JPH0365285A - セルラーゼによる工業スライムの除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、冷却水塔の表面上及び製紙用損紙水（ｂｒｏ
ｋｅ　ｗａｔｅｒ）中に存在するまたはそこに蓄積する
、微生物によって生成される細胞外ポリマーの処理用混
合または複合酵素系に関する。微生物細胞を含むこのよ
うな細胞外ポリマーはバイオフィルムまたは微生物スラ
イムとしても知られている。

〔従来の技術〕

微生物によって生成された細胞外ポリマーは蓄積して、
熱伝達を遅らせ、且つ冷却水系を通る水の流れを制限す
る可能性がある。有毒薬品の適用によるスライム形成細
菌の防除（ｃｏｎｔｒｏｌ　）は、環境問題のために次
第に受は入れられなくなってきている。さらに、微生物
を覆う細胞外多糖類は大部分が非透過性であるので、ス
ライムによって毒物の有効性が最小化される。

毒物は付着した多量の細菌を充分に防除できず、主に浮
遊微生物に対して有効である。スライムを遭遇し且つス
ライムの構造を粗（する助けとなる界面活性剤及び分散
剤は毒物の活性を増大させるが、非特異的であって、し
かも工業的方法に対して有害な作用を有する可能性があ
る。

本発明は、特異的で且つ無毒性であるという利点を有す
る酵素の使用を説明する。このアプローチは、（ａ）ス
ライムが形成された場所におけるスライムの除去を増大
し、（ｂ）スライムの蓄積を防止し、且つ（ｃ）固着し
た細菌に対する殺生物剤の有効性を改良するためのもの
である。酵素は細菌を取り巻くスライム層に特異的に作
用する。

その結果として、微生物はプランクトン様になり（バイ
オフィルム生成に関して無害であり）、殺生物剤を受は
易くなる。酵素はまた、清浄な表面を保持するように作
用する（第６図参照）。

先行技術の単一酵素製剤の例は米国特許第３．７７３．
６２３号（Ｉ（ａｔｃｈｅｒ、　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、）に見られるものであり、該特許においてはバ
ルブ及び製紙工場からの白水のような工業用水また、米
国特許第４，０５５，４６７号（Ｃｈｒ　ｔ　ｓ　ｔｅ
ｎｓｅｎ　＋Ｎａ１ｃｏ）はスライム、ならびに数ｐｐ
ｉｍの酵素、ＲｈｏｚｙｍｅＨＰ−１５０、ベントサナ
ーゼーヘキサナーゼでスライムを処理することによって
スライムを分散及び防止することのできる工業的方法を
説明し、米国特許第３．８２４．１８４号（Ｗａｔｃｈ
ｅｒ、　Ｈｃｏｒ＋ｏｍｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ。

Ｉｎｃ、）は工業用水に制御量の酵素レバンヒドロラー
ゼを意図的に加えることによってスライム形成が制御さ
れることを記載している。

さらに、米国特許第４．６８４，４６９号（Ｐｅｄｅｒ
ｓｅｎ　ｅｔａｌ、　Ａｃｃｏｌａｂ、　Ｉｎｃ、）は
二成分殺生物剤組成物によるスライムの制御に適当な方
法を開示している。

標品は殺生物剤及び多糖類減成酵素からなる。

殺生物剤に関しては、これまで一般にメチレン−ビス−
チオシアナートが好ましかった。他の使用できる殺生物
剤としては、フエナート化合物、たとえば、ペンタクロ
ロフエナート及びトリクロロフェナート；有機水銀化合
物、たとえば、フェニル水銀酸；カルバメート化合物、
たとえば、メチルジチオカルバメート、エチレンビスジ
チオカルバメート及びジメチルジチオカルバメート；カ
ーボネート化合物、たとえば、シアノジチオイミドカー
ボネート；チオシアネート、たとえば、クロロエチレン
チオシアネート化合物；及び他の殺生物剤、たとえば、
プロモーヒドロキシアセトフェノン化合物、ベンゾチア
ゾール化合物、エチレンジアミン化合物、ニトリロブロ
ビオンアξド、プルモプロビオンアミド、プロモーアセ
トキシブテン、ブロモプロパノールアルデヒド化合物、
ビス−トリクロロメチルスルホン、ビメチルヒダントイ
ン化合物が挙げられ、殺生物剤の同様な混合物も使用で
きる。

ジメチルジチオカルバメート及びエチレンビスジチオカ
ルバミド酸二ナトリウムの組合せを含むような殺生物剤
メチレン−ビス−チオシアネートが本発明に関連して特
に有効であることがわかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は酵素を用いて工業的に発生するスライ
ムをその被覆表面から特異的かつ無毒的に除去すること
のできるスライムの除去方法を提供することを目的とす
る。

〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明に従えば
、スライムで覆われた表面に有効量のセルラーゼを接触
させてスライムの存在しない表面を保持することを含ん
でなる、スライム被覆表面からスライムを除去する方法
が提供される。

細菌を防除するために殺生物剤の使用よりも酵素ブレン
ド組成物（又は混合物、配合物）の方が優れている点は
、殺生物剤は系において毒物となり、且つ汚染の問題が
常に存在することである。

本製剤が殺生物剤を含む単一酵素の製剤よりも優れてい
る点は、単一酵素は狭い一群の炭水化物ポリマーにしか
作用しないのに対して、本発明は塩基性プロテアーゼと
共にセルラーゼ及びα−アミラーゼの活性を組み合わせ
ることによって作用の範囲を改良し、細菌を取り巻く炭
水化物ポリマー及びタンパク質に広く作用することであ
る。複合酵素配合物のこの使用に関する特定の配合物に
ついての典型的な割合を具体的に示すと、セルラーゼ２
部、α−アミラーゼ１部及びプロテアーゼ１部である。

この配合においてα−アミラーゼは少なくとも１部であ
って、わずかに１部を越えることができる。１部に設定
したプロテアーゼは実際は０．５〜１部であることがで
き、セルラーゼは２部に設定する。

好ましいｍ放物はセルラーゼ２部、α−ア逅ラーゼ１部
及びプロテアーゼ１部である。この組成物中、セルラー
ゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）の代わりにセルラーゼ（ｅｅ
ｒｕｌａｓｅ）を使用できる。

一般に、はとんどの酵素は２〜１１００ｐｐ＋、多くの
場合には２〜１０ｐｐ＋ｍの用量で使用する。酵素は多
くの化学製造業者、たとえば、Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｃ
ｙａｎａｍｉｄ＋Ｂｅｔｚ、　Ｂｅｃｋｍａｙ＋、　Ｄ
ｅａｒｂｏｒｎ　Ｃｈｅｓｉｉｃａｌ、　Ｅｃｏｎｏｍ
ｉｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｅｒｃ
ｋ＋　Ｎａ１ｃｏ＋　ＶｉｎｅｌａｎｄＣｈｅｓ　ｔｅ
ａ　１などから入手することができる。

本発明における有効性に必要な酵素の濃度は広範囲に変
化し、水の温度及びｐＨ１微生物数ならびに処理する工
業用水の型のような条件で決まり得る。必要濃度の下限
及び上限は使用する特定の酵素または酵素の組合せによ
って実質的に決まる。

たとえば、本発明に関連して有効性の高い酵素は本発明
に関連して工業用水１００万部当り主に１または２部の
酵素の濃度を必要とする可能性があるのに対し、別の酵
素は８０〜１１００ｐｐの最小濃度を必要とするかもし
れない。

先行技術とは異なり、本発明の配合物は特異的且つ無毒
性である０本発明を考慮し且つ先行技術と比較して、本
＆Ｉｌ放物は標的ポリマー上では同様であるがα−アミ
ラーゼ、セルラーゼ及びプロテアーゼの組合せ酵素活性
のためにそれらをより効率よく消化すると言うことがで
きる。さらに、セルラーゼはこの効率の良さを可能にす
る唯一の酵素成分である。α−アミラーゼ及びプロテア
ーゼは微生物スライムに傷をつけ、セルラーゼの接近を
可能にしてスライムエクソボリマーをより効率よく消化
するということができる。

一般的なメカニズムの問題として、α−アミラーゼ単独
ではスライムの保護もしなければ、スライムの除去もし
ないことが注目される。α−アミラーゼはグルコース分
子間のα結合に作用する。

α−アミラーゼはスライム分子の外側に傷をつけ、その
結果、セルラーゼが炭水化物分子に入り込んで作用でき
る。プロテアーゼは細胞外タンパク賞分子に作用する。

これまで、細菌によって生成された工業スライムまたは
スライムポリマーの酵素処理は単一酵素、たとえば、レ
バナーゼからなるものであった。レバナーゼはレバンの
ポリマーをそのサブユニット（フルクトース）に分解す
るものであった。しかしながら、レバナーゼをスライム
レバン上で使用した後も、耐性細菌が依然として残って
増殖するのであった。レバナーゼをそれ以上適用しても
効力がなかったのは、レバナーゼが作用するポリマーが
もはや存在しないためであった。レバンポリマーはなく
なったが、他のスライムポリマーは依然として存在し、
細菌がよく生育するのであった。

他の酵素標品、たとえば、ＥＤＣ，レバンハイドロライ
ザー（Ｓｕｎｏｅｏ）がこれまで市場で使用されてきた
が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌ならびにポリマー中に
配列されたグルコース、マンノース及びグロース糖の量
が多い、Ｋ１ｅｂｓｉｅｌｌａ＋　Ａｃ１ｎｅｔｏｂａ
ｅｔｅｒ。

Ｆ１ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ＋　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ及びＡｅｒｏｂａｅｔｅｒのような、野外の他の
細菌によって生成されるポリマーに実際に作用する酵素
の組合せはこれまでなかった。

一般化された方法において、前記先行技術に答えて、本
発明はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌の透明な培養物を選
んで、低基質環境においてスライムポリマーを生成させ
た。第二に、本発明は冷却塔水及び水道をシミユレート
した、実験室及び野外条件の両方において生育させた、
ブレンドした野外からの微生物の複合体を選んだ。

結果は、付着している（ｐｅｎｄｉｎｇ）細菌からの炭
水化物層の最大の除去が起こったことを示す。このよう
に、極めて広く行きｌ、たＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｉ）
１菌において酵素の利用が有用であると判明した場合に
は特に、酵素の新しい混合物（ｈｌｅｎｄ）を利用する
と優れた結果が得られる。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌に対する試験において種々
の酵素を利用した。酵素の４２種の標品から、３つの型
の酵素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌によって生成され
たスライムに対して有効であることが判明した。第一に
、α−ア果ラうゼは細菌のスライムに作用することが判
明した。第二に、プロテアーゼもま、た、ｗｉのスライ
ムに対して効果を有することが判明している。次に、ア
ミラーゼ、セルラーゼ及びプロテアーゼによる組合せ酵
素処理がバイオフィルムの除去に有効であることが判明
した。しかしながら、いずれも単独では有効であるほど
充分にはスライムを除去しないであろう、有効なのはセ
ルラーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼの混合物であっ
た・ 〔実施例〕 以下、実施例に従って本発明を一層明瞭に説明するが、
本発明の範囲をこれらの実施例に限定するものでないこ
とはいうまでもない。

裏旌班土 攪拌された、小さい滅菌ビーカー中で被選定酵素で処理
したスライム付着顕微鏡スライドを用いて、約４０種の
被選定酵素の予備活性スクリーニングを行った。工業用
水中で細胞外ポリマーを生成することが知られているＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのコロニ単離物または野外微生物
の複合体を用いてスライム発生ボックス中で試験スライ
ドを調製した。細菌はトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ　
）中で増殖させ、トリプトングルコースエキス（ＴＧＥ
　）上で細胞数を計測した。ＴＳＢ栄養源を補うように
無水デキストロース（Ｄ−グルコース）を用いた。

１．２及び４時間の間隔でスライドからのバイオフィル
ムの除去を目視評価することによって酵素の消化速度を
測定した。このスクリーニング試験において有望な活性
を示す被選定酵素を以下のようにさらに充分に検討した
。

裏亀炎上 スクリーニング試験からの最も有望な９種の炭水化物及
びプロテアーゼを、野外の適用における水管の汚染をシ
ミユレートするＢｉｏｆｉｌｍ　ＲｅｍｏｖａｌＲｅａ
ｃｔｏｒ（ＢＲＲ）を使用する別の試験に供した０反応
器を第１図に図示する。最初に、循環最小基質中のスラ
イム形成細菌に７２時間暴露することによって反応器の
管にスライムを形成させた。

被選定酵素の各々を表■に示した条件下で２４時間、反
応器中で１１００ｐｐの量で試験した。ＢＲＲ中のバイ
オフィルムの除去を、汚染された系の酵素処理によって
得られるバイオマスの減量パーセントに換算して測定し
た。混合プロテアーゼ−カルボヒドラターゼに関する結
果を第２図及び表■に示す、これらの試験については、
反応器の管を６０°Ｃで一夜乾燥し、次いで清浄にし、
乾燥し、そして再秤量して、記録した重量分析データを
得た。

反応器のスライムで覆われた管の圧力低下の減少度合も
汚染の基準として提供する同様な装置であるＭｉｃｒｏ
ｂｉａｌ　Ｆｏｕｌｉｎｇ　Ｒｅａｃｔｏｒ（ＭＦＲ）
中で、これらの酵素の別の試験を行った。装置を第３図
に示し、実験条件を表■に列挙する。バイオマス測定の
ための実験方法は、バイオマスを実験の経過中に数回測
定する以外は前記ＢＲＲに使用したのと一般に同様であ
った。さらに、酵素処理の有効性を、反応器のスライム
で覆われた管の圧力低下の減少によって、そして覗きガ
ラス部での目視観測によって測定する。第４図及び第５
図はポリオール生物分散剤に比較した混合酵素の試験の
結果を示す。

Ｂｉｏｆｉｌｍ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｒｅａｃｔｏｒ中で
試験した酵素標品のうち５種はスライムの防除に有効で
あった。

これらをその相対有効性と共に表■に示す。これらのう
ち、混合酵素が最も良好なことは明白であった。この酵
素複合体は１種のプロテアーゼと２種のカルボヒドラタ
ーゼ、すなわち、α−アミラーゼ及びセルラーゼの組合
せである。試験時間後にバイオマスの３７％を除去する
１つの市販混合酵素組成物を表に示す。

Ｂｉｏｆｉｌｍ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｒｅａｃｔｏｒ（第
１図）の結果も第２図に示す。バイオフィルム除去実験
において、酵素セルラーゼは２４時間後にバイオマスの
２３％を除去した（処理前８０■／ｃｊに対して処理後
６に／ｄ）、α−アミラーゼ、セルラーゼ及びプロテア
ーゼ酵素の１：２：１の組合せは同じ時間内でバイオフ
ィルムの３７％を除去した。未処理の対照（ブランク）
はバイオマスが６５％まで増加し続けた。比較のために
、非酵素性化学的生物分散剤はバイオフィルムの全部の
生長をほとんどチエツクしたがバイオマスを除去はしな
かった。従って、混合酵素アプローチが最良（３７％）
であった。

ＭＦＲ実験におけるバイオマス除去の結果は７２．５時
間と９６．５時間の間における３７％の除去とほとんど
一致した（第４図）、同じ（ＭＦＲ）実験における圧力
低下データ（第５図）がこの発見を支持する。

実蓬且旦 混合酵素に焦点を合わせて、バイオフィルムの除去にお
けるその有効性に対するｐＨの作用を測定するために別
のＭＦＲ研究を行った。　ｐＨを７゜５゜８゜５または
９゜０に保持した単一サイクルの合成水道水中において
対照としてポリオール生物分散剤を用いて複合酵素を試
験した。結果を表■に要約する。混合酵素はｐＨ９まで
有効であった。酵素の組合せの有効性をまた、表組中で
中性及びアルカリ性のｐＨにおける分散剤の有効性と比
較する。

裏旌Ａ星 微生物汚染反応器（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｆｏｕｌｉｎ
ｇ　Ｒｅａｃｔｏｒ）上で実験を行い、結果を第６図に
示す、この実験は本発明の酵素製品が表面を清浄に保持
するか否かを試験するために行った。実験条件は基ｆ濃
度及び処理用量が異なった（表■）、基質濃度は低く、
冷却水中の基質レベルと同様であった。用量は殺生物剤
のスラグまたは酵素製品のスラグであった。

第６図において、対照すなわち未処理（−ム一）曲線は
バイオフィルムの生長が低基質条件で起こり得ることを
示している。圧力低下の減少によって測定したところ、
殺生物剤の曲線は、６，９゜１３　、１６　、２０　、
２３　、２８及び３１日目に反応器中に入れた１１００
ｐｐの非酸化性殺生物剤が、バイオフィルムを減少させ
たことを示す、酵素の組合せの性能を表す曲線はまた、
各処理後のバイオフィルムの減少を示す、３１日以後は
殺生物剤処理線と未処理対照との差は２．４インチ（Δ
Ｐ−２，４インチ）であり；酵素ブレンドを用いた場合
には２．ツイフチであった。第６図は、処理停止後に画
線においてバイオフィルムが生育することを示す。

結果が良好であった。実験は酵素が１ケ月以上にわたっ
てバイオフィルムの生長を非常によく制御することを証
明した。無毒性である酵素混合物は毒物（非酸化性）殺
生物剤と少なくとも同様な性能であった。

ｐＨ ８，５ ？、５．８．５または ９．０” 温度（°Ｃ） ３６±１′ ３３．０±１ｃ 基質濃度 ５Ｂ Ｄ−グルコース ０ｐｐｍ ０ｐｐｍ ０ｐｐａｉ ０ｐｐｍ 生育時間 処理 酵素濃度 持続時間 ７２時間 ００ｐｐｍ ２４時間 Ｐ１１０ｉｎ＠ １００ｐｐＨ ２４時間 ｂ ｐＨ設定は実験によって異なる。

ＢＲＲ温度は一貫して、再循環ポンプの操作によって生
じる３６±１°Ｃである。

ＭＦＲ温度はサーモスタット制御する。

−回循環（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｙｃｌｅ）合成Ｃｈｉｃａ
ｇｏ水道水。

１０インチのＭＦＲｐが約７２時間で起こった。

アルカリ性プロテアーゼ（１） アルカリ性プロテアーゼ（２） 脱分岐化酵素 アルカリ性α−アミラーゼ β−グルカナーゼ（１） β−グルカナーゼ（２） セルラーゼ１ −５０．０ １８．０ −１９．０ ２１．５ １４．０ ２３．０ セルラーゼは糖分手間のβ結合に作用する。

夫−Ｎ ｐＨ 温度 補給水 基質濃度 ５Ｂ Ｄ−グルコース 接種物 処理 酵素濃度 持続時間 頻度 殺生物剤濃度 持続時間 頻度 ８．５ ３３．０±１．０℃ 合成水道水 ０ｐｐｍ １０ｐｐｍ＋ 野外複合体 １５０ｐｐｍ＋ スラグ用量 週に２回 ００ｐｐｍ スラグ用量 週に２回 遺−−−］ ７．５ ８．５ ａ　性能は酵素濃度レベル１１００ｐｐ、生物分散剤濃
度レベル２０ｐｐｍにおいて評価する。

ｂ　除去は３３±１℃における２回の実験の平均である
。

【図面の簡単な説明】

第１図はバイオフィルム除去リアクター系の平面図であ
り； 第２図は生物分散剤、セルラーゼならびにα−アミラー
ゼ、セルラーゼ及びプロテアーゼの１＝２：１の混合物
によるバイオフィルムの除去を示すグラフ（単一サイク
ル合成水−ｐ１４８．５）であり；第３図は微生物汚染
反応器系の平面図であり；第４図は酵素処理及び生物分
散剤に関してバイオフィルム質量対時間を示すグラフ（
ｐＨ８，５）であり； 第５図は酵素処理及び生物分散剤に関する圧力低下対時
間を示すグラフ（ｐＦＩ８．５）であり；第６図は微生
物汚染反応器中における酵素対殺生物剤の処理の結果を
示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし） ｎ ′り）村し区＼ バイオマスｍｇ／ｃｍ２ 　　８ 圧力低下（水中） 圧力低下（水中） 手 続 補 正 書 （方式〉 補正の対象 平底２年８月 ２２日 補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スライムで覆われた表面に有効量のセルラーゼを接
   触させてスライムの存在しない表面を保持することを含
   んでなる、スライム被覆表面からスライムを除去する方
   法。 ２、冷却塔のスライムで覆われた表面に、セルラーゼ２
   部、α−アミラーゼ１部及びプロテアーゼ１部の割合か
   らなる複合酵素配合物の有効量を接触させることを含ん
   でなる、冷却塔のスライム被覆表面からスライムを除去
   する方法。 ３、微生物スライムを消化し且つ微生物の付着及びバイ
   オフィルムを低減させるために、セルラーゼ、α−アミ
   ラーゼ及びプロテアーゼからなる複合酵素配合物を使用
   する方法。４、セルラーゼ２部、α−アミラーゼ１部及
   びプロテアーゼ１部からなる酵素の複合混合物少なくと
   も８０ｐｐｍで廃水を処理することを含んでなる、スラ
   イム被覆表面及び廃水処理からのスライムを消化し且つ
   系においてスライムを含まない表面を保持する方法。 ５、セルラーゼ２部、α−アミラーゼ１部及びプロテア
   ーゼ１部からなる、スライム被覆表面からの微生物バイ
   オフィルムの除去及び廃水処理に有効な酵素混合物。 ６、セルラーゼ２部、α−アミラーゼ少なくとも１部で
   且つ２部未満及びプロテアーゼ０．５〜１部からなる、
   スライム被覆表面からの微生物バイオフィルムの除去及
   び廃水処理に有効な酵素混合物。