JPH0363352B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は比重調整した固定化菌体もしくは固定
化酵素に関する。 固定化菌体（ここで菌体は細菌、酵母等の菌体
をいう）を用いて、エタノール、アセトンおよび
ブタノール等を発酵生産することは公知である
〔エタノールについてEuropean J.Appl.
Microbiol.Biotechnol10，275〜287（1980），アセ
トン・ブタノールについてBiotechnology
Letters vol.2（No.５），241−246（1980）〕。 固定化菌体を用いる連続発酵における培地の供
給方式には上昇流方式と下降流方式とがあるが、
下降流方式は発酵中に増殖する菌体や培地中の浮
遊物による閉塞、偏流を伴いやすい問題点があ
る。これらの問題点は特に固定化菌体の粒子が小
さいときに発生しやすい。 したがつて一般には上昇流方式が望ましい。 ただし、この上昇流方式で発酵を行う場合に
は、固定化菌体の比重と培地の供給速度との関係
で固定化菌体が浮上するか又は沈降して一部反応
に十分関与しない固定化菌体が存在する状態を生
ずることがある。 浮上や沈降は発酵生産物の収量の低下をもたら
す。ここで培地の供給速度を下げれば浮上率を下
げることができるが、そうすると単位時間当りの
収量が減るので好ましくない。 そこで本発明者らは供給速度をおとすことなく
浮上率を下げることを種々検討した結果、固定化
菌体として、固定化の際に発酵に悪影響を及ぼさ
ない固体を第３成分として含ませることにより比
重を調節した固定化菌体を用いることにより浮上
率を下げることができることを見い出した。 なお、比重調整の必要性は下降流方式でも存在
し、本発明はこの場合にも適用されるものであ
る。 本発明は以上の知見によりなされたものであ
る。なお、本発明は固定化菌体に限らず固定化酵
素の場合も全く同様に適用でき、その場合も本発
明の範囲内に入るが、固定化菌体の場合を例にし
て以下、本発明をさらに詳しく説明する。 発酵生産菌の固定化は一般的手法によつて行う
ことができる。例えば担体結合法、架橋法、ゲル
包括法などを適用できる。 これらのうち、固定化が容易で安定した活性が
得られるゲル包括法が好適に使用される。ゲル包
括法にはアルギン酸カルシウムゲル、ポリアクリ
ルアミドゲル、コラーゲン、フイプリン、寒天、
カラギーナン、セルロース等による方法がある。
これらのゲルによる包括の操作は公知の操作によ
ればよいが具体的な例を示せば次の通りである。 すなわち、アルギン酸ナトリウム水溶液中に包
括しようとする生菌体又は培養液を加え混合物を
つくり、ゲル化剤の塩化カルシウムなどの水溶液
中に該混合物を滴下すると固定化菌体が得られ
る。 ポリアクリルアミドゲルによる包括は、アクリ
ルアミドモノマー、架橋剤としてのＮ，N′−メ
チレンビスアクリルアミドおよび生菌体（培養液
としてでもよい。を緩衝液に懸濁し、該懸濁液に
重合開始剤としての過硫酸アンモニウムおよび重
合促進剤としてのＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチ
ルエチレンジアミンを加えて15〜23℃で10分程度
重合反応を行わせると固定化菌体が得られる。 本発明でいう固定化菌体の比重調整は上記の固
定化に際し、比重を大又は小にする第３成分を担
体原料液（例えばアルギン酸ナトリウム水溶液、
アクリルアミドモノマー懸濁液）又は担体原料液
と生菌体もしくは培養液との混合物中に添加する
ことにより達せられる。 固定化菌体の比重を大にする第３成分としては
硫酸バリウム、バライトチタン白、ケイ酸類、ガ
ラス粉末などが、比重を小にする第３成分として
はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレ
ン、ポリウレタンなどを一般に用いることができ
る。 本発明の連続発酵は固定化菌体を反応塔に充填
して培地（発酵培地）を連続的に供給することに
より行う。連続発酵に先立つて回分式培養を行つ
てもよく、特にアセトン・ブタノール発酵では意
義が大きい。 連続発酵中の固定化菌体の浮遊状態は固定化菌
体の比重、培地の供給速度、発酵液の粘度、発酵
中に発生するガス量などによるが、培地の供給速
度は目的とする収量から設定され、又、粘度、ガ
ス量も定まるので、比重も好ましい浮遊状態とす
べく予め設定できる。本発明者らは固定化菌体の
比重を種々かえて発酵生産物（アセトンおよびブ
タノール、エタノール等）の収量との関係から検
討したところ、固定化菌体の液面上への浮上の程
度に収量が左右されること、つまり浮上の程度の
適当な範囲に設定・維持することにより高い収量
を維持できることを見い出した。その適当な範囲
とは３〜20％であり、この範囲に維持すれば前記
比重、供給速度、粘度、ガス量に関係なく高い収
量を維持できる。 固定化菌体の個々の粒子の比重は通常正規分布
をなしていると考えられるので、３〜20％はその
もつとも軽い部分であり、その部分が浮上してい
ることによつて、全体としての浮遊状態が酵素反
応にもつとも好適な状態になるものと考えられ
る。 回分式培養の温度、PH、炭素源濃度等の操作条
件は連続発酵時の操作条件と同様でよい。 連続発酵時の操作条件は発酵の種類〔例えばア
セトン・ブタノール発酵、アルコール（エタノー
ル）発酵等〕によつてそれぞれ通常行われている
条件でよい。 以下、アセトン・ブタノール発酵について上記
操作条件、使用菌等を念のため例示するが、これ
らは本発明をアセトン・ブタノール発酵に限定す
ることを意味するものではない。 本発明に使用するアセトン・ブタノール生産菌
としては公知のものが使用できる。 例えばクロストリデイウム（Clostridium）属
に属する種々の菌、すなわちクロストリデイウ
ム・アセトブチリクム（acetobutylicum）、クロ
ストリデイウム・サツカロペルブチアセトニクム
（saccharoperbutyacetonicum）、クロストリデイ
ウム・サツカロブチリクム
（saccharobutylicum）、クロストリデイウム・サ
ツカロブチルアセトニクム
（saccharobutylacetonicum）、クロストリデイウ
ム・サツカロアセトブチリクム
（saccharoacetobutylicum）などに属するアセト
ン・ブタノール生産菌が用いられる。具体的には
クロストリデイウム・アセトブチリクム
ATCC824，4259，10132，IFO3854，クロストリ
デイウム・サツカロペルブチアセトニクム
ATCC27022などがあげられる。 回分式培養及び連続発酵の培地としては、同様
のものを用いることができる。すなわち主炭素源
のほか窒素源、無機物その他の栄養物を程よく含
有する培地ならば、合成培地または、天然培地の
何れも使用可能である。炭素源としては、グルコ
ース、シユークロース、フラクトース、マンノー
ス、殿粉、殿粉加水分解物、廃糖蜜など種々の炭
水化物が使用できる。窒素源としては、アンモニ
ア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸
アンモニウム、酢酸アンモニウムなど各種の無機
および有機のアンモニウム塩類あるいは尿素およ
び他の窒素含有化合物、並びにペプトン、肉エキ
ス、イーストエキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フイツシユミールある
いはその消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化
物、蛹加水分解物など種々の天然物が使用可能で
ある。更に無機物としては、リン酸カルシウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを使用で
きる。 培地としてはバイオマスなどから製造される浮
遊物をかなり含んだ液も使用できる。このような
液の例は例えば特開昭53−136585に記載されてい
る。 回分式培養及び連続培養の温度、PH、炭素源濃
度等は菌の増殖、アセトンおよびブタノールの生
成がほどよく行われる限り特に限定はないが、28
〜38℃、PH6.5前後、炭素源濃度４〜10％（ｗ／
ｖ）（グルコース換算）が好適である。 回分式培養の終了又は連続式発酵への切り換え
は湧付（発酵生産物の生成に伴つて生成する水
素、炭酸ガス等の発酵ガスによる発泡）の始まつ
た時点がややその後に行うのが通常である。 連続式発酵は上昇流方式でも下降流方式でも行
うことができる。 培地供給速度は特に限定はないが充填固定化菌
体１当り0.1〜0.4／hrが適当である。 以上、固定化菌体の場合について説明したが固
定化酵素の場合も公知の手法により調製した固定
化酵素を用いて上記と同様に本発明を適用するこ
とができる。 実施例 １ (1) 固定化菌体の調製 クロストリデイウム・サツカロペルブチアセ
トニクムATCC27022のソイルストツクの少量
を試験官中の下記組成の活性化培地10mlに入れ
て沸騰湯煎中で１分間熱処理（いわゆるheat
shock）した。次に冷却して30℃で24時間嫌気
培養した。ついで得られた活性化培養液を250
ml容三角フラスコ中の下記組成の種培養培地
150mlに加え、30℃で24時間嫌気培養した。 一方、第３成分としての硫酸バリウムを一定
量添加した３％アルギン酸ナトリウム水溶液を
110℃で10分間殺菌し、冷却後上記種培養液を
10％（ｖ／ｖ）加え、混合物を１％塩化カルシ
ウム水溶液中に滴下して固定化菌体を得た。 活性化培地： 馬冷薯150ｇ、ブドウ糖３ｇ、硫酸アンモニウ
ム0.6ｇ、炭酸カルシウム1.2ｇおよび水420mlよ
りなる。 種培養培地： 糖蜜６ｇ／dl（グルコースとして）、硫酸アン
モニウム0.5ｇ／dl、炭酸カルシウム0.3ｇ／dl，
過リン酸石灰0.03ｇ／dl 上記固定化菌体各60mlを第１図に示すごとき
100ml容反応塔に充填し、下記発酵培地を供給し
て反応塔内容量を100mlにして32℃で回分培養を
行つた。培養開始後20時間目から前記発酵培地を
固定化菌体１当り0.2／hrの速度で上昇流方
式で連続供給し、連続発酵を開始した。発酵温度
は32℃とした。連続発酵開始後７日目の固定化菌
体浮上率、対糖収率を第１表に示す。 発行培地： 糖蜜６ｇ／dl（グルコースとして）、炭酸アン
モニウム0.5ｇ／dl，炭酸カルシウム0.3ｇ／dl，
過リン酸石灰0.03ｇ／dl

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施に使用する発酵装置の一
例を示す。図中各番号は次の意味を示す。 １：供給糖液、２：定量ポンプ、３：反応塔、
４：固定化菌体、５：受器。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 固定化の際に発酵に悪影響を及ぼさない固体
   を第３成分として含ませることにより、比重を調
   整し、発酵液面上への浮上の割合を３〜20％とな
   した固定化菌体もしくは固定化酵素。