JPH0356102A - アルカリゲネス・キュピダスの産出する多糖類、それを用いた凝集剤及び凝集方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な多糖類、該多ｔ！類の製法、微生物由来
の凝集剤及び凝集方法に関するものであり、これらは、
各種の汚濁物質の処理、各種工業の排水処理分野、都，
市下水、各種の発酵液の処理、さらには有用物質等の回
収利用等広範囲にわたり利用が期待される。

〔従来の技術〕

凝集剤は各種工業の進展に伴い、各種工程及びそれから
排出される廃水分野に広く使用されている。凝集剤は一
般的に合戒高分子系（例えば、ポリアクリルアミド系等
）、無機系凝集剤（例えば、硫酸バンド等）及び生物系
凝集剤に大別される。

このうち微生物産生凝集剤は微生物が生産する物質で他
の物質を凝集させ沈澱（沈降）し易くさせる性能を有す
る物質である。また、機能面よりとらえると、カチオン
系、ノニオン系、アニオン系の３つに分類することがで
きる。

従来、これら合戊高分子系及び無機系凝集剤は活性汚泥
法等を用いた廃水処理分野から土木浚渫工事等への清澄
処理剤として多用されてきた。また、上水道、中水道の
造水分野、発酵工業における発酵液と菌体の分離といっ
たダウンストリームブロセッシング分野からさらには食
品工業分野への適用というように非常に広範囲な分野に
わたって凝集剤の使用は期待されている。このように、
凝集剤の使用は今日の社会生活に深く組み込まれており
、なくてはならないものであるがゆえに、さらに今後ま
すますその使途が多岐にわたり使用量が増加するものと
予想される。このため凝集剤の使用は環境面ひいては人
間の健康にも直結していると考えられる． しかしながら、現在広く用いられている合威高分子系凝
集剤（例えば、ポリアクリルアξド）等は能力、経済性
の点で優れているが安全性及び環境面での問題点も指摘
されていると言われている。

さらに、バイオインダストリーにおけるダウンストリー
ムプロセッシングへの適用を考えると合成高分子系凝集
剤の使用には問題があると考えられる。

これらの欠点を解消・克服する新規凝集剤の開発は各方
面より切望されており、特に生分解性を持ち安全でかつ
二次公害の恐れのない生物由来の凝集剤の開発が急務な
課題となっている。

ところで、微生物産生凝集剤についてはダラム陽性細菌
に属するロードコッカス属由来の微生物産生凝集剤ＮＯ
Ｃ−１　（日本特許第１，０９６，０６２号）又、黒色
菌科（Ｄｅ＋ｗａｔｉａｃｅａｅ）のデマチューム属（
Ｄｅｍａ　Ｌｉｕｍ）が生産する微生物産生凝集剤（特
公昭６１−４７５１２号公報）又、ダラム陰性細菌アル
カリゲネス・レイタスが生産する微生物産生凝集剤（日
本発酵工学会昭和６３年大会要旨集ｐ．１５０．　１９
８８年）も知られており、凝集剤として有効であるが、
より高い収率の微生物産生凝集剤が求められていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

このような背景のもとに、本発明者らは高分子系凝集剤
等のもつ問題点を解消・克服すべく広く微生物、特にダ
ラム陰性細菌による微生物産生凝集物質を求めて検索を
行った。

即ち、安全性、生分解性が優れており二次公害の恐れの
ない安全な凝集剤及びその凝集方法について種々の研究
開発を重ねたところ、ダラム陰性細菌のアルカリゲネス
属に属する微生物、特にアルカリゲネス・キュピダスの
産生ずる多ＩＩ類、アルカリゲネス・キュビダスの培養
物又は培養処理或いはそれらと無機塩の１種との存在下
で非常に優れた凝集効果を有すること、かつ高収率で凝
集剤が得られることを見出し、本発明を完威させるに至
った。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は、次の１乃至４の技術的構戒からな
る． １．　アルカリゲネス・キュビダスに属し凝集物質産生
能を有する微生物の培養物又はその培養処理物を主成分
とする微生物産生凝集剤。

２．　アルカリゲネス・キュピダスがアルカリゲネス・
キュビダスＫＴ２０１株（ｐＥＲｎ　ｐ−１０６０９）
である上記１記載の微生物産生凝集剤。

３．　カチオン性無機塩の少なくとも１種以上を含有す
る上記１ないし２記載の微生物産生凝集剤。

４．上記１ないし３のいずれかの微生物産生凝集剤を被
処理物と接触せしめることを特徴とする凝集方法。

５．下記の理化学的性質を有する多Ｉｉ類。

（１）元素分析：炭素３６．９４％，水素５．４２％（
２）紫外吸収スペクトル：３４０〜１９０ｎｍの範囲内
では極大吸収はないが３００ ｎｍから徐々に吸光度が増 加した。

（３）赤外吸収スペクトル：３５５０ｃｍ−’にＯＨの
吸収、１７２０ｃｍ−’にカルボキシエ ステルの吸収、１６０５ｃ＋ｒ’ にカルボキシル基の吸収 が確認できる。

（４）呈色反応：ニンヒドリン反応 キサントプロテイン反応 フェノール硫酸法　　　　　十 アンスロン硫酸法　　　　　十 カルバゾール硫酸法　　　　十 Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ反応 （５）′！＃質の色：白色 （６）溶剤に対する溶解性：熱水に易溶冷水に易溶 希酸に易溶 希アルカリに易溶 アルコール、ジメチル ホキシド、クロロホル ム、ヘキサンに不溶 （７）構成糖及び構威糖比：グルコース／ガラクトース
／グルクロン酸＝ ６．３４　：　５．５５　：　１．０ （８）脂肪酸及びその含量：酢酸　６〜１ｌ％四ハ）（
９）旋光度：　６７．０　［αｌ”，”　ＤＷ００）イ
オン性：アニオン性　１．６９　（ｍｅｑ／ｇ）（１１
）極限粘度：　１７２　（溶媒：蒸留水）０２）炭化点
：２３７〜２５６℃ ６．アルカリゲネス属に属する上記５記載の多糖類を産
生ずる能力を有する微生物を培地に培養し、培養物から
前記多糖類を採取することを特徴とする前記多糖類の製
造方法。

本発明に使用される微生物は凝集物質生産能を有するア
ルカリゲネス・キュビダスに属する微生物であれば、い
ずれでもよいが、その代表菌株としてアルカリゲネス・
キュピダスＫＴ２０１株が挙げられる。そして、このア
ルカリゲネス・キュビダスＫ７２０１株は工業技術院微
生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−１０６０９として
寄託されている。

以下、本発明に使用する菌株（ＦＢＩ？Ｍ　Ｐ−１０６
０９）の菌学的性質を第１表に示す。

この第１表に示す菌学的性質について細菌分類書である
バージー・マニュアル・システマテンク・バクテリオロ
ジー第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏ
ｌｕｍｅ　１）＋　（１９８４年）で検討した結果、回
書第３７２頁に記載されているアルカリゲネス・キュピ
ダスと一致し、本菌をアルカリゲネス・キュピダスと同
定した。

なお、タイフ゜ストレイン（八ＴＣＣ　２７１２４）に
おいては第１表における糖より酸の生成、菌体外ボリマ
ー生産能の記載は坤い、また酢酸での生育のみタイプス
トレインと異なるが他の諸性質は本願の株とタイプスト
レインは一致する。

（本頁以下余白） 第ｌ表 諸 性 質 運動性 べん毛 好気性生育 オキシダーゼ ＯＦテスト 硝酸還元 ゼラチン液化 菌体外ポリマーの生産能 各種Ｃ源での生育 グルコース フラクトース シュークロース マンノース キシロース アラビノース マンニット 周べん毛 十 グルコン酸　　　　　　　　　十 酢酸 アジビン酸 ピメリン酸 セバシン酸 スベリン酸 メソー酒石酸 タコン酸 ２％ＮａＣ１添加培地”ｆの生育　　　十〇Ｃ含量（％
）　　　　　　　６１．４％本２％ＮａＣｌ添加培地：
実施例ｌの培地にを添加した培地 ２％ＮａＣ１ 本菌を用いての培養条件及び凝集剤の生産は次の通りで
ある。炭素源としては、フラクトース、グルコース、シ
ェークロース等の単糖類、少９１Ｍ類の他に、ヘミセル
ロース、でん粉、コーンスターチ等の天然高分子等が好
ましくは用いられる。

さらに硫安等の無機体窒素源、酵母エキス、ペブトン、
麦芽エキス等の有機窒素源、その他リン酸カリ、硫酸マ
グネシウム、食塩等の無機塩類が培地構或成分として使
用される． 培養は液体培養でもよい。培養は初発ｐＨ４〜１０、温
度１５〜４０℃の範囲で行われる。培養は炭素源等の種
類にもよるが、培養１日から１０日間の間で行われる。

培養液は菌の生育にともない白濁し、粘性を有する凝集
物質の生産により粘質性となる。培養液の粘度は培養終
期で６３００ｃｐｓ　（２５℃）に達する。

培養を行うことにより凝集能を有する培養物を得る。遠
心分離により除菌した培養液に同量のエタノールを加え
、析出した凝集物質を遠心分離にて集め減圧乾燥等によ
り水分をとばした凝集物質が培養処理物として得られる
。しかしながら、本発明ではこのように分離精製した培
養物を使用するまでもなく、培養物そのものをそのまま
使用することができる。

本発明の本凝集物質は白色無定形で水に溶けて無色透明
の粘性のある液体となる。本凝集物質の０．１％溶液は
ｌ！類呈色反応としてのアンスロン反応に強い陽性を示
し、蛋白呈色反応としてのキサントプロテイン反応（検
出限界は牛アルプミンで０．０１％以上）に陰性、アξ
ノ基呈色反応としてのニンヒドリン反応（検出限界はグ
リシンで０．００１％以上）に陰性であった。また、本
凝集物質は各種コロイド試薬との、例えば、メチルグリ
コールキトサン及びグリコールキトサンとの反応性から
、アニオンボリマーであった．以上の結果から本凝集物
質は多糖を主戒分としたアニオンポリマーと考えられる
。この凝集物質、すなわち多￥ｐ４類の理化学的性質を
詳細に記載すると次の通りである。

（１）元素分，析：炭素３６．９４％，水素５．４２％
（２）紫外吸収スペクトル：第１図に示した。

３４０〜１９０ｎｍの範囲内では 極大吸収はないが３００ｎｍ から徐々に吸光度が増加 した。

（３）赤外吸収スペクトル：第２図に示した。

３５５０ｃｍ−’にＯＨの吸収、１７ ２０ｃｍ−’にカルボキシェス テルの吸収、１６０５ｃｍ−’に カルボキシル基の吸収が 確認できる。

（４）呈色反応：ニンヒドリン反応 キサントプロテイン反応 フェノール硫酸法 アンスロン硫酸法 カルバゾール硫酸法 Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ反応 （５）物質の色：白色 （６）溶剤に対する溶解性： 十 ＋ ＋ 熱水に易溶 冷水に易溶 希酸に易溶 希アルカリに易溶 アルコール、ジメチル ホキシド、クロロホル ム、ヘキサンに不溶 グルコース／ガラクト ース／グルクロン酸＝ ６．３４　：　５．５５　：　１．０ （７）構戒糖及び構成糖化： （８）脂肪酸及びその含量：酢酸　６．６〜１０．３％
（Ｗ／Ｗ）（９）旋光度：６７．Ｏ［α］！！ｌｆｆ　
ｏ匈００）イオン性：アニオン性　１．６９　（ｍｅｑ
／ｇ）（１１）極限粘度：　１７２　（溶媒：蒸留水）
０力炭化点：２３７〜２５６℃ ０３）電気泳動：酢酸セルロース膜電気泳動により本多
ＩＪ！類の脱アセチル体が均一物 質と確認された。（第３図） 本結果から、本凝集物質はグルコース、ガラクトース、
グルクロン酸及び脂肪酸を含む酸性多糖類であり、糖の
水酸基の一部はアセチル化されていると考えられる。

この凝集物質の凝集効果をさらに促進するために併用さ
れる無機塩としては水中でカチオンを生成し得るものが
望ましく、好ましくは２価以上の多価カチオンを生威し
得るものがよく、塩化カルシウム、硫酸アルミニウム、
硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄が効果的に用いることが
出来る。

しかし、これら併用される無機塩の添加量は凝集させる
べき対象の種類によって決められるのが望ましく一般に
特に制約されるものではない。

本発明において、凝集の対象となるものは特に制約され
るものではない。代表的なものを例示すると、粘土の一
種であるカオリン（白とう土）懸濁液、活性炭懸濁液が
例示される。一般には各々の凝集対象に際し、好適に実
施される。

本発明の方法は一般的には各種懸濁液などに対し、本発
明によるアルカリゲネス・キュビダス菌の培養物又は培
養処理物を加えるか、あるいは各種懸濁液に本発明によ
るアルカリゲネス・キュビダス菌の培養物を加え、つい
で併用する無機塩を加えることによって実施される。こ
れらの実施方法は特に制約されるものではない。

〈吸光度による凝集活性測定〉 本活性測定法は下記のごとく行った。

すなわち、５０００ｐｐｍカオリン懸＠液１００ｄを１
００ｍｌのメスシリンダーに採り、硫酸アルξニウム０
．０５成（０．５％）を加えた後、５倍に希釈した培養
物（又は精製物）　０．１ｉｄを加え転倒攪拌した。５
分間静置し、その上清液の吸光度を波長５５０ｎｍにて
分光光度計を用いて測定した。各吸光度を測定した後、
次式により凝集活性（ＦＡ）を算出した。

１ １ なお、コントロールの００５５０は前述の培養物の代り
に培地におき変えたものであり、他は全て前述と同じ方
法をとったものである。

〔発明の効果〕

本発明により、アルカリゲネス・キュビダスに属する微
生物が産生ずる新規な多ｔｌ！ｉｆ！及びそれを用いた
凝集剤を提供することができた。モして−、この凝集剤
は、安全性、生分解性が優れたものであって、二次公害
を生しないものである。又、この凝集剤は無機塩を添加
することにより、更に優れた凝集効果が得られる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説？する。

実施例１ 〈凝集物産生菌の培養と凝集物質の精製〉シュークロー
ス４．０ｇ，　　（ＮＨｎ）ｔｓＯａ　０．０２ｇ，Ｍ
ｇＳＯｎ・７Ｈｚ０　０．０４ｇ．　ＣａＣ１ｔ・Ｈｚ
０　０．００４ｇ．ＮａＣ１　０．０２ｇ，ＦｅＳＯ．
・ｌｌｔ０　０．００２ｇ．κＩ１■ＰＯａ　０．０４
ｇ．　ＫＪＰＯｍ　０．３２ｇ＋酵母エキス０．０４ｇ
を蒸留水２００ｍｆｆｉに溶かし、培地をｐＨ’７．１
±０．１に調整した。これを５００ｍ三角フラスコに入
れオートクレープ殺菌（１２０℃．　１５分）した後、
アルカリゲネス・キュピダスＫＴ２０１株（Ｆｌｌ！Ｒ
Ｍ　Ｐ−１０６０９）を１白金耳の量でフラスコに移植
し、３０゛Ｃにて回転振とう培養（回転数は１８０ｒｐ
ｍ）を行う。本培養時の菌体と凝集活性の経時変化を調
べた。菌体量は、その濁度を分光光度計にて波長６６０
ｎｍにて吸光度を測定することにより求めた．凝集活性
測定は前述の示した様に行った．結果を第２表に示す。

菌体の生育は培養３日間内に対数増殖期になるが、その
後も少しずつ菌体増殖が続いた。

しかしながら、本凝集活性は培養３日で最大となり、 それ以降は定常状態となった。

第２表 この最大凝集活性を示す培養液より凝集剤の精製を行っ
た．即ち、培養液から遠心処理により菌体を除去した。

その後、同量のエタノール（アセトン、メタノール等で
もよい）を加え、析出した凝集ＩＩＪ質を遠心分離によ
り集め、減圧乾燥すると白色無定形の固形凝集剤を得る
ことが出来た。これらの操作により前記培地を用いるこ
とにより、培養液２００ｄ当り約０．６ｇ　（乾燥重量
）の凝集物質を得た． 実施例２ く部分精製凝集物質からの多糖類の調製法〉エタノール
沈澱により得られた部分精製凝集物質１．６ｇを０。０
５Ｍ塩化ナトリウム８５０ｄに溶解後、ｌＯ％セチルピ
リジニウムクロリド（ＣＰＣ　）水溶液４８ｍｌを攪拌
しながら徐々に加え、３７℃で一夜静置した。その後、
析出した繊維状物質（凝集物質とＣＰＣの複合体）を集
め、蒸留水（ＤＷ）で洗浄した。その繊維状物質に０．
４Ｍ塩化ナトリウム５００ｍを加え溶解させた。次に同
量のエタノールを徐々に加え析出した繊維状凝集物質を
集め、エタノールで５回洗浄後、シリカゲルを含む真空
ディシケーターにて乾燥させた。乾固物を０．２５Ｍ塩
化ナトリウム７５０成に溶解後、エタノールを加え、析
出した繊維状凝集物質を集めた。それをエタノールで２
回洗浄後、五酸化リンを含む真空ディシケーターにて乾
燥させ、多Ｉｉ類１．２８ｇを得た（収率８０％）。

実施例３ く培養処理物によるカオリン懸濁液の凝集〉実施例１の
ようにして精製したところの培養処理物（精製物）０．
４■（乾燥重量）を１　ｍＡ蒸留水に溶解させ培養処理
物水溶液（０．４■／ｄ）を作った。この培養処理物水
溶液０．１ｍｌを用いて、前述のカオリン懸濁液を用い
た吸光度による凝集活性を測定した。結果を第３表に示
す。第３表に示す如く培養処理物によりカオリンは効果
的に凝集沈澱し、透明できれいな上清液が得られた。

第３表 カオリン懸濁液　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．００〃　　十精製物　　
　　　　　　　　　１．Ｉ８〃十〃　　　十硫酸アルミ
ニウム　　　　　　　　　６．０９〃　　　　　十硫酸
アルミニウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．０６実施例４ くカチオンの併用効果〉 凝集活性測定は前述のカオリン懸濁液を用いた吸光度に
よる活性測定法に従って行った。

凝集反応液における硫酸アル５ニウムを各種無機塩に置
き変え凝集時におけるカチオン性無機塩の併用効果を検
討し、これら添加無機塩水溶液の濃度、添加量は全て同
じである．結果を第４表に示した。第４表に示す如く各
種カチオン溶液全てに添加効果が認められた。中でも塩
化カルシウム、硫酸アルミニウム、硫酸マグネシウムに
高い併用効果が認められた。

第４表 カｔＶ：／懸濁液＋培養液 ｔｔ　　　　　−ｔ−培４液＋硫酸ア１シミニウム〃　
　十培養液十塩化カルシウム 〃　　十培養液＋硫酸第一鉄 〃　　　　　十培養液＋硫酸マグネシウム〃　　　　　
十硫酸アルミニウム 〃　　　　十塩化ｔＩルシウム 〃　　十硫酸第一鉄 〃　　　　　十硫酸マグネシウム ３．０ ７．９７ ７．９７ ５．８３ ７．１７ ０．０６ ０．０５ ０．０５ ０．０２ 実施例５ く活性炭粉末の凝集〉 ５０００ｐｐｍ活性炭粉末懸濁液ｌ００Ｉｄに実施例１
で得られたところの培養液の５倍希釈液０．　１　ｄを
加えｐＨを４〜６に調整し、転倒攪拌した。５分静置し
た。その上清の濁度を波長５５０ｎｍにて吸光度を測定
することにより求めた。第５表に示す様に活性炭粉末も
カオリン同様に凝集することが出来た。

第５表 上清液濁度（ＯＤｓｓ。）

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ本多糖類の紫外吸収スペ
クトル及び赤外吸収スペクトル、第３図は、本多ＩＪｉ
類の脱アセチル体の電気泳動写真である。 都永連

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリゲネス・キュピダスに属し凝集物質産生能
   を有する微生物の培養物又はその培養処理物を主成分と
   する微生物産生凝集剤。 ２、アリカリゲネス・キュピダスがアルカリゲネス・キ
   ュピダスＫＴ２０１株（ＦＥＲＭＰ−１０６０９）であ
   る請求項１記載の微生物産生凝集剤。 ３、カチオン性無機塩の少なくとも１種以上を含有する
   請求項１〜２記載の微生物産生凝集剤。 ４、請求項１ないし３のいずれかの微生物産生凝集剤を
   被処理物と接触せしめることを特徴とする凝集方法。 ５、下記の理化学的性質を有する多糖類。 （１）元素分析：炭素３６．９４％、水素５．４２％（
   ２）紫外吸収スペクトル：３４０〜１９０ｎｍの範囲内
   では極大吸収はないが３００ ｎｍから徐々に吸光度が増 加した。 （３）赤外吸収スペクトル：３５５０ｃｍ＾−＾１にＯ
   Ｈの吸収、１７２０ｃｍ＾−＾１にカルボキシエ ステルの吸収、１６０５ｃｍ＾−＾１ にカルボキシル基の吸収 が確認できる。 （４）呈色反応：ニンヒドリン反応 キサントプロテイン反応 フェノール硫酸法＋ アンスロン硫酸法＋ カルバゾール硫酸法＋ Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ反応 （５）物質の色：白色 （６）溶剤に対する溶解性：熱水に易溶 冷水に易溶 希酸に易溶 希アルカリに易溶 アルコール、ジメチル スルホキシド、クロロ ホルム、ヘキサンに不 溶 （７）構成糖及び構成糖化：グルコース／ガラクトース
   ／グルクロン酸＝ ６．３４：５．５５：１．０ （８）脂肪酸及びその含量：酢酸６〜１１％（Ｗ／Ｗ）
   （９）旋光度：６７．０［α］＾２＿Ｄ＾３ＤＷ（１０
   ）イオン性：アニオン性１．６９（ｍｅｑ／ｇ）（１１
   ）極限粘度：１７２（溶媒：蒸留水）（１２）炭化点：
   ２３７〜２５６℃ ６、アルカリゲネス属に属する請求項５記載の多糖類を
   産生する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物か
   ら前記多糖類を採取することを特徴とする前記多糖類の
   製造方法。