JPH03504503A - カルシトニン遺伝子関連ペプチドアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシトニン遺伝子関連ペプチドアナログ１１目し九」 本発明はカルシトニン遺伝子関連ベゾチドの新規なアナログ、その製造方法及び その治療的使用に関する。

及豆塁！ｌ カルシトニン遺伝子関連ペゾチド（ＣＧＲＰ）はカルシトニン遺伝子系の産物で ある。カルシトニン遺伝子から二者択一的にＲＮＡが転写されることにより、３ ７個のアミノ酸のベゾチドであるＣ０ＲＰが神経組織中で産生される。０ＧＲＰ はラット、ニワトリ、ヒトを含む多くの種において発見されている。ＣＧＲＰ系 化合物は互いにわずか数個のアミノ酸しか異ならない程に密接に関連している。

ヒ）　０ＧＲＰはα−ＣＧＲＰ　Ｃ英国特許第ＧＢ２１４１４３ＯＢ号参照）、 β−ＣＧＲＰ　Ｃ欧州特許出願第ＫＰ−Ａ−１８８４［１０号参照）として存在 し、ｙ−ＣＯＲＰの存在もまた報告されている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ　ａｔヒ トα−ＣＧＲＰのアミノ酸配列は、よく知られた一文字記号を用いてアミノ酸残 基な示せば、ＡＯＤＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＩ９Ｇ　ＧＶＶＫＮＮＰＶ ＰＴ　ＮＶＧＳＫＡＦ　トなる。

Ｃ０ＲＰは、心臓血管系に対する効果という観点から、主として高血圧の処置に 用いられることが記載されており、直管拡張をひき起こし、血圧を降下させるこ とが認められている。Ｃ０ＲＰはまたカルシウム調節と胃液分泌において役割を 果たすものとされている。最近、Ｃ０ＲＰは脳血液供給減少の処置に有用である と報告された（本発明者らによる係属中の公開国際特許公報第ＷＯ３９１０３６ ８６号参照）。

本発明者らは天然の０ＧＲＰのアナログを研究し、有用な生物活性を示す０ＧＲ Ｐ由来の一群の新規なペプチドアナログを同定した。これらの化合物は、３番目 、２２番目、２５番目のうちの少なくとも二つが修飾されたＤＧＲＰアナログで ある。

発明の要約 本発明は式■の化合物、その塩及び保護されたその誘導体を提供するものである 。

■ ＮＨ２−ｋｌａ−Ｑｙｓ−Ａ−ａａα−Ｂ−０−Ｌｙｅ−１）−ａａβ−ＣＯＮ Ｈ２ここでＡＪＬｅＬ　、　ＯＩＢ及びＬｙａはそれぞれアラニン残基、システ ィン残基及びリジン残基を示し、Ａはアスパライン残基又は式■の構造を表し、 ［Ｃ！０Ｒ （ＣＨｚ）Ｈ −ＩＪＨ−１：！Ｈ−Ｃ！Ｏ− ここでｎは１から６までの整数であり、Ｒは水酸基又はＮＲ１Ｒ２基であり、こ こでＰｌとＲ２は同一であるか又は異なり、水素原子又は直鎖状もしくは分岐上 の炭素数１〜乙のアルキル基、シクロアルキル基、たとえば炭素数３〜８のシク ロアルキル基、アリール基、たとえば炭素数６〜１２の了り−ル基、又はシクロ アルキルアルキル基、たとえばシクロ７’−ビルメチル基であり、 α ａａ　はＣ０ＲＰの４番目から２１番目１でと実質的に同じアミノ酸配列馨表し 、 Ｂはバリン残基又は式■の構造を表し、ＩＩＩ　　　　　　　Ｒ３ −ＮＨ（：Ｈ−ＣＯ− ここでＲ３はインノロビル以外のヒトａカビル基又は（ＣＨ２）ｍ−８ＣＨ３基 乞表し、ここでｍは１から６１での整数であり、 Ｃはバリ／残基又はグリシン残基乞表し、Ｄはアスパライン残基又はグルタミン 残基又は式■の構造馨表し、 Ｖ　　　　Ｒ，−ＣＦ（−ＯＨ （ＣＨ２）ｐ −ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ− ここでｐはＯ又は１から６１での整数であり、Ｒ４は水素原子、直鎖状もしくは 分岐上の〆炭素数１〜乙のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基のよう なシクロアルキル基、炭素数６〜１２の７リール基のようなアリール基、たとえ ばフェニル、アラルキル基、たとえばアルキレンの炭素数が１〜３のアラルキル 基、又はシクロアルキルアルキル基であり、ａａβ−〇〇ＮＨ２＋ｆ。

ＣＧＲＰの２６番目から６７番目までと実質的に同じ配列を表す、ただし、Ａが アスパラギン酸残基であるときは、Ｂはバリン残基ではなく、かつＤはアスパラ ギン残基ではない、また、Ｂがバリン残基であるときは、Ａはアスパラギン酸残 基ではなく、かつＤはアスパライン残基ではない、また、Ｄがアスパラギン残基 であるときは、Ａはアスパラギン酸残基ではなく、かつＢはバリン残基ではない 。

もちろん、Ａ、Ｃ，ｌびＤの文字はアラニン残基、システィン残基及びアスパラ ギン酸残基を表わしていなくてもよい。

弐Ｉの化合物は、ヒトα−０ＧＲＰのアミノ酸配列について３番目、２２番目及 び２５番目のうちの少なくとも二つが修飾されたＣ０ＲＰアナログである。本発 明者らは、このように修飾されたアナログが、ラットを用いた実験でｉｎ７旺り における望ましい心臓血管活性？示すことを見出した。これらの実験結果によれ ば、該アナログが心臓血管療法、たとえば、本発明者らによる係属中の公開国際 特許比願第ＷＯ３９１０３６Ｂ６号に記載されているように、脳血液供給減少の 処置に使用し得ろことがわかる。

弐Ｉの化合物においてＲ３がヒドロカルビル基であるときは、脂肪族基、環脂肪 族基、芳香族ヒドロカルビル基であってもよい。たとえば、Ｒ３は直鎖状もしく は分岐鎖状の炭素数１〜乙のアルキル基のようなアルキル基、炭素数３〜８のシ クロアルキル基のようなシクロアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基のよう なアリール基、たとえばフェニル、アラキル基、たとえば、ベンシル基、フェネ チル基もしくはインドールメチル基のようなアルキレンの炭素数が１〜３のアラ ルキル基、又はシクロアルキルアルキル基、たとえばシクロプロピルメチル基で あってもよい。

Ｒ，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４は、必要に応じてたとえば、炭素数１〜１６のア ルキル基のような直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよい 。

しかしながら、特定の態様においては、式■の化合物の残基ＡＳＢ及びＤは天然 のアミノ酸残基である。

たとえばＡはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基又はグ ルタミン残基であってもよく、好１しくはアスパライン酸残基又はアスパライン 残基である。Ｂはグリシン残基、アナリン残基、バリ／残基、７Ｏｒ：バリ／残 基、ａイン／残基、インロイシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、 トリプトファン残基、システィン残基又はメチオニン残基であってもよい。好ま しくは、Ｂはバリン残基又はメチオニン残基である。Ｄはアスパライン残基、グ ルタミン残基、セリ／残基又はスレオニン残基であってもよく、好ましくはアス パラギン残基又はセリン残基である。筐た、Ｃは好ましくは、バリン残基である 。

本明細書において用いられている「実質的に同じ配列Ｊとは、関連領域の範囲内 で、天然に存在するＣ０ＲＰと実質的に一致する配列ｔいう。このような天然に 存在する０ＧＲＰとしては、特に、ラット、ヒト又はニワトリのα、β又はγＣ ！ＧＲＰが包含される。該配列は、好ましくは、あるＣ０ＲＰと９０％より高い 相同性？示し、より好ましくは、天然に存在するＣ！ＧＲＰと９５係より高い相 同性乞臀する。最も好ましくは、該配列はヒトαＣ０ＲＰのような天然に存在す るＣ！ＧＲＰの配列と同一である。

式（Ｉ）の化合物が、２個以上のシスティン残基を、たとえば２番目と７番目の 位置に有している場合には、これらは典型的にジスルフィド架橋を形成している ことが理解されよう。

塩としては、無機酸塩のような酸性２７０塩、たとえば壇酸、硫酸又はリン酸の ような鉱散により形成された塩が包含され、１１こ、アルカリ金属塩、たとえば ナトリウム塩、カリウム塩マグネシウム塩又はカルシウム塩のような、塩基によ り形成された塩や、アンモニア又は適当な有機アミンにより形成されたアンモニ ウム塩も包含される。

塩としては、薬剤学的に許容される塩であることが好ましい。

合成されており、望ましい心臓血管特性乞有することが見出されている式Ｉの化 合物の特定の態様としては、以下ｃｎ０００８、ｃＢｏｏｌ　１及びＨ７０３０ と呼ぶこととする化合物がある。これらの化合物のアミノ酸配列は、以下個々の 例において示すこととする。

本発明による化合物は公知の方法によって調製される。これらは化学台底によっ て、あるいは適当な場合には、組替えＤＮＡ技術によって調製してもよい。

本発明によるペプチドは、標準的な固相及び／又は液相ペノチド合放技術を用い て調製するのが最も便利である（たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｒ，Ｂ、　 Ｆｅｄ、ｐｒＯｃ、　Ｆｅｄ。

Ａｍｅｒ、　ｓｏｃ、　ＥＸｐ、Ｂｉｏｌ、　ｆ互、４１２（１９６２）参照） 。

このよ５な固相合成においては、固相支持体は放炎じているオリ♂マー鎖に対し て、Ｃ末端の保護基として作用する。

たとえば一般的に固相合成については、Ｎ末端が保護されたアミノ酸又はペプチ ドが、適当に機能化された不溶のポリマーと反応して、Ｃ末端残基が不溶の支持 体に付着するのである。このときＮ末端の保護基はアミノアシルポリマーから選 択的に除去され、Ｎが保護された次のアミノ酸又はペプチド又はアミノ酸アナロ グのような誘導体が、適当な試薬を用いることにより該ポリマーに連結するので ある。この試薬は、導入しようとするアミノ酸やペプチドのカルボキシル基を活 性化するためのものである。このとき、この脱保護化と連結のサイクルは、適当 なアミノ酸、ペプチド又は誘導体を用いて必要に応じて繰り返し、ポリマー担体 上に、式（Ｉ）の望ましいペプチド配列を構築することができる。いったん配列 が完改すれば、より活性の強い試薬をペプチド−ポリマー系に適用して、ベゾチ ドＹ／リマーにつないでいる結合を分割し、これによりペプチドを遊離するので ある。このペプチドは従来技術により回収することができる。

得られたペプチドのＣ末端が酸であるかアミノ基であるか、又はＮ末端保護基を 有するか否かは、使用した固相合成に用いられた条件及び／又は樹脂支持体によ る。アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基のような他の反応性の基が あるとして、それらが合成の間、適当に保護されており、ペプチドがポリマーか ら分割された後も依然として保護された状態にあるということも考えられるであ ろう。それゆえ、以下に述べるように、式（Ｉ）の望ましい化合物を得るために 、特にたとえば、ジスルフィド架橋を導入するために、４ｆチドをさらに処理す ることが必要となる場合が多い。保護基の導入と除去は当該技術分野においては よく知られている（たとえば”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”第３巻、Ｇｒｏｓｓ 及びＭｅｉｅｎｈｏｆｆｅｒ　１％ＳＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｆｒａａｓ　ｌ　９８ １参照］。

固相合成に使用するアミノ酸もしくはペプチド出発物質又はその反応性誘導体は 、公知の化合物であるか、又は公知の化合物を調製するために用いられる方法に 類似した方法によって調製してもよい。

アミノ酸又はペプチドのカルざキシル基の活性化に用いられる特別の試薬として は、たとえば、ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなイミド類、ペンタフロ ロフェニルエステル類又はアミノ酸無水物自身カ包含される。

樹脂は、たとえば不溶性の重合支持体であり、架橋ポリジメチルアクリルアミド 樹脂のようなポリアミド樹脂、ジビニルベンゼンもしくはメチルベンズヒドリル アミン樹脂で架橋されたポリスチレンのような不活性入網状樹脂などがある。

本発明者らは特に、本発明の化合物を調製するのに有用な二種類の方法があるこ と”ｒｉ出した。その一つは、合成サイクルで用いた保護基が三級デトキシカル ポニル基であるＢＯＣ法である。ＢＯＣ保護基はトリフロロ酢酸とゾクｏｏメタ ンを用いて各段階で選択的に除去される。合成サイクルの完了後、側鎖保護基は フッ化水素とアニソールによる処理によってペプチドから除去してもよい。もう 一つの方法はＦＭＯＣ法として知られており、ピペリジンの２０％ジメチルホル ムアミド溶液を用いて選択的に除去されろ７ｏレニルメトキシカルボニル基を利 用する。側鎖保護基はトリフロロ酢酸とアニソールによる処理によってペプチド から除去される。ペプチドはメタノールとアンモニアによる処理により樹脂から 除去される。

式（Ｉ）の化合物が分子内もしくは分子間ジスルフィド架橋を有している場合、 合成の最終段階は架橋の形成であろう。たとえば、式（Ｉ）の化合物の主たる配 列を有し、少なくとも二個のシスティン残基を含んでいる化合物は、酸化するこ とによってジスルフィド架橋ヲ導入し、最終生産物を得ることができる。

酸化は、二つのシスティン残基ｔジスルフィドにま″Ｃ−酸化することのできる 酸化剤を用いて行ってもよい。

空気酸化や酸素処理水溶液中での酸化を用いることもできる。適当な酸化剤とし てはトリフロ１１２酢酸タリウムが包含される。この反応の出発物質は、標準的 な技術を用いると存在するかもしれないメルカプト保護基を除去した後に、上述 した固相合成によって得ることができる。

式（Ｉ）の化合物のＣ末端アミド基は、上述の固相合成で用いた分割条＃−ヲ適 当に選ぶことにより導入できる。

たとえば、化合物を支持体から分割して、たとえばメタノールとアンモニアで処 理することにより一段階でアミド化することができる。あるいは、分割条件を選 択してＣ末端カルボンｌ！！Ｙ有するペプチドが得られる場合には、酵素処理を 含む従来的手段によって所定のアミドな得てもよい。たとえば、Ｃ末端ロイシン 残基を有する１−３８残基ペプチド中間体を、カルポキシにゾチダーゼＹとアン モニアとを用いて、式■の化合物に変換することができる。あるいは、Ｃ末端グ リシン残基な有する１−３８残基ペプチド中間体乞、Ｂｒａｄｂｕｒｙ　Ａ、Ｆ 、　　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　２９８　２４０−２ａｄ（１９８２））Ｋ より記載されているようなαアミド化酵素？用いて変換することができる。１だ 、式■の化合物は１−３７残基ペプチドの活性化誘導体ｔたとえばアンモニアで 化学処理することにより調製することもできる。

弐Ｉの化合物が３番目、２２番目及び２５番目の全位置に天然に存在するアミノ 酸乞配してし・石場合には、該化合物は組替えＤＮＡ技術によって調製してもよ し・。

式（Ｉ）の化合物のためのＤＮＡ配列コードは、当該技術分野においてよく知ら ｆ′Ｌだ方法、たとえばホスホトリエステルと亜燐酸塩の方法を用いて、化学的 に合成してもよい（たとえば、”Ｐｏ１ｙｚｅｒ−８ｕｐｐｏｒｔｅｄ　Ｒｅａ ｃｔｉｏｎｓｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″Ｐ、　）（ｏｄｇｅ ｓ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｃ。

Ｓｈｅｅｒｉｎｇｔｏｎ編Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ　（１ ９８０）４ろ５−４５６中のＬ　Ｊ、　Ｇａ１ｔ著″Ｐｏｌｙｍｅｒ−８ｕｐｐ ｏｒｔｅａ！３ｙｎｔｈ、ｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅ ”参照）。

また、天然に存在するＣ０ＲＰのためのＤＮＡ配列コードは、以下に示す手順に より、Ｃ０ＲＰ産生組織中で得ロコトモできる。ＣＤＮＡクローンバンクは哺乳 動物組織から製造されたｍＲＮＡから作ることができる。このときＣＧＲＰ　Ｙ エンコードしている遺伝子は、Ｃ０ＲＰのＮ末端一致配列に基づいた標識ＤＮＡ プローブでＣ！ＤＮＡバンクを探査することにより同定することができろ。適当 なハイブリダイゼーション条件を用いれば、標識プローブはＣ０ＲＰのためのＤ ＮＡ配列コードとハイブリッドタ形放するであろう。ＤＮＡ配列は標準的手順２ 用いてシーケンス化してもよい。

式Ｉの化合物をエンコードしているＤＮＡ配列は、このようなりローン化された ＤＮＡ配列から、適当な制限酵素消化及びＤＮＡフラグメントの接着によって構 築することができる。このとき、式Ｉの化合物乞コードするＤＮＡ配列は、適当 な表現ベクター中に挿入され、たとえばＭａｎｌａｔｉｓ　ｅｔ　ａｘ　（１９ ８２）Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒＣ１ｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ”　ｃｏｌａ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙに記 載されているような、当該技術分野でよく知られている技術を用いて表現されて いてもよい。

クローニングと表現のために用いられるホスト細胞は、たとえば植物や昆虫の細 胞のような真核細胞、Ｓ、　ｃｅｒｅｖ１θｌａｅのような酵母細胞又は、たと えばＣＨＯ細胞やを髄起源の細胞のような哺乳動物細胞、たとえばミエローマや ハイプリドーマ細胞のいずれでもよい。

ホスト細胞は、たとえばｚｃｏｌｉのようなグラム陰性菌、Ｂ、　５ｕｂｔｉ’ ｌｉｓのようなりａｃｌｌｌｕｅ　ｉｉｉの一種もしくはｓ、　１ｉｖｉｃｌａ ｎｓのような５ｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｅ属の一種ノヨうなグラム陽性菌といった 原核細胞のいずれでもよい。

クローニングと表現のための適当なホストとベクターとしては、ヒトα−ＣＯＲ Ｐとともに使用する英国特許第ｏＢ２１４１４３０Ｂ号に記載されたものが包含 され、特に英国特許第ＧＢ２１３６８１４Ｂ号に記載された双起源ベクターが包 含されろ。組替えＤＮＡ技術を使用することにより、式（Ｉ）に対応するＣ末端 カルボン駿が得られる。Ｃ末端アミド基は、適当な酵素による処理もしくは上述 の化学処理のような従来技術を用いて導入することができ、式（Ｉ）の望ましい 化合物が得られる。

式（１）のベゾチドは頚動脈の血流量を選択的に増大させるのに効果があること が見出されており、それ故クモ膜下出血、脳卒中、偏頭痛のような、脳への血流 減少に関連した疾病の処置に使用できると考えられる。

それはまた、心臓疾患及び高血圧の処置にも用いられる。

かくして第二の局面として、本発明は、適当な薬剤学的に許容し得ろ希釈剤、賦 形剤又は担体と組合せた式（Ｉ）の化合物ン含む治療用組成物を提供する。

従ってまた、第三の局面として、本発明は式１の化合物の有効ｌ２ヒト又は動物 に投与すること乞含む治療的処置方法を提供する。

前述の化合物は、Ｃ０ＲＰの使用が適切である、脳血液供給減少の処置を含むい かなる状況におし・でも治療的に用いることができる。たとえば、本発明者らの 係属中の公開国際特許出願第ＷＯ３９１０３６８６号に記載されている。

脳血液供給減少の処直に有用であるためには、治療剤が脳血管床に選択的に作用 し、血液供給が所望の部位で増大するようになることが不可欠である。治療剤と してさらに望ましい性質は、血液供給が実質的に血圧を低下させることなく増大 することである。脳血管収縮を元に戻すための現在の治療戦略は、同時に血圧低 下を起こし、そのため原初的問題を悪化させてしまうため、満足のいくものでは ない。そのため、従来から、脳血流量χ回復させ、及び／又は脳血管痙４ｊを解 消するための効果的な処置が真に必要とされてきた。

本発明者らは本発明のＣ０ＲＰアナログの適当量を投与することにより、血圧に 実質的な影響を与えることなく、作用部位の選択性の要求及び脳血液供給の望ま しい増大の両者χ達成できることン見出した。また、Ｃ０ＲＰベースの化合物を 用いれば、重篤な低血圧効果が見られはしても、脳のようにきわめて重要な基管 への血流、たとえば肉類動脈血流が増大することも、本発明者らは見出している 。

さらに、第四の局面として、本発明は、式Ｉの化合物ｔ１薬剤学的に許容し得る 担体、賦形剤又は希釈剤と混合することを含む、本発明による薬剤組成物の製造 法を提供するものである。

本発明により使用される薬剤組成物は従来通りに処方することができ、必要に応 じて一つ又はそれ以上の生理学的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤Ｚ用いて もよい。

本発明により使用される化合物は、経口、口内、非経口もしくは直腸投与用に処 方することができ、また鼻腔投与もしくは吸入、吹込による投与に適した剤形に 処方することができる。

経口投与のために、薬剤組成物は、結合剤（たとえば、あらかじめゼラチン化し たコーンスターチ、ポリ−ニルピロリドン又はヒドロキシゾａピルメチルセルａ −スフ、充填剤（たとえば、２クトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カル シウム）、潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、メルク又はシリカ） 、分解剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムンのような薬剤学的に許容し得る 賦形剤を用いて、従来の手段によって調製された、たとえば錠剤又はカプセル剤 の剤形にすることができる。錠剤は当該技術分野においてよく知られた方法で被 覆してもよい。経口投与用の液剤はたとえば、溶液剤、シａツゾ剤又は懸濁剤の 剤形にしてもよく、あるいは便用前に水又を裏地の適当な媒体で構成するための 乾燥生産物として提供してもよい。このような液剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水 媒体、防腐剤のような薬剤学的に許容し得る添加剤ビ用いて、従来からの手段に よって調製してもよい。製剤はまた、適当な緩衝塩、矯臭剤、着色剤及び甘味料 を含有してもよい。

経口投与剤は、活性化合物がコントロールリリースされる。Ｊ、５に適当に処方 してもよい。

口内投与のために、組成物は従来通りに処方した錠剤又はひし形削の形にしても よい。

ＣＧＲＰアナログは、注射たとえばポーラス注射や連続点滴による非経口投与用 に処方してもよい。注射用の処方は単位投与量剤形で提供することができる。組 成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁剤、溶液剤又は乳剤のよ５な剤形？とる ことができ、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤のような処方用剤を含有して もよい。

あるいは、活性成分は粉末状にして、使用面に適当な媒体、たとえば殺菌済のパ イロジエンフリーの水を用いて構成してもよい。

Ｃ０ＲＰアナログは、また、坐剤や滞留浣腸剤のような、ココアバターや他のグ リセライド等の従来からの坐剤基剤を含有しているような直腸用組成物として処 方することができる。

前述の処方に加え、Ｃ０ＲＰはデボ剤として処方してもよい。このような長時間 作用型の処方剤は、皮下注入又は筋肉内注射によって投与することができる。

鼻腔投与又は吸入投与用としては、本発明に使用する化合物は、ジクロロシフｏ ｏメタン、トリクロロブ００メタン、シクロロチドラフロミニタン、二酸化炭素 、その他のガス等の適当な噴霧媒体を入れた圧力バックまたはｒｇｔ霧器から、 エアａゾルスプレーの形で送達するのが好都合である。

薬剤組成物は、活性成分を含有する一回又はそれ以上の単位投与量剤形を含むパ ック又は調剤装置で提供することも必要に応じてできる。パック又は調剤装置は 、投与の指示とともに用いるのがよい。

脳血液供給減少の処置に使用するときは、脳血液供給が有意に増大し、好ましく は血圧が実質的に影響を受けないような用量のＣ！ＧＲＰアナログｔヒトに投与 する。ｃｅＲｐアナログの正確な用量は投与ルート、アナログの効力、患者の体 重や病状に依存する。重要なファクターは標的血管床に存在する０ＧＲＰアナロ グの濃度であると考えられる。所定の効果をひき出すために投与するＣ０ＲＰア ナログの用量は、−人一人の患者について、低用量χ１０−２０分間投与し、つ いでその用量を１０−２０分毎に、所定の効果が見られるまで増加することによ って決定することができる。ＱＧＲＰアナログは平均７０ｋｇのヒトに■点滴に よって、０．０１〜３２　ｎｇ　／ゆ／ｍｉｎの範囲、好ましくは０．０６〜２ ４　ｎｇ　／ゆ／　ｍａｎの範囲、より好ましくは４〜２４ｎｇ／ゆ／ｍｉｎの 範囲、最も好１しくは４〜１６ｎｇ／Ｊ　／　ｍｉｎの範囲の用量で投与する。

たとえば、該アナログは平均７０ゆのヒトに■点滴により、−４ｎｇ／に９／ｂ わたって投与する。より長い時間をかけて、たとえば１時間以下もしくはそれ以 上、又は２４時間以上かけてアナログを患者に注入するのが望ましい場合もある 。

本発明を以下の非限定的な例において、添付の作図、第１〜６図により、さらに 説明する。第２．３．５図は比較例に関する。

図面の簡単な説明 第１囚は、ラットに０ＧＲＰアナログ（Ｂ　００１１７６０分間注入したときの 心臓血管応答のグラフを示す。

第２図は、ラットにＣ０ＲＰアナログＯＢ　００１０を６０分間注入したときの 心臓血管応答のグラフを示す。

第３図は、ラットにＣＧＲＰアナａグ（！Ｂ　０００９　Ｙ６０分間注入したと きの心臓血管応答のグラフを示す。

第４図は、ラットに０ＧＲＰアナログＣＢ　０００８を６０分間注入したときの 心臓血管応答のグラフを示す。

第５図は、ラットにＣ０ＦＬＰアナログＣＢ　０００７７６０分間注入したとき の心臓血管応答のグラフを示す。

第６間は、ラットにＣ（）ＲＰアナログＨ７００３０１に６０分間注入したとき の心臓血管応答のグラフを示す。

第１〜６図において、以下の記号は下に示すような用量レベルχ示す。

＾＝　０．００６　ｎｍｏｌ／ｈｒ ○＝　Ｑ、Ｑ　６ｎｍｏｌ／ｈｒ ・＝＝　Ｑ、（５ｎｍｏｌ／ｈｒ 具体的態様の記載 旦ユ Ｃ０ＲＰアナログＣＢ　Ｏ００７、ＣＢ　０００８、ＣＢ　００　Ｄ　９、ＣＢ 　００１０、ＣＢＯＯｌｌ及びＨ７Ｃ１Ｏは以下の配列を有する ＡＣＤＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲ３ＧＧＭＶＫＮＮＦＶＰＴ　ＮＶＧＳＫ ＡＦ−Ｃ！ＢＯＯＯ７ＡＣＤＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲ８ＧＧＭＶＫＳＮ ＦＶＰＴ　ＮＶＧＳＫＡＦ−ＣＢＯＯＯ８ＳＩ：！ＤＴＡＴＣＶＴＩ（ＲＬＡＧ ＬＬＳＲ８Ｇ　ＧＶＶＫＮＮＦＶＰＴ　ＮＶＧＳＫＡＦ−ＣＢＯＯＯ９ＡＣＤＴ ＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲ８Ｇ　ＧＶＶＫＮＮＦＶＰＴ　ＮＶＧＳＫＡＦ− （ＩＢＯＯＩＯＡＣＮＴＡＴＣ：ＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲ８Ｇ　ＧＭＶＫＮＮＦ ＶＰＴ　ＮＶＧＳＫＡＦ−ＣＢＯＯＩＩＡＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲ ８Ｇ　ＧＶＶＫＳＮＦＶＰＴ　ＮＶＧＳＫＡＦ−Ｈ７００３０これらのＣ０ＲＰ アナログはメチルベンゾヒドリルアミン樹脂を用いて合成した。ペプチドは、５ ＴＤＦＩ合底ファイルを用い１こＡＢ４３０Ａ’プチド合底機でＦＭＯＣ法によ り、アルギニンとヒスチジンの位置でダブルカップリングケして合成し１こ。Ｆ ＭＯＣ基は合成の終点で、樹脂サンプリング足せずに除去した。Ｃ１０−ａｃＩ Ｉｌ基を保護用に用シゴニ。エーテルとエステルはｔ−ブチルエステルとして保 護した。アルギニンはＭＴＲエステルとして保護した。

これらのアナログのうちの一つ（ｈ７０３０）は、次のよりなりＯＣ固相合合法 法よっても合成した。

合成は３６ｍの４メチルベンズヒドリルアミン樹脂乞用い固相技術により行った （　Ｑ、７　ｎｍｏｌ　／　ｇｍ　）。

６ｍ、ｅｑかも１０ｍ、ｅｑの］３０Ｃアミノ酸χカツプリングに用いた。樹脂 洗浄用溶媒の量は樹脂に対し約１５−〜２０−／ｇｍであった（　ＴＦＡ　／　 ＣＨ２’２２１５　ｔｄ　〜２０ｍｌ　／　ｇｍ　）。０７θカツプリングを洗 浄後、Ｂｏｃ基の除去に用いたＴＦＡ　／　ＣＨ２ｃｆ２乞ＤＴＥ　（２％）と ともに混合した。

分割については、１０Ｉのペプチド＋樹脂をＨＦ（１００−ｄ）十アニソール（ １０ｄ）２用いて０℃で１時間処理した。ＨＦの除去後、ペプチド樹脂をエーテ ルで洗い、酢酸で抽出した。酢酸抽出物乞水で希釈し、Ｅｌ１ｍａｎテストが陰 性になるまで室温で攪拌した。

内容物を次にＨＰＬＯで精製した。

ジスルフィド架橋の′入 上記ペプチド１００■を、ｐＨ８で１　ｍＭ重重炭酸アンモニウム金含有る、あ らかじめ酸素処理したＨ２Ｏ１／に７１１］えた。

混合物を室温で３時間放置し１こ。氷酢酸４０ｄＹｐＨ２になるまで添卯し、混 合物を凍結乾燥した。

得られた固体をｈｐｌｃで分析した。

１又 腎臓、腸間膜及び臀部に、又は左右の頚動脈に共通に、流量ノロープを付げ７Ｃ Ｃｏｎ５ｃｉｏｕｓ　Ｗｉｓｔａｒラット（全群ｉＣオ’−’てｎ＝８）にＣ０ ＲＰアナログＣＢ　０００７とＣＢ　０００８　、又はＣＢ　Ｏ００９とＣＢ　 Ｑ　Ｑ　１１　、又はＣＢ　００１０と［７０３０（構造は例１で示した〕を与 えた。動物には最初の実験日に各対のアナログのうちの一つを無作為に、１時間 に０．００６．０．０６及び［）、６　ｎｍｏｌ　／　ｈｒの用量で、注入後に 各１時間の間隔を置いて投与しムニ（他方のアナログは第二の実験日に投与した ）。結果を第１〜６図に示す。

ＣＧＲＰアナａグは例１に記載したＦＭＯＩ：ｉ法の後、通常のペプチド含量に より合成した〔たとえばＭθｒｒｉｆｉｅｌｄＲ，Ｂ、　、　Ｆｅｄ、　Ｐｒ０ Ｃ，ｐａｄ、　ｈｍｅｒ、　ｓｏｃ、　ＥＸｐ、　Ｂｉｏｌ、　２４　４１２（ １９６２）参照〕。

実験操作は２日にわたり、動物には第１日に以下に示す対のアナログのうちの一 つを無作為に与えた。

ＯＢ　０００７又はＣＢ　０００８　；　ＣＢ　Ｏ［１Ｄ　９又はＣＢＯＯｌ　 １　；　ｃＢｏｏｌ　０又はＨ７０３０第二の実験日に、対の残りのアナログを 与えた。全アナログとも等張の食塩水（１％ウシ血清アルブミン含有）に溶解し た。溶かした凍結乾燥物の景は、一定のペプチド含量に従って、適切に希釈した 溶液ン０．３　ｍｌ　／　ｈｒの割合で注入したときに、０．００６．０．０６ 又は０．６ｎｍｏｌ　／　ｈｒと計算される用量が送達されるように調整し１こ 。６０分のベースライン時間の後、注入７６０分間行い、次いで６０分の後注入 時間を置いた。全アナログとも高用量の繰り越し効果を避けるべく徐々に用量ケ 増７１０するように投与した。

測定は注入を０〜６０分で続けながら、−１０，０，５，１０，２０，３０，４ ０，５０，６０，７０，８０，９０、ｉｏＯ，ｉｌｏ及び１２０分の時点で行つ た。

（）、６ｎｍｃ＋ｌ　／　ｈｒの用量で、すべてのアナログとも頻脈、低血圧、 臀部及び頚動脈の充血をひき起こした。

しかし、心拍数と平均血圧の変化がすべてのアナログで類似している一方、［７ ０３０が数値的には最大の頚動脈充血を起こしく積分応答、即ち曲線下面積応答 から判断しり）、腎潅流を損うこともなかつに０もっとも腸間膜血流には著しい 減少が見られた。ヒトα−及びβ−０ＧＲＰによって得られた先のデータと比較 すルト、７すＣＩグＨ７０３０はＱ、（５ｎｍｏｌ　／　ｈｒで、これらのペプ チドの双方よりも、全体として大きな頚動脈充血？ひき起こすことがわかった。

０．０６　ｎｍｏｌ　／　ｈｒの用量では、アナログＣＢ　０００７とＣＡＢ［ ］００８（これらを工同じ動物に投与した）は有意に異なる頚動脈充血効果？及 ぼし、その能力は後者のアナログの方が大きかっＬ０化合物Ｈ７０３０もまたＣ ＡＢ　０００７よりも大きな頚動脈光面効果を有しており、ＣＢ　０００８とＨ ７ＣＩＯの双方とも、臀血流に影響を与えろことなく、増大した頚動脈充血効果 を及ぼした。しかし、臀血流はＣＢ　０００７の存在下では減少した。筐だ、ア ナログＣＢ　０００８は、アナログＣＢ　０００９及びＣＢ　ＣＪ　０１０より も大きな頚動脈血流の増大乞ひき起こした。

Ｑ、Ｑ　Ｑ　（５ｎｍｏｌ　／　ｈｒの用量では、心拍数の増７ＪＯＹも１こら し１このは、アナログＨ７［）３０だげであった。しかし、この現象は該用量で は、頚動脈充血、又は平均血圧もしくは体系的な血液力学の変化を示すことなく 起こった。これは、化合物が心筋作用を増大させうろこと？示している。

ラットに゛おいて頚動脈への選択的な効果を示すＣ！ＧＲＰアナａグの活性プロ フィールは、人間における脳血液供給減少の処置への使用を支持している。

Ｃ！ＧＲＰアナログの　果の比較 ｃｏＲｐアナログの血管拡張効果における差を評価するために、０．０６及び０ ．６　ｎ！ｏｏｌ　／　ｈｒの注入に対する臀部及び頚動脈充血応答を、第１〜 ６図の応答曲線上面積の測定によって定量化した。第１表は、両者の注入に関し て、臀部にある範囲の応答が見られたが、６種の全群を同様に比較しても、それ らの間に有意の差がな力１つだことを示している。しかし第２表は、頚動脈充血 応答の間に有意の差が、特にＱ、Ｑ　（５ｎｍｏｌ　／　ｈｒ用量で見られたこ とを示している。アナログＣＢＯＯＯ７とＣＢ　Ｏ００８に対する応答の差は、 これらのデータが同じ動物から得られたのであるから、注目に値するものである 。ＣＢＱＱＩＱよりもＨ７０３０に対する方がより強い応答７示す傾向にあるこ とは、同じ理由により留意されるべきである。

第１表 任意の単位で表現した０ＧＲＰアナログに対する積分臀部充血応答（曲線下面積 から評価しｒｓ　）。値は平均儂（ＳＥＭ　） ０．０６　ｎｍｏｌ　／　ｈｒ　　　　　　０．６　ｎｍｏｌ　／　ｈｒＯＢＯ ＯＱ７　６２　　（１９）　　Ｃ！ＢＯＯＯ７１６３（２７）ＣＢＯＯＯ９８４ （２３）　　ＣＢＯＯＩＯ１８４（２７）ｃＢｏｏｌｌ　　　８８　　（１８） 　　ｃＢ０００９　１８５　　（３１）ｃＢｏｏｌｏ　　９６　　（２０）　　 Ｈ７０３０２５５（４９）ｃＢ０００８　１１８　　（２７）　　０ＢＯＯＯ８ ２５９（６０）Ｈ７０３０１２６（３４）　　ｃｌｏｌｌ　　２９９　（（５３ ）データは各用量での応答順に並べであるが、応答間に有意の差はなかつ７Ｃ（ Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａ：Ｌｌｉｓテスト〕。

第２表 任意の単位で表現し７ＣＣ０ＲＰアナログに対する積分臀部充血応答（曲線下面 積から評価した）。値は平均値（ＳＥＭ　） ・Ｑ、Ｑ　６ｍｍｏｌ　／　ｈｒ　　　　　　Ｑ、６ｍｍｏｌ　／　ｈｒｃＢＯ ＱＯ７１１８（２３ン０・ｂ　　０ＢＤＤＯ９７１７（９１）’ｃｎ０００９　 １６２（２９）ｃ　　ＣＢＯＯｌｏ　８４１（１０３）（！ＢＯＯ１０１７５（ ４８）　　　（！ＢＯＯＯ７９２２（９６）ｃＢｏｏｌｌ　　２７５（５７）　 　　（：！ＢＯＯＯ８１００５（１１７）ａ７０３０　３３４（５！ｌ）　　　 ＣＢＯＯｌｌ　　１１０４（１５３）ｃＢ０００８　４２０（６０）　　　Ｈ７ ０３ＣＪ　　１３００（１１３）ａ、Ｐ　　Ｏ，０５０ＢＯＯＯ７ｖｓ、　　ｃ Ｂ０００８；ｂ、Ｐ　　Ｏ，０５Ｃ！ＢＯＯＯ７１ｍ、　　Ｈ７０３０；ｃ、Ｐ 　　Ｏ，０５ｃＢ０００９　　ｖｓ、　　ｃＢ０００８；ｄ、Ｐ　　Ｏ，ｏｓ　 ａｎｏｎ　１０　　ｖｓ、　　ＣＢＯＯＯ８ｐθ、Ｐ　　Ｏ，０５Ｃ！ＢＯＯＯ ９ｖｓ、　　Ｈ７０３０゜（Ｋｒｕａｋａｌ−Ｗａｌｌｉａテストン。

データは各用量での応答順に並べである。

しかしながら、総じて、第１表及び第２表に示した結果は、アナログＣ！Ｂ　０ ００８、Ｃ！ＢＯＯ１１及びＨ７０３０、特に後者のアナログが、脳血液供給減 少の処置に使用できることｔ支持する特に望ましい性質を有していることを示し ている。これら後者のアナログ類のすべては、ヒトα−ＣＯＲＰのアミノ酸配列 に関して、３．２２及び２５番目のうちの少なくとも２ケ所で修飾されているこ とは特筆すべきことである。

比較において、アナログ０ＢＯＯＯ７、ｃＢｏ　００９及びＣＢＯＯｌｏはより 劣った性質１に有しているようである。これらのアナログ（１？！ＢＯＯＯ７、 ＣＢＯＯＯ９及びＣＢＯＯＩＯンはいずれも、ヒトα−ＣＯＲＰのアミノ酸配列 に関して、一つのアミノ酸だけが修飾されているにすぎないことは特筆すべきで ある。

ム：０．００６　ｎｍｏｌ　／　ｈｒ 手続補正書（自発） 平成２年　７　月２６日

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉの定義された化合物、その塩及び保護されにその誘導体 Ｉ ＮＨ２−Ａｌａ−ｃｙｓ−Ａ−ａａα−Ｂ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ｄ−ａａβ−ＣＯＮＨ ２ここでＡｌａ、ｃｙｓ及びＬｙｓはそれぞれ、アラニン残基、システィン残基 及びリジン残基を示し、Ａはアスパラギン酸残基又は式ＩＩの構造を表し、ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｎは１から６までの整数であり、Ｒは水酸基又はＮＲ１Ｒ２基であり、こ こでＲ１とＲ２は同−であるか又は異なり、水素原子又は直鎖状もしくは分岐状 の炭素数１〜６のアルキル基、シクロアルキル基、たとえは炭素数５〜８のシク ロアルキル基、アリール基、アたとえば炭素数６〜１２のアリール基、又はシク ロアルキルアルキル基、たとえばシクロプロピルメチル基であり、 ａａαはＣＧＲＰの４番目から２１番１でと実質的に同じアミノ酸配列を表し、 Ｂはバリン残基又は式ＩＩＩの構造を表し、ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ３はイソプロピル以外のヒドロカピル基又は（ＣＨ２）ｍ−ＳＣＨ３基 を表し、ここでｍは１から６までの整数であり、 Ｃはバリン残基又はグリシン残基を表し、Ｄはアスパラギン残基又はグルタミン 残基又は式ＩＶの構造を表し、 ＩＶ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｐは０又は１から６までの整数であり、Ｒ４は水素原子、直鎖状もしくは 分岐状の炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基のような シクロアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基のようなアリール基、たとえば フェニル、アラルキル基、たとえばアルキレンの炭素数が１〜３のアラルキル基 、又はシクロアルキルアルキル基であり、ａａβ−ＣＯＮＨ２はＣＧＲＰの２６ 番目から３７番目までと実質的に同じ配列を表す、 ただし、Ａがアスパラギン酸残基であるときは、Ｂはバリン残基ではなく、かつ Ｄはアスパラギン残基ではない、またＢがバリン残基であるときは、Ａはアスパ ラギン酸残基ではなく、かつＤはアスパラギン残基ではない、またＤがアスパラ ギン残基であるときは、Ａはアスパラギン酸残基ではなく、かつＢはバリン残基 ではない。
2. ２．Ａ、Ｂ及びＤが天然アミノ酸残基である請求の範囲１記載の化合物。
3. ３．Ａがアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基又はグルタ ミン残基である請求の範囲１又は２記載の化合物。
4. ４．Ｂがグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、ロイシン残 基、イソロイシン残基、フエニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン 残基、システイン残基又はメチオニン残基である先行する請求の範囲のいずれか に記載の化合物。
5. ５．Ｄがアスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基又はスレオニン残基で ある先行する請求の範囲のいずれかに記載の化合物。
6. ６．ｃがバリンである先行する請求の範囲のいずれかに記載の化合物。
7. ７．アミノ酸配列が 【配列があります】である 請求の範囲１記載のポリペプチド。
8. ８．アミノ酸配列が 【配列があります】である 請求の範囲１記載のポリペプチド。
9. ９．アミノ酸配列が 【配列があります】である 請求の範囲１記載のポリペプチド。
10. １０．固相又は液相ペプチド合成技術による化学合成を含む請求の範囲１記載の 化合物の製造方法。
11. １１．請求の範囲２記載の化合物の製造方法であって、該化合物をコードするＤ ＮＡ配列を表現することを含む方法。
12. １２．請求の範囲１記載の化合物を適当な薬剤学的に許容し得る希釈剤、賦形剤 又は担体と組み合わせて含む治療用組成物。
13. １３．請求の範囲１記載の化合物の効果的な量をヒト又は動物に投与することを 含む治療的処置方法。
14. １４．請求の範囲１記載の化合物を薬剤学的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈 剤とともに混合することを含む治療用組成物の製造方法。
15. １５．脳血液供給減少の処置における請求の範囲１記載の化合物の使用。