JPH03505471A - タンパク質抵抗およびタンパク質除去のための高分子超界面活性剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質抵抗およびタンパク質除去 のための高分子超界面活性剤 発明の背景 本発明は、（１）タンパク質および他分子の付着を最小とするための材料の処理 、および（２）材料からのタンパク質および多分子の除去、のための材料および 方法に関する。我々は、主な装置はタンパク質溶液に関連すると予測するのでタ ンパク質という単語を用いる。

しかし、我々は、既述の方法および原料があらゆる界面吸着、付着および凝集過 程に適用されると理解している。

原料および器具が生体溶液および生理溶液を含めて種々の水性およびその他溶媒 媒体に接触しなければならない多くの装置がある。

このような媒体は、界面に吸着できおよび／または凝集できるタンパク質または 他の化学物質を頻繁に含有する。多くの装置にとって、上記分子の付着および凝 集を最小とするのが望ましくかつしばしば必要となる。タンパ々質付着が望まれ ない例として。

心循環系器具類（凝固、血栓症、および／または補体の賦活化）； 眼科用器具類（生化学プロセスの活性化、眼特性不全）；血液および血液成分の 収集および保存のための血液バッグおよび関連器具類；酪農および食肉業界を含 む食品加工および保存；薬製品（ペプチド類または他の活性物質の吸着および変 性）。

；ヒト用衛生製品（おしめおよび生理用ナプキン類のような）；膜類（極性化お よび汚損）；センサー類（非特異的結合）；クロマトグラフィ、電気泳動、およ び場流量分離のような分離工程；バイオテクノロジープロセスおよび生化学工学 （反応容器界面および気泡および／またはその他の気体／液体または真空／液体 界面における吸着および凝集）。

上記およびその他の全ての装置において、タンパク質の吸着、付着および凝集を 最小とするために界面を処理する１正皇材料および方法を有することが望ましい 。タンパク質類が未処理界面、素材または器具に吸着する場合、このタンパク質 類を除去する１１皇手段を有することが望ましい（良い例は、コンタクトレンズ の洗浄である）。

Ｉ−−一」仕 我々および他者は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）（ポリエチレングリコール またはＰＥＧとも呼ばれる）が界面に結合すると、水溶液中において有効なタン パク質抵抗を持たらすことを示してきた。他の中性親木性ポリマー類もまた有効 であるが、ＰＥＯはその特徴的な水との相互作用によってタンパク質抵抗を促進 する上で例外的に有効である。我々および他者は、ＰＥＯ含有非高分子性ブロッ ク共重合体界面活性剤が界面において吸着されタンパク質抵抗を付与することが できることを示してきた。このような吸着は、しかし。

余り安定でないことが頻繁であり、このタンパク質抵抗効果は至適なものではな い。

既述の問題を、 １、　界面に最も良く結合し安定で長期にわたり効果的なタンパク質抵抗性の界 面を付与するべく分子的にエンジニアリングされた新規組成物すなわちＰＥＯ側 鎖含有共重合体について述べること、および。

２、　これらの新規重合体類による界面の効果的処理および改変の過程を述べる こと。

によって克服することが本発明の目的である。

我々は、これらの重合体類を″超界面活性剤″と呼ぶ・問題の界面への強力な結 合を付与するＰＥＯ鎖、スペーサー類および成分を含有する高分子界面活性剤組 成物が提供される。

本発明は特に、 （１）ＰＥＯブロック含有ポリウレタンおよび他のブロック共重合体類； （２）プルロニック（ｐｌ、ｕｒｏｎｉｃ）　、テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉ ｃ）および／またはポリアロキリマータイプのＰＥＯトリブロックおよび関連共 重合体界面活性剤類； （３）ＰＥＯ含有単量体と塩化ビニルおよび／または酢酸ビニルとのグラフト共 重合体類；および（４）ＰＥＯを既存の固体原料にグラフトするための他の工程 類、 を除外する。

本発明は、疎水性イオン性および疎溶媒性の相互作用によって溶液から前記の超 界面活性剤を適切な界面に結合させるように設計された組成物を実際に含む。Ｐ ＥＯ鎖含有重合体類は、約２００の最小ＰＥＯ鎖分子量を有し、これ以下では前 記のタンパク質抵抗が化学的に劣化する。　４０００およびそれ以上では、前記 重合体類はほとんど同一の特性を有する。前記共重合体上のＰＥＯ鎖スペーシン グは、４〜２０人の範囲内に入る。４人より少しでも近接するよう間隔を取るこ とは、化学的には極めて困難である。および、より広い間隔では。

前記のタンパク質抵抗特性が有意に劣化する。

上記を例示するものとして、下記の例を引用する： （ａ）空気または気体／液体界面および固体／水接触角が２０°　より大きい固 体／液体界面のような疎水性界面において疎水性結合を付与するアルキル鎖また は基類を含有する共重合用単量体類；（ｂ）疎水性または過フッ化炭化水素表面 への疎水性または親フッ素性結合を付与するフルオロアルキル鎖または基類含有 共重合用単量体類；（ｃ）シロキサンおよびその他の疎水性表面への結合を付与 する種々のシロキサン成分含有共重合用単量体類； （ｄ）正の価電表面との静電気的相互作用を付与する負の価電基類を含有する共 重合用単量体類；（ｅ）負の価電表面との静電気的相互作用を付与する正の価電 基類を含有する共重合用単量体類；（ｆ）複合界面の複数の結合性質と最適に相 互作用する疎水性、疎フッ素性、正または負の性質をおよその比率で有する共重 合用単量体類。

全ての場合において、目的は、タンパク質付着を最小とするために充分なＰＥＯ を含有する界面を作ることである。

この工程で用いられた単量体類は、炭素−炭素二重結合を有し、例えば、過酸化 ベンゾイル、アゾビスイソビチロニトリル、および、アゾビスジメチルバレロニ トリルのような従来のラジカル開始剤によって共重合できる。

共重合後、前記共重合体類は沈殿によって適切な沈殿剤中に単離される。しかし 、生体材料表面上への付着のため、重合混合物を（この共重合体濃度を調整後） 直接使用することができる。未反応の単量体類は、適当な溶媒によって洗い流す ことができる。これらの操作およびその他をさらに詳細に下記で説明する。

１−皿 本出願に述べたデータに対応するグラフを下記の図面に示す。

第１図は、タンパク質吸着前後においてＬＤＰＥ表面上に吸着された重合体の量 を示すグラフである。

第２．２Ａおよび２Ｂ図は、前記合成共重合体類と特定市販界面活性剤間の表面 特性の比較である。

第１図　タンパク質吸着前後においてＬＤＰＥ表面上に吸着された重合体の量（ タンパク質吸着、ヒトアルブミン１ｍｇ／鳳直、３０分；重合体処理、１＋Ｈ／ ｍ１重合体溶液中における３０分吸着後の水中における３０分脱離、網掛は棒グ ラフ、タンパク質吸着前、斜線棒グラフ、タンパク質吸着後）（ｎ＝３） 第２，２Ａおよび２Ｂ図　前記合成共重合体類と特定市販界面活性剤間の表面特 性の比較（ｎ−３−５） 第２図　ＬＤＰＥ表面上における重合体類の吸着第２Ａ図　重合体処理ＬＤＰＥ 表面のタンパク質抵抗 第２Ｂ図　ＬＤＰＥ表面における吸着剤タンパク質の重合体溶液処理による除去 特性（網掛は棒グラフ、アルブミン１．０ｍｇ／ｍｌ吸着；斜線棒グラフ、血漿 １．０％吸着）。

試　　薬 モノ　　キシポ１　エ　レンオキシ（１９００メ゛　　ル−　　ＭＰＥ○１９０ ０　Ｍ　Ａ　　　　１９００は゛よ　　　　　　　・　る。

５℃に冷却した乾燥塩化メチレン　（ＣＩ、　ＣＩり２０ｔｎ　Ｑ中のモノメト キシポリ（エチレングリコール）（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ） ）１５．２　ｇ　（８ｍ＋ｎ０１）の充分に撹拌した溶液中に、　塩化メチレン ２ｍＡおよびトリエチルアミン１．６２　ｇ　（１６ｍｍｏｌ）中メタアクリロ イルクロリド１．６７ｇ（１６ａ＋ａ＋ｏｌ）をゆっくりと滴下した。その後、 反応物を室温で一晩（少量の阻害剤三級オクチルピロカテキン存在下において） 撹拌した。沈殿したトリエチルアミン塩酸塩をろ去し、この溶液を冷却したジエ チルエーテル中に沈殿させることによって巨大単量体を単離し、粉末化した重合 体をジエチルエーテルで徹底的に洗浄し乾燥させた。

モノ　　キシポｒ　エ　レンオキジＪ 曹　レー　　　　ＭＰＥＯ４０００ＭＡ　　　ｌｔ　　　Ｓ、　　ｆガオカ（Ｎ ａｇａｏｋａ）　　（トーμ・インダストリーズ社（Ｔｏｒａｙ　Ｉｎｄｕｓｔ ｒｉｅｓ　、　Ｉｎｃ）、神奈川、日本）の好意により提供を受けた。（我々は ＭＰＥＯＭＡを゛１巨大単量体”と呼ぶ。

その理由は、それが、鎖末端〔メタアクリロイル末端基〕で重帯可能な機能を有 する種を有する単量体である一方で、長いＰＥＯ鎖を有する大分子であるからで ある。） ２２′　−ゾビス　ツブ　ロニ　１ル　ＡＩＢＮ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃ ｈ）　）　　はメタノールから再結晶によって精製し、重合開始剤として使用し た。

メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ヘキシルメタクリレート（ＨＭＡ）およびラ ウリルメタクリレート（ＬＭＡ）（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ） ）は、使用前に減圧下でその都度蒸留した。

ツへ 実施例１： この共重合体類は、トルエン中で前記単量体を４５時間、５０℃でタンデム（Ｔ ａｎｄｏｍ）重合することによって調製した。

単量体１４．０重量％、Ａ　Ｉ　Ｂ　Ｎｏ、６重量％およびトルエン８５．４重 量％含有重合混合物に１５分間、チッ素を通気した後アンプル中に密封した０重 合終了後、ロータリ・ペーパー・エバポレータを用いて減圧下に重合体溶液の容 量をおよそ５０％減容した。重合体類を冷却したジエチルエーテル中に沈殿させ 、洗浄しかつ乾燥させた。非共重合巨大単量体（約２０％、ゲル口過クロマトグ ラフィ（Ｇ　Ｐ　Ｃ３で決定）を除去するために、ＰＥＧ１９００含有重合体類 をビスキング（Ｖｉｓｋｉｎｇ）透析チューブ３５（分子量カットオフ、６００ ０−８０００）中で３０間透析した。Ｐ　Ｅ　０４０００含有重合体類は限外口 過（アミコン（八ｍ１ｃｏｎ）、メンブレンＰ　Ｍ−３０）を用いて精製した。

その後この重合体類を凍結乾燥によって単離した。第１表は１合成共重合体類の 一覧を示したものである０本表の各項目は特定の実施例と考えることができる。

この重合体類のほとんどは水または水性緩衝液の直接には可溶でないので、表面 張力または吸着研究、ＧＰＣ測定または透析または限外口過のための水溶液の調 製のためには特殊な操作法を用いた０重合体１１００ＩＩＩを温エタノール（約 ５０℃）５ｍｌ　　に溶解後、水２０＠ｔで希釈しその接水（表面張力および吸 着研究のため）またはトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ＧＰＣ測定のため）に対して 透析した。その後、本溶液を必要な′ａ度にまで希釈した１本重合体類はまた、 水−エタノール混合物のような混合溶媒中でも適用でき、または、エタノールの ような有機溶媒中でも適用できる。

表１．　使用ＰＥＯ含有界面活性剤の組成合成メ以下余白 １４　　　　　　　　　　　２０　　　　　　２０　−　　６０　〜　　　１７ α組成　　　　　　ｒｒｒｏ１％ 市販ブロック共重合体界面活性剤 ２６（Ｍ状ブロック）　　　　　　　　　　　　　　　２６　　　　　　　　　 ２９−４０実施例２：　　１に１創　ヘ　　−Δ　に口処理すべき高分子材料（ 低密度ポリエチレンフィルム（ＬＤＰＥ　　、ＮＨＬＢＩ　　ＤＴＳプライマリ ・レフ７ランス・マティリアル（Ｐｒｉｕ＋ａｒｙ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｍａ ｔｅｒｉａｌ））を吸着のため室温で３０分間。

共重合体溶液（１，０ｋｇ／ｍｌ）に浸漬した（平衡を達するためには、３０分 の暴露で充分であった）共重合体吸着フィルム類を精製水で洗浄し、その後、脱 離のため再度３０分間精製水に浸漬した。再度精製水で洗浄後、Ｘ線光電子分光 （ＸＰＢ）分析のためこの共重合体処理表面類を大気雰囲気中で一晩、真空乾燥 した。広範囲のスキャンによる酸素ＩＳピークを吸着共重合体分析に用いた。

共重合体吸着の定量化のため、少量のメタクリロイルチロシンアミド（ＭＡ−Ｔ ｙｒ−ＮＨｚ２　を合成中に共重合体類構造中に導入した。全共重合体中のチロ シン含量は１６±３ｎｍｏｌ／＋＋ｇ　（または約１．５０１０１％）であった 、この共重合体類は、改変クロラミン−Ｔ　（Ｃｈｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ）法を用 いてヨウ素−１２５で標識した。ヨウ素化反応時間は４時間であり、この反応混 合物は反応中連続的に振盪した。ヨウ素化後、ＬＩＩＪ標識共重合体溶液を別に 準備したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５ミニカラムに２回通 し。

遊離１２Ｊを除去した。あらかじめのその表面積を測定した処理すべき重合体素 材（ＬＤＰＥフィルム）を１ｍＪ標識および非標識重合体の公知の比率（ｒａｔ ｉｏｎ）の溶液中に浸漬し、そして、ｘｐｓ分析のための試料の場合と同操作で 吸着を行った。

共重合体吸着および洗浄の後で、この共重合体処理フィルムを直接計測バイアル に入れ保持された放射能をガンマカウンターで測定し、前記表面上に吸着された 重合体の量の値に換算した。

第１表は、ＸＰＳ分析およびヨウ素化標識のために合成した共重合体類を列挙し たものである。

第１図は、ＬＤＰＥ表面に吸着された共重合体類の量を示したものである。第１ 図はまた、タンパク質（ヒト血清アルブミン）暴露後において前記共重合体類が 前記表面上に安定に吸着されることを示している。

実施例：３廿臂　　ム　　　〜　　　　ンパク五五豊工 前記共重合体処理ＬＤＰＥフィルム類をｐ　Ｈ７，４のリン酸緩衝生理食塩水（ ＰＢＳ）で調整したタンパク質溶液（ヒトアルブミン、１　、　Ｏｎ＋ｇ／ｍ　 １または血漿１．０％）に３０分間浸漬後ＰＢＳ中で洗浄し、精製水で洗浄・真 空乾燥し、次いでこの調製された試料をＸＰＳで分析した。吸着タンパク°質の 分析のため、チッ素ＩＳピークを用いた。

Ｌ２Ｊ標識共重合体処理表面類を同様に用いて、これらの表面上におけるタンパ ク質の吸着前後の双方において放射能を計測し１表面上にあらかじめ吸着された 共重合体とこのタンパク質の交換の効果を調べた（第１図参照）。

第２図は、この共重合体類の表面特性をＰＥＯおよびポリプロピレンオキシド（ ＰＰＯ）またはポリブチレンオキシド（ＰＢＯ）含有市販ブロック界面活性剤か ら数種選択したものの特性と比較したものである。第２（Ａ）図におけるｘＰＳ 分析の酸素原子％は、前記重合体類が異なる数の酸素を含有しているので正確な 比較はできないが、ＬＤＰＥ表面における前記重合体類の吸着を示している。第 ２（Ｂ）図において、チッ素原子％は。

前記重合体処理ＬＤＰＥ表面類におけるタンパク質の相対吸着量を示している。

第２（Ｂ）図でわかるように、この合成共重合体類は、おそらく吸着量が多くし かもＰＥＯ鎖が長いことによって水中において高運動性が付与されるので、前記 市販ブロック界面活性剤よりもはるかに優れたタンパク質（アルブミンおよび血 漿）抵抗を示す。

ＬＤＰＥ表面類のタンパク質吸着のため、ＬＤＰＥフィルムをｐＨ７，４のリン 酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調製したタンパク質溶液（ヒトアルブミン、０． １ｍｇ／ｍｌ　または血漿１．０％）に３０分間浸漬しＰＢＳ中で洗浄し、精製 水中において洗浄を行った。大気雰囲気中で一晩真空乾燥後、ＬＤＰＥ表面類に おけるタンパク質の吸着量をＸＰＳで分析した。チッ素ＩＳピークをこの吸着タ ンパク質のために用いた。

タンパク質吸着済ＬＤＰＥフィルムを前記界面活性剤溶液（１，０ｍｇ／ｍｌ） に３０分間浸漬し、ＰＢＳおよび精製水で同様に洗浄し、真空乾燥し、その後表 面上に残存しているタンパク質を同様にｘＰＳによって分析した。

ＬＤＰＥ表面上に既に吸着されたタンパク質の除去のための合成共重合体類の効 果を第２（Ｃ）図において市販の界面活性剤の効果と比較した。

本図かられかるように、市販の界面活性剤の方が優れた除去特性を示してはいる が、この合成共重合体類は吸着済タンパク質（アルブミンおよび血漿）を効果的 に除去する性質を示している。ＸＰＳ分析、１２５１標識共重合体類および１２ ５■標識タンパク質の研究から、おそらく異なる種類の界面活性剤、合成共重合 体類（多分、このタンパク質と前記共重合体の交換機構によって主に作用する） 、および市販のブロック界面活性剤類（多分、このタンパク質と前記界面活性剤 との溶液機構によって作用する）を我々が用いる時、多分具なる機構によって前 記タンパク質類が前記表面から除去されると我々は結論することができる。

Ｆｉｇ、　　／ 浄書（内容に変更なし） 手続補正書 １．事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　　８９１０４１１０ ２、発明の名称 タンパク質抵抗およびタンパク質除去のための高分子超界面活性剤 ３、補正をする者 ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面明細書及び請求の範囲の翻訳文 図面の翻訳文（第２図、第２Ａ図、第２Ｂ図）委任状の翻訳文 ７、補正の内容 別紙の通り。

国際調査報告 喝＋１１＋＋ｊ１．１１ｓａ畷＾！ｅ’！１１１”’＠ｐＣ’！’／ｌｌ５ｌ！ ９７４１１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 我々は請求する； １．界面において吸着または付着されることができタンパク質抵抗特性を付与し 、無作為に配直されたポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）鎖を含有する可溶性重合 体類および共重合体類で、ＰＥＯ鎖分子量が２００より大きくかつ前記共重合体 類に沿った前記のＰＥＯ鎖スペーシングが４乃至２０Åである前記重合体類およ び共重合体類。 ２．アルキル鎖とともに無作為に配置されたポリエチレンオキシドＰＥＯ鎖を含 有し疎水性表面類上への最適吸着および結合を付与し、ポリオレフイン類、アク リレート類、およびメタクリレート類、ブニルポリマー類、ポリウレタンを含む 疎水性ブロック共重合体類、および前方水接触角が２０°より大きいその他全て の重合体類を含む可溶性重合体類および共重合体類。 ３．過フッ化炭素鎖とともにＰＥＯ鎖を含有しフッ化炭素表面類上への最適吸着 および結合を付与し、過フッ化ポリマー類および表面類、および前方水接触角が ７０°より大きいその他全ての重合体類を含む可溶性重合体類および共重合体類 。 ４．表面上への最適吸着および結合を付与するＰＥＯ鎖シロキサン鎖、および前 方水接触角が６０°より大きいその他全ての重合体類を含有する可溶性重合体類 および共重合体類。 ５．負または正の電荷を有する成分とともに無作為に配置されたポリエチレンオ キシドＰＥＯ鎖を含有し、それぞれ、正または負の表面上への最適吸着および結 合を付与する可溶性重合体類および共重合体類。 ６．ＰＥＯ含有単量体の量が５乃至９０重量％の範囲にあることを特徴とする請 求の範囲第１項に記載の材料。 ７．Ａが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは６乃至２００、Ｒ１はＨまたはＣＨ３、およびＲ２はＨまたはＣ１ からＣ８アルキルである）によって表わされる単量体単位Ａを５％重量以上およ び他の単量体単位を９５％重量以下含有する可溶性重合体類および共重合体類で 、前記共重合体類が、それ自体Ａと共重合可能である１個以上の共重合用単量体 類とＡの共重合によって合成される可溶性重合体類および共重合体類。 ８．前記共重合用単量体のひとつが式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ３はＣ１からＣ２ｓアルキルである）である請求の範囲第７項記載の 組成物。 ９．前記共重合用単量体のひとつが式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ４およびＲ５はＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルである）であり、他の共 重合用単量体がアクリル酸、メタクリル酸、ジアセトンアクリルアミド、Ｎ−ビ ニルピロリドン、ジエチルアミノエチル（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ）メタクリレート、およびシエメチルアミノエチル（ｄｉｅｍｅｔｈｙｌａｍｉ ｎｏｅｔｈｙｌ）メタクリレートである請求の範囲第７項記載の組成物。