｄｌｌ
ｒを失活させずに吸着することができる（実施例３）。
素が失活しない温度である。例えば、工一カラギーナン
ゲルは、４〜３７℃を含む広い温度範囲でＨｉｎｄｌｌ
ｒを失活させずに吸着することができる（実施例３）。
また、本発明の多糖ゲルは、本発明の効果を失わせない
限り、連続系で使用しても回分系で使用してもよい。
限り、連続系で使用しても回分系で使用してもよい。
本発明をさらに詳細に説明するために、以下に実施例を
挙げるが、本発明の範囲はこれらの実施例によっていか
なる制限も受けない。
挙げるが、本発明の範囲はこれらの実施例によっていか
なる制限も受けない。
ｇ墨鼾
各種制限酵素に対するＥ一カラギーナンゲルの吸着作用
を検討した。
を検討した。
κ一カラギーナンゲルに５倍量の洗浄用バッファ− （
１０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ， ｐｎ’ｙ．ｓ． １
００ｍＭ ＫＣＩ， １０＋ａｋｌ ２−肛）を添加し
、約５分間撹拌し遠心分離（ ３０００ｒｐ一，３分間
）した後、上清を捨てる操作を５回繰り返してゲルを平
衡化した。平衡化したゲル２０ｕｌに上記バッファ−１
６μｌを加えた後、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＵ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ， Ｈｉｎｄ Ｉ［［またはＰｓｔｌのいずれかの
制限酵素４μ１を添加、撹拌した。次いで、３７℃で１
時間処理し、遠心分離して上清を取り出した（試料Ｂ）
。
１０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ， ｐｎ’ｙ．ｓ． １
００ｍＭ ＫＣＩ， １０＋ａｋｌ ２−肛）を添加し
、約５分間撹拌し遠心分離（ ３０００ｒｐ一，３分間
）した後、上清を捨てる操作を５回繰り返してゲルを平
衡化した。平衡化したゲル２０ｕｌに上記バッファ−１
６μｌを加えた後、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＵ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ， Ｈｉｎｄ Ｉ［［またはＰｓｔｌのいずれかの
制限酵素４μ１を添加、撹拌した。次いで、３７℃で１
時間処理し、遠心分離して上清を取り出した（試料Ｂ）
。
さらに、上記バブファ−と制限酵素との混合物を、３７
℃に１時問おいた試料も調製した（試料Ａ）。
℃に１時問おいた試料も調製した（試料Ａ）。
各々の試料１０μ■、λＤＮＡ２μ！、１０％反応液（
１００ｉＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ． ｐＨ７．５， １０
０ｍｍ ＭｇＣＩ， ＩＯｍＭＤＴＴ） ２μｌおよび
水６μｌを混合して３７℃で６時間インキユベートした
。その後、色素液２μｌを添加、撹拌し遠心分離した。
１００ｉＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ． ｐＨ７．５， １０
０ｍｍ ＭｇＣＩ， ＩＯｍＭＤＴＴ） ２μｌおよび
水６μｌを混合して３７℃で６時間インキユベートした
。その後、色素液２μｌを添加、撹拌し遠心分離した。
常法に従って反応液を０．７％アガロースゲルを用いて
電気泳動し、エチジウム染色して泳動パターンを記録し
た。試料ＡおよびＢの泳動パターンを第１図に示した。
電気泳動し、エチジウム染色して泳動パターンを記録し
た。試料ＡおよびＢの泳動パターンを第１図に示した。
第ｌ図より、Ｋ一カラギーナンゲルはＨｉｎｄＩＩＩを
強く吸着し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを弱く吸着し、
Ｂａ冒ＨｌおよびＢｇｌｎは吸着しないことが明らかで
ある。なお、上記の洗浄処理を行ったゲルからは所定の
時間内に酵素活性を有意に阻害する物質の溶離は認めら
れなかった。
強く吸着し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを弱く吸着し、
Ｂａ冒ＨｌおよびＢｇｌｎは吸着しないことが明らかで
ある。なお、上記の洗浄処理を行ったゲルからは所定の
時間内に酵素活性を有意に阻害する物質の溶離は認めら
れなかった。
実施例２
各種制限酵素に対するλ一カラギーナンゲルの吸着作用
を検討した。
を検討した。
Ｌ一カラギーナンゲルの代わりによ−カラギーナンゲル
を用いて４℃で１時間処理した点を除き実施例】と同一
の方法を繰り返した。得られた泳動パターンを第２図に
示した。
を用いて４℃で１時間処理した点を除き実施例】と同一
の方法を繰り返した。得られた泳動パターンを第２図に
示した。
第２図より、２−力ラギーナンゲルはＢａｍＨＩは吸着
するが他の制限酵素は吸着しないことが明らかである。
するが他の制限酵素は吸着しないことが明らかである。
虫贅判
各種制限酵素に対するヘバリンセファロースの吸着作用
を検討した。
を検討した。
ヘパリンセファロースを用いて実施例ｌと同様の方法を
繰り返した。得られた泳動パターンを第３図に示した。
繰り返した。得られた泳動パターンを第３図に示した。
第３図より、ヘバリンセフ１ロースはいずれの制限酵素
も同等に吸着することが明らかである。
も同等に吸着することが明らかである。
実施例３
Ｉ一カラギーナンゲルへのＨｉｎｄ［Ｉの吸着に対する
温度の影響を検討した。
温度の影響を検討した。
制限酵素としてＨｉｎｄＩＩＩを使用し、４℃または３
７℃で１６時間処理する点を除き、実施例１と同一の操
作を繰り返して上清を得た（４℃で処理した場合の上清
を試料Ｅとし、３７℃で処理した場合の上清を試料Ｆと
した）。
７℃で１６時間処理する点を除き、実施例１と同一の操
作を繰り返して上清を得た（４℃で処理した場合の上清
を試料Ｅとし、３７℃で処理した場合の上清を試料Ｆと
した）。
比較のために、ＨｉｎｄｌｌＩを含有する上記のバツフ
ァーからなる試料Ｃおよび上記のバッファーのみからな
る試料Ｄを調製した。
ァーからなる試料Ｃおよび上記のバッファーのみからな
る試料Ｄを調製した。
試料Ｃ〜Ｆについて実施例ｌと同一の方法によって活性
試験を行った。泳動パターンを第４図に示した。
試験を行った。泳動パターンを第４図に示した。
第４図より、４℃および３７℃のいずれの温度において
も、κ一カラギーナンゲルはＨｉｎｄＩＩＩを有効に吸
着することが明らかである。
も、κ一カラギーナンゲルはＨｉｎｄＩＩＩを有効に吸
着することが明らかである。
（発明の効果）
本発明の多糖ゲルは、制限酵素を特異的に吸着すること
ができ、しかもそれ自体がゲル化するために効率の良い
アフィニティーゲルとして利用しうる点で極めて有用で
ある。
ができ、しかもそれ自体がゲル化するために効率の良い
アフィニティーゲルとして利用しうる点で極めて有用で
ある。
第Ｉ図は、各種制限酵素に対するＬ一カラギーナンゲル
の作用を示した泳動パターンである。 第２図は、各種制限酵素に対するλ一カラギーナンゲル
の作用を示した泳動パターンである。 第３図は、各種制限酵素に対するヘバリンセフ１ロース
の作用を示した泳動パターンである。 第４図は、Ｈｉｎｄｌｍに対するλ一カラギーナンゲル
の作用を示した泳動パターンである。 （外４名） 本１ 凹 １２３４５ ／一−へ＼／′一ゝ＼／′一ゝ＼ ／一一ゝ＼ ／′一
＼＼Ａ ８ Ａ ８ ＡＢ ＡＢ ＡＳｌ： ＢαｒｎＨｌ ４ ： ＨｉｎＪ ｌ ２：ＢＩＪＩＩＩ ５：Ｐｓｔｆｆ ３ ： ＥｃｏＦｌ 毛３圀 ｌ ２ ３ ４ ５ ／； ８αｒｎＨｌ ２： Ｂ，ＩＩＩ ３ ： Ｅｃｏ尺ｌ ４ ： ＨｉｎｅＪｍ ５： ＰｓｔＩ 第２図 ＢａｒｎＨＩ ２二Ｂｉｌｌ ３： ＥＣｏ／？Ｊ １−ＨｎｃＪ ５：Ｐａｔｌ 暴４
の作用を示した泳動パターンである。 第２図は、各種制限酵素に対するλ一カラギーナンゲル
の作用を示した泳動パターンである。 第３図は、各種制限酵素に対するヘバリンセフ１ロース
の作用を示した泳動パターンである。 第４図は、Ｈｉｎｄｌｍに対するλ一カラギーナンゲル
の作用を示した泳動パターンである。 （外４名） 本１ 凹 １２３４５ ／一−へ＼／′一ゝ＼／′一ゝ＼ ／一一ゝ＼ ／′一
＼＼Ａ ８ Ａ ８ ＡＢ ＡＢ ＡＳｌ： ＢαｒｎＨｌ ４ ： ＨｉｎＪ ｌ ２：ＢＩＪＩＩＩ ５：Ｐｓｔｆｆ ３ ： ＥｃｏＦｌ 毛３圀 ｌ ２ ３ ４ ５ ／； ８αｒｎＨｌ ２： Ｂ，ＩＩＩ ３ ： Ｅｃｏ尺ｌ ４ ： ＨｉｎｅＪｍ ５： ＰｓｔＩ 第２図 ＢａｒｎＨＩ ２二Ｂｉｌｌ ３： ＥＣｏ／？Ｊ １−ＨｎｃＪ ５：Ｐａｔｌ 暴４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、海藻多糖ゲルからなる制限酵素分別精製用ゲル ２、■−カラギーナンゲルからなる制限酵素分別精製用
ゲル ３、λ−カラギーナンゲルからなる制限酵素分別生成用
ゲル
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1234394A JPH0671427B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 制限酵素分別精製用ゲル |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1234394A JPH0671427B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 制限酵素分別精製用ゲル |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0398582A true JPH0398582A (ja) | 1991-04-24 |
| JPH0671427B2 JPH0671427B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=16970311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1234394A Expired - Lifetime JPH0671427B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 制限酵素分別精製用ゲル |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0671427B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113234793A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 江苏迅睿生物技术有限公司 | 一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法 |
-
1989
- 1989-09-08 JP JP1234394A patent/JPH0671427B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113234793A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 江苏迅睿生物技术有限公司 | 一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0671427B2 (ja) | 1994-09-14 |
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