JPH0375148B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞培養装置に関するものであり、
濃縮培養バツグへの空気の注入、培地の交換、細
胞の回収、等を無菌的に操作できるようにしたも
のである。 ［従来の技術］ 従来、動物細胞の培養方法としては、静置法、
ローラーボトル法、等が知られていたが、これら
の方法は培地交換の際、クリーンベンチ内での作
業、および遠心操作等を行なう必要があり操作が
面倒である。また中空糸型培養装置も知られてい
るが、外液や内液を循環させるための装置が必要
であり、装置が複雑となつて高価である。 こうしたことから、本出願人は、先に従来とタ
イプをまつたく異にした新たな濃縮培養装置を提
案した特願昭61−198898号（特開昭63−56275号）
この装置は外袋と、半透膜の内袋とから構成さ
れ、半透膜内袋に封入した細胞浮遊液（内液）と
外袋の培地（外液）間の濃度勾配による拡散現象
を利用し、容器全体に回転を与えながら培養を行
なうようにしたものである。 ［本発明が解決しようとする問題点］ 上記培養バツグを使用するためには、外袋に培
地を封入する操作、半透膜内袋に細胞浮遊液を注
入する操作、これらの袋に無菌空気を注入する操
作、培養後の細胞を回収する操作などが必要であ
る。 本発明はこのような操作を無菌的に行なえるよ
うにした（ただし、細胞浮遊液の注入は、クリー
ンベンチ内で行なう必要がある）培養装置を提供
しようとするものである。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、培地を収容する外袋１に、細胞浮遊
液を収容する半透膜の内袋２を収納し、前記半透
膜を介して細胞浮遊液と培地間の濃度勾配による
拡散現象によつて細胞の高密度培養を行なう濃縮
培養バツグと、前記外袋１に培地を供給する培地
バツグ５０と、前記内袋２に細胞浮遊液を注入す
る注入器具２０と、前記内袋２の培養後の細胞を
回収する回収バツグ７０と、前記濃縮培養バツグ
と培地バツグ５０または回収バツグ７０とを連結
する連結チユーブ１１と、前記各袋へ無菌空気を
注入する器具４０からなつている。 ［作用］ 前記内袋２の口部６に細胞浮遊液の注入器具２
０を接続し、所定量の細胞浮遊液を注入した後、
無菌空気注入器具４０を接続し、内袋２に無菌空
気を送り込み、その後口部６を封止する。また前
記外袋１の口部３には連結チユーブ１１ｂを介し
て培地バツグ５０を接続する。この培地バツグ５
０にはあらかじめ所定量の培地が調製されて封入
されており、この培地を前記チユーブ１１ｂを介
して外袋１に注入した後、前記内袋２と同じよう
にして無菌空気を送り込み、口部３を封止する。
その後、培養バツグを回転させつつ内袋２の細胞
を培養する。所定期間培養した後、前記内袋２の
口部６に回収バツグ７０を接続し、培養された細
胞をその回収バツグ７０に移す。 ［実施例］ 第１図は本発明における培養バツグを示すもの
であり、外袋１と、その内部に収納される半透膜
製の内袋２とから構成されている。 前記外袋１は二枚の軟質合成樹脂の周囲を袋状
にシールして作られたものであり、下端部には複
数の外液操作口３が設けられている。この操作口
は必要に応じてプロテクターで密封されている。
また外袋１のコーナー部のシール部には、後述す
るロータリーアジテーターへの取り付け穴４が開
口されている。 前記内袋２はチユーブ状半透膜の両端開口部を
シールして作られたものであり、上端部には内液
操作口６が設けられている。この内液操作口６は
前記外袋１の外部に突き出ている。この内袋２は
保護ネツト５で覆われている。 本実施例の外袋１はポリ塩化ビニル製であり、
シート厚0.4mm、容量は2000mlの外液と約2000ml
の空気で合計4000mlである。また内袋２は再生セ
ルロース製であり、膜厚20uｍ、分画分子量
10000、容量500mlの内液と約500mlの空気とで合
計1000mlである。 次に、このような培養バツグに使用される各種
器具を、その取り扱い方法とあわせて説明する。
なお、以下の実施例ではヒトリンパ球の培養を例
にとつて説明するが、本発明はこのほかにもマウ
スハイブリドーマなど、特に血液由来のセルライ
ンの高密度培養として有効である。 () 培養バツグの洗浄 前記内袋２は、乾燥防止のためグリセリンが
塗布されている。このため使用前、生理食塩水
による洗浄が必要となる。 まず、第２図に示すように生理食塩水の封入
されたバツグ１０に連結チユーブ１１を接続
し、他方を内液操作口６に接続する。この連結
チユーブ１１はチユーブ両端部に輸液針１２，
１３が設けられており、チユーブの中間部には
クランプ１４が取り付けられている。このクラ
ンプ１４は最初、閉にしておき、操作口６とバ
ツグ１０を接続した後、開にすることにより、
生理食塩水を落差により約500ml注入する。 次にクランプ１４を閉じ、連結チユーブ１１
をバツグ１０からはずした後、操作口６近くの
２個所を固く結んでシールし、不要部分を切除
する。 内袋のリークの有無を確認した後、前記と同
様な方法で外袋１に約2000mlの生理食塩水を封
入する。第３図は外袋１に生理食塩水を注入し
た後、連結チユーブ１１ａを固く結んでシール
１５，１５ａした状態を示している。なお、外
液操作口３はプロテクターのないものから使用
する。 続いて、上記培養バツグを後述するロータリ
ーアジテーターに取り付け、15分程度、４〜
5rpmで回転させる。 () リンパ球浮遊液（内液）および培地（外
液）の注入 洗浄液の排出 ロータリーアジテーターから前記培養バツ
グをはずした後、外液操作口３より連結チユ
ーブ１１ａを抜き、新しい連結チユーブ（ク
ランプ閉）を接続する。この連結チユーブの
クランプを開け、落差により外袋１内の洗浄
液を排出した後、その連結チユーブを２回固
く結びシールし、不要部分は切除する。 その後、内袋２のリークの有無を確認した
後、上記と同じ方法で内袋２内の洗浄液を抜
き、連結チユーブをシール切除する。 内液の注入 次に前記内袋２にリンパ球浮遊液を注入す
るが、この操作はクリーンベンチ内で行な
う。 リンパ球浮遊液は次のような手順により内
袋２に注入される。 内液操作口６より前記連結チユーブ１１を
抜き、第４図に示すような細胞浮遊液注入器
具２０を接続する。この注入器具２０はロー
ト２１に誘導チユーブ２２を連結し、そのチ
ユーブに輸液針２３を取り付けたものであ
る。 前記内液操作口６にこの輸液針２３を差し
込んだ後、ロート２１からリンパ球浮遊液を
落差によつて内袋２に注入する。 リンパ球浮遊液を注入した後、注入器具２
０を抜き、第５図に示すような操作アダプタ
ー３０を接続する。この操作アダプター３０
は輸液針３１の後端部に、ゴム栓付のキヤツ
プ３２を嵌めたものである。 次にこの操作アダプター３０に第６図に示
すような無菌空気注入器具４０を接続する。
この注入器具４０はデイスポシリンジ４４の
先端に三方活栓４３、除菌フイルター４２、
デイスポ針４１を順次連結したものである。 前記操作アダプター３０のゴム栓部にデイ
スポ針４１を刺し込んだ後、シリンジ４４の
ピストン運動と三方活栓４３の切り替えによ
つて無菌空気を注入し、内袋２に張りを与え
る。無菌空気の注入量については厳密な設定
は必要ない。こうして無菌空気が注入された
後、注入器具４０がはずされる。 外液の注入 第７図に示すように、あらかじめ作製して
おいた培地入りバツグ５０に、上記と同じ構
成の連結チユーブ１１ｂの一方の輸液針１２
ｂを接続した後、外袋の外液操作口３に接続
されていた連結チユーブを抜き、この操作口
３に他方の輸液針１３ｂを接続する。その
後、クランプ１４ｂを開け、落差により外液
を注入する。 注入後、外液操作口３より連結チユーブ１
１ｂを抜き、上記と同じ構成の操作アダプタ
ー３０を接続する。 次に内液の注入で使用した無菌空気注入器
具４０の除菌フイルター４２とデイスポ針４
１を新しいものと交換し、内袋２への注入と
同じ方法で外袋１に無菌空気を注入し、その
袋１に張りを与える。注入量については内袋
２と同様、厳密な設定は必要としない。 () 培養の開始 第８図に示したようなロータリーアジテータ
ーを、37℃に設定された恒温室またはインキユ
ーベーターに設置し、上記培養バツグをセツト
する。このアジテーターは、ボツクス６１に回
転板６０が適度に傾けられて設けられており、
該回転板６０は、ボツクス６１に内蔵された駆
動機構によつて回転可能となつている。またそ
の回転板６０の四隅には、上記培養バツグを固
定するための止め具６２が設けられており、外
袋１の取り付け穴４を止め具６２によつて回転
板６０に固定できるようになつている。培養バ
ツグを回転板６０に装着した後、回転板を４〜
5rpmで回転させることにより、培養を開始す
る。 () 培地（外液）の交換 交換時間は外液の黄色化によつて判断する。
培地は大量に調製したものを培地バツグに小分
けして保存しておくと便利である。 培地を交換する場合、まずロータリーアジテ
ーターの回転を停止させ、培養バツグをはず
す。次に未使用の外液操作口３に第２図と同じ
構成の連結チユーブ（クランプ閉）を接続した
後、クランプを開け、落差により外液を排出す
る。 外液を排出した後、クランプを閉じ、あらか
じめ作製しておいた培地バツグに、別の連結チ
ユーブ（クランプ閉）を接続する。その後、外
液操作口３に接続していた連結チユーブを抜
き、前記培地バツグの連結チユーブを接続する
と共にクランプを開け、落差により外液を注入
する。 外液の注入が完了した後、クランプを閉じ、
培地バツグから連結チユーブを抜き、この連結
チユーブを２回固く結んでシールし、不要部分
を切除する。このとき外袋１の張りがたりない
場合には、上記と同じ方法により無菌空気を注
入する。 その後、培養バツグをロータリーアジテータ
ーに固定し、培養を再開する。 () 培養の終了およびリンパ球浮遊液（内液）
の回収 培養を終了した後は、培養バツグをロータリ
ーアジテーターよりはずすし、第９図に示すよ
うな回収バツグ７０を準備する。 この回収バツグ７０には誘導チユーブ７１が
連結されており、その先端部に輸液針７２が取
り付けられている。この誘導チユーブ７１は、
あらじめバツグに近い部分を同図に示すように
ゆるく結び、ループ７３をつくつておく。 次に、内液操作口６に接続していた操作アダ
プターを抜き、回収バツグ７０の輸液針７２を
接続し、落差により内液を誘導チユーブ７１を
介して回収バツグ７０に回収する。 回収後、誘導チユーブ７１のループ７３を固
く結んでシールした後、輸液針７２を内液操作
口６からはずす。結び目のすぐそばに、もう１
個所同様の結び目をつくつてシールし、不要部
分を切除する。 なお、上記した培養バツグ、培地バツグ、回
収バツグ、連結チユーブ、操作アダプター、細
胞注入器具、無菌空気注入器具、等はプラスチ
ツク製のデイスポーザブル製品である。 下表は本発明装置を使用して各種細胞を培養
した場合のデータである。

【表】

【表】

【表】 ［効果］ 以上のような本発明によれば、次のような優れ
た効果が得られる。 従来のローラーボトルによる回転培養に比
べ、小規模なスペース、器材で培養が可能であ
る。さらに中空糸利用細胞培養法のように、複
雑なシステムを必要とせず、それに近い大量濃
縮培養が可能である。 培養細胞と培地を異なる容器に封入し、細胞
の注入・回収、培地の交換、無菌空気の注入等
はそれぞれの操作用器具をワンタツチで接続し
て行なうものであるから、取扱いが簡便であ
る。 上記各器具を使用することにより、細胞の回
収、培地の交換はクリーンベンチを使用しなく
とも無菌的に行なうことが可能である。 従来のローラーボトルによる回転培養法に比
べ、栄養分が半透膜を通して細胞側へ透過する
ので、培地を適時交換することにより、細胞は
封入された半透膜内で高密度に培養することが
可能である。 ロータリーアジテーターにより細胞や培地は
ゆるやかに撹拌されるため、培地成分は一様に
分散され、さらに細胞は容器壁への付着や凝集
を起しにくく、高い回収率を得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る濃縮培養バツグの概略
図、第２図は濃縮培養バツグの洗浄方法を説明す
るための概略図、第３図は外袋を洗浄した後、連
結チユーブをシールした状態の概略図、第４図は
内袋に細胞浮遊液注入器具を接続した状態を示す
概略図、第５図は本発明で使用される操作アダプ
ターの概略図、第６図は内袋に無菌空気注入器具
を接続した状態を示す概略図、第７図は外袋に培
地バツグを接続した状態を示す概略図、第８図は
本発明で使用されるロータリーアジテーターの概
略図、第９図は内袋に細胞回収バツグを接続した
状態を示す概略図である。 図中、１は外袋、２は内袋、３は外液操作口、
５は内袋保護ネツト、６は内液操作口、１０は生
理食塩水入りバツグ、１１は連結チユーブ、２０
は細胞浮遊液注入器具、３０は操作アダプター、
４０は無菌空気注入器具、５０は培地バツグ、７
０は細胞回収バツグである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 培地を収容する外袋に、細胞浮遊液を収容す
   る半透膜の内袋を収納し、前記半透膜を介して細
   胞浮遊液と培地間の濃度勾配による拡散現象によ
   つて細胞の高密度培養を行なう濃縮培養バツグ
   と、前記外袋に培地を供給する培地バツグと、前
   記内袋に細胞浮遊液を注入する注入器具と、前記
   内袋の培養後の細胞を回収する回収バツグと、前
   記濃縮培養バツグと培地バツグまたは回収バツグ
   とを連結する連結チユーブと、前記各袋へ無菌空
   気を注入する器具からなる細胞培養装置。