JPH03504017A - 哺乳動物ｇａｐ‐４３組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物ＧＡＰ−４３組成物および使用方法関連出願の相互関係 本出願は、１９８８年５月２日付けの出願であって、放棄した米国特許出願１８ ９２２３号の一部継続出願である１９８８年１２月２２日付けの出願であって、 放棄した米国特許出願２８８６０４号の一部継続出願である１９８９年２月２日 付けの出願であって、放棄した米国特許出願３０５２３９号の一部継続出願であ る１９８９年９月１日付けの出願の同時継続米国特許出願４０１４０８号の一部 継続出願である。

本発明は分子遺伝学および神経学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、 哺乳動物ＧＡＰ−４３、二ニーロン成長関連蛋白のｃＤＮＡ配列および対応する アミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、ＧＡＰ−４３の発現を調節し、それ により軸索成長を調節する方法、および原核生物または真核生物宿主細胞または 生物においてＧＡＰ−４３を産生ずる方法に関する。さらに詳しく述へれば、本 発明は、ＧＡＰ−４３の膜結合および成長円錐富化を調節でき、かついずれの所 望の蛋白またはポリペプチドをもニューロンまたは非二ニーロン細胞の膜に対し て定方向化できるＧＡＰ−４３由来の新規な膜−ターゲツティング（ｍｅｍｂｒ ａｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ペプチドに関する。また、本発明は、とりわけ、 ヒトを含めた動物における神経学的徴候において、ＧＡＰ−４３およびその調節 および膜ターゲツティング要素の臨床的なｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒ ｏでの診断および治療適用に関する。

背景技術の記載 ＧＡＰ−４３は成長する軸索を特異的に特徴付ける蛋白の１つである（スケ不（ Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）　３ユニ　６９７　（１９８４）；メイツ（Ｍ ｅｉｒｉ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）Ｕ　Ｓ　Ａ　８３　：　３５ ３７　（１９８６）　）。軸索により輸送される蛋白は全細胞蛋白のうち小さい サブセットであり、これらのうち少数が、そのレベルが軸索成長を直接に媒介す ると考えることができるように変化する「スケ不およびウィリアード（Ｓｋｅｎ ｅ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ジャーナル・第１５３　（１９８３）；スケ 不（Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）３ヱ：６９７（１９８４）；メイツ（ｌｌ ｅｉｒｉ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）ＵＳＡ８３　：　３５３７　 （１９８６）　）。これらの分子のいずれかが構造変化を媒介する直接の証拠は 欠くが、ＧＡＰ−４３は候補として特に魅力的である。というのは、それは、第 一に成長円錐構成要素であり、そこでは成長円錐膜の内表面に結合し、蛋白キナ ーゼＣについての基質として働くからである（アロヨ（Ａｌｏｙｏ）、ジャーナ ル・サブ・二ニーロケミスドリー（Ｊ、　１ｌｅｕｒｏｃｈｅｓ、）±上＋６４ ９（１９８３）：Ｚイカーズおよびロウテンプルグ（Ａｋｅｒｓ　ａｎｄ　Ｒｏ ｕｔｔｅｎ−ｂｅｒｇ）、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）３３４ 　：　１４７　（１９８５））。さらに、その遺伝子発現のレベルは、細胞培養 および１ｎｖｉｖｏ双方において、軸索成長に大いに関係する（バシ（Ｂａｓｉ ）、セ９８７）；ドウ・う・モーントら（ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ ）、未発表）。

成熟したヒト中枢神経系（ＣＮＳ）における修復の欠如は手ごわい臨床的問題で ある。急性虚血または外傷の後、再生の組織病理学的証拠は最小であり、神経学 的回復は通常存在しないかまたは不完全である。他方、末梢神経系のニューロン は、金魚またはヒ牛ガエルのごとき他の種のＣＮＳニューロンがそうであるごと く、再生することが予測できる（スケ不およびライラード（Ｓｋｅｎｅ　ａｎｄ 　Ｗｉｌｌｉ−ａｒｄ）　、ジャーナル・サブ・セリニラ−・バイオロジー（Ｊ 、　　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）８９　：　８６　（１９８１）　　；ベノウイツおよびりニーイス （Ｂｅｎｏｗｉｔｚ　ａｎｄ　Ｌｅｗｉｓ）、ジャーナル・サブ・ニューロサイ エンス（Ｊ。

ニューロンの不応性についての１の説明は、成長に重要な分子の不可逆的抑制で あろう。特に、ＧＡＰ−４３は再生に対して臨界的であると示唆されている（ス ケ不（Ｓｋｅｎｅ）、セル（Ｃｅｌｌ）３７　：　６９７（１９８４））。これ についての証拠は成長円錐におけるその富化（スケ不（Ｓｋｅｎｅ）、サイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３　：　７８３　（］　９８６）：メイツ（Ｍｅｉｒ ｉ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）Ｕ　Ｓ　Ａ８３　：　３５３７　（ １９８８））および周産期ＣＮＳとは対照的な成人におけるその最小発現（スケ 不およびライラード（Ｓｋｅｎｅ　ａｎｄ　Ｗｉ−１１ｉａｒｄ）、ジャーナル ・サブ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１゜４３は、ヒキガエルまた は金魚視神経または哺乳動物末梢神経のごとく、再生が可能な二ニーロンにおけ る負傷の後、高レベルまで増加するが、哺乳動物ＣＮＳニューロンに対する同様 の負傷の後ではそうはならない（スケ不およびライラード（Ｓｋｅｎｅ　ａｎｄ 　Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ジャーナル・サブ・セリ１ラー・バイオロジー（Ｊ、　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）８９：９６　　（１９８１））。

本発明者らは、ヒトＣＮＳ機能および病気におけるＧＡＰ−４３の役割を調べた 。ヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡをクローン化し、その発育および成人分布を死後組 織のアッセイによって調べた。高い周産期発現に加え、本発明者らは、ＧＡＰ− ４３発現は成人の不連続（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）領域に残存し、予期せぬことに急 性虚血負傷は、通常それが低い領域においても、ＧＡＰ−４３の高い発現に関係 することを見い出した。

発明の要約 哺乳動物ＣＮＳ機能および病気におけるＧＡＰ−４３の潜在的な重要性を認識し つつ、本発明者らは、相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）クローニングによって、哺乳動 物ＧＡＰ−４３遺伝子の配列決定に成功した。ラフ）ＧＡＰ−４３をコード付け する遺伝子の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定した。ラットＧ ＡＰ−４３についてのｃＤＮＡをプローブとして用いて、ヒト脳幹および小脳ラ イブラリーからのヒトＧＡＰ−４３についてのｃＤＮＡを同定し、クローン化し た。ヒトＧＡＰ−４３についてのアミノ酸配列も決定した。

かくして、本発明の１の具体例において、実質的に純粋な哺乳動物ＧＡＰ−４３ 蛋白、またはその機能的誘導体が提供される。また、実質的に純粋な形態のラッ トおよびヒ）ＧＡＰ−４３蛋白、ならびにこれらの蛋白の機能的誘導体が提供さ れる。本発明の特別の具体例は、各々、第２図および５Ａ図に示したものに対応 するアミノ酸配列を有する実質的に純粋なラットおよびヒトＧＡＰ−４３蛋白お よびポリペプチド、およびそれらの機能的誘導体よりなる。

本発明のもう１つの具体例は、第２図または５Ａ図に示したヌクレオチド配列ま たはそれと実質的に同様のヌクレオチド配列よりなるｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓまたは その誘導体を提供する。本発明のｃＤＮＡはプラスミドのごとき適当な発現ベク ターに組み込むことができ、該ベクターを用いて原核生物または真核生物宿主細 胞をトランスフェクトし、次いで、該宿主細胞は、適当なｉｎ　ｖｉｖｏ、　ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏまたは１ｎｓｉｔｕ条件下で該ｃＤＮＡを発現し、これらすべて は、それにより産生されたＧＡＰ−４３蛋白またはポリペプチドと一緒に本発明 のさらなる具体例を形成する。

かくして、本発明のさらにもう１つの具体例は、哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白また はポリペプチドをフード付けするｃＤＮＡよりなるベクターで原核生物または真 核生物宿主細胞をトランスフェクトし、該哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白またはポリ ペプチドの発現を可能とする条件下で該宿主細胞を適当な培地中で培養し、該哺 乳動物ＧＡＰ−４３蛋白またはポリペプチド、あるいはその機能的誘導体を該培 地から分離することを特徴とする哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白またはポリペプチド あるいはその機能的誘導体を産生ずる方法を提供する。

本発明の実質的に純粋なＧＡＰ−４３抗原を使用し、本発明者らは、対ＧＡＰ− ４３抗体を作り出すのに成功し、かかる抗体ならびにその機能的および化学的誘 導体は本発明のさらなる具体例よりなる。本発明のＧＡＰ−４３抗体は多クロー ンまたは、好ましくは単クローン抗体とでき、種々のＭ！、診断および治療用途 に適し、これらはなおさらに本発明の具体例を形成すると理解されるべきである 。

さらに、本発明のＧＡＰ−４３抗原および抗体は、すべて特定の調製、診断また は治療適用が要すると判断される、例えば検出可能な標識または治療標識に関す るごとく適当な標識化に、および医薬上許容されるまたは許容されなくてもよい 組成物にて他の活性剤と共に使用するのに適する。かかる標識化ＧＡＰ−４３抗 原、抗体ならびにその機能的および化学的誘導体、ならびにかかる組成物は本発 明の具体例よりなる。

その機能的および化学的誘導体と共に、本発明のＧＡＰ−４３抗原および、特に 抗体は当業者に公知の種々の診断方法で用いることができる。免疫細胞化学的方 法およびイムノメト１ルツク方法を包含するがそれらに限定されるものではない かかる方法はさらに本発明の具体例をなす。

従って、本発明の１の例示的具体例において、ＧＡＰ−４３抗原または抗体を含 有することが疑われる試料を各々検出可能に標識化抗体複合体の形成を可能とす るために該試料を該抗体または抗原と共にインキュベートし、かく形成された複 合体を複合体を形成しなかった抗原または抗体から分離し、標識した複合体化抗 体または抗原を検出することを特徴とする、試料において哺乳動物ＧＡＰ−４３ 抗原または抗体を測定または検出する方法が提供される。本発明の本具体例およ び他のものは、所望するに応じて、ｉｎ　ｖｉｖｏ、　１ｎｖｉｔｒｏまたはｉ ｎ　５ｉｔｕで行うことができる。

本発明の調製、診断または治療方法で用いる場合、本発明の化合物および組成物 は、都合よくは、キット中に包含させることができ、かかるキットは本発明のも う１つの具体例を形成する。かくして、非限定的例として、閉じた区画に１また はそれ以上の容器手段を収容させるために仕切を設けた担体手段よりなり、■ま たはそれ以上の該容器手段が、調製、検出または治療可能に標識化されたＧＡＰ −４３抗原または抗体、あるいはその機能的または化学的誘導体よりなる、ＧＡ Ｐ−４３抗原または抗体の調製、精製、単離、測定ま有用なキットが提供される 。

また、本発明者らは、正常な、並びに損傷または疾患ＣＮＳ組織においてＧＡＰ −４３発現を評価した。ｉｎ　ｖｉｖｏＧＡ　Ｐ　−４３発現は中枢組織の発育 間に変化し、ＧＡＰ−４３発現の領域による変動が存在することが見い出された 。さらに、ＧＡＰ−４３発現は中枢組織に対する損傷の結果、かなりの変化を受 けることも見い出された。

さらに、本発明者らは、哺乳動物ＧＡＰ−４３発現を増強でき、または所望なら ば抑制できるメカニズムを見い出した。特に、ＧＡＰ−４３発現は神経成長因子 によって増強され、これはある種のステロイド類によって抑制されることを見い 出した。ＧＡＰ−４３発現を調節する能力は、中枢または末梢神経系に対する損 傷、またはその病気もしくは機能障害に罹った哺乳動物、特にヒトを処置するに おいて大いに治療的利用ができので、これらの発見の重要性は容易に理解される であろう。さらに、本発明者らは、ＧＡＰ−４３またはその機能的誘導体をコー ド付けするｃＤＮＡを非神経細胞に導入することによって、非神経細胞であって も成長円錐一様突起を形成できるという驚くべき発見をした。再度、この発見の 潜在的治療価値は顕著なものである。

従って、もう１つの態様において、本発明は、疾患または損傷ＣＮ５ｌｆｌ織、 ならびに正常なＣＮＳ組織におけるＧＡＰ−４３活性および発現を評価または測 定する方法よりなる。さらに、本発明は、中枢または末梢神経組織の損傷、疾患 または機能障害に罹ったヒトを含めた哺乳動物を治療する方法、およびヒトを含 めた哺乳動物において正常なＣＮＳ組織における構造再編成を調節する方法より なる。

かくして、１の具体例において、本発明は、細胞をｉｌ　ＶｉＶＯ５ｉｎｖｉｔ ｒｏまたはｉｎ　５ｉｔｕで有効量の神経成長因子に暴露することを特徴とする 該細胞においてＧＡＰ−４３の発現を誘導する方法よりなる。細胞をか＜　ｉｎ 　ｖｉｔｒｏで暴露した場合、もう１つの態様において、治療効果を伴いつつ、 損傷、疾患または機能障害の中枢または末梢神経細胞の位置にかかる細胞を導入 し、または該位置と綿密に同格の位置に導入することが可能であろう。

もう１つの態様において、ＧＡＰ−４３をコード付けするｃＤＮＡを非神経細胞 または神経細胞に導入することによって、ＧＡＰ−４３発現を誘導または増強す ることができる。これは、トランスフェクション、形質導入および直接的マイク ロインジェクションを含めた種々の手段によってｉｎ　ｖｉｖｏ、　ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏまたはｉｎ　５ｉｔｕで達成することができ、これらすべては本発明を限 定するものではない意図した具体例を形成する。別法として、本発明のｃＤＮＡ は、レトロウィルスまたはウィルスベクターの手段によって導入できるか、また はいずれかの数の細胞表面レセプターリガンドに付着させ、かかるリガンドと共 に細胞中に移送することができる。これらの方法、ならびにＧＡＰ−４３ｃＤＮ Ａならびにその機能的および化学的誘導体よりなる組成物およびベクターのすべ ては本発明のさらなる具体例を形成する。

同様に、本発明のなおさらなる具体例は、構造再編成を調節する方法、シナプス 可塑性を調節する方法、および、神経成長因子、ステロイドおよびそれらの機能 的誘導体よりなる群から選択される１またはそれ以上の物質の有効量に細胞をａ 露することを特徴とするエコーロンおよび非ニューロン細胞を包含する細胞のミ クロ環境を調節する方法よりなる。

また、驚くべきことに、ＧＡＰ−４３は１０個のアミノ酸アミノ末端エクソンを 含有すること、およびこのペプチドはＧＡＰ−４３を細胞膜へ、特に二ニーロン 細胞の成長円錐領域へ定方向化する原因となることを見い出した。さらに、この １０個のアミノ酸膜−ターゲツティングペプチド、およびその機能性誘導体は、 所望の蛋白またはペプチドのアミン末端にまたはその近くに結合した場合、該蛋 白またはペプチドを細胞膜へ定方向化できることを見い出した。

この驚くべき発見は、通常細胞質ゾルであり、通常は膜連結性でない蛋白類およ びペプチド類に適用される。

かくして、本発明のさらなる具体例は、いずれの所望の蛋白またはペプチドをも 二ニーロン細胞または非二ニーロン細胞の細胞膜へ定方向化できる膜−ターゲノ テイングペブチドまたはその機能的誘導体よりなる。本発明の膜−ターゲノティ ングベブチド、またはそれに結合する所望の蛋白またはペプチドは診断または治 療のため標識化できる。該膜−ターゲノティングペブチドを用いる、ヒトを含め た動物の二ニーロンまたは非二ニーロン細胞の診療または治療のｉｎ　ｖｉｖｏ ％ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　５ｉｔｕ処置は本発明のさらなる具体例を構成 する。

図面の簡単な記載 第１図　ＧＡＰ−４３ｃＤＮＡのハイブリッド−選択翻訳。

リキアルディら（Ｒｉｃｃｊａｒｄｉ　ｅｔ　ａｌ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス （ＰＮＡＳ）７６　：　４９２７　（１９７９）の手法により、ＥｃｏＲＩイン サート、ＧＡＰ４３−２を用いてｍＲＮＡを選択した。略言すれば、該ＧＡＰ４ ３−２インサート０，５μｇ１または当量の非特異的ＤＮＡ、細菌プラスミドｐ ｓＰ６５をニトロセルロース上にスポットし、６５％ホルムアミド、４００ｍＭ 　　ＮａＣｇ、１０ｍＭ１．４−ビベラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ） を含む溶液、ｐＨ６，４中、新生児ラット脳ポリアデニル化［ポリ（Ａ）’］Ｒ ＮＡ１７．５μｇと４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた。６５℃で標準的な りエン酸添加生理食塩水（Ｓ　Ｓ　Ｃ）ＣＸ　１　）、０．５％ＳＤＳ中で洗浄 した後、該フィルターを沸騰し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、ウサギ網状赤 血球溶解物で翻訳し、蛋白を［３６Ｓ］メチオニンで１ｍ化した（ペルハムら（ Ｐｅｌｈａｍ　ｅｔ　ａｌ）、ニーロビーアン・ジャーナル・サブ・バイオケミ ストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、）旦ユニ　２４７　（１９７８） ）。翻訳産物、または対ＧＡＰ−４３抗体で免疫沈殿させた産物を１２％５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で分離した。（Ａ）（ｉ）外因性ＲＮＡ無し、にｒ ）ｐＳＰ６５−選択ＲＮ　Ａ　、　　（ｉｉｉおよびｉ％＝）ＧＡＰ４３−２− 選択ＲＮＡ、および（ｖ）ポリ（Ａ）゛新生元服ＲＮＡ　（新生児）でのｉｎ　 ｖｉｔｒｏ翻訳産物。（Ｂ）スニペスら（Ｓｎｉｐｅｓ　ｅｔ　ａｌ）、ンク・ ニューロサイ°アブストル（Ｓｏｅ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓｔｒ、　） 上２　：　５００　（１９８６）におけるごとく調製したＧＡＰ−４３蛋白で該 ＧＡＰ−４３抗体を予め吸収させた後に翻訳産物の免疫沈殿を示す４番目のレー ンを除き（Ａ）について記載したごとく、（Ａ）の翻訳産物のＧＡＰ−４３に対 する抗体による免疫沈殿。

第２図　ＧＡＰ−４３のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列。胚１ ７〜１８日令ラットからの後板神経節よりのＲＮＡでｃＤＮＡライブラリーを得 た。チャーゲインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、バイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）且：　５２９４（１９７４）の方法によって全細胞 ＲＮＡを単離し、ポリ（Ａ）’ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースで選択した。グ ブラーおよびホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ）、ジーン（Ｇｅ ｎｅ）２５　＋　２６３　（１９８３）によって記載されているリボヌクレアー ゼＨ法によって二本鎖ｃＤＮＡを得、ＥｃｏＲＩリンカ−に結び、ラムダファー ジクローニングベクターλｇｔ　１０およびλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位に結ん だ。対ＧＡＰ−４３ウサギ抗体、続いてアルカリホスファターゼ一対ウサギグロ ブリンＧ（プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ■ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ））連結抗体 を用いることによって、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ Ｇ）での誘導の後、同定された最長クローン、ＧＡＰ４３１１ライブラリー中の 約５ｘｌＯ’プラークから同定した。該ｃＤＮＡインサートをＭｌ　３ｍｐ　１ ８のＥｃｏＲ１部位に継代クローンした。２のより短いクローンの最初のＤ　Ｎ 　Ａ配列分析により、それらは最長のものに包含されていることが明らかにされ た。ジデオキシヌクレオチド鎖−停止法（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）ヱ４：５４６３　（１９７７））に より、配列の下方に示した一連の重複する制限断片を用いることによって、イン サートＧＡＰ４３−２を配列決定した。この断片の３′末端は３の独立したλｇ ｔｌｌ単離体に共通のＥｃｏＲ１部位であり、ＧＡＰ−４３遺伝子において天然 に生じるＥｃｏＲ１部位と考えられる。ポリアデニル化配列を有するインサート を含有するクローンはなかったので、該ｃＤＮＡ内のＥｃｏＲ１部位はライブラ リー構築の間にメチル化されなかったようである。ＧＡＰ−４３についての予測 される蛋白配列を該ＤＮＡ配列の上方に示す。イタリック体の第１のメチオニン は後記する理由でコーディング領域のスタートとして選択した。ここにアミノ酸 ５として示す他のメチオニンのみが別に開始コドンとして働（のではないようで ある。アミノ酸７におけるアルキニン（Ｒ）からアミノ酸２０におけるイソロイ シン（Ｉ）までの直接的な蛋白配列決定によって同定されたアミノ酸残基の上に 線を引いた。確実性をもってアミノ酸を決定できる配列決定の最初のサイクルは アルギニンであった。次のアミノ酸は確実性をもって決定できなかった。断片化 されていない蛋白を配列決定できないことは、アミノ末端はブロックされている らしいことを示唆する。

Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｍ、ＭｓｐＩ　；Ｖ、ＰｖｕＩＩ；Ｈ，ＨａｅｎＩ；Ｐ。

Ｐｓ　ｔ　Ｉ　；Ｓ、５ａｕ３Ａ０ヌクレオチド１００および１０１間の矢印は 第１および第２エクソン間の境界を示し；ヌクレオチド６６４および６６５間の 矢印は第３エクソンのスタートを示す。

第３図　ＰＣ１２細胞におけるＧＡＰ−４３発現の調節。

１０％ウマ血清および５％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ培地中でＰＣＩ２細 胞を継代した。該細胞を平板培養した４０時間後、該培地を異なる添加物を含む ように変更した。４日後、該細胞を写真に撮り（Ａ）、次いで、各細胞培養から ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ（試料当たり１０μｇ）を変性し、１．２％アガロー ス−ホルムアルデヒドゲル上で泳動させ、シーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅ ｅｎ）ナイロンフィルターに移し、紫外線架橋によって該フィルターに結合させ 、３″Ｐ−１識化ＧＡＰ４３−２でプローブした（Ｂ）。最終の洗浄は６５℃に おけるＳ　ＳＣ（ｘ　Ｏ，２）　、０．１％ＳＤＳであった。

含まれる添加物はい）無し、（ｉｉ）１ミリリ・ノトル当たりＮＧＦ５０ｎｇ、 （ｉｉｉ）１０−’Ｍ　ジブチリルｃＡＭＰ、および（ｉｖ）１ミリリツトル当 たりＮＧＦ５０ｎｇおよび１０−”Ｍ　ジブチリルｃＡＭＰであった。最後のレ ーンは、プロ・ノド法およびノ１イブリダイゼーシ讐ン法についての陽性対照と して泳動させた新生元服からのＲＮＡｌ０μｇである。

第４図　ＧＡＰ−４３遺伝子発現の発育調節および組織特異性。

チャーダインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、バイオケミストリー（Ｂｉ ｏｃｈｅ−ｓｉｓｔｒｙ）１８　：　５２９４（１９７９）の手法の修飾法によ って、全細胞ＲＮＡを、示したラット組織から単離した。各ＲＮＡ（１０μｇ） を変性し、１．２％アガロースーホルムアメデヒドゲルＬこて電気泳動を行い、 ニトロセルロースに移した。該フィルターをニックトランスレーションによって 、デオキシシチジン５″−［α−３ｔＰコトリホスフエートで標識したλｇｔ　 １１　　ＧＡＰ４３−２からのＥｃ。

Ｒ１インサートと４２℃にて一晩ハイブリダイズさせた。最終の洗浄は６５℃に てＳＳＣ（ｘｏ、２）　、０．１％ＳＤＳで行った。ＲＮＡ試料：　（ｉ）胚１ ３日令（Ｅ　１３）心臓（Ｈ）　、（ｉｉ）Ｅ　１３肝臓（Ｌ）、（ｉｉｉ）　 Ｅ　１３脳（Ｂ）、（ｉｖ）Ｅ１３後根神経節（Ｄ　ＲＧ）、（ｖ）ないしくｖ ｉ）胚１７日令心臓、肝臓、脳、および後板神経節；（ｉｘ）ないしくｘｉ）新 生児心臓、肝臓、脳、および後板神経節：（ｘｉｉｉ）ないしくｘｖｉ）成人心 臓、肝臓、脳および後板神経節。１８、Ｓおよび２８ＳリポソームＲＮＡの位置 を右に示す。下方は同フィルターとグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコード付けするｃＤＮＡプローブ（ビニシャチク ら（Ｐｉｅｃｈａｃｙｋ　ｅｔ　ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）４２　：　５８９　 （１９８５）　）とのハイブリダイゼーシヨンである。

第５図　（Ａ）ヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および帰結される アミノ酸配列。Ｅ：ＥｃｏＲＩ　；Ｈ：ＨａｅＩＩｌ；Ｍ・Ｍｓｐ＋、コーディ ング領域は太線で示す。規模は１００ｂｐである。矢印は配列決定した重複制限 断片を示す。（Ｂ）ヒト、ラットＧＡＰ−４３およびマウスＰ−５７アミノ酸配 列の配置。垂直線は同一性を示し、コロンは保存される置換を示す。アミノ酸は 、ＩＩＪＰＡＣ−ＩＵＢ　　ＣＢＮの一文字記号によって表す。ラットの配列は 第２図のそれであり、マウスの配列はシムラーら（Ｃｉｍｌｅｒｅｔ　ａＤ、ジ ャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ）　２６２　：　１２１５８　（１９８７）からのもので ある。

（Ｃ）ツカ−およびシュタイグラ−（Ｚｕｋｅｒ　ａｎｄ　Ｓｔｅｉｇｌｅｒ） 、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）９　 ：　ｌ　３３　（１９８工）のひだ（ｆｏｌｄ）プログラムによって予測される ３°−非翻訳領域におけるステム−ループ構造。

第６図　成熟を伴うＧＡＰ−４３発現の領域制限を示すノーザンブロ、ト。８日 令、１６年令、６４年令の脳領域からの全１０μｇＲＮＡを各レーンに負荷し、 該プロットを、実施例■に記載したごとく、ヒトＧＡＰ−４３プローブＣｌａで プローブする。１８ｓおよび２８ＳのｒＲＮＡバンドの位置を示す。

第７図　ＧＡＰ−４３発現が虚血事故のあとに増加することを示すノーザンブロ ノト。（Ａ）野（Ａｒｅａ）　１７　（視覚皮質）における卒中を有する患者の 異なる脳領域からのＲＮＡ１０μｇ０野１７における発現は脳（野１１）におけ る最大に匹敵するレベルまで増加した。（Ｂ）すべて泳動させ、レーン２および ３間で切り出した関係のないバンドを有する同プロット上でプロットした、３人 の患者からの野３．１．２．５からのＲＮＡ１０μｇ０レーン３はわずかの卒中 を包含し、ＧＡＰ−４３発現の増加を示すのに対し、レーン１および２は組織学 的に正常であった。

第８図　ｉｎ　５ｉｔｕ・ハイブリダイゼーションにより、梗塞に隣接する領域 におけるＧＡＰ−４３発現の増加が明らかにされる。（ＡＩ）脂質負荷マクロフ ァージおよび反応性星状細胞による組織の散漫な浸潤を示すＢにおける梗塞領域 の高倍率拡大。この領域に残存する二ニーロンはない（Ｘ１６０）。（Ａ２）豊 富な組織学的に無傷なニューロンを有する正常な隣接皮質（ｘ　３００）。（Ｂ ）】の転回（矢印頭）および隣接転回における無傷皮質（矢印）を含む組織化虚 血梗塞（１０ないし１４４日令を有する視覚皮質の低倍率図（ｘ　１２）。（Ｃ ）暗視野調査によると、正常な視覚皮質においては、ＧＡＰ−４３発現は少数の 散在二ニーロンに制限される（矢印頭）。（Ｄ）梗塞皮質においては、アンチセ ンスＧＡＰ−４３プローブの特異的結合はない。大きな明るい焦点はセンスプロ ーブで非特異的に標識する凝集ネクローシスの領域からのものである（Ｇ）。

対照的に、隣接無傷皮質においては、多数の二ニーロンがＧＡＰ−４３を発現す る（アンチセンスプローブで標識したＥ−明視野およびＦ−暗視野）。特異的Ｇ ＡＰ−４３結合の不存在を示す、センスプローブで標識した（）（）対照明視野 および（Ｄ暗視野（Ｃ−１ｘ１６０）。

第９図　重症の低血圧症および低酸素症の発作の数日後における小脳皮質のニュ ーロンにおけるＧＡＰ−４３発現の増強。すべての切断面を同時に処理した。（ Ａ）検出可能なＧＡＰ−４３標識化の不存在を示す正常成人小脳皮質。（Ｂ）プ ル牛二二細胞および外部顆粒細胞層におけるＧＡＰ−４３の発現の顕著な増加を 示す虚血後手脳皮質。（Ｃ）対照としてのセンス鎖プローブと７〜イブリダイズ させたＢに隣接する断面図（すべてｘ３１５）。

第１０図　ＣＨＯ細胞系における突起形成に対するＧＡＰ−４３の影響。中抜き 線は４のＣＤＭＳ−トランスフェクト系統における突起を有する細胞を表し、切 れ口のない線はＧＡＰ−４３を発現する４の細胞系を表す。細胞系は実施例Ｖに 記載したごとくに得た。

突起を有する細胞のパーセンテージは、ＣＨＯ細胞をポリーＤ−リジンー被覆カ バーガラス上に平板培養することによって検定した。

２０ミクロンより長い突起をもつ細胞を陽性として記録した。比較性を確実とす るために、すべてのアッセイは、平板培養の後、３０分から４５分にわたる時間 枠内で行った。本アッセイの重要な要素は選択した時間枠であった。というのは 、より長い平板培養時間の後では、あるいは細胞が密集するに従い、突起は不明 確となるからであった。この時間枠の閾に、できるだけ多くの細胞を計数し、調 ベたすべての細胞を包含させた。異なる系について計数した細胞数はＩＡ、４０ Ｂ：　ＩＢ、４０８：２Ａ、２８７；２Ｂ、３０３；５Ｅ、２３４；４，３３３ ；１２．１５６；１４．１６１０ＧＡＰ−４３発現細胞系で突起をもつ細胞の割 合は対照におけるよりもがなり高かった（ｐ＜０．００１）。

第１１図　アミノ末端エクソンがＧＡＰ−４３蛋白を細胞膜へ定方向化させる原 因であること、およびそれはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ の膜ターゲツティングを指令することを証明する実験の模式図。左欄（「構築」 ）は、ＣＯ３，ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯまたはＰＣＩ２細胞のトランスフェクシ曹 ンで用いる遺伝子の構築を示す。右欄（「膜」）は、発現された蛋白または断片 が、亜細胞分別、続いてのウェスタンブロッティング、直接免疫蛍光、またはそ の双方によって検定して、膜一連結（＋）であったか否か（−）を示す。エクソ ン２の実質的部分（ＧＡＰ（−内部））またはＧ’ＡＰ−４３遺伝子のカルボキ シ末端領域（ＧＡＰタッグ）を欠＜ＧＡＰ構築物もそうであったように、無傷Ｇ ＡＰ−４３遺伝文　　遺伝子（ＧＡＰ）はがなり誤連結性であった。しがしなが ら、ＧＡＰ−４３の最初の４個のアミノ酸をコード付けするヌクレオチドを欠失 した場合（ＧＡＰ（−１−４））、発現された蛋白断片は誤連結性でなかった。

第１のエクソンの３（Ｃ３）または４（Ｃ４）位におけるシスティンをコード付 けする配列に点突然変異を導入した結果、得られた蛋白でアラニンが発現された 。Ｃ３（ＧＡＰ水ＣＳ）またはＣ４（ＧＡＰ＊ＣＪいずれがの突然変異の結果、 無傷ＧＡＰ−４３と比較して膜レベル（＋／−）が減少した。Ｃ４を変更した場 合、減少は特に顕著であった。Ｃ３およびＣ４（ＧＡＰ＊Ｃ１，、）双方の突然 変異は誤連結を全く排除した。

この通常は細胞質ゾルの酵素について予測されるごと（、クロラムフェニコール アセチルトランスフラーゼ（ＣＡ　Ｔ）をコード付けする遺伝子の一時的発現に より、誤連結蛋白は産生されなかった。

第１のＧＡＰ−４３エクソンの１０個のアミノ酸をコード付けするヌクレオチド 配列をＣＡＴ遺伝子のアミノ末端に結ぶと（ＧＡＰ（１−Ｉ　０）ＣＡＴ）　、 発現された蛋白は誤連結性であった。

第１２図　ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした場合、通常のＧＡＰ−４３は膜成 分および細胞質ゾル成分（Ｍ＝膜：Ｃ−細胞質ゾル）を共に有することを示すウ ェスタンプロット。第１のＧＡＰ−エクソンの第３または第４システイン（Ｃ− ３またはＣ−４）をコード付けするヌクレオチド配列の突然変異は膜結合成分に 干渉し、一方、両システィン（Ｃ−３，４）の突然変異は膜結合を完全に排除し た。

対照細胞（ＣＯＮ）はＧＡＰ−４３を有さず；脳膜（ＢＲ）はトランスフェクト した遺伝子からのものと同一の分子量のＧＡＰ−４３を有していた。

第１３図　ラｙトＧＡＰ　　４３遺伝子の地図Ａ、　　５°から３゛への向きの ＧＡＰ−４３遺伝子の直線表示。マツピングに用いたファージインサートの表示 を示す。３個のエクソンを垂直線として表す。示した部位は制限エンドヌクレア ーゼＢａｍＨ１（Ｂ）　、Ｋｐｎ　Ｔ　（Ｋ）　、および５ａｃｌ（Ｓ）につい てのものである。

Ｂ、イントロン−エクソン境界および３゛ポリアデニル化部位。

コンセンサススプライス部位に最良に適合させ、ここに記載するごときｃＤＮＡ 配列と比較することによって、エクソンおよび１ＪＩｉ［Ｊｊ域を配列決定し、 イントロン−エクソン境界を決定した（マウント（Ｍｏｕｎｔ）、ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１旦：　４５９− ４７２　（１９Ｂ２）。主要ポリアデニル化部位は、ＲＮＡ５ｅ保護によって決 定した。利用したポリアデニル化シグナルの直ぐ３゛側にしばしば見い出される 推定ポリアデニル化シグナルおよびコンセンサス・モチーフ（ｍｏｔｉｆ）のタ ンデム対に下線を引いた（マクラウヒランら（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ　ｅｔ　ａ ｌ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（＋１ｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、）上３：１３４７−１３６８（１９８５））。

第１４１Ｎ　　ＧＡＰ−４３プロモーター領域の配列。ヌクレオチド＋１位はＧ ＡＰ−４３蛋白の開始ＡＴＧコドンのＡを示す。この配列は＋３０で終わる可変 サイズの第１のエクソンを包含する。主要な転写スタート部位は矢印によって示 す。プリン残基は星印を下に示す。フンセンサスＰｉｔ−１結合部位は上に線を 引く。

第１５図　Ｈ−ＤＮＡによって誘導された制限断片における移動度シフト。制限 部位および主要なホモプリン−ホモピリミジン領域（太くし標識したＩ、■、お よび■）の位置を示す−５１８ないし→−８５のＧＡＰ−４３プロモーター領域 の模式図。下方に、以下の酵素でプラスミドｂｓ１．５ＲＩＸ４を消化すること によって遊離したＧＡＰ−４３プロモ一ター断片を表示する：　１）Ｓｓｐｌ。

６０３ｂｐ；２）Ｘｂａｌ／５ｓｐｌ、５６０ｂｐ；３）Ｓｍａｌ／５ｓｐｌ、 ４９０ｂｐ；４）ＳｓｐＩ／Ｎｈｅｌ、４０９ｂｐ；５）Ｓｓｐｌ／Ｎｓ　ｉ　 Ｌ　　２８４ｂＩ）（領域Ｉを含有）、３１９ｂｐ（領域■および■を含有）； ６）Ｓｓｐｌ／Ａｃｃｌ、３１４ｂｐ　（領域１）、２８９ｂｐ　（領域■およ びＩＩＩ）　　；　７）　Ｘｂａ　Ｉ／Ｎｈ　ｅ　１゜３６０ｂｐ　；および８ ）Ｓｍａ　Ｉ／Ｎｈｅ　Ｉ、２９５ｂｐ。

第１６図　９３４およびｐ３Ｂについての部分的蛋白配列好ましい具体例の記載 以下の記載において、分子遺伝学および神経学の分野の当業者に公知の種々の方 法を参照する。参照がなされるかかる公知の方法を記載する出版物および他の資 料を十分に記載されているごとくその全体を参照により一体化させる。

ＤＮＡ組換え技術の一般的な原理を記載する標準的な文献はワトソン・ジェイ・ ディら（Ｙａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）、モレキュラー・ノイイオロジ ー・サブ・ザ・ジーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｇｅｎｅ）＋　Ｉおよび■巻、ザ・ベンジャミン／クミンクズ・パブリノシイン グ・カンパニー・インコーホレイテッド（Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍａｉｎｇｓ 　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、　）、出版者、メン口・パ ーク（Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ）、カリフォルニア州（１９８７）；ダーネル・ジ エイ・イーら（Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、　Ｅ、　ｅｔａｌ）、モレキュラー・セ ル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、号イエ ンティフック・アメリカン・ブ・ノクス・インコーホレイテッド（Ｓｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ、）、出版者、二ニーヨー ク、ニーーヨーク州（１９８６）、レーウイン・ビイ・エム（Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ 。

Ｍ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　Ｉ［、ジョン・ウィリー・アンド・サンプ（Ｊｏ ｈｎｍｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、出版者、二ニーヨーク、二ニーヨーク州（１ ９８５）：オールド・アール・タブリコーら（Ｏｌｄ、　Ｒ，ｉｌ、ｅｔａｌ） 、プリンンブルス′・サブ硬ジーン・マニニビュレーション：アン・イントロダ クション・トウ・ジーネテ什ツク・エンジニアリン’）”　（Ｐｒｉｎｃ−ｉｐ ｌｅｓ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｅ　　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ二Ａｎ　　Ｉｎｔｒ ｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ｔｏ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎ■奄氏| ｅｅｒｉｎｇ）、第２版、ユニバーシイティ・サブ・カリフォルニア・プレス（ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ）、出版者、 ノく−ケレイ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、カリフォルニア州（１９８１）およびマニ アテイス・ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ）、モレキュラー・ク ローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ ノ＼−ノイー・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ）、出版者、コールド・スプリング・Ｉ〜−バー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニ二−ヨーク州（１９８２）を包含する。

「クローニング」とは、特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿 入するｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換技術の使用を意味する。所望の遺伝子を首尾よくク ローン化するためには、ＤＮＡ断片を生成させる方法、該断片をベクター分子に つなぐ方法、該複合ＤＮＡ分子をそれが複製可能な宿主中に導入する方法、およ び受容宿主細胞の間から標的遺伝子を有するクローンを選択する方法を使用する 必要がある。

ｒｃＤＮＡＪとは、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用に よってＲＮＡ鋳型から産生された相補的ＤＮＡまたはコピーＤＮＡを意味する。

かくして、ｒｃＤＮＡクローン」はクローニングベクターに担持された、注目す るＲＮＡ分子に対して相補的なデュプレックスＤＮＡ配列を意味する。

ｒｃＤＮＡライブラリー」とは、−緒になって、生物体の全ゲノムよりなるｃＤ ＮＡインサートを含有する組換体ＤＮＡ分子の収集を意味する。かかるｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａライブラリーは、当業者に公知であって、例えば、マニアテイスら（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ− ｅ　？　二ｘアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、）、前掲、に記載されて（Ｘる方法ζこよって調製でき る。一般に、そのゲノムから特定の遺伝子をクローン化することが所望される生 物の細胞からＲＮＡをまず単離する。本発明の目的に好ましいのは哺乳動物、お よび特にヒト細胞系である。

「ベクター」とは、その中へＤＮＡ断片を挿入またはクローン化できるプラスミ ドまたはバクテリオファージ由来ＤＮＡ分子を意味する。ベクターは１個または それ以上の唯一の制限部位を含有し、クローン化配列が再生可能なような定義宿 主またはビヒクル生物中で自律複製が可能である。かくして、ｒＤＮＡ発現ベク ター」とは、ＤＮＡの付加配列が自律要素ゲノムに組み込まれた後、宿主染色体 から独立して、宿主中で複製できるいずれの自律要素も意味する。

かかるＤＮＡ発現ベクターは細菌プラスミドおよびファージを包含する。本発明 の目的で好ましいのはラムダｇｔｎ発現ベクターである。

「実質的に純粋」とは、各々、他の抗原または遺伝子が実質的になく、または通 常天然に見い出される可能性のある他の不純物が実質的になく、天然に見い出さ れない形態で存在する本発明のいずれの抗原、またはいずれのかかる抗原をコー ド付けするいずれの遺伝子をも意味する。「機能的誘導体」とは、分子の＝断片 」、「変異体」、「同族体」、または「化学的誘導体」を意味する。本発明のｃ ＤＮＡ配列のいずれかの断片のごとき分子の「断片」とは、分子のいずれのヌク レオチドサブユニットをもいうものとする。かかる分子の「変異体」とは、全分 子、またはその断片いずれかに実質的に同様な天然に生じる分子をいうものとす る。分子の「同族体」とは、全分子またはその断片いずれかに実質的に同様な非 天然分子をいうものとする。

両分子においてアミノ酸の配列が実質的に同一であれば、分子は他の分子に「実 質的に同様」であるという。実質的に同様なアミノ酸分子は同様な生物学的活性 を有する。かくして、２の分子が同様な活性を有するならば、分子の一方が他方 で見い出されない付加アミノ酸残基を含有したり、またはアミノ酸残基の配列が 同一でない場合にもその用語を用いるごとく、それらは変異体であると考えられ る。本明細書中で用いるごとく、分子が通常は当該分子の一部ではない付加化学 部位を含有する場合、該分子はもう１つの分子の「化学的誘導体」であると言わ れる。かかる部位は分子の溶解性、吸収、生物学的半減期等を改良する。また、 該部位は分子の毒性を減少させ、分子の望ましくない副作用を排除しまたは減衰 させるなどする。

かかる効果を媒介できる部位は、例えば、レミントンズ・ファルマシコーテイカ ル・サイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｅｅｕｔｉｃａｌ　５ ｃｉｅ−ｎｃｅ）、　第１６ＲＬマツク・ハフリノシング・カンパニー（Ｍａｃ ｋ　Ｐｕ−ｂｌｉｓｂｉｎｇ　Ｃｏ、）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ベニシ ルノくニア州（１９８０）に開示されている。

同様に、本発明の抗原のいずれかの遺伝子の「機能的誘導体」とは、ヌクレオチ ド配列が「実質的に同様であり」、同様の活性を有する分子をコード付けする遺 伝子の「断片」、「変異体」、または「同族体」を包含させる意図である。

ＧＡＰ−４３をコード付けするＤＮＡまたはその機能的誘導体、あるいは膜−タ ーゲノテイングペプチドまたはその機能的誘導体は、結ぶための平滑末端または スタガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適当な末端を供給するための制限酵素 消化、適当に粘着性末端を満たすこと、望まない結合を回避するためのアルカリ ホスファターゼ処理、および適当なりガーゼで結ぶことを含めた通常の技術でベ クターＤＮＡと組み合わせることができる。かかる操作についての技術はマニア ティス・ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　、　ｅｔ　ａｌ）、前掲、によっ て開示されており、かつ当該分野でよく知られている。

ＤＮＡのごとき核酸分子は、転写および翻訳調節情報を含有するときはポリペプ チドを「発現することができる」と言われ、かかる配列は該ポリペプチドをコー ド付けするヌクレオチド配列に「作動可能に結合」している。作動可能な連鎖は 、調節ＤＮＡ配列および発現が求められるＤＮＡ配列が遺伝子発現を可能とする ように連結した連鎖である。遺伝子発現に要する調節領域の正確な性質は生物間 で変わり得るが、それは、一般に、原核生物においては、（ＲＮＡ転写の開始を 指令する）プロモーターならびに、ＲＮＡに転写されたときに蛋白合成の開始を 指令するＤＮＡ配列を共に含有するプロモーター領域を包含する。かかる領域は 、通常、ＴＡＴＡボ、、クス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のごとき、転写お よび翻訳の開始に関与するそれらの５°　−非コーディング配列を包含する。

所望ならば、蛋白についてコード付けする遺伝子配列より３′側の非コーディン グ領域は前記方法によって得ることができる。この領域は、終始およびポリアデ ニル化のごとき、その転写終始調節配列のために保持することができる。かくし て、蛋白についてコード付けするＤＮＡ配列に本来隣接する３゛−領域を保持す ることによって、転写終始シグナルを供することができる。転写終始シグナルが 発現宿主細胞で満足に機能しない場合、該宿主細胞において機能する３′領域を 置き換えることができる。

（プロモーター領域配列およびＧＡＰ−４３をコード付けする配列のごとき）２ のＤＮＡ配列は、２のＤＮＡ配列間の連鎖の性質の結果、（１）フレーム−シフ ト突然変異の導入が起こらず、（２）ＧＡＰ−４３遺伝子配列の転写を指令する プロモーター領域配列の能力に干渉せず、または（３）プロモーター領域配列に よって転写されるべきＧＡＰ−４３遺伝子配列の能力に干渉しないときは、作動 可能に連結していると言われる。かくして、プロモーター領域は、該プロモータ ーがＤＮＡ配列の転写を行うことができるならば、そのＤＮＡ配列に作動可能に 連結していることになろう。

かくして、蛋白を発現させるには、適当な宿主によって認識される転写および翻 訳シグナルを要する。

本発明は、原核生物または真核生物細胞いずれかにおけるＧＡＰ−４３蛋白（ま たはその機能性誘導体）の発現を含む。好ましい宿主はイー・コリ（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、サルモネラ（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）等を包含する。最も好ま しい原核生物宿主はイー・コリである。サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセスセンス（ Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｃ）、および種々のシュードモナスＣＰ ｓｅｕｄｏｔａｏｎａｓ）種のごとき他の腸内細菌を利用することもできる。

かかる条件下では、ＧＡＰ−４３はグリコジル化されないであろう。

原核生物宿主は発現プラスミドにおいてレプリコンおよび制御配列に適合するも のでなければならない。

（例えば、イー・フリ（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）、ビイ・スブチリス（Ｂ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、ストレプトミセ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等のごとき）原核生物細胞でＧＡＰ−４３蛋白 （またはその機能的誘導体）を発現させるには、ＧＡＰ−４３をコード付けする 配列を機能的原核生物プロモーターに作動可能に連結させなければならない。か かるプロモーターは構成的または、より好ましくは、調節可能（例えば、誘導可 能または脱抑制可能）いずれかであってよい。

ｉ成約７’ｅ７モーターの例はバクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐ ＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２ ５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモー ター等を包含する。誘導可能な原核生物プロモーターの例はバクテリオファージ λの主要な右側および左側プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、Ｉａｃ：Ｚ、Ｉａｃｌ、およびｇａｌプロモー ター、バチラス・スブチリス（Ｂ、　５ｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ（ウル マネン・アイら（Ｕｌｍａｎｅｎ、１．　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・バ クテリオロジ−（ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、）±６２：１７６−１８２　（１ ９８５）およびσ−２８−特異的プロモーター（グリマン・エム・ゼットら（Ｇ ｌｉｍａｎ、Ｍ、Ｚ、、　ｅｔ　ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）３２　：　１１〜 ２０　（１９８４））、バチルス属のバクテリオファージのプロモーター（グリ コアン・ティ・ジェイ（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ、　）、ザ・モレキユラー ・バイオロジー・サブ・ザ・バチリ（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ）、アカデミツク・プレス・インコーホレ イテッド（＾ｃａｄｅｍｅｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、　）、ニューヨーク州（１９８２））、およびストレプトミセス（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロモーター（ワード・ジエイ・エムら（Ｗａｒｄ、　 Ｊ。

Ｍ、＋ｅｔ　ａｌ）、モレキーラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイ・ノクス （Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　）　２０旦：４６８−４７８　（１９８ Ｂ））を包含する。原核生物プロモーターはグリツク・ビイ・アール（Ｇ１＋ｃ ｋ。

Ｂ、Ｒ，）（ジャーナル・オプ・インディアン・マイクロバイオロジー（Ｊ、Ｉ ｎｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）よ：　２７７〜２８２　（１９８７）　）；セ ナテイエンポ・ワイ（Ｃｅｎａｔ　ｉｅｍｐｏ、　Ｙ、　）　（ビオシミー（Ｂ ｉｏｃｈｉｍｉｅ）６８　：　５０Ｓ、　（アヌ・レブ・ジェネト（Ａｎｎ、Ｒ ｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、）　１８　：　４１５〜４４２（１９８４））によって総括 されている。

原核生物細胞での適当な発現には、遺伝子−コーディング配列の上流のリポソー ム結合部位の存在も必要である。かがるリボソーム結合部位は、例えば、ボルド ・エルら（Ｇｏｌｄ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ）　（アヌ・レブ・マイクロパイオル（ Ａｎｎ、Ｒｅｖｊｌｉｃｒｏｂｉｏｌ、）３５　：　３８５　４０４（１９８１ ））によって開示されている。

もっとも好ましい宿主は、ｉｌ　ｙｉｔｒｏ、または組織培養いずれかにおける 、酵母、昆虫、菌類、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）を含めた真核生物宿主であ る。哺乳動物細胞は、正しい部位における正しい折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）ま たはグリコジル化を包含する蛋白分子に対する翻訳後修飾を提供する。宿主とし て有用である得る哺乳動物細胞はＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ　Ｉのごとき線維芽 細胞起源の細胞、またはハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧ１４のごときリンパ系 起源の細胞または骨髄腫Ｐ３ｘ８３Ｓｇ８、およびその誘導体を包含すついて良 好な能力を提供するＳ　Ｐ　２１０およびＪ５５８Ｌ、ならびにＩＭＲ３２２の ごとき神経芽細胞腫細胞系を包含する。また、ＣＯＳ細胞は、ＧＡＰ−４３発現 、ならびにＧＡＰ−４３発現の調節の研究について都合よい真核生物宿主であっ て、本目的については好ましい。

哺乳動物宿主については、多くの可能なベクター系がＧＡＰ−４３の発現に利用 できる。宿主の性質に応じ、多くの種類の転写および翻訳調節配列を使用できる 。調節シグナルが高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連するとき、転写お よび翻訳調節シグナルは、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、シミアンウィ ルス等のごときウィルス源に由来するものであってもよい。別法として、アクチ ン、コラーゲン、ミオシン等のごとき哺乳動物発現産物からのプロモーターを用 いることもできる。遺伝子の発現を調節できるように、抑制または活性化を可能 とする転写開始調節シグナルを選択できる。

注目すべきものは、温度を変化させることによって発現を抑制または開始するこ とができように温度感受性である調節シグナル、あるいは化学調節、例えば、代 謝物に付される調節シグナルである。

酵母はグリコジル化を含めた翻訳後ペプチド修飾も行うことができる点て実質的 な利点を提供する。酵母での所望の蛋白の産生に使用することができる強力なプ ロモーター配列および高コピー数のプラスミドを用いる多数の組換えＤＮＡ技術 が存在する。酵母はクローン化哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、 リーダー配列を担持するペプチド（例えば、プレーペプチド）を分泌する。

グルツースが豊富な培地で酵母を増殖させる場合に大量に産生される解糖酵素に ついてコード付けし、活発に発現される遺伝子からのプロモーターおよび終始要 素を一体化する一連の酵母遺伝子発現系のいずれを利用することもできる。また 、公知の解糖遺伝子は非常に効果的な転写制御シグナルを提供できる。例えば、 ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネータ−シグナ ルを利用することができる。

ＧＡＰ−４３またはその機能的誘導体の昆虫での産生は、例えば、当業者に公知 の方法によって、昆虫宿主をＧＡＰ−４３を発現するよう設計したバクロウィル スに感染させることにより達成できる。

かくして、１の具体例において、Ｇ　Ａ　Ｐ〜４３をコード付けする配列をウィ ルス多角体蛋白の調節領域に作動可能に連結することができる（ジャスニイ（Ｊ ａｓｎｙ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３８　：　ｌ　６５３（１９８ ７））。組換体バクロウィルスで感染させ、培養した昆虫細胞、または生きた昆 虫それ自体は、全蛋白生産の２０ないし５０％もの量でＧＡＰ−４３蛋白を生産 できる。生きた昆虫を用いるべき場合、現在のところ、本発明による大規模なＧ ＡＰ−４３生産用に毛虫が好ましい宿主である。

前記したごとく、真核生物宿主でのＧＡＰ−４３の発現には真核生物調節領域を 必要とする。かかる領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分なプ ロモーター領域を包含する。好ましい真核生物プロモーターはマウス・メタロチ オネインＩ遺伝子（ヘイマー・ディら（ｌａｍｅｒ、　Ｄ、　＋　ｅｔ　ａｌ） 、ジャーナル・サブ・モレ牛ニラ−・アンド・アプライド・ジェネティ／クス（ Ｊ９Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　）↓：２７３〜２８Ｂ　（１９８２）） ；ヘルペスウィルスのＴＫプロモ−ター（マノクナイトーｘス（ＭｃＫｎｉｇｈ ｌ、、　Ｓ、　）、セル（Ｃｅｌｌ）３１　：３５５〜３６５　（１９Ｂ２）） ；ＳＶ４０初期プロモーター（ベノイスト・シイら（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，、 ｅｔ　ａｌ）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（１ｏｎｄｏｎ）λ旦ユニ３０ ４〜２１０　（１９８１）：酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（ジヲンストン・ ニス・エイら（Ｊｏｂｎｓｔｏｎ、　Ｓ、＾、ｐｅｔａｌ）、プロシーディング ズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシスＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔ 　］、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　（Ｕ　Ｓ　Ａ　）ユ９：６９７］〜１９７ ５　（１９８２）；シルバー・ビイ・エイ　（Ｓｉ　１ｖｅｒ、　Ｐ、　Ａ、　 、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ ・サイエンシス°（Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｅａｄ、　Ｓｃｉ、）　（ＵＳＡ）　 ８　ｉ　：　５９５１〜１９５５　（１９８４））を包含する。

広く知られているごとく、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコード 付けするコドンで開始される。この理由により、真核生物プロモーターとＧＡ、 Ｐ−４３蛋白（またはその機能的誘導体）をフード付けするＤ　Ｎ　Ａ配列との 間の連鎖が、メチオニンをコード付けできるいずれの介在コドン（すなわちＡＵ Ｇ）も含有しないことを確認するのが好ましい。かかるコドンの存在の結果、（ Ａ　Ｕ　ＧコドンがＧＡＰ−４３をコード付けするＤ　Ｎ　、Ａ配列と同一のリ ーディングフレームにあれば）融合蛋白を形成するか、または（ＡＵＧコドンが ＧＡＰ−４３をコード付けする配列と同一のリーディングフレームにない場合は ）フレームシフト突然変異が起こる。

ＧＡＰ−４３をコード付けする配列および作動可能に連結したプロモーターを、 線状分子または、より好ましくは閉環状分子いずれかであり得る非複製ＤＮＡ　 （またはＲＮＡ）分子として、受容体厚植生物または真核生物細胞に導入するこ とができる。かかる分子は自律複製ができないので、ＧＡＰ−４３蛋白の発現は 導入された配列の一時的発現を通じて起こり得る。別法として、永久的な発現は 、導入された配列の宿主染色体への組込を通じて起こり得る。

１の具体例において、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体に組み込むことができ るベクターを使用する。導入されたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組み込んだ 細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ以上 のマーカーも導入することによって選択できる。該マーカーは、栄養素要求性宿 主に対する原栄養性、生物殺傷耐性、例えば抗生物質、または銅のごとき重金属 等を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列 に直接連結するか、または共トランスフェクンヨンによって同細胞に導入するこ とができる。また、−重鎖結合蛋白ｍＲＮＡの最適合成には、さらなる要素が必 要となり得る。これらの要素はスプライスシグナル、ならびに転写プロモーター 、エンハンサ−１および終始シグナルを包含し得る。かかる要素を一体化するｃ ＤＮＡ発現ベクターはオカヤマ・エイチ（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｉｌ、　）、モレ キュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ　Ｃｅ１．　Ｂｉｏｌ、 　）　３：　２８０　（１９８３）によって記載されているものを包含する。

好ましい具体例において、導入された配列は受容体宿主中で自律複製できるプラ スミドまたはウィルスベクターに組み込まれる。広範な種類のベクターいずれも この目的で使用することができる。特定のプラスミドまたはウィルスベクターの 選択で重要な因子は二ベクターを含有する受容体細胞がそれにより認識され、当 該ベクターを含有しない受容体細胞から選択される容易さ；特定の宿主中で所望 されるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間をベクターを往来させ ることかできるのか望ましいか否かを包含する。好ましい原核生物ベクターは、 （例えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ］、ｐｓｃ　１０　］、ｐＡＣＹＣ１８４、 πＶＸごとく）イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で複製できるもののごときプラス ミドを包含する。かかるプラスミドは、例えば、マニアティス・テ、ｆら（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　、　ｅｔａｌ）　（モレキュラー・クローニング、ア・ ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド−スプリング拳バーバーナブレス （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリン グ・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニ二−ヨーク州（１ ９８２））によって開示されている。バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プラスミド はｐｃ１９４、ｐＣ２２１、ｐ７１２７等を包含する。

かかるプラスミドはグリツァン・ティ（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　）　（ザ・モ レキュラー・バイオロジー・サブ・ザ・バチリ（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 ＢｉｏｌＯｇＹ−ヨーク州（１９８２）、３０７〜３２９頁）によって開示され ている。適当なストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｅｙｃｅｓ）プラスミドは、 ｐＩＪｌｏｌ　（ケンダル・ケイ・ジェイら（Ｋｅｎｄａｌｌ、　Ｋ、　Ｊ、　 、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オン・パイテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、　）上旦旦：４１７７〜４１８３　（１９８７））、およびφＣ３１の ごときストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｉｙｃｅｓ）バクテリオファージ（ チャタ−・ケイ・エフら（Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、　Ｆ、　、　ｅｔ　ａｌ）　（ シックスス・インターナショナル・シンポジウム・オン・アクチノミセテイルズ ・バイオロジー（ＳｉｘｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 　ｏｎ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデミアイ・ カイト（Ａｋａｄｅａｉａｉ　Ｋａｉｄｏ）、ブダペスト、ハンガリー（１９８ ６）、４５〜５４頁）を包含する。シュードモナス（ＰｓｅｕｄｏＩｌ＋ｏｎａ ｓ）プラスミドはジッン・ジェイ・エフら（Ｊｏｈｎ、Ｊ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ） 　（レビューズ・オン・シンフェクシャス・ディシーズ（Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃ ｔ、　Ｄｉｓ、　）旦：　６９３−７０４　（１９８６）”）　、およびイザキ ・ケイ（Ｉｚａｋｉ、　Ｋ、　）（ジャパニーズ・ジャーナル・オン・パイテリ オロジ−（Ｊｐｎ、　Ｊ。

れている。

好ましい真核生物プラスミドはＢＰＶ、ワクンニア、ＳＶ４０゜２−ミクロンサ ークル（ｃｉｒｃｌｅ）等、またはその誘導体を包含する。

かかるプラスミドは当該分野でよく知られている（ポートスティン・ディら（Ｂ ｏｔｓｔｅｉｎ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ）、マイアミ・ラントル・シンポ（ｋｌｉａ ｍｉＷｎｔｒ、　Ｓｙｍｐ、　）１旦：２６５〜２７４　（１９８２）；ブロー チ・ジェイ・アール（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，）　　：ザ・モレキユラー・ バイオロジー・オン・ザ・イースト・サツカロミセス：ライフ・サイクル・アン ド中インへりタンス（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｙｅａｓｔ　５ａｃｃｈａｒｏ−ｓｙｃｅｓ　：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ 　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、 ニーーヨーク州、４４５〜４７０頁（１９８１）；ブローチ・ジェイ・アール（ Ｂｒｏａｃｈ＋　Ｊ、　Ｒ，）、セル（Ｃｅｌｌ）　２８　：　２０３−２０４ 　（１９８２）　；ボロン・ディ・ビイら（Ｂｏｌｌｏｎ、　Ｄ、　Ｐ、　、　 ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オン・タリノ・ヘマトル・オンコル（Ｊ、　ＣＩ　 ｉｎ、　ｔｌｅａａｔｏｌ、　０ｎｃｏ１．　）　１０　：　３９〜４８（１９ ８０）；マニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）、セル・バイオロジー ニア・コンプリヘンシブ・トリーテイス（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏ ｌｌ１ｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ）、３巻、ジーン・イクスブレ ／ｇン（Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、アカデミツク６ブレス（Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、５６３〜６０８　（１９８０）　） 。

一旦構築体を含有するベクターまたはＤＮＡ配列を発現用に調製したならば、形 質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム 沈殿のごとき生化学的手段、およびジメチルアミノエチル（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ）デ キストランのごときポリカチオンの適用、および電気穿孔、直接マイクロインジ ェクション、およびマイクロプロジエクテイール（−ｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉ ｌｅ）　　（バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ））ボンバードメント（ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）　（ジョンストンら（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４０　（４８５８）：　１５３Ｂ　（１ ９８８）等を包含する種々の適当な手段のうちいずれかによって、該ベクターま たはＤＮＡ構築体を適当な宿主細胞に導入することができる。

ベクターの導入の後、含ベクター細胞の増殖について選択する選択培地中で受容 体細胞を増殖させる。クローン化遺伝子配列の発現の結果、ＧＡＰ−４３蛋白が 産生されるか、またはこの蛋白の断片が産生される。これは、形質転換細胞中で 、あるいは（例えば、プロモデオキンウラシルを神経芽細胞腫細胞等に投与する ことによって）これらの細胞を分化するよう誘導した後、起こり得る。

発現された蛋白は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフイニティクロマトグ ラフィー、電気泳動等のごとき常法に従って単離し精製できる。

また、本発明は、ＧＡＰ−４３またはその断片およびベーターガラクトシダーゼ のごとき検出可能な酵素、あるいはいずれかの所望の同種または異種蛋白または ペプチドよりなる融合蛋白をコード付けするクローン化遺伝子に関する。かかる 融合蛋白を産生ずる方法は教示されている。例えば、パイ・ディ・エイチら（Ｂ ａｉ、　Ｄ、　Ｈ，、ｅｔａｌ）、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ン・ティ・ニーら（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、Ｕ、　ｅｔ　ａｌ）、ディ・エヌ・エイ・ クローニング・テクニックス、ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡＣｌｏ ｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ） 中の「λｇｔ　１０およびλｇｉｌｌにおける構築およびスクリーニングｃＤＮ Ａライブラリーズ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　 ｃＤＨｋ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓン、ディーグロバー（Ｄ、　Ｇ　］　ｏｖｅｒ） 編、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、オノクスフォード、 】９８５．４９〜７７頁。

ＧＡＰ−４３、その機能的誘導体、またはＧＡＰ−４３またはその断片および検 出可能な酵素または所望の蛋白もしくはペプチドよりなる融合蛋白は当業者に公 知の常法によって単離できる。例えば、細胞を遠心によって収集し、または適当 な緩衝液で溶解でき、蛋白は、例えばＤＥＡＥ−ラルロー・ス、ホスホセルロー ス、ポリリボシチジル酸−アガロース、ヒドロキシアパタイト上のカラムクロマ トグラフィーまたは電気泳動もしくは免疫沈殿によって単離できる。

別法として、ＧＡＰ−４３またはその機能性誘導体、またはＧＡＰ−４３および 検出可能な酵素または所望の蛋白もしくはペプチドよりなる融合蛋白は抗−ＧＡ Ｐ−４３抗体の使用によって、または検出可能な酵素または所望の蛋白もしくは ペプチドに対する抗体の使用によって単離することができる。かかる抗体は、よ く知られた方法によって得ることができ、そのうちいくつかを後記する。かくし て、例えば、多クローンウサギ抗−ＧＡＰ−４３血清の調製は本明細書の実施例 部分に開示されている。

本発明のもう１つの具体例は、対ＧＡＰ−４３蛋白抗体よりなる。

本明細書中で用いる［抗体Ｊ（Ａｂ）または「単クローン抗体Ｊ（Ｍａｂ）とは 、抗原を結合できる（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、断片のごとき）無傷 分子ならびにその断片を包含するものとする。ＦａｂおよびＦ　（ａ　ｂ’）　 、断片は無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環から急速に消失し、無傷抗体の低い非 特異的組織結合を有し得る（ウオールら（Ｗａｂｌ　ｅｔ　ｍｌ）、ジャーナル ・サブ・ヌクレイ・ツク・メディシン（ＪＪｕｃｌ、Ｍｅｄ、）２４　：　３１ ６〜３２５　（１９８３）　）。

本発明の抗体は種々の方法のうちいずれによっても調製できる。

例えば、ＧＡＰ−４３蛋白、またはその機能性誘導体を発現する細胞は、ＧＡＰ −４３を結合できる多クローン抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物 に投与できる。

最も好ましい方法では、本発明の抗体は単クローン抗体である。

かかる単クローン抗体はハイブリドーマ技術を用いて調製できる（コーラ−ら（ Ｋｏｈ）ｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）２旦旦：４９５（ １９７５）；コーラ−ら（ＩＩ：ｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ニーロビーアン・ ジャーナル・サブ・イミ二ノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、　ｌａ＊ｕｎｏ１．）６　： 　５１１　（１９７６）：コーラーらＣＫｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ユーロピ ーア７−ジャーナル・サブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、　ｌ能ｕｎｏ１．） ８　：　２９２（１９７６）：ハマーリングら（Ｈａ關ｅｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａ ｌ）、モノクローナル・アンテイボディズ・アンド・ティーセル・ハイブリドー マズ□１ｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈ ｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、エルセピエやエヌ争ワイ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎ、　 Ｙ、　）、５６３〜６８１頁（１９８１））。一般に、かかる手法はＧＡＰ−４ ３抗原での動物の免疫化を含む。かかる動物の胛臓細胞を抽出し、適当な骨Ｈ肺 細胞系と融合させる。いずれの適当な骨髄腫細胞系も本発明で用いることができ る。融合の後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持し、 次いで、ワンズ・ジェイ・アールら（Ｗａｎｄｓ、Ｊ、Ｒ，、ａｔ　ａｌ）　（ ガストロエンテロロジー（Ｇａｇｔｒｃｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）且：　２２５〜 ２３２　（１９８１）によって記載されているごとき限界希釈法によってクロー ン化する。

次いで、かかる選択により得られたハイブリドーマ細胞を検定してＧＡＰ−４３ 抗原を結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。

本発明の抗体は、フォーフード（ｆｏｒｖａｒｄ）サンドイッチ、リバース（ｒ ｅｖｅｒｓｅ）サンドイッチ、シマルテイニアス（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ） サンドイッチアッセイのごときイムノメトリックアッセイまたは「サンドイッチ 」アッセイを包含する当該分野で公知の標準的な免疫診断アッセイで用いるのに よく適合する。本発明の抗体は、当業者が、ＧＡＰ−４３抗原またはその同等物 についての許容される特異性、感受性、および正確性の免疫アッセイを行ために 不都合な実験を行うことなく決定できるごとく、いずれの数の組み合わせで用い ることもできる。

免疫学の一般的原理に関する標準的な文献は、クライン・ジエイ（Ｋｌｅｉｎ　 、　Ｊ、　）、イミュ／ロジー：ザ・サイエンス・サブ・セルフ−ノンセルフ・ ディスクリミネーシヨン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：　Ｔｈｅ　５ｃｉｅｎｃｅｏ ｒ　５ｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ　Ｄｉｓｃｒｉ＋ｍ１ｎａｔｉｏｎ）、ジオン・ ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、出版者、 二ニーヨーク（１９８２）；ケネノト・アールら（Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｒ，、ｅ ｔ　ａｌ）編、モノクローナル・アンティボディズ、ハイブリドーマニア・二ニ ー・ディメンション・イン・バイオロジカル・アナリシーズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ ａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ　Ｎｅｖ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ）、ブレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｓ　Ｐｒｅｓｓ） 、出版者、二ニーヨーク（１９８０）、ブルドン・アールら（Ｂｕｒｄｏｎ、　 Ｒ，、ｅｔ　ａｌ）Ｉｉ、ラボラトリ−・テクニックス・イン・バイオケミスト リー・アンド・モレキユラー・バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１３巻、エルセビエ（Ｅｌｓｓｖｉｅｒ）、出版者、アムス テルダム（１９８４）、中のカンベル・エイ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａ、）、「モ ノクローナル・アンティボディ・テクノロジー（輩ｏｎｏｅｌｏｎａｌ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を包含する。

「検出する」とは、物質の存在または不存在を測定すること、および物質の量を 定量することを包含するものとする。かくして、該語は、定量的および定性的測 定についての本発明の物質、組成物、および方法の使用をいう。

本明細書中に記載したのと同一の特異性の単クローン抗体を分泌する他のハイブ リドーマの単離は、抗−イディオタイプスクリーニングの技術によって達成でき る。ポトスミャノクら（Ｐｏｔｏｃｍｊａｋ。

ｅｔ　ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２上５　：　１６３７　（１９ Ｂ２）、簡単に言えば、抗−イディオタイプ抗体は注目するクローンによって産 生された抗体上に存在する唯一の決定基を認識する抗体である。

該抗−イディオタイプ抗体は、単クローン抗体の源として用いるのと同一の株の 動物を注目する単クローン抗体で免疫化することによって調製される。免疫化さ れた動物は、これらのイディオタイプ決定基（抗−イディオタイプ抗体）に対す る抗体を産生ずることによって、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、 それに応答するであろう。単一クローンによって産生された単クローン抗体につ いて特異的な、第２の動物の抗−イディオタイプ抗体を用いることによって、免 疫化に用いた他のクローンを同定することができる。２のクローンの産物のイデ ィオタイプの同一性は、２のクローンが同一のエピトープ決定基のそれらの認識 に関して同一であることを示す。また、抗−イディオタイプ抗体を「免疫原」と して用いてさらにもう１つの動物において免疫応答を誘導し、元のＭＡｂに対し てエピトープ的に同一である、いわゆる抵−イディオタイプ抗体を産生させるこ とができる。かくして、単クローン抗体のエピトープ決定基に対する抗体を用い ることによって、同一のエピトープ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定 することができる。抗体において、イディオタイプ決定基は所与のエピトープに 結合する超可変領域に存在する。

従って、本発明の単クローン抗体を用いてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスのごと き適当な動物において抗−イディオタイプＡｂｓを誘導することができる。これ らの動物からの肺臓細胞を用いて抗−イディオタイプハイブリドーマ細胞系を産 生ずる。ＫＬＨにカフプリングした単りローン抗−イディオタイプＡｂｓを「免 疫原」として用いてＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを免疫化する。これらのマウス からの血清は、占められたエピトープについて特異的な元のＡｂの結合特性を有 する抗抗−イディオタイブＡ　ｂ　ｓを含有するであろう。かくして、抗−イデ ィオタイプＭＡｂｓは評価されるべきエピト−プと構造的に同様なイディオタイ プ抗原決定基を有する。

複製については、ハイブリッド細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ双 方にて培養することができる。高ｉｎ　ｖｉｖｏ産生はこれを現在最も好ましい 培養方法とする。略言すれば、個々のハイブリッド株からの細胞をブリスタンで 初回抗原攻撃を受けたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに腹腔内投与して、高濃度 の所望の単クローン抗体を含有する腹水液を産生させる。アイソタイプＩｇＭま たはＩｇＧの単クローン抗体は当業者によく知られたカラムクロマトグラフィー 法を用い、培養上澄みから精製することができる。

本発明の抗体は、それを液相で用いることができるか、または固相担体に結合さ せることができる免疫アッセイで用いるのに特に適している。加えて、これらの 免疫アッセイにおける抗体は種々の方法で検出可能に標識することができる。

当該分野では、多くの異なる標識および標識法がある。本発明で用いることがで きる標識のタイプ例は、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、ケミルミネッセン ス化合物、生物ルミネッセンス化合物および金属キレートを包含するが、それら に限定されるものではない。当業者ならば、抗体に結合させる他の適当な標識を 知っているであろうし、ルーチン的な実験の使用によってそれを確認することが できるであろう。さらに、これらの標識の抗体への結合は当業者に通常知られた 標準的な技術を用いて達成できる。

本発明の抗体を検出可能に標識できる方法の１つは、抗体を酵素に結合させるこ とによる。後でその基質に暴露した場合、この酵素は、例えば１８分光的または 蛍光光度的手段によっ°ζ検出できる化学基を生じるように基質と反応するであ ろう。本発明の抗体を検出可能に標識できる酵素の例はリンゴ酸デヒドロゲナー ゼ、スタフィロコッカス・ヌクレアーゼ、デルタ−■−ステロイドイソメラーゼ 、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセリンリン酸デヒドロゲナ ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチン−アビジンペルオキシダーゼ、 ホースラディンユペルオキンダーセ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナー ゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、 ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−■１−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、 グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを包含する。

また、本発明の検出可能に標識した抗体の存在は、ガンマカウンターまたは／ン チレーションカウンターの使用のごとき手段によって測定できる放射能活性アイ ソトープで抗体を標識することによって検出できる。本発明の目的に特に有用な アイソトープは、３Ｈ１＋１５夏、、ｆｉｔｐ、　３５３．１４ｃ、　ｌｌＩｃ 　ｒ、　３ｍ（：、、Ｑ　、　６７ＣＯ１”Ｃｏ　。

５＠Ｆｅおよび７ＳＳｅである。

また、抗体を蛍光化合物で標識することによって、本発明の検出可能に標識した 抗体の結合を検出することができる。蛍光的に標識した抗体を適当な波長の光に 暴露すると、染料の蛍光のため、その存在か検出できる。最も普通に使用される 蛍光標識化合物の中には、フルオロセイン、イソチオ／アネート、ローダミン、 紅藻素、藻青紫、アロフィコ／アニン、０−フタロアルデヒドおよびフルオレス カミンがある。

また、本発明の抗体は＋５′Ｅｕ、または他のランタノイド系列のごとき蛍光を 発する金属を用いて、検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエ チレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ ）のごとき金属キレート基を用いて抗体分子に結合させることができる。

また、本発明の抗体は、それをケミルミネッセンス化合物にカップリングさせる ことによって検出可能に標識することができる。次いで、ケミルミネッセンス− 標識抗体の存在は、化学反応の間に生じるルミネッセンスの存在を検出すること によって決定できる。特に有用なケミルミネノセ／ス標識化合物の例は、ルミナ ール、イソルミナール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔ　ｉｃ）アクリジニウ ムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルであ る。

同様に、生物ルミネッセンス化合物を用いて本発明の抗体を標識することができ る。生物ルミネッセンスは、触媒蛋白がケミルミネッセンス反応の効率を増加さ せる生物学系で見い出されるタイプのケミルミネッセンスである。生物ルミネッ センス抗体の存在はルミネ。

センスの存在を検出することによって決定される。標識の目的のための重要な生 物ルミネッセンス化合物はルシフェリン、ル／フェラーゼおよびエクオリンを包 含する。

本発明の抗体および実質的に精製された抗原は、理想的には、キ・ノドの調製に 適する。かかるキットは、バイアル、試験官等のごとき１個またはそれ以上の容 器手段を閉じた区画に収容するように仕切った担体手段よりなり、該容器手段の 各々は用いるべきアッセイの別々の要素よりなる。

キット形態に一体化できるアッセイのタイプは多くあり、例えば、競合アッセイ および非競合アッセイを包含する。本発明の抗体を利用できるアッセイの典型的 な例はラジオイムノア、セイ（ＲＩ　Ａ）、酵素イム／アッセイ（ＥＩＡ）、免 疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）、イムノメトリック、またはサントイ・ノチ、イムノア ッセイである。

「イムノメトリックアッセイ」または「サンドイッチイムノアッセイ」なる語と は、シマルテイニアス（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）サンドイッチ、フォーワー ド（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチおよびリノイース（ｒｅｖｅｒｓｅ）サンド イッチイムノアッセイを包含するものとする。これらの語は当業者に十分理解さ れるであろう。また、当業者ならば、本発明の抗体は他の変法および現在公知で あるまたは将来開発されるであろうアッセイ形態において有用であごとを理解す るであろう。これらは本発明の範囲内に包含されるものとする。

フォーワード・サンドイッチ・アッセイは、例えば、米国特許第３８６７５１７ 号；第４０１２２９４号および第４３７６１１０号に記載されている。リバース ・サンドイッチ・アッセイは、例えば、米国特許第４０９８８７６号および第４ ３７６１１０号に記載されている。

当該アッセイを実行する好ましい態様においては、ある種の「遮断薬（ｂｌｏｃ ｋｅｒ）Ｊをインキニベーション媒質に存在させることが重要である（通常、標 識した可溶抗体と共に添加する）。該「遮断薬」を添加して、非特異的蛋白類、 プロテアーゼ、または実験試料中に存在するマウス免疫グロブリンに対するヒト 抗体が、固相支持体上の抗体、または放射能標識した抗体を架橋させたりそれを 破壊して誤った陽性結果または誤った陰性結果を生じないことを確認する。

従って、「遮断薬」の選択は、本発明で記載したアッセイの特異性を実質的に増 加させる。

アッセイで用いるものと同一のクラスまたはサブクラス（アイソタイプ）の多数 の無関係ない（すなわち、非特異的）抗体（例えば、Ｉ　ｇ　Ｇ　ｒ、ＩｇＧ、 、、ＩｇＭ等）を「遮断薬」として用いることができる。適当な感度を維持し、 ヒト血清中で交差反応性蛋白を相互に生じることによる望まない干渉を抑制する には、「遮断薬」の濃度（通常１〜１００マイクログラム／マイクロリツトル） が重要である。

加えて、「遮断薬」を含有する緩衝液系は最適化されることを要する。好ましい 緩衝液は、生理学的ｐＨ範囲におけるイミダゾール、ＨＥＰＰＳ、ＭＯＰＳ、Ｔ ＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳＳ　ＨＥＰＥＳ。

ＰＴＰＥＳ、ＴＲ１Ｓ等のごとき弱有機酸をベースとするものである。幾分かは 好ましくない緩衝液は、リン酸塩、ホウ酸塩または炭酸塩のごとき無機緩衝液で ある。最終的には、公知のプロテアーゼ阻害剤を、「遮断薬」を含有する緩衝液 に（通常０．０１〜１０マイクログラム／ｍＱで）添加すべきである。

これまでに使用されてきた、および本発明で用いることができる多くの固相免疫 吸着剤がある。よく知られた公知の免疫吸着剤は、チニーブ、ビーズの形態のガ ラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロンおよび他の材料 、およびかかる材料から形成したまたはそれで被覆したマイクロタイタープレー トを包含する。

固定化抗体は、アミドまたはエステル結合を介する共有結合のごとき技術、ある いは吸着によって、固相免疫吸着剤に共有結合によりまたは物理的に結合させる ことができる。当業者ならば、多くの適当な固相免疫吸着剤およびその上に抗体 を固定化する方法を知っているであろうし、ルーチン的な実験を用いるだけで、 それを確認することかできるであろう。

ｉｎ　ｖｉｖｏ、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　５ｉｔｕ診断については、放 射性核種のごとき標識を、直接的にまたは媒介官能基を用いることによって、本 発明の抗体に結合させることができる。金属カチオンとして存在する放射性同位 元素を抗体に結合させるのにしばしば用いる媒介基はジエチレントリアミン四酢 酸（ＤＴＰＡ）である。このようにして結合される金属チオンの典型的な例は＝ ８＠ｓＴＣ，Ｉｔｓ　１、ＩＩＩＩＮ。

ＩＩＩ　１１・’Ｒｕ、”Ｃｕ、”Ｇａおよび６ＩＧａである。また、本発明の 抗体は診断目的の非放射性同位元素で標識することもできる。

この方法で特に有用な元素は＋５７０　ｄ　％”Ｍ　ｎ　、　”！Ｄｙ、”Ｃｒ および５１１Ｆｅである。

また、本発明の抗体は、本発明の抗体と反応性のエピトープを伴うＧＡＰ−４３ 抗原を発現する良性または癌性新形成のごとき障害を有するヒトを包含する動物 において免疫療法で用いることができる。

免疫療法で用いる場合、本発明の抗体は治療剤で標識しなくても標識してもよい 。免疫療法で本発明の抗体にカップリングできる治療剤の例は、放射性同位元素 、レクチンおよびトキシンである。

レクチンは特異的糖部位に結合する、通常、植物材料から単離した蛋白である。

また、多くのレクチンは細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができる。リ ジンは免疫治療で用いられてきた毒性レクチンである。この使用は、毒性の原因 となるリジンのアルファーペプチド鎖を抗体分子に結合させ゛Ｃ毒性欠損の部位 特異的デリバリを可能とすることによって達成される。これは、例えば、ビテ。

夕ら（ｖｉｔｅＮａ　ｅｔ　ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３　Ｆ３ −　：　１０９８　（１９８７）、およびバスタンら（Ｐｓａｊａｎ　ｅｔ、　 ａｌ）、アドバ・アレルギ（Ａｄｖ、　Ａｌｌｅｒｇｙ）　４ユ°６４１　　（ １９８６）に記載されている。

トキシン類は、十分な用量であるとしばしば死に至らしめる、植物、動物または 微生物によって産生される有毒性物質である。例えば、ジフテリアトキシンはコ リネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔ ｈｅｒｉａ）によって産生される蛋白である。、二のトキシンは適当な条件下で 分離できるアルファおよびベータサブユニｌトよりなる。該トキシンのアルファ 成分は抗体に結合し、部位特異的プリパワに用いることができる。

免疫療法で用いる本発明の抗体に結合できる放射性同位元素の例は　：　　”Ｕ ｍ、　　”１．　　［ＩＯ”（、＠？Ｃｕ％Ｉ〕Ｂ　ｉ　、　　２１！Ａ　ｉ　 、　　！ｌｔｐ　ｂ１４７Ｓ　ｃおよび””Ｐｄである。

勿論、発現されたＧＡＰ−４３は１１通常、細胞膜内に閉じ込められている。従 って、当業者ならば、本発明の抗体を用いるｉｎ　ｖｉｖ。

診断法および治療法は、かかる抗体が細胞内膜上のＧＡＰ４３を検出できるメカ ニズムをいくらか必要とすることを理解するであろう。１のかかる方法は、抗体 またはその断片を細胞膜に導入するか、または細胞膜を通過させて細胞目体の中 へ導入することである。これは、例えば、樟的細胞がそれに対してレセプタ一部 位を含有するリガンドに抗体を結合させることによって達成できる。かくして、 当該抗体は、リガンドと共に細胞膜内に輸送されるか、または細胞膜を通過する ことができる。

担体リガンドの選択は、当業者に理解されるごとく・、いくつかの因子に依存す る。これらは、例えばリガンドお誹ひそのレセプターの、および受動または能動 を含む全輸送の速度論を含み、活性化されて輸送されるリガントか好ましい。ま た、抗体をリガンドに結合させる手段は制限内で変化し、例えば、共有結合また はイオン結合とすることができるか、かかる結合はりガント−レセプターの親和 性を許容されない程度に変化させるへきでないことを銘記すべきである。

かかる適用に適したレセプターの例はレセプターの飲食作用について必要な情報 をすべて含有することが示されている（ディビスら（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ） 　、ジャーナル・サブ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｊｏｌ、 ）］　０７　（６／３）　４、アブストラクト番号３１１２（＋９８８）低密度 リポ蛋白（ＬＤＬ）に対するレセプター、ならびにドーパミンについてのものの ごとき公知の脳−特異的レセプターを包含する。この点に関し、リガンドはそれ 自体で、本発明の抗体がそれに対して結合し得るレセプターに特異的な抗体また は断片となり得ることが理解されるであろう。

さらに、当業者ならば、リガンド−レセプター相互作用に干渉しないようであり 、かつ容易に細胞膜を通過し得る（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ“）、断片の ごとき）本発明の抗体断片を使用するのが特に望ましいことを見い出すであろう 。当業者に理解されるであろうごとく、−重鎖抗体がこれらのおよび他の理由で 好ましいであろう。

抗体が前記し、たごとく細胞膜内にまたは細胞内に輸送されるべき場合、抗体が ＧＡＰ−４３蛋白上のその抗原部位に結合するときに標識が比較的より効果的と なるようｉこ診断または治療に際して抗体をｔｌＬａするのが好ましいであろう 。これは、例えば、抗原−抗体コンプレックスの形成の結果、活性または検出可 能となる標識を使用することによって達成できる。別法として、抗原−抗体コン プレックスの形成が抗体のフンフォメーションの変化を誘導してまだ暴露されて いないまたは十分には暴露されていない標識を暴露したりまたは十分に暴露する ように抗体自体を標識することができる。前記基準およびその他のすべては本発 明のこれらの態様を実施するに際し当業者に明らかであろう。

また、本１発明の抗体を有するリポソームをそれらの膜内で利用して当該抗体を 標的領域に特異的に輸送することもできる。これらのリポソームは、それらが、 当該抗体以外に、標的部位で放出されるであろう薬剤、放射性同位元素、レクチ ンおよびトキンンのごとき免疫療法剤を含有するように製造することができる。

抗体、および好ましくはＧＡＰ−４３をコード付けするヌクレオチド配列（およ びその機能的および化学的誘導体）を診断または治療目的で神経細胞に導入する もう１つの好ましい方法は、レトロウィルスを包含するウィルスベクターの使用 による。適当なウィルスの例として、種々のヘルペスウィルスを挙げることがで きる。適当なウィルスは、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）を包含する。他 の適当なウィルスおよびレトロウィルスは当業者によく知られている。哺乳動物 細胞に遺伝子を導入するためにウィルスベクターを使用することは、例えば、パ ルマス（Ｖａｒｍｕｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｅｇｌｉｔｉｓ　ｅｔ 　ｓｌ）、バイオテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｂｎｉｑｕｅｓ）６．　７　：　 ６０８（１９５８）；シニーニノシ−Ｌ　（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）サンエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）２４０　（４８５８）：１４６８　（１９８８）：およびベルン シニタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　、ジェ不テックス・エンジ ニアリング・二ニーズ（Ｇｅｎｅｔ、　Ｅｎｇ、　）　（Ｎ、　Ｙ、　）ユニ２ ３５　（１９８５）で総括されている。

本発明の目的では、弱毒化したウィルスまたはレトロウィルス株を使用するのが 好ましいでろう。かくして、例えば、本発明の抗体またはＤＮＡ配列のためのベ クターとして、ＣＤ４−依存メカニズム（フンヶら（Ｆｕｎｋｅ　ｅｔ　ａｌ） 　、ジャーナル・サブ・エクスペリメよって神経細胞に侵入するＨＩＶ　　２ｓ ｔ（コンブら（Ｋｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ）。

サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０　（４８５８）　　：　ｌ　５２５　（１ ９８Ｂ））またはＨＩ　Ｖ　　２ｏｃｌ（エバンズら（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０　（４８５Ｂ）：　１５２３　（１９ ８８））のごとき弱毒化細胞変性（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）を有するレト ロウィルスを用いることができる。ＨＩＶ感染の神経生物学は、例えば、ション スンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）、エフ・エイ・ニス・イー・ビイ・ンヤ ーナル（ＦＡＳＥＢ　Ｊ、）、　　２　（１４）　　：　２９７０　（１９８８ ）に記載されている。

当業者ならば、ルーチン的技量の努力によって、ウィルスに対し公知の感受性を 有する異なる神経集団を標的とすることができるであろう。例えば、ＣＤ４はヒ ト脳において変異転写体を有することが知られており、前脳で含有量が最大であ る（マトンら（Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）４ユニ　３３３　 （１９８６）。

理想的には、遺伝子デリバリ系の選択は、組織に適した方法により、遺伝子の発 現が適当なレベルであっていずれの逆効果もなく、効果的かつ安定な遺伝子移送 の目的を銘記しつつ、当業者によってなされるであろう。例えば、ウォルフら（ ＷｏｌｆＴ　ｅｔ　ａｌ）　、リニーム・ディス・タリノ・ノース・アム（Ｒｈ ｅｕｍ、Ｄｉｓ、Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、）１４　（２）：４５９　（１ ９８８）参照。中枢神経系標的へのデリバリに関しては、ＨＩＶを包含する多く のウィルスベクターが血液脳関門を通過できる利点を提供する（ジランスンら（ Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）、エフ・エイ・ニス・イー・ビイ・ンヤーナル（ ＦＡＳＥＢ　Ｊ、）２　（１４）：　２９７０　　（１９８８））。

標識したプローブを用いるラノ）ＧＡＰ　　４３の単離について前記した方法に 従い、Ｇ　Ａ　Ｐ−４３をコート付けするＤＮＡ配列、またはその断片をＤＮＡ プローブとして用いて、ヒトにおける対応抗原を単離することかできる。次いで 、ヒト抗原遺伝子をクローン化し、宿主で発現させてヒト抗原を得ることができ る。次いで、このヒト抗原を、対応する自己抗体についての、およびヒトを包含 する動物の治療処置についての診断アッセイで用いることができる。

本発明者らは、ＧＡＰ−４３遺伝子の発現を制御する調節メカニズムを明らかに すべく設計した実験を行った。ＧＡＰ−４３発現の変調は、中枢神経または末梢 神経組織の損傷、疾患または機能障害に罹ったヒトを包含する哺乳動物を治療処 置できる便利で効果的な方法を提供する。さらに、本発明による、ヒトを包含す る哺乳動物における通常の中枢または末梢神経組織で構造再編成を変調する方法 は、ニューロンの構造および機能のメカニズムをさらに明らかにする点で当業者 にとって大いに役立つであろう。

神経学的病気または障害の治療における本発明の前臨床治療的使用または臨床治 療的使用は、診断および処置の許容される原理を用いて、当業者により最善に達 成されるであろう。かかる原理は当該分野で公知であり、例えば、ピータースド ルフ・アール・シイら（Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ、Ｒ，Ｇ、　ｅｔ　ａｌ）編、ハ リスンズ・ブリンシプル・サブ・インターナル・メディシン（）Ｉａｒｒｉｓｏ ｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｒ　ＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）、 第１０版、マグロ−ヒル（ＭｅＧｒａｗ−Ｈｉ　１１）、出版者、ニューヨーク 、ニューヨーク州（１９８３）、特にその文献のバートＡ１セフシラン】１の「 中枢神経系の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｏｆｔ、ｈｅ　ＣｅｎｔｒａｌＮｅｒ νｏｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）Ｊなる標題の部分に記載されている。

本発明の抗原、抗体および組成物、またはそれらの機能的誘導体は医薬組成物の 調製によく適合する。本発明の医薬組成物は、本発明の化合物の有用な効果を享 受できるいずれの動物に投与することもできる。かかる動物の中で第１にはヒト であるが、本発明はそのように限定されるものではない。

本発明の医薬組成物はその意図する目的を達成するいずれの手段によって投与す ることもできる。例えば、投与は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮 、またはバッカル経路によって投与できる。別法として、または同時に、投与は 経口経路によって行うことができる。投与すべき用量は受容者の年令、健康、お よび体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、および所望する効果の性 質に依存する。

薬理学的に活性な化合物に加え、新しい医薬製剤には、活性化合物を医薬に使用 できる製剤中に入れて加工するのを容易とする賦形剤および添加剤よりなる適当 な医薬上許容される担体を含有させることができる。好ましくは、製剤、特に錠 剤、糖衣錠、およびカプセル剤のごとき経口投与できる製剤および好ましい投与 タイプで用いることができる製剤、および生薬のごとき直腸投与できる製剤、な らびに注射による投与に適した液剤には、賦形剤と共に、活性化合物約０．００ １ないし約９９パーント、好ましくは約０．０１ないし約９５パーセントを含有 させる。

本発明の組成物投与だめの用量範囲は所望の効果を生じるのに十分な程大であり 、それにより、例えば、膿瘍性組織は減少するか排除されあるいは改善される。

用量は、望まない交差反応、アナフィラキンー反応等の逆効果を引き起こすほど 大であって１才ならない。

一般に、用量は患者の年令、状態、性及び病気の程度により変化する。逆兆候（ ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、もしあれば、免疫寛容および他の変数 もまた適切な用量に影響するであろう。抗体は注射または時間をかけての徐々に 行う大量注入（ｐｒｏｆ　ｕｓ　ｉ　ｏｎ）によって非経口投与できる。また、 本発明の抗体は静脈内、イントラバレントラリ（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａ ｌｌｙ）、筋肉内または皮下投与できる。

本発明の医薬製剤は、それ自体公知の方法、例えば、通常の混合、顆粒化、糖衣 作成、溶解、凍結乾燥工程によって製造できる。かくして、経口使用のための医 薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と合し、所望により、得られた混合物を粉砕 し、顆粒の混合物を加工し、所望によりまたは要すれば、適当な添加剤の添加の 後に錠剤または糖衣錠のコアを得る。

適当な賦形剤は、特に、糖類のごとき充填剤、例えばラクトースまたはスクロー ス、マンニトールまたはソルビトールｇ製物および、／またはリン酸カルシウム 、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、ならびに、例えばト ウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカント 、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチル セルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンを用いる澱粉ペー ストのごき結合剤である。所望ならば、前記澱粉およびカルボキシメチル−澱粉 、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリ ウムのごときその塩のような崩壊剤を添加することができる。添加剤は、前記し たちのすべて、流動調節剤および滑沢剤、例えば、／リカ、タルク、ステアリン 酸またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムのごときそ の塩、および／またはポリエチレングリコールである。

糖衣錠コアには、所望ならば、胃液に対して耐性の適当なコーテイポリビニルピ ロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、う、カー溶液 および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有させてもよい濃い糖溶液を用いる ことができる。胃液に対して耐性のコーティング剤を得るには、アセチルセルロ ースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートのごとき 適当なセルロース調製物の溶液を用いる。染料または色素を、例えば、同一性の ため、または活性化合物用量の組み合わせを特徴付けるために錠剤または糖衣錠 コーティングに添加することができる。

経口的に用いることができる他の医薬製剤は、ゼラチンでつくったブノシコーフ ィソト（ｐｕｓｈ−ｆ　ｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロー ルまたはソルビトールのごとき可塑剤でつくった柔軟で密封したカプセル剤を包 含する。該ブツシュ−フィツトカプセル剤には、ラクトースのごとき充填剤、澱 粉のごとき結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのご とき滑沢剤、および所望により安定剤と混合できる顆粒形態の活性化合物を含有 させることができる。ソフトカプセル剤においては、活性化合物は、好ましくは 、脂肪油または流動パラフィンのごとき適当な液体に溶解または懸濁できる。加 えて、安定剤を添加することもてきる。

経直腸的に使用できる可能な医薬製剤は、例えば、１種またはそれ以上の活性化 合物と坐薬基剤との組み合わせよりなる生薬を包含する。適当な坐薬基剤は、例 えば、天然または合成トリグリセリド、パラフィン炭化水素である。加えて、活 性化合物と基剤との組み合わせよりなるセラチン直腸カプセル剤を用いることも できる。可能な基剤は、例えば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコール 、またはパラフィン炭化水素を包含する。

非経口投与用の適当な処方は、水溶性形態、例えば水溶性塩である活性化合物の 水性溶液を包含する。加えて、適当な油性注射懸濁剤としての活性化合物の懸濁 剤を投与することができる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒクルは脂肪油、例 えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグ リセリドを包含する。水性注射懸濁剤には、懸濁剤の粘度を増加させる物質、例 えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／ま１こは デキストランを含有させることができる。所望により、該懸濁剤には安定剤を含 有させることもできる。

本発明のＧＡＰ−４３抗原はニューロン細胞に対してユニークであり、かくして 、便利で有用なマーカーを提供する。従って、ＧＡＰ−４３に定方向化された抗 体は当業者によ（知られた種々の技術で用いてニューロン細胞を同定することが できる。さらに、本発明の抗体は新形成およびニューロン起源の他の障害の検出 、測定および治療処置を可能とし、ヒトを包含する動物において癌および他の障 害の前臨床および臨床評価および治療のための、便利で有用な１ｎｖｉｖｏ、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　５ｉｔｕ診断および治療方法を提供する。

本発明の抗原は、本発明の抗体を使用して、実質的に純粋な形態で単離できる。

かくして、本発明の具体例は実質的に純粋な抗原ＧＡＰ−４３を提供し、該抗原 は本発明の抗体によって認識されかつそれに結合する点で特徴付けられる。もう １つの具体例において、本発明は、ＧＡＰ−４３に定方向化された１種またはそ れ以上の抗体と該抗原とでコンプレックスを形成することによって、ＧＡＰ−４ ３抗原を単離しまたは精製する方法を提供する。

本発明の実質的に純粋な抗原Ｇ　Ａ　Ｐ　−４３は、脳を髄液、血清または尿の ごとき試料において対ＧＡＰ−４３抗体を検出しまたは測定するのに用いること ができる。かくして、本発明の１の具体例は、Ｇ　Ａ　Ｐ　−４，９抗原に対す る抗体を含有する試料と検出可能に標識されたＧＡＰ−４３とを接触させ、次い で該標識を検出することを特徴とする該試料中のＧＡＰ−４３抗原に対する抗体 の存在またはその量を測定する方法よりなる。ＧＡＰ−４３の免疫反応性画分お よびＧＡＰ−４３の免疫反応性同族体も用いることができることが理解されるで あろう。「免疫反応性画分」なる語は、ＧＡＰ−４３に定方向化された抗体に対 し同等の免疫応答を示すＧＡＰ−４３抗原のいずれの部分もいうものとする。「 免疫反応性同族体」なる語は、１個またはそれ以上のアミノ酸だけＧＡＰ−４３ 蛋白とは異なるが、本発明の抗体に対し同等の免疫応答を示す蛋白をいうものと する。

本発明のなおさらにもう１つの態様において、ＧＡＰ−４３蛋白は、ＧＡＰ−４ ３蛋白を細胞膜へ、特にニューロン細胞の成長円錐の領域へ定方向化する新規な 膜−ターゲノティングペブチドドメインを含有することが判明した。この膜−タ ーゲノティングドメインの構造を決定し、該ペプチドは（通常は膜連結でない） 通常は細胞質ゾルの蛋白を細胞膜へ定方向化するのに効果的なことが示された。

本発明の詳細な説明する実験は明細書の実施例■に詳細に記載する。

本発明の本態様の組成物および方法により、とりわけ、通常は膜連結でない蛋白 を含むいずれの所望の蛋白も細胞膜へ定方向化することができる。さらに、本発 明の本態様の組成物および方法は、動物における、神経学的損傷および障害のｉ ｎ　ｖｉｔｒｏＳｉｎ　ｖｉｖｏ、およびｉｎ　５ｉｔｕ治療処置で利用できる ことは明らかである。当業者ならば、診断および治療方法のこれまでの記載は本 発明の本具体例に等しく適用されることを理解するであろう。さらに、本発明の 膜−ターゲノティングベブチドはいずれの所望の蛋白またはペプチドを細胞膜へ 定方向化することにも使用され、かくして、同様に、非神経学的指標において診 断および治療で使用されることも明らかである。

かかる指標の例は、細胞の膜が免疫学的指標のごとき重要な役割を演じるいずれ の適用も包含するが、それらに限定されるものではない。

本発明を実施する態様および方法は以下の実施例を参照して当業者に十分に理解 されるだろうが、これらの実施例は、断じて、本発明の範囲または請求の範囲を 限定するものではない。

実施例■ ラットＧＡＰ−４３についてのｃＤＮＡのクローニング１７日令胎由来のラット 後板神経節のＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得、λｇｔ１１発現ベクター中 にクローニングした［ヒュイン７　（Ｈｕｙｎｈ）　ラ、ｒ　ティーエヌエー・ クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ 　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ、　Ａｐｐｒｏａｃｈ）玉ディーｃム・グｇ−バー（Ｄ、 　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ）編（アイアールエル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、 ワシントン・ディー・シー、１９ｇ５）　ｐｐ、４９−７８１゜３つの推定ＧＡ Ｐ−４３クローンを、スナイプス（Ｓｎｉｐｅｓ）らのＳｏｃ、　Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ、　Ａｂｓｔｒ。

いて同定した。最長クローン、ＧＡＰ４３−２の同定を、ハイブリッド選択翻訳 法によって確実とした（第１図）。ＧＡＰ４３　２は、ハイブリタイセージ９ン によって、天然ＧＡＰ−４３、すなわち約４３ｋＤの分子サイズの予測される移 動度で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中を移動するポリペプチドの翻訳を方何 付けるメツセンジャー　ＲＮ　Ａ　（ＩＩＲＮ　Ａ　）を選択した。このｉｎ　 ｖｉｔｒｏ翻訳産物をＧＡＰ−４３に対する抗体によって選択的に免疫沈降させ た。免疫沈降の特異性は、非標識化精製ＧＡＰ−４３との競合によりて証明した 。さらに確認のために、精製したＧＡＰ〜４３の臭化シアン分解によって調製し たペプチドを配列化した。該配列、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−１１ｅは、Ｇ ＡＰ４３−２の予想されたオーブンリーディングフレームの範囲内に完全に含ま れている（該Ｘは、アミノ酸の同一性が確実に決定され得ない配列決定のサイク ルを表す）。

ＧＡＰ４３−２の完全なヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を第２ 図に示す。リーディングフレームは、配列決定されたペプチドフラグメントを含 んでおり、λｇｔｌｌのβ−ガラクトンダーセ遺伝子と同一のリーディングフレ ーム中にある。［ラノ）ＧＡＰ−４３に関するｅＤＮＡは、スキｍ；（Ｊ、　Ｈ ，Ｐ、　５ｋｅｎｅ）および彼の同僚（バシ（Ｇ、Ｂａ５ｉ）、ヤコブソン（Ｒ ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、ビラグ（１，Ｖｉｒａｇ）、スキｍ；（Ｊ、　Ｈ，Ｐ、 　５ｋｅｎｅ八私信）によって独立して得られた。該配列のコピーを交換した。

本発明の予測されるアミノ酸配列は、スキｍ；（Ｊ、　Ｈ，Ｐ、　５ｋｅｎｅ） によって提供されたものと完全に一致し、ヌクレオチド配列は、３゛非翻訳領域 における１つの位置だけ相異する。］オープンリーディングフレームの開始と一 致するメチオニンは、ヌクレオチド位置１３のイン・フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍ ｅ）停止コドン（ＴＡＡ）の後の最初のメチオニンであり、真核生物の翻訳を開 始するのに最も有利な前後関係とするためにコザック（Ｋｏｚａ＆）のセル（覗 見）４４：２８３　（１９８６）によって示唆された９つのヌクレオチドコンセ ンサス配列のうちの８つによって囲まれている。これは、ＧＡＰ−４３コーデイ ング領域の最初の残基であることを示唆する。しかし、該メチオニン（アミノ酸 ５）は、この役割を果す可能性がある。ＧＡＰ−４３の予測される組成は、高極 性であり、明白な膜内外ドメインまたは可能なＮ−結合グリコシル化部位を有し ていない。この組成は、ＧＡＰ−４３が膜連結性であるが、膜浸透化なしでは抗 体認識に達しにくいという観察と一致しており［メイリ（Ｍｅｉｒｉ）ら、ＰＮ ＡＳＵＳＡ　８３：３５３７　（１９８６）］　；かくして、これは膜の内部表 面に連結しているかもしれない。

オーブンリーディングフレームからのＧＡＰ−４３蛋白の予測される分子サイズ は２４ｋＤであり、これは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の分子の見掛の 分子サイズとしてスキｍ；（Ｓｋｅｎｅ）およびウイリアード（Ｗｉｌ　１ｉａ ｒｄ）によって最初に観察された４、３ｋＤより小さい［スキｍ；（Ｓｋｅｎｅ ）およびウイリアード（Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ジャーナル・サブ・セル・バイオ ロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　８９：８６　（１９８１）、同上、ｐ、 ９６］。ＧＡＰ−４３の見掛の分子サイズはポリアクリルアミド濃度に依存する ので、該分子サイズは不確かであり［ヤコブソン（Ｊａｅｏｂｓｏｎ）ら、ジャ ーナル・サブ・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）　６：１８４３　 （１９８６）ｌ、この蛋白か、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で変則的に移 動する蛋白の節部に入ることを示唆する［バンカー（Ｂａｎｋｅｒ）ら、ジャー ナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　） 、２４７：５８５６（１９７２）　；パーソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）ら、サイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２５：６８７　（１９８４）　；スマート（Ｓｍａｒ ｔ）ら、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１１２ニア０３　（ＩＨＩ）］。

この特性は、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

翻訳産物が天然ＧＡＰ−４３の移動度と同様の移動度を有するので、翻訳後の修 飾によるとは思われない（第１図）。

推定上のオーブンリーディングフレームの範囲内でコード付けされる蛋白の５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル移動特性に関する情報を収集するために、メルトン （Ｍｅｌｔｏｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２ニア０３５ 　（１９８４）の方法によって、バクテリオファージＳＰ６　プロモーターを用 いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写系においてｃＤＮＡからＧＡＰ−４３ＲＮＡを合成 した。５ａｕ３Ａ部位、すなわち予測されるオーブンリーディングフレームの端 部の６５塩基３゛側で切断したｃＤＮＡを転写することによって８００−塩基Ｒ Ｎ　Ａを得（第２図）、ｃＤＮＡの３′末端のポリリンカル領域におけるＨｉｎ ｄｎ１部位で切断することによって１１００−塩基ＲＮＡを得た。８００−塩基 ＲＮ　Ａおよび】１ｏ〇−塩基ＲＮＡの両者は、網状赤血球溶解産物を用いＴｉ ｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳し、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル上で分析する と見掛分子サイズが４０ｋＤであるポリペプチドの合成を指令した。両方の場合 の４Ｏ−ｋＤ翻訳産物を、対ＧＡＰ−４３抗体を用いて免疫沈降した。新生児う ７）脳ＲＮＡからｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成したＧＡＰ−４３は、これらの翻訳産物 と一緒に移動した。

ＧＡＰ−４３が成長円錐の機能に対して重要であるという確信に関する証拠とし ては、成長円錐膜中の蛋白の豊富さ［メイリ（Ｍｅｉｒｉ）ける蛋白の輸送の増 大［スキｍ；（Ｓｋｅｎｅ）およびウイリアード（Ｗｉｌｌｉａｒｄ）、ジャー ナル・サブ・七ノいバイオロジー（Ｊ、　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、　）その発 現をＰＣ１２細胞において試験したが、そこて；ま神経突起の突出は神経発育因 子（ＮＧＦ）によって促進され、アテノシン３’、５’−モノホスフェート（ｃ ＡＭＰ）によってはそれ程ではなかった。これらの薬物は神経突起の突出を誘導 する際に異なった機構によって作用する［ガニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら、ジャ ーナル・サブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　８９：２４ Ｄ　（２９ｇりコ。いずれかの薬物によって誘導される神経突起成長には、ＧＡ Ｐ−４３ｍＲＮＡレベルの増加が伴い、両薬物に暴露された細胞で増加が最大で ある（第３図）。

通常の成長期間のＧＡＰ−４，３遺伝子の発現のパターンを決定するために、全 細胞性ＲＮＡを、１３日令胎、１７日令胎、新生児、および成体ラットの脳、後 板神経節、心臓、および肝臓から単離した。神経−特異的方法で、ＧＡＰ−４３ を発現させた（第４図）。全ての年令で、約１５ｏＯヌクレオチドの主要なハイ ブリダイズするバンドは、ニューロン組織中だけで見える。本発明者らはゲノミ 。

りＧＡＰ−４３遺伝子がイントロン配列を含有していることを見い出したので、 かすかな、大きい分子サイズのバンドは、スブライシングしていない前駆体分子 に対応し得る。ＧＡＰ７４３はニューロン中に位置するのでＳメイツ（Ｍｅｉｒ ｉ）ら、ＰＮＡＳ　Ｌ：ＳＡ　８３：３５３７　（１９８６）ｒ、ニューロン組 織におけるＧＡＰ−４３ｍＲＮＡは、神経膠（ダリア）の起源よりもおそらく神 経の起源であり、ＧＡＰ−４３ＲＮＡは、神経膠腫（グリオーム）細胞系Ｃ６中 では検出されなかった。

神経組織において、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの量は、発育段階によって変化する。

ピーク濃度は、用度期に生じ、末梢神経系に対し中枢神経系では若干遅延する。

発現のタイミングは、軸索成長の期間に一致する［ヤコブソン（Ｊ　ａｃｏｂｓ ｏｎ　）、ティベローブメンタル・ニューロンロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｌ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（ブレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、二ニー・ ヨーク、１９７８）］。しかし、成体神経組織中の有意な量のＧＡＰ−４３ＲＮ Ａは、用度期間よりも有意に少量ではあるが、。

ＧＡＰ−４３蛋白が成体う／ト皮質中に存続するという観察と一致している［ヤ コブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら、ジャーナル・サブ・ニューロサイエンス（Ｊ 、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　）、６：１８４３　（１９８６）］。ＧＡＰ−４３発 現の持続は、成体神経系における進行役を示唆している。ＧＡＰ−４３から電気 泳動的および抗原的に識別不可能なリン蛋白であるＢ−５０およびＦｌの特性は 、成体神経組織において評価されてきた。

これらの蛋白は、プロティンキナーゼＣ様酵素に対する基質として働き、そのリ ン酸化は、神経ペプチド、神経伝達物質、および長期相乗作用期間によって調節 される［ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら、ジャーナル・サブ’　二５−〇サ イエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）　６：１８４３　（ｔ９８６）；アロヨ（ Ａｌｏｙ□）ら、ジャーナル・サブ・二ニーロケミスドリー（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃ ｈｅｍ、）　４１：６４９　（１９８３）　；ツバイヤーズ（Ｚｗｅｉｅｒｓ） ら、Ｐｒｏｇｒ。

Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５６：４０５　（２９８２）：ｌ。成体のＧＡＰ−４３ 調節が遺伝子発現における変化によっても生じるか否かは知られていない。成熟 動物におけるＧＡＰ−４３の機能に関する１つのモデルとして、シナプス交替［ コツトマン（Ｃｏｔｍａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２５：１２ ｇ？（２９８４）ｌおよび神経末端での構造成長によって伴われる学習のような 他の神経系の「形成性の（ｐｌａｓｔｉｃ）Ｊ変化［ベイゾー（Ｂａｉ　１ｅｙ ）およびディン（Ｃｈｅｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２０：９１　 （１９８３月における進行役が挙げられる。

実施例■ 剖検時および死後１０時間以内のヒト脳組織を新しく入手した。

特定領域から得た２ｘ２ｘＯ，５ｃ寓以下の脳の細片を、ドライアイスで冷却し たインペンタン（２−メチルブタン）中でスナップ凍結し、次いで、−９０℃で 貯蔵した。これらの標本は、ｉｎ　５ｊｔｕハイブリダイゼーンヨンおよび免疫 細胞化学のために用いた。さらに、新しく、または該凍結試料から得た同〜領域 からの組織の小さい部分を、ノーザンブロノト分析めために用いた。凍結ブロッ クと直接隣接しているホルマリン−固定化、パラフィン−包埋した組織において 、通常の組織学を行った。

ｃ　Ｄ　ＮＡクローニング １日令の脳幹および７日令の小脳のｃＤＮＡライブラリー「両ライブラリー共に 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）からのものであった］からヒトＧ 、ＡＰ−４３ｃＤＮＡを単離した。これらのライブラリーを、３３Ｐ−標識化う ｙ　トＧＡＰ　　４３　ｃＤＮＡプローブでスクリーニングした［カーンズ（Ｋ ａｒｎｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３６：５９７　（１９８７） ］。

ハイブリダイゼーションは、４×標準ク工ン酸添加生理食塩水（ＳＳＣ）、０， ８×デフ　バー　）　（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ）、１０％硫酸デキストラン、４０ ％ホルムアミド、ＩＪρ当たりニシン精子ＤＮＡ　　２０μ９．７１Ｍトリス（ ＴｒｉｓＸｐＨ７，６）、１％ＳＤＳ、および１０６ｃｐ■／１１Ｑのプローブ 中、４２℃で１６時間で行った。フィルターを、オートラジオグラフィー前に、 室温で２ＸＳＳＣ，５３℃でｌＸ５ＳＣ。

次いで、再度６０℃で１ｘＳＳＣ中で、充分に洗浄した。陽性クローンをｐＧｅ ａ−３２［プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ＊ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）］およびＭ ］３ｓｐ１Ｂの両方の中で継代クローンし、鎖成長停止反応方法［サンガー（Ｓ ａｎｇｅｒ）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・ サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ。

二バー／ティー・サブ・ライスコンシン・ジエネティクス・コンピューター・グ ループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 　ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）ｌソフトウェアパッケージによってＤＮＡ配列 を分析した。

ノーザンブロノト分析 チオシアン酸グアニジン法［チャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ）ら、バイオケ ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８：５２９４　（１９７９）コに よって剖検したヒト組織から全細胞ＲＮＡを単離した。ノーザンブロノトのため に、各組織からの全ＲＮＡ　１０μ９を変性し、１．２％アガロース−ホルムア ルデヒドゲルで泳動させ、１ＯｘＳＳＣ中、シーンスクリーン（Ｇｅｎｅｓｃｒ ｅｅｎ）　［二ニー・イングランド・ニニークリア（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮ ｕｃ］ｅａｒ）コまたはナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）ＩＩニス・アンド・ニス（ Ｓ　＆　Ｓ）コに移し、紫外線架橋させ、任意に準備した「ファインバーブ（Ｆ ｅｉｎｂｅｒｇ）およびホーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）、アナリテ ィカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｅＩｌ、）　１３２：６　 （１９８３）］］ヒトＧＡＰ−４３ｃＤＮＡクローンＣ１と一緒に４２°Ｃで一 晩ハイブリダイズした。最後にフィルターを、６０℃で、０，１％ＳＤＳで１ｘ ｓｓｃに洗浄した。Ｃ１ａでプローブした後、フィルターを細片化し、対照とし てラットグリセルアルデヒド−３−ホスフェートーデヒドロゲナーセ（ＧＡＰＤ Ｈ）ｃＤＮＡ　プローブ［ビーチャフライクヒト脳組織の低温槽切片標本を４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、０．３％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　− １００で処理し、次いで１μ９／＊Ｑブロテイナーゼにで処理し、アセチル化し 、５０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ中でプレハイブリダイズした。５０℃で５時 間、湿気のあるチャンバー中、スライド当たり２　Ｘ　１０”ｃｐｍの３ＳＳ− 標識化アンチセンスまたはセンスツボプローブ［メルトン（Ｍｅｌ　ｔｏｎ）ら 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２ニア０３５　（１９８４）ｌを 用いてハイブリダイゼーシヨンを行った。次いで、組織切片標本を、最初に５０ ％０％ホルムアミドラしており、次いで５０％ホルムアミド＋０．１％トリトン （Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　Ｘ　１００を含有している１０ｘＭジチオトレイトールを 有する２ＸＳ　ＳＣ中で洗浄した。５０ｔ１９／ＭＱ　ＲＮＡａｓｅ　Ａで処理 することによって、−重鎖ＲＮＡを取り出した。該切片標本を、さらに２時間、 １＋ＭＤＴＴを有する２ＸＳＳＣ中で洗浄［５、次いで、０．３Ｍ酢酸アンモニ ウムを含有する標準アルコーノ喧ｇｒａｄｅｄａｌｃｏｈｏｌｓ）によって脱水 した。ＮＴＢ２コダック（Ｋｏｄａｋ）エマルジョンを用いて、放射能活性信号 を検出した。エマルジョン塗布したスライドをヘマトキシリンで対比染色した。

残玉 ヒトＧＡＰ−４３はマウスカルモジュリン結合タンパクと相同で実施例１に記載 のとおり、ラン）ＧＡＰ−４３に関するｃＤＮＡをクローンし、プローブとし− Ｃ用いて、ヒト脳幹および小脳ライブラリー由来の関連するｃＤＮＡ　　クロー ンを同定した。各ライブラリーから重複しているクローンが得られ、これらは重 複領域中で一致していた。最長クローンの配列（小脳ライブラリー由来Ｃ１ａ） を第５図Ａに示し、第５図ＢにおいてラットＧＡＰ　　４３との比較を示した。

Ｐ−５７と称する神経特異性マウスカルモジニリン結合タンパクとＧＡＰ−４３ との同一性は、ンムラー（Ｃｉｍｌｅｒ）らのジャーナル・サブ・バイオロジカ ／ｌ、−ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６２：１２１５ｇ　（ １９８７）によって開示されたので、第５図Ｂにおいて配列を示す。Ｐ−５７は 、カルシウムレベルが土がるとカルモジュリンを結合するよりもむしろ放出する という例外的な特性を有する神経特異性カルモジュリン結合蛋白として開示され ている［アンドリーセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉ ｏｃｈｅｉｉｓｌ、ｒｙ）　２２：４６１５　（１９８３月。該蛋白は、ヒト、 ラットおよびマウスの間でかなり維持されている。例えば、ヒトおよびマウス間 のアミノ酸の同一性は８９％である。さらに、第５図Ｃに示す２つの効果的に望 ましいステム−ループ構造を含む３゛−非翻訳領域間の維持は異常に高く（８０ ％）、これは、他の遺伝子との類似性によって、メツセンジャーＲＮＡ安定性を 調節するのに役立つ［リーベス（Ｒｅｅｖｅｓ）ら、プロシーディンゲス・サブ ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８３：３２２ｇ　（１９８６）　； シｗ　−（Ｓｈａｍ）およびカメン（Ｋａｍｅｎ）、七ル（Ｃｅｌｌ）　４６： ６５９　（１９８６）コ。

Ｇ　Ａ　Ｐ　−４３発現は成人ヒト脳の孤立性領域において持続するＲＮＡ分解 を最小にするために、死後１ｏ時間以下の患者から脳組織を得た。隣接する切片 標本を組織病理学的に試験した。８日令および１力月令の２乳児において、／− ザーンブロノトによって評価すると、脳の至る所でＧＡＰ−４３が均一に健全に 発現されていた。試験した領域は、小脳、側頭皮質、側頭連合皮質、前頭皮質、 眼窩前頭皮質［野（Ａｒｅａ）　１１　］、海馬、視覚皮質（野１７／１８）、 およびを髄を含んでおり、幾つかの例を第６図に示す。これらの令では、脳に対 して、を髄のレベルは低く、これは、この領域の早期成熟に関連し得る［アナン ド（Ａｎａｎｄ）およびヒキ（Ｈｉｋｅｙ）、ニュー・イングランド・ジャーナ ル・サブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｙ＋ｇ１．ＪＪｅｄ、）　３１７：１３２１ 　（１９８７）］。ＧＡＰ−４３は１．新生児または成人のいずれにおいても試 験された如何なる非ニューロン組織（腎臓、肺、肝臓および副腎を含む）におい ても発現されなかった。正常な成人脳において、ＧＡＰ−４３発現は、様々な領 域間で顕著に変化した。例えば、３一つの脳において、ブロードマン野１１（眼 窩前頭口）では、新生児に匹敵するレベルが見られ、視覚皮質（野１７／１　Ｂ ）では非常に低いレベルで発現した。海馬では、一致して低いレベルであった。

成体ラット海馬は、ＧＡＰ−４３に富んでいるので、後者は興味深いものである 。同様の分布がネベイ（Ｎｅｗ６）のＭｏ１ｅｃ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２： １７７　（１死前１０〜１４日に生じた小さい臨床的無症状梗塞（ｓｅａｌ　１ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ　５ｉｌｅｎｔ　１ｎｆａｒｃｔｓ）を有する２人の患者 からの脳組織を試験した。これらの亜急性梗塞を特徴付ける組織病理学的特徴と しては、以下のものが挙げられる：［１］梗塞形成組織と無傷組織との間の鮮明 なデリニエーシヲン；　［２］ニコーロンの喪失；［３］単核炎症細胞とリンー 積載マクロファージによる壊死組織の浸潤；および［４］梗塞の縁に沿った線維 性星状細胞の活性化。ある−人の患者は、視覚皮質（野１７）に梗塞があり、他 の患者には、頭頂葉（野３、Ｉ、２．５）に梗塞があった。該組織をノーザーン 分析に用い、穂」１四ハイブリダイゼーシヨンは、梗塞形成組織および同一のブ ロードマン野からの周囲の正常な脳の両方を含んだ。第７図Ａは、野】７１；お ける発作の後、ＧＡＰ−４３発現が、成人においてＧＡＰ−４３が通常量も富ん でいる領域である野１１に匹敵するレベルまで増加することを示す。第７図Ｂは 、２つの正常な脳からの野３、ｌ、２．５におけるＧＡＰ−４３レベル（レーン １および２）がその場所で小さな発作を有する別の患者（レーン３）と比較して 低かったことを示す。これらの観察は、ＧＡｐ−４３が虚血性梗塞後、数日以内 増加することを示唆する。

上述のとおり、ＧＡＰ−４３は、その発現においてニー−ロン制限され、二ニー ロンは梗塞した領域には存在しないので（第８図Ａ１、Ｂ）、おそらく、ＧＡＰ −４３発現の増加は形態学的に無傷の二ニーワンから誘導されたのであろう。こ の仮説を試験するために、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンを用いて、梗 塞形成領域におけるＧＡＰ−４３発現の分布を研究した。ＧＡＰ−４３発現の詳 細な細胞解剖学を実施例３に記載する。ノーザーン分析から予想されるように、 視覚皮質（野１７）を含んでいる成人大脳皮質のほとんどの領域の全体にわたっ て、ＧＡＰ−４３を発現した細胞がほんの少しだけ散乱していた（第８図Ｃ）。

率直に言って、壊死領域はアンチセンスおよびセンスプローブの両方と非特異的 に結合したが、視覚皮質の梗塞領域において、特異的なＧＡＰ−４３発現は見ら れなかった（第８図Ｄ、第８図Ｇ）。他方、隣接する形態学的に正常な野１７（ 第８図Ａ２）において、本質的に、全ての二ニーロンがＧＡＰ−４３発現を明示 しく第８図Ｅ、第８図Ｆ）、梗塞した組織と隣接する領域が増加したＧＡＰ−４ ３発現の起源であることを確認した。

ＧＡＰ−４３発現による梗塞を伴わない一時的虚血の影響も吟味した。大脳皮質 および海馬のンマーセクター（Ｓａ１１ｇｅｔ’ｓ　５ｅｃｔｏｒ）のような脳 のある領域における二ニーロンは、特に潅流低下による場合、虚血性および低酸 素発作に対して選択的に傷つき易いことを証明する［ブリアーリー（Ｂｒｉｅｒ ｌｅｙ）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）、グリーンフィールズ一二二一りバソ ロジー（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ’ｓ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第４版 、アダムス（Ｊ、　Ｈ，Ａｄａｍｓ）、コーセリス（Ｃｏｒｓｅｌ　Ｉ　ｉｓ、 　Ｊ、　Ａ、　Ｎ、　）、（Ｅｄｖａｒｄ　Ａｒｎｏｌｄ）、ロンドン、１９８ ４、ｐｐ、　１２５−１５６’、。このタイプの損傷は一時的なものであり、数 週間以内で完全な回復が起こり得る。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリグイゼーシヨンを用いて、全無酸素症を付随した心拍停 止をした一人の患者の大脳皮質を試験した。該患者は数日後に死亡し、剖検で、 梗塞を伴わない無酸素性脳障害の形跡があった。

これは、散乱した多数の核濃縮（暗く縮んだ）ニー−ロンまたは水腫（膨張した ）二ニーロンの存在ならびに大脳皮質、海馬および小脳における神経網の空胞形 成によって証明された。小脳において、虚血性プルキンエ細胞は、水腫性であり 、無色であった。第９図Ｂに示すとおり、小脳において、主に、正常な成人にお いてｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヲンによって検出可能なＧＡＰ−４３発 現を伴わないことがわかった領域であるプルキンエ細胞層において、ＧＡＰ−４ ３発現の著しい増強があった（第９図Ａ）。

界察 成長円錐は、神経を発育および再生させることによって分けられた神経末端構造 である［例えば、レイセン・イ・カジャル（Ｒａｉ＋ｏｎ　ｙＣａｊａｌ）、ｒ デジェ不し−ション・アンド・リジェネレーション・イブ９ザ０ナーバスＱシス テム（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｒｔ ｈｅ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）ｊ　、オノクスフォード・ユニバージテ ィー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ロンド ン（１９１１１２）　；ケイター（Ｋａｔｅｒ）およびレトゥア／イ（Ｌｅｔｏ ｕｒｎｅａｕ）、「バイオロジー・サン・ザ・ナーブ※グロースφフーン（Ｂｉ ｏＩｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈｃｏｎｅ）Ｊ　、アラン ・アール・リス・インコーポレイテノド（Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　）、ニューヨーク（１９８５）］。これらは、局部情報 の運動性および変換に関する機械装置を含んでおり、体細胞からの運搬によって 決定されたタンパク成分を有する。ＧＡＰ−４３は、迅速に運搬されたタンパク の１つであり、これは、神経を発育および再生させる際に、軸索運搬における明 確な質の向上が顕著である。再生するべき哺乳動物ＣＮＳニューロンの欠損は、 成人脳における低く誘導できないレベルのＧＡＰ−４３と結びつけられた［スキ ーニ（Ｓｋｅｎｅ）、セル（並旦）　３７：６９７　（１９ｇ４）］。すなわち 、もちろん、ＣＮＳ損傷および発作の治療において遭遇する問題のために、ヒト においてこのタンパクの調節を研究するのは、特に興味深いものである。

ＧＡＰ−４３および成長円錐 ＧＡＰ−４３は、ラットとヒトの間で非常に保存持され、周囲のカルシウムが増 加するとカルモジュリンを放出する異常な特性を有するカルモジュリン−結合タ ンパクとして近年同定されたマウスタンパクに明らかに匹敵する［アンドリーセ ン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）　２２：４６１５　（１９８３）　ニジムラ−（Ｃ４ｎｄｅｒ）ら、ジャーナ ル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　ＢｉｏＬＣｂｅｍ、）　２６ ０：１０７８４　（１９８５）　ニアレキサングー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、 ジャーナル・サン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｓ、　）　２９２：６１０８　（１９８７）］。上記著者らによって示唆された ように、成長円錐におけるその役割に関する概念は、カルモジニリン活性を調節 すること、および局所的細胞ドメインにおいてそれを放出することによってその ようにすることである。すなわち、カルモジュリンに対するＧＡＰ−４３の結合 性は、例えば、活動電位の後、カルシウムが上昇すると減少するであろう［ビラ ーデティ（Ｂｅｌａｒｄｅｔｔｉ）ら、プロシーディンゲス・サン・ナショナル ・アカテミー・サン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ）　 ８３ニア０９４　（１９８８：Ｂ。そのために、成長円錐のカルモジュリン依存 活性は、カルシウム入口のすぐ近所の範囲内で調節することができる。

成人におけるＧ　Ａ　Ｐ　−４３ ＧＡＰ−４３発現は、発育の間に非常に調節される。一般に、最高レベルは、軸 索伸び率のピークの期間とよく相互関係をもつ。しかし、成熟脳の個々の領域に おける高いレベルの発現は、ＧＡＰ−４３がいくつかの成体二ニーロンにおける 進行役を有することを示唆している。１つの可能性は、ＧＡＰ−４３発現が、特 に神経末端で、それらの構造を改造する際に活発に従事した細胞を示すことであ る。これに関する証拠は、ラットにおいて、ＧＡＰ−４３を発現する成体ニュー ロンが海馬二ニーロンおよび嗅球の僧帽状細胞を最も顕著に含んでおり、実際に 、該ニューロンは、成体においてそれらの末端を改造することである。ヒト海馬 は、低いレベルでのみＧＡＰ−４３を発現し、ＧＡＰ−４３が実際にこのような 構造上の改造の標識であるとすれば、ヒト脳の様々な領域がこの機能を保持して いたことを示唆している。ＧＡＰ−４３について提案された他の機能は、そのホ スホリル化状態が長期相乗作用の結果として変化するので、学習である［ネルソ ン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびルノテンバーグ（Ｒｏｕｔｊ、ｅｎｂｅｒｇ）、イク スベリメンタル”　ニュー０ロジー（Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　）８９：２１ ３　（１９８５）］。実際に、構造上の改造は、長期学習の一面であり［チャン （Ｃｈａｎｇ）およびグリーナフ（Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ）、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ 、　３０９：３５　（１９８４）　；ゲレ−ｙ　ト（Ｇｏｅｌｅｔ）ら、ネイチ ャー（回り３２２二４１９　（２９８３）］、神経末端領域の成長は、アプリシ ア（Ａｐｌｙｓｉａ）において長期学習を伴うことが立証された［ベイリ（Ｂａ ｉｌｅｙ）およびチャン（Ｃｈａｎ）、サイエンス（ト籾μ達）　２２０：９１ 　（１９８３）ｌ。すなわち、１つの興味をいだかせる可能性は、長期学習に関 する構造上の形成性を使用する成人脳のニューロンがＧ　Ａ　Ｐ　−４，３を発 現するものであるということである。この可能性は、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ） およびルソテンバーグ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ）のイクスベリメンタル・ニュ ー０ロジー（ＥＸｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　）−ロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ、）　６：１８４３　（１９８６）、およびネベイ（Ｎｅｖｅ）で検討され ており、本研究は、これらの示唆と一致する。この提案は、種々の疾患状態とＧ ＡＰ−４３発現との密な相互関係を必要とするであろう。

成体ＣＮＳにおけるＧＡＰ−４３および修復ＣＮＳ損傷からの回復による抑制は 、あまり理解されていない。

哺乳動物の末梢神経または両生動物の中枢神経でさえ、切断の後、完全に回復す るが、これに反して、哺乳動物の中枢神経におけるこのような損傷は回復しない 。中枢神経は、ガイドとしてそれらが末梢神経鞘を有する限り、軸索切断の後、 長い距離伸びるので、成体ニューロンは、成長する能力を維持する［ベンツエイ （Ｂｅｎｆｅｙ）およびアグアヨ（Ａｇｕａｙｏ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ ）　２９６：１５０　（１９ｇ２）コ。修復の失敗は、末梢神経系とは反対に、 中枢神経系においては、軸索運搬タンパクのグループにおける異なる調節抑制に 起因していた。特に、ＧＡ、Ｐ−４３が関係しているのは、そのレベルが正常な 成長および回復力に非常に匹敵しているからである［スキｍ；（Ｓｋｅｎｅ）、 セル（Ｃｅｌｌ）　３７：６９７（１９８４）］。本発明者らは、あるタイプの 刺激の後で、成熟ニューロンが高いレベルでＧＡＰ−４３を発現することができ るということを示した。

一時的な虚血性および大脳梗塞のような疾患は、軸索切断の後、障害が永久であ るが、これに反して、臨床学的回復がこのような病変の後にしばしば生じるので 興味深いものである。神経学的回復が損傷細胞の修復によって誘導されるかまた は近隣の無傷細胞の発芽によって誘導されるかは、臨床病理的相互関係によって 識別することはできない。高レベルのＧＡＰ−４３を発現するニューロンと細胞 死領域との間の距離は、発芽を意味し得ることを示唆する。他方、これらの場合 に観察されるＧＡＰ−４３の増加は、体幹の虚血性影響から誘導され：該影響は 、軸索切断の間にはあまり生じないらしい。例えば、これらは、興奮性アミノ酸 の放出および結果として起こるＮ〜メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ） レセプター興奮を含む［オルネイ（Ｏｌｎｅｙ）、イクスペリメンタル・アンド ・クリニカル”　二ｘ　−０）キシコｏジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎ ｄ　Ｃ１ｉＣ１１ｎｉｃａｌＮｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏ、スペンサー（Ｐ、　 Ｓ、　５ｐｅｎｃｅｒ）およびシャランバーブ（Ｈ，Ｈ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ ）、ｅｄｓ、　（パルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、ＭＤ：ウィリアムズ（ Ｗｉｌｌｉａａｓ）およびウィルキンズ（Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ｐｐ、　２７２− ２９４（１９８０）　：ロスマン（Ｒｏｔｈｍａｎ）、ジャーナル・サン・ニュ ーロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）　４：１８８４　（１９８４）］。

犬裡ガ皿 精製したＧＡＰ−４３タンパクに対して指向する抗体を用いるＧＡＰ−４３発現 の検出 先の免疫組織化学研究は、特に成長している神経系において、ＧＡＰ−４３が神 経突起に限定されることを示唆していたしベノヴイ１．。

ツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）ら、ジャーナル・サン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ、）　ｆｉ：３３９−３５２　（１９８ｇ）；ジスペン（Ｇｉｓｐ ｅｎ）ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、３２８：３８１−３８５　（１９８５）　：メ イリ□１ｅｉｒｉ）ら、プロシーディンゲス・サン・ナショナル・アカデミ−・ サン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ）　８３：３５３７−３５４１　（１９８６）　；スキｍ；（Ｓｋ ｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３３ニア８３−７８６　（１９ ８６）コ。本実施例におい（ｐｅｒｉｋａｒｙａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示す ＧＡＰ−４３に対する新規な抗体を用いて、本発明者らは、ＧＡＰ−４３を発現 する細胞個体群を同定し、成体脳において、広く行き渡ったＧＡＰ−４３免疫反 応性軸索が二ニーロンの比較的小さい個体群から発散され、このほとんどが局部 的に制限されることを示す。

いる組織を新しく入手し、ドライアイスによって冷却された２−メチルブタン中 でスナップ凍結した。使用直前に、適当な固定液を用いて低温槽切片標本を固定 した。胎芽うｙ　ト（Ｅ）（１２，１５，１８および２０日令）、生後発育して いるラット（Ｐ）（１，７および１４日令）および成体ラノ）由来の脳とを髄を 同時に研究した。該組織を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．３％トリ トンＸ１００で処理し、次いて１μｇ／Ｒρブロテイナーゼにで処理し、アセチ ル化し、５０％ホルムアミド／２×襟準ク工ン酸添加生理食塩水（ＳＳＣ）中で プレハイブリダイズした。プローブは、上記のとおり、ＧＡＰ−４３アンチセン スＲＮ　Ａの１１２１塩基であった。５０°Ｃで５時間、湿気のあるチャンバー 中、スライド当たり２　Ｘ　１０”ｃｍｐのｓ５３　１識化アンチセンスまたは センスリボプローブを用いてノ＼イブリダイゼーションを行った。次いで、組織 切片標本を、最初に５０％ホルムアミドを含有しており、次いで５０％ホルムア ミド＋０．１％トリトン−Ｘ１００を含有している１０ｘＭジチオトレイトール を有する２ＸＳＳＣ中で洗浄した。５０　μｇ／ａＱ　ＲＮＡａｓｅＡで処理す ることによって、−重鎖ＲＮ　Ａを取り出した。該切片標本を、さらに２時間、 ＩＭＤＴＴを有する２ＸＳＳＣ中で洗浄し、次いで、０．３Ｍ酢酸アンモニウム を含有する標準アルコール（ｇｒａｄｅｄ　ａｌｃｏｈｏｌｇ）によって脱水し た。ＮＴＢ２　　コダック（Ｋ　ｏｄａｋ）エマルジョンを用いて、放射能活性 信号を検出した。エマルジョン塗布したスライドをヘマトキンリンおよびエオシ ンで対比染色した。

ＧＡＰ−４３の抗体発生、特徴付け、および免疫組織化学的実証組織切片標本を 免疫組織化学のために用いた。λｇｔｌｌ中で発生したキメラＧＡＰ−４３−β −ガラクトシダーゼ融合タンパクを注射したウサギにおいて、ポリクローナル抗 血清が高められた［カーンズ（Ｗａｒｎｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 　２３６：５９７−６００　（１９８７）　；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）　ラ、プロ シーディンゲス・イン・ナシコナル・アカデミ−・イン・サイエンス・ニーニス ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８０：１１ ９４−］、１１９ｇ（１９８３）］。硫酸アンモニウム分画法およびＤ　Ｅ　Ａ 　Ｅセルロースクロマトグラフィーによって、粗血清を処理した［ホロヴイノッ （Ｈｏｒｏｗｉ　ｔｚ）ら、ファンダメンタル・テクニクス・イン・パイロロジ ー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｌ／ｉｒｏｌｏｇ ｙ）、ｐｐ、　２９７−３１５１．新生児ラット脳から調製した成長円錐膜粒子 を用いて［フエニンガー（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　３５ ：５７８−５８４　（１９８３）］、ウウェスターンクロッ９析法［メイツ（Ｍ ｅｉｒｉ）ら、プロシーディンゲス・イン・ナシ贅ナル・アカデミ−・イン・サ イエンス・ニーニスニー（堕をＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　８３： ３５３７−３５４１　（１９８６）］によって該抗体を検査した。ウェスターン プロットは、アルカリホスファターゼ／ＢＣＴＰ／Ｎ　Ｂ　Ｔ　キット［プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｅを用いて展開させた。ウェスターンプロｙ）検査法にお いて結合する抗体の特異性は、新生児ラット脳から精製されたＧＡＰ−４３タン パクによる予備吸収によって示された［チャン（Ｃｈａｎ）ら、ジャーナル・イ ン・二二一口サイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｅｉ、）　６：３６１Ｂ−３６２７ （１９８６）］。ＧＡＰ−４３タンパクは、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ） として３−３“ジアミノベンジジンおよヒ対比染色としてヘマトキシリンを用い て、アビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合法［フス（Ｈｓｕ）ら 、ジャーナル・イン・てＣＮＳ組織において示された。標識化の特異性は、新生 児ラット脳由来の精製した天然ＧＡＰ−４３タンパクと一緒に第１抗体をブレイ ンキュベートすることによって確認された。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブソタイゼーシヨンによって評価された発育期のＧＡＰ−４ ３発現 】２および１５日令の胎芽で、ＣＮ　ＳにおけるＧＡＰ−４３ｍＲＮＡ発現は低 いが、神経神経節のニューロンは、その軸索成長のピーク期間に応じて極度な標 識化を呈した。Ｅ２０で、ＧＡＰ−４３レベルは、脳の全体に渡って均一に、か つ著しく高かった。出生後生活期間第１週の間、高レベルの発現が維持されたが 、Ｅ２０およびＰｌで観察された拡散した標識化に対照して、Ｐ７ラツトの脳に おいて、個々の二ニーロン上での別々の標識化は、神経網の広がりおよび神経膠 素子の成長によって、正しく評価することができた。

最もよく試験することができるように、全てのニューロンをこの年令で標識化し た。Ｐｌ４ては、ＧＡＰ−４３諭ＲＮＡ発現は、一般的なシグナルの強さが低（ 、皮質二、Ｓ−ロンの５０〜７５％だけが標識された。

成体ＣＮＳにおいて、ＧＡＰ−４３は、はとんどの大脳皮質の全体にわたって、 拡散された細胞だけが標識化される程度の比較的少ない二ニーロンにおいて発現 され、標識化の強度がＰｌ４脳と比較して顕著に低下した。しかし、内側嗅皮質 （ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ　ｃｏｒｔｅｘ）は、適度に高い密度のＧＡＰ−４３〜 発現ニューロンを有した。二ニーロンの濃い局所的標識化は、ＰＩ４ラットのを 髄、脳幹、および小脳においてまだ存在しているが、成体においては、ＧＡＰ− ４３−発現ニューロンが、これらの領域において存在しないかまたは非常に低い 密度で存在するかのいずれかであった。しかし、成体において、はとんどのニュ ーロンの極度の標識化が海馬および嗅球の２つの領域に維持された。海馬におけ る標識化のパターンは、歯状回、ＣＡＩおよびＣＡ３の全体にわたって、二ｓ　 −０ンがＧＡＰ−４３＠ＲＮΔを発現したことを示した。嗅球において、主に、 高レベルのＧＡＰ−４３ｍＲＮＡを含有する僧帽状細胞領域であった。

免疫組織化学によるＧＡＰ−４３−発現の観察λｇｔｌｌ中で生じるキメラＧＡ Ｐ−４３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパクに対するウサギポリクローナル抗 体で、新生児ラット脳のウェスターンプロットにおいてＧＡＰ−４３を特異的に 標識した。

ＧＡＰ−４３抗原に関する特異的な免疫染色は、神経膠細胞においては検出され ないが、ニューロンにおいては検出された。発育の間じゅう、免疫反応性ＧＡＰ −４３は、神経細胞形質および神経突起の両方に存在した。神経突起−制限免疫 反応性ＧＡＰ−４３は、以前観察されていた［ベノヴイッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ ）ら、ジャーナル・イン・ニューロサイエンス（↓工Ｘ講りびとびりよ）　８： ３３９−３５２　（１９８８）　；ギスペン（Ｇｉｓｐｅｎ）ら、Ｂｒａｉｎ　 Ｒｅｓ、　　３２１ｉ：３８１−３１１１５　（１９８５）　：スキーニ（Ｓｋ ｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３３ニア８３−７８６　（１９ ８６）］。細胞分画研究はＧＡＰ−４３が細胞体中にもあることを示唆している ［アレキサングー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、ジャーナル・イン・バイオロジカ ル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６２：６１０ｇ−６１１３ （１９８７）］。

我々の抗体を用いる免疫染色法は、ＧＡＰ−４３−発現細胞の局在化およびｉｎ 　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヲンのデータとの比較を可能にした。免疫反応性 ＧＡＰ−４３を含有する二ニーロンの局所的な分布および密度は、ｉｎ　５ｉｔ ｕハイブリダイゼーシヨンによってそのｍＲＮＡに関して観察された発育パター ンを反映した。ＧＡＰ−４３免疫標識化は、Ｅ１２胎芽において検出されず、Ｅ １５ＣＮＳにおいて少量だけ存在した（かすかな免疫組織化学染色によって明示 された）。Ｅ１８では、ＧＡＰ−４３免疫反応性は一層はっきりと見え、Ｅ２０ では、神経細胞の体幹および神経突起の両方において高レベルで検出された。Ｇ ＡＰ−４３タンパクに関する免疫染色のこの度合は、Ｐｌまで持続された。その 結果として、ＧＡＰ−４３免疫反応性は、はとんどの領域において減少し、した がって、ＧＡＰ−４３免疫反応性の一層制限された分布はそのままである。

成体において、広がっているがかすんでいる神経標識化（ｎｅｕｒｉｔｉｃｌａ ｂｅｌｉｎｇ）は、ＣＮＳの全体にわたって立証された。ニューロン神経細胞形 質は、高レベルのＧＡＰ−４３を発現するとしてｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ ーシヨンによって同定された領域において、密に標識された。

例えば、海鳥では、ＣＡＩ、ＣＡ４および歯状回の全体にわたる錐体細胞および 顆粒細胞の両方において、強い標識化が示される。

−緒に予備吸収されると、標識化は生じなかった。β−ガラクトシダーゼ予備吸 収は、標識化に影響を及ぼさなかった。小脳、脳幹、およびを髄において、免疫 標識化細胞はほとんどなく、前頭皮質、体性感覚皮質、視覚皮質および脳幹神経 節における免疫標識化細胞は低い密度であり、内側嗅皮質においては適度に高い 密度であった。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシ１ンについて注意したように、免疫反応性Ｇ ＡＰ−４３に関する強い神経細胞形質染色は、２つの領域：海馬および嗅球にお いて最も顕著に維持された。ＣＡＩ、ＣＡ３および歯状回の全体にわたる錐体細 胞および顆粒細胞は両者とも標識された。噴球において、標識化は、僧帽状細胞 に対して、および顆粒細胞のうちの神経突起に対して大きく制限されている。す なわち、ＧＡＰ−４３免疫反応性のパターンは、ｉｎ　ｓｉｔυノ＼イブリダイ ゼーシ１ンのものを反映した。

考察 本実施例は、Ｇ　、Ａ、　Ｐ　−４３が開度期間の全ＣＮＳ二ニーロンにおいて 発現されることを示している。発育が進行するに従い、その解剖学的分布は、漸 次的に制限され、成体においては、Ｇ　Ａ　Ｐ　−４３−含有ニューロンは不均 一に分布し、最も高いレベルの発現が、主に、２つの別々の領域：海馬および嗅 球に制限される。

ここで報告されたものといくらか異なることは、小脳および前頭皮質における高 いレベルのそれらの発見および歯状回における標識化の欠損であった。先の報告 において、免疫反応性ＧＡＰ−４３は、その細胞起源の表示なしで神経突起にお いて排他的に検出された［ベノヴイソツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）ら、ジャーナル・ サブ・ニューロサイエンス本発明者らによって生じさせられたβ−ガラクトシダ ーゼ−ＧＡＰ−４３融合タンパクに対する抗体は、ニューロン神経細胞形質の極 度の標識化を可能にした。この従前の報告との相違点は、抗原のキメラ的性質に よるものであり、おそらく、異なった程度にいくつかの異なったエピトープをさ らす。他方、該相違点は、アルデヒド固化の省略を反映しており、これは、神経 細胞形質標識化を減少させるために本発明者らによって示された。

如何なる場合にも、本発明者らは、本発明の方法が、ＧＡＰ−４３遺伝子発現の 部位がＧＡＰ−４３免疫反応性のものを反映したということを示した。ＣＮＳに おけるＧＡＰ−４３の分布は、ラットとヒトの間で異なる。成人脳では、海馬に おける以上に連合皮質領域において高いレベルを維持し［ネベイ（Ｎｅｖｅ）ら 、プロシー・ディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　８５：３６ ３８−３６４２　（＋９１！＋り］、これに反して、成体ラットでは、海馬、嗅 球および内側嗅皮質において最も高いレベルのＧＡＰ−４３発現がある。この発 見の重要さは、不明瞭であるが、ニューロン形成性の領域的保持力に関して、種 の相違に関連しているのであろう。成体において高いレベルのＧＡＰ−４３を安 定に発現するＣ　Ｎ　Ｓニューロンのサブセットが生物学的特徴を共有するか否 かを決定することか残っている。

１つの可能性は、ＧＡＰ−４３がシナプスの構造的改造を行う際に含まれている 細胞において発現されることである。成長円錐は、において、単一の細胞の進行 しているシナプス再配置が示される［バび性的二形性行動（ｓｅｘｕａｌｌｙ　 ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ　ｂｅｈａｖｉｏｒ）［カーズ（Ｋｕｒｚ）ら、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３２：３９５−３９８　（１９８６）］にとって必須で あるという証拠がある。

成長円錐およびシナブトソーム（ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ）におけるタンパク の補充物は、定性的にはあまり異なっておらず［エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、ジャ ーナル・サン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）　５：１３９３ −１４０】（１９８５）　；カソッ（Ｋａｔｚ）ら、ジャーナル・サン・二二一 口サイエンその未来のシナプス（ｓｙｎａｐｓｅｓ−ｔｏ−ｂｅ）のマーカーを 付ける［ヒユーム（Ｒｕｓｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３０５：６３ ２−６３４　（１９８３）　；サン（Ｓｕｎ）ら、プロシーディンゲス・サン・ ナショナル・アカデミ−・サン・サイエンス・ニーニスＩ−−（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８４：２５４０−２５４４　（１ ９８７）］。成熟ニューロンは、これらの工程に移した分子の成分を変化するこ とによって部分的にこれらの構造を調節する［グラフスティン（Ｇｒａｆｓｔｅ ｉｎ）ら、ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ、　　６Ｑ：１１６７−１２８３　（１９８（ １）　：マクカーリー（ＭｃＱｕａｒｒｉｅ）ら、ジャーナル・サン・ニューロ サイエンス（Ｊ、？１ｅｕｒｏｓｃｉ、）　彰１５９３−１６０５　（１９８６ ）Ｌこのような変化は、局所的に［レイスフ（Ｌａｓｅｋ）ら、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ ｔｉｌｉｔｙ、　ＲＤ　Ｇｏｌｄｍａｎ、　Ｔ　Ｆｏｕｌａｒｄ。

Ｊ　Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、　Ｅｄｓ、　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｎ　Ｃｅ１ｌニユーヨーク、ｐ、１０２１− １０４９　（１９７６）コ、該レベルの遺伝子発現で、例えば、チー−プリンに ついて示されたような［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、ジャーナル・サン・セル・ バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ］］、Ｂｉｏｌ）　１０５：３０６５−３０７３　（１ ９８ｒ＞２オヨヒａ　Ａ　Ｐ　−４３について本発明者らによって示さ成体ＣＮ Ｓニューロンの特徴は知られていないが、成熟神経系におけるシナプスの発育期 および再設計期の神経突起成長間で類似性が与えられ、分子レベルでは、成長関 連タンパクの必要性が不合理でない。

形成性に対するＧＡＰ−４３の結合を確実にするために依存するマーカーはない が、成体において高レベルのＧＡＰ−４３を発現スるニューロンのいくつかは、 シナプス再設計ができるという証拠がある。すなわち、ＧＡＰ−４３発現は、嗅 神経およびその標的、嗅球の僧帽状細胞において高い。嗅二ニーロンは、生涯を 通じて死と交換のサイクルを続けるので［グラシアディ（Ｇｒａｚｉａｄｅｉ） ら、Ｍ、　Ｊａｃｏｂｓｏｎ（Ｅｄ、）、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　５ｅｎｓ ｏｒｙ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　Ｍｏｌ　ＩＸ＋Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　０ ｆＳｅｎｓｏｒｙ　５ＹＳｔｅｒｎＳ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｓｐｒｊｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ　ｐｐ。

５５４３　（１９７８）Ｅ、これらのシナプスは、変化し続けなければならない 。成体におけるＧＡＰ−４３を発現する内側嗅二ニーロンは、損傷の非存在下で 再設計することは明らかではないが、神経切断域中に発芽することによって末梢 領域を拡張することができる。最後に、海馬の回路は機能的に形成性であり［ベ ノヴイッッ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）ら、ジャーナル・サン・ニューロサイエンス（ Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）　８：３３＆−３５２（１９８８）　；コツトマン（ Ｃｏｔｍａｎ）ら、サイコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｌ、）　３３：３７１−４（１ １（１９ｓ２＞：　ジー（Ｌｅｅ）ら、Ｇ、Ａ、Ｘｅｒｋｕｔ　ａｎｄ　）１． Ｖ、Ｗｂｅ８１　（Ｅｄｓ）。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｌ５ｏｌａｔｅｄ　Ｍａｍｍａｌ ｉａｎ　ＣＮＳ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、アカテ゛ミ、り、二ニーヨーク、 １９８１．　ｐｐ、　１８９−２１２　：シー（Ｌｅｅ）ら、ジャーナル・サン ・ニューロフィジオａジー（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｊｏｌ、　）す：２４７ −２５８　（１９８０）］、形形態学的板によって、長期相乗作用を伴っている シナプスの数および形の変化を確認した［チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｂｒａｉｎ 熟ム稙：３５−４６　（１９ｇ４）］。すなわち、成体ＣＮＳにおいてＧＡＰ− ４３の制限された局在化は、ＧＡＰ−４３−発現ニューロンが再設計している神 経末端において活動的に関係しているものであるという概念と適合する。

実施例■ 神経発育因子およびグルココルチコイドによるＧＡＰ−４３遺伝子発現の二重調 節 多くの場合、個々のニューロンの表現型は、その微小環境に依存する。このよう な「形成性」は、例えば、交換神経副腎系の前駆細胞によって細胞運（ｃｅｌｌ 　ｆａｔｅ）の選択において証明され、これは、神経発育因子（Ｎ　Ｇ　Ｆ　） の影響下のニューロン表現型またはフルチフステロイドの存在下の内分泌クロム 親和細胞表現型と仮定される。

さらに、二ニーロンは、正常な発育の間およびシナプス使用に対して、それらの 関係、シナプス形成性と称した現象を再設計する［イースター（Ｅａｓｔｅｒ） ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３０：２０７−５１１　（１９８５）コ 。

これら２つのタイプの形成性に関するある統一テーマは、元の華麗なニューロン の形の確立において劇的であり、関係の再配列においてさらに微妙である構造的 な再編成である。１つの概念は、ｌセノトの遺伝子の発現がニューロン形成性に ついて責任を有するということである。微小環境によるこれら遺伝子の調節は、 構造的な変化をもたらすであろう。

コルチコステロイドは、哺乳動物の神経系の正常な発育に必要であり、細胞運お よびニューロン構造および完全性に影響する［ダウベ（Ｄｏｕｐｅ）ら、ジャー ナル・イン・二二一口サイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　）６）；ボーン （Ｂｏｈｎ）およびラウダー（Ｌａｕｄｅｒ）、Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　 １：２５０−２６６　（１９７ｇ）　；シェフ（Ｓｃｈｅｆｆ）ら、Ｅｘｐｔ、 Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　６８：１９５−２０１　（１９８０）；シェフ（Ｓｃｈｅ ｆｆ）およびコツトマン（ＣｏｔＩｌｌａｎ）、Ｅｘｐｔ、　Ｎｅｕｒｏｌｏｇ ｙ″Ｌ小さく極度の蛍光性の（ＳＩＦ）細胞および副腎髄質細胞を含む神経堤ラ イニジ（ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞は、ニューロン性またはクロム親和性のいずれ の表現型を呈することもできる。コルチコステロイドによって、それらかクロム 親和性特徴を帯ひる。フルチフステロイドの非存在下、Ｎ　Ｇ　Ｆの存在によっ て、それらがニューロン性の特性を発育させる［ダウペ（Ｄｏｕｐｅ）ら、ジャ ーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）　５：２１１９ −２１４２　（１９８５）］。

ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫から誘導したクローン株ＰＣＩ２の細胞［グ リーン（ｃｒｅｅｎｅ）およびティシニラー（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ）、プロ７−ゾ サングス・イン・ナンゴナル・アカデミ−・イン・サイエンス・ニーニス！−（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　７３：２４２４−２４２ ８　（１９８６）　；グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびテイシニラ−（Ｔｉｓｃ ｈｌｅｒ）、Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ、　Ｖｏｌ、３、ｐｐ、　３７３−４１３、アカデミツク・プレス、二ニー ヨーク（１９ｇ２）］は、ＮＧＦによって、よりニューロン性となり、コルチコ ステロイドにさらしてクロム親和特性を維持する、同様の両能運（ｂｉｐｏｔｅ ｎｔｉａｌ　ｆａｔｅ）を示す。

驚くべきことに、ＧＡＰ−４３発現の本研究は、ＰＣ１２細胞および培養した交 換神経ニューロンの両方において、コルチコステロイドがＧＡＰ−４３遺伝子発 現の有用な陰性調節物であることを示した。さらに、コルチコステロイドかＧＡ Ｐ−４３発現におけるＮＧＦの刺激効果を抑制することを発見した。

酵素は、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）、二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ａｂｓ）、またはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、供給者によって指定さ れたとおりに使用した。組織培養産物は、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から購入した。

放射化学物質は、二ニー・イングランド・ニュークリアーデュ・ボン（ＮｅｗＥ ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ−Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）から購入した。寒天および塩 化セシウムは、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから購入した。機ヲ得テ懐 妊しているスブラーギニードーレイ種う、トは、チャールズ・リバー・ラット（ Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｒａｔ）から購入した。ステロイドは、シグマ（ Ｓｉｇｍａ）から、ＮＧＦは、コラボレイテイブ・リサーチ（Ｃｏｌ　１ａｂｏ ｒａｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（２、５ｓ型）から購入した。他の全ての化学 物質は、入手可能な最高級のものであった。

細胞培養 ５％熱不活化ウマ血清および１０％ウシ胎児血清を有するダルベツコ修飾イーグ ル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）中でＰＣＩ２細胞を増殖した。約２０％の集合度の時 に細胞をルーチン通りに用いた。ＲＩＡによって測定したコルチソルレベルは、 血清含有培地中、３ｎＭまたはそれ以下であった。３７℃で、５％二酸化炭素を 存する湿気を帯びたインキュベーター中で細胞を増殖した。２０日齢胎芽ラうフ 上顆神経節から分離した二ニーロンを、ＮＧＦ（５０ｎ９／１Ｉ２）、０．６％ グルコースおよび１０％ウシ胎児血清を供給したハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ　１２培 地中で培養した。ステロイド試験のために、通常、該化合物を９５％エタノール に溶解した。ビヒクルとしてエタノールを用いて行った対照は、豊富なＧＡＰ− ４３またはＧＡＰＤＨＲＮＡ中で変化を示さなかった。

ＲＮＡブロッティング インチオンアン酸グアニジン法によって、培養された細胞から全ＲＮ　Ａを調製 した［チャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８：５２９４−５２９９　（１９７９）Ｅｌ。各培養物 由来の全ＲＮＡ２０μ９を、２．２Ｍホルムアルデヒドを含有している１、２％ アガロースゲルを介して電気泳動にかけ、ナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）［シコラ イヒャー・アンド・シニール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ ）コにキャピラリティによって移し、核酸を加熱固化によって固定化した。５０ ％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：　１５０１Ｍ塩化ナトリ１７ム、１ ５ｘＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、１ｘデンハーツ（Ｄ　ｅｎｈａｒｄ ｔ’　ｓ）溶液、１％ドデフル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００μ９／ｗ Ｑの変性したサーセン精液ＤＮＡを含有しているノ＼イブリダイゼーション溶液 中、４２℃で、少なくとも１時間、ブレハイブリダイゼーションを行った。

ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを用いて、任意のへキサヌクレオ チドブライミングによって調製したＩ　Ｘ　１０　’Ｃｐｅ／ｘＱのａｌｐ−標 識化ＤＮＡプローブを含有している同一の溶液中、４２℃で１０〜１２時間、ハ イブリッド形成を行った［ファインバー作製した［ピエチャクツィク（Ｐｉｅｃ ｈａｃｚｙｋ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：６９５１−６９６ ３　（１９ｇ４）］。ププロトを、６５℃で、２ＸＳＳＣで２回、各２０分間、 ならびに６５℃で、０．２ＸＳＳＣでさらに２０分間洗浄した。−７０℃で、ス クリーンを強めながら、オートラジオグラフィーを行った。Ｉ×デンハーツ溶液 、１％ＳＤＳ、５０ｘＭトリス、ｐＨ７，４および０．０５％ピロリン酸ナトリ ウムを含有している溶液中、８０℃で２時間、ハイブリダイズしたプローブをプ ロットからストリップした。

ＬＫＢウルトラスキャンによってスキャニングレーザーデンシトメトリーを行っ た。与えられたプロットのいくつかの位置をスキャンし、像の強度を時間に対し てプロｙ）した。像の強度の測定は、曲線の線形部分から得た。ＧＡＰＤＨＲＮ Ａレベルの注意深い先の測定によって、これらのいくつかの実験条件下で変化し ないこと各実験の４８〜６０時間前に、ＰＣ１２培養物をスプリットした。

細胞は、未処理のままか、あるいはＮＧＦ（５０ｎ９７ｘ（１’）またはデキサ メタシン（１μＭ）のいずれかで６時間処理した。約１，０００万の核を、以下 の変形を伴ってグリーンバーブの方法［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ） ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０二１４１０１−１４１１０　（１９８５ ）］ｌこよって、それぞれから調製した。細胞溶解は、１０＋Ｍ塩化ナトリウム 、１０ｘＭトリス、ｐＨ７，４，３ｘＭ塩化カルシウムおよび２００ユニ。

ト／ｘＱ　ＲＮＡ５ｉｎＪプロメガ・バイオツク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ ｃ）］中だった。５０ｘＭｔ−リス、ｐＨ８，３，４０％グリセロール、５ｘＭ 塩化マグネシウム、Ｑ、ｌｘＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｘＭジ チオトレイトールおよび２００ユニツト／ｚ（ｌ　ＲＮＡ５ｉｎ中細胞溶解緩衝 液で洗浄した後、核を再懸濁した。核を計数し、５．　Ｏ００万／Ｒ（ｌの濃度 で、液体窒素中に貯蔵した。

懸濁した核に、同量の、１０ｙＭｌ−リス、ｐＨ８，０，５ｘＭ塩化マグネシウ ム、０．３Ｍ塩化カリウムおよび各々１０ｚＭのアデノシン、シチジンおよびグ アノノンすクレオチド三リン酸を含有している緩衝液に添加することによって、 解凍した植生の発生期鎖の標識化を行った。次いで、ウリジン三リン酸（”Ｐ） ３００μＣｉを添加しく３０００Ｃｉ／ミリモル）、３０℃で３０分間、鎮咳を 標識した。次いで、３７℃で４５分間、６０ｘＭトリス、ｐＨ７，５，１５ｚＭ 塩化ナトリウム、１０ＲＭ塩化マグネシウム、および２００ユニツト／Ｉ（ＲＮ Ａｓｉｎを含有している緩衝液６００μＱ中で１００ユニツトＲＱＩ　　Ｄ　Ｎ 　Ａ　ａｓｅ［プロメガ・バイオチックｊを添加して核を消化した。

次いで、開示されているとおり［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら、し Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　２６０：１４１０１−１４１１０　（１９８５）］、標 識化ＲＮＡをブロテイナーゼＫ［バーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］で消化した。

数回のフェノール、クロロホルム−イソアミルアルコール抽出の後、酢酸ナトリ ウムの存在下、核酸をエタノール沈殿した。回収した標識化核酸は、まだＤＮＡ を含有しており、これを、３７°Ｃで４５分間、ＲＱ　Ｉ　　ＤＮＡａｓｅ（５ ０ｘＭ）リス、ｐＨ７，５，１０ｘＭ塩化ナトリウム、７．５１１１Ｍ塩化マグ ネンウムおよび２００ユニツトＲＮＡ５ｉｎ／ａ（を含有している緩衝液２５０ ７ｔｌｌ中５０ユニツト酵素）、次いで、４２℃で３０分間、ブロテイナーゼＫ （５％ＳＤＳ、０゜５Ｍトリス、ｐＨ７，４，１２５ｉＭＥＤＴＡおよび０．２ Ｊ９／村プロテイナーゼＫを含有している緩衝液１００μｇを添加することによ る）の別の循環にかけた。数回のフェノール、クロロホルム−イソアミルアルコ ール抽出の後、標識化ＲＮＡを、酢酸アンモニウムによるエタノール沈殿を３回 行い、一体化していないヌクレオチド三リン酸を除去した。

チロンンヒドロ牛シラーゼに関してクローンしたＣＤＮＡＵルイス（Ｌｅｗｉｓ ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２８５：１４６３２−１４６３７　（１９８３ ）］、］グリセルアルデヒドー３−リン酸デヒドロゲナーゼＧＡＰＤＨ）、ｐＢ Ｒ３２２およびＧＡＰ−４３遺伝子の８キロベースゲノムフラグメントを含むプ ラスミドを、適当な制限酵素を用いて線形化し、フェノール抽出し、エタノール 沈殿し、そして、遠心分離によって回収した。ＤＮＡ（２５０μ９／１１ρ）を 、アルカリ（０，５Ｎ水酸化ナトリウムラによって変性し、１０容量の１Ｍ酢酸 アンモニウムの添加によって中和した。ニトロセルロースフィルターサークルを 、重力濾過によってＤＮＡ　５０１１９で負荷した。２５ＪＩＭＰＩＰＥＳナト リウム、ｐＨ７，２，５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、２．５ ｍＭＥＤＴＡおよび１００μ９／肩（ｌのｔＲＮＡを含有している緩衝液中、４ ５℃で１０〜１２時間、該フィルターのブレノルイブリッド形成を行った。

１〜３　Ｘ　Ｉ　Ｏ＠ａｐｅ／　ｚ（ｌの範囲の比活性の標識化ＲＮＡを含有す る同一の緩衝液中で、４５℃で４日間、］＼イプリダイゼーシ５ンを行った。開 示されているように［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｗ、　２６０：１４１０１−１４＋１０　（１９８５）］、洗浄およびＲ Ｎ　Ａ　ａｓｅ処理を行った。２回行ったフィルターを、シンチレーションカウ ンターにおいて、乾燥後に計数した。データは、フィルターを含有しているベク ターからバックグランドを引いた後ノ・イブリダイズした１００万当たりの部数 として表す。

ＧＡＰ　　４３ＩｌｌＲＮＡ蓄積に与えるＮＧＦおよび糖質コルチコイドの影響 をＲＮＡプロット法によって測定した。デキサメタシンはＧＡＰ−４３ａ＋ＲＮ Ａレベルの顕著な減少を生じるのに対し、ＮＧＦ添加の結果、基底レベルよりも 著しく増加した。デンシトメトリーによって測定し、ＲＮＡ負荷について修正し たＧＡＰ−４３ＲＮＡの定量化の結果、デキサメタシンは５．５倍減少させるが 、ＮＧＦは３．５倍増加を生じることが明らかとなった。ｃ−ｆｏｓとは異なり 、ＮＧＦの存在下でのＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの蓄積は安定しており、これは数時 間以内にピークに達し、次いで、ＮＧＦの継続存在にもかかわらず素早く衰退す る。

蓄積したＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルに与えるステロイドの効果の特異性を試験 するために、いくつかの構造クラスの種々のステロイドを、ある濃度範囲にわた って試験した。各クラスのステロイドは、ｉｌ　ｖｉｖｏで様々なタイプのニュ ーロンに選択的に影響を及ぼすことか示された［マクエラエン（ＭｃＷｅｎ）ら 、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　　６６：１１２１−１１８８　　（ ＋９１１１６）コ。

１つの試験において、ステロイドの濃度は、４８時間の処理の間、１μＭであっ た。デンシトメトリーによって定量化を行い、ＲＮＡ入力におけるわずかな変動 について正規化した。エストラジオール、テストステロン、およびプレグネノロ ンは、蓄積したＧＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルに対し影響しなかった。デキサメタ シン、フルチコステロン、アルドステロンおよびプロゲステロンは、ＧＡＰ−４ ３ＲＮＡのレベルを、各々、対照（ＧＡＰ−４３ＲＮＡのＮＧＦ−刺激レベルを １００％として定義した）の６％、１５％、１０％および１５％まで減少した。

プロゲステロン効果は、それ自体のレセプターによってもたらされるかもしれな いが、これらのデータは、鉱質コルチコイドまたは糖質コルチコイドのいずれか のレセプターの活性化を示唆している［アリザ（Ａｒｒｉｚａ）ら、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３７：２６８−２７５　（１９８７）　；キゲレ（Ｇｉｇ ｕｅｒｅ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　４６：６４５−６５２　（１９８６冗。

コルチフステロイドは、ＳＩＦおよび副腎骨髄細胞の両方においてニューロン表 現型のＮＧＦ誘導を遮断する［ダウベ（Ｄｏｕｐｅ）ら、ジャーナル・イン＊＝ 、−ｏサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｊ、）　５：２１１９−２１４２　（１ ９８５）　；　ｆウヘ（Ｄｏｕｐｅ）ら、ジャーナル・イン・ニューロサイエン ス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）　５：２１４３−２１６０　（１９８５）］。Ｇ ＡＰ−４３発現に際しての２つの薬物の相互作用の性質を調べるために、ＮＧＦ （５０ｎｇ／肩のおよびデキサメタシン（１μＭ）の存在下、ＰＣ１２細胞を３ ６時間増殖させた。結果は、デキサメタシンが、ＮＧＦによってもたらされるＧ ＡＰ−４３ｍＲＮＡの増加を妨げることを示す。

ＮＧＦおよびステロイドの効果は直接的であるＮＧＦおよびフルチフステロイド の効果が直接的に及ぼされるのかまたは間接的に及ぼされるのかという疑問を、 タンパク合成抑制薬シクロへキシミドの使用によって処理した。０．５μ９／ｘ Ｑのシクロヘキシミドのａ度は、２４時間目の細胞成育能力への影響なくしてタ ンパクへの（３Ｈ）ロイシンの取り込みの９４％以上を抑制する。

／クロヘキシミドは、ＧＡＰ−４３遺伝子発現のＮＧＦ強化およびデキサメタシ ン抑制のいずれをも妨げず、これはいずれの効果もｄｅｎｏｖｏタンパク合成を 必要としないことを示す。ＮＧＦ処理細胞と、ならびにＮＧＦおよび０．５μ９ ／１１１２または２μｇ／ｘ（ｌシクロへキシミドで処理した細胞と、対照とを 比較した。０．５μｔｉ／　ｘ（ｌシクロへキシミドによる処理の後、大きいサ イズの転写産物が示され、これは、スプライスしていない前駆体を表すであろう 。ＧＡＰ−４３発現のデキサメタシン抑制は、デキサメタシンだけを用いるより もシクロへキシミドとデキサメタシンを用いる方がより著しいものであった。

０、ＩＪＩＭの濃度にて、より強力なタンパク合成抑制薬アニソマイシンを用い 、これらの実験を、１２時間までに細胞死が生じるために６時間の暴露時間で繰 り返した。アニソマイシンは、ＮＧＦによってもたらされるＧＡＰ−４３ｍＲＮ Ａの増加に影響を及ぼさなかった。デキサメタシン抑制は、ＮＧＦ誘導よりも遅 く、６時間までは認識されず、従って、該効果は、アニソマイシン感受性に関し て検査することかできなかった。ＮＧＦによるプレ処理は、ステロイド抑制を直 接防止しなかった。

別の試験において、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの充分に抑制された安定状態レベルを 達成するのに必要とする時間は、ＮＧＦ予備処理の後にステロイドを添加すると 一層長くなることが判明した。

ステロイド抑制は転写的である ＮＧＦおよびステロイドの両効果に関与する調節のレベルを評価するために、核 追加試験（ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｕｎ−ｏｎ　ｅｘｐｅｒｉＩＩｌｅｎｔｓ）を行 った。

核は、５０　ｎｇ／ｎＱ　Ｎ　Ｇ　Ｆまたは１μＭデキサメタシンで６時間処理 したＰＣ１２細胞から調製した。各グループからの標識化ＲＮＡを、固定化ＤＮ Ａ５を含有するニトロセルロースフィルターにノ＼イブリダイズした。ノ１イブ リダイゼーンヨンおよび洗浄の後、各フィルターに関する特異的放射能活性を算 出し、データを１００万当たりの部数でハイブリダイズされた数として表した。

ＮＧＦは、基本的な転写率に対し影響は認められなかったが、デキサメタシンは 、ＧＡＰ−４３の転写率を約４５倍減少した。比較すると、チロンンヒドロキシ ラーゼ転写は、デキサメタシンによって増大し、ＧＡＰＤＨの転写は変化しなか った。

ＧＡＰ−４３転写ユニツトを定義する一連の実験において、新生児脳核から調製 した流出（ｒｕｎｏｆｆ）−標識化ＲＮＡを、第１イントロンの初期部分を通っ て、５”フランキング領域にわたる近隣の一連の一重鎖Ｍ１３クローンにハイブ リダイズした。結果は、転写がコーディング鎖だけからであり、フランキングセ グメントからではなＮＧＦ処理ＰＣ１２細胞は、分化した二ニーロンの良いモデ ルであるとみなされるが、コルチコステロイドの効果が、充分な分化状態を達成 した後、−次二二−ロンによって発揮されるか否かを決定するのが望まれた。そ うするために、ラット上類神経節の分離した二ニーロンを培ｔし、これに１μＭ デキサメタシンを４８時間添加した。上記のとおり、全ＲＮＡを調製し、分画し 、プロ、トし、プローブした。デキサメタシンは、交換神経ニューロンにおける ＧＡＰ−４３ＲＮＡの発現を減少させた。デキサメタシン処理培養物中の二ニー ロンの形態学的外観は、未処理細胞のものと相異しなかった。これは、短時間に わたる神経突起の延長または維持がＧ　Ａ、　Ｐ　−４３ｍＲＮＡの持続性に依 存しないらしいが、ＧＡＰ−４３遺伝子産物が長い半減期を有するので、長期の 効果を評価する必要があることを示唆している。

曳寒 本実験において、ＧＡＰ−４３遺伝子発現は、ＮＧＦによる陽性および糖質フル チコイドによる陰性の両対照に支配されることを示す。両効果は、直接的であり 、いずれも新しいタンパク合成を必要としない。興味深くかつ驚くべきことに、 シクロへキンミドは、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡのデキサメタシン抑制をさらに増加 させることが分かった。特定の理論によって結合することを意図しないが、これ は、ｍＲＮＡ安定化タンパク上での合成の抑制によるものであろう。

Ｉｎ　ｖｉｖｏで、ＧＡＰ−４３遺伝子は高度に調整される。それは今日まで、 ニューロンにおいてたけ報告されてきた。しかしながら、本発明者らは、神経堤 から誘導される他の細胞における低レベルの発現を支持するデータを得た。動物 におけるピークレベルは、神経突起の成長時に達成され、正常な成長または再生 に関係している。

その細胞特異的かつ成長に関連する発現の分子調節器は、まだ明らかにされてい ない。神経発育因子は、中間フィラメントに関連するｃ−ｆｏｓ、　ＮＧＦ　Ｉ 　Ａ、　ＮＧＦ　Ｔ　Ｂ、ベーターアクチンおよびクローン化ｃＤＮＡのような いくつかの遺伝子の発現を直接増加させる［グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒ ｇ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２６０：１４１０１−１４１１０　（１ ９８５）；ミルプラント（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）　２３８ニア９７−７９９（１９８７）　；ミルプラント（Ｍ４　Ｉｂｒａｎ ｄｔ）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）　１：１８３−１８８　（１９８８）　； レオナルト（Ｌｅｏｎａｒｄ）ら、ジャーナル・イン・セル・ノイイオロジー（ Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　１０琢１８１−１９３　（１９８８）］。

本データは、ＧＡＰ−４３Ｍ節とこれらの他の遺伝子の調節との間にいくつかの 顕著な相異、？３．があることを示している。ｃ−ｆｏｓおよびＮＧＦＩＡおよ びＮＧＦＩＢのようなものについて、ＮＧＦ誘導は、迅速であり、数分以内に影 響を及ぼし、数時間後に衰退する。

これは、ＧＡＰ〜４３発現へのＮＧＦ効果とは対照的であり、着手はゆっくりで あり、安定である。

さらに、広範囲の刺激は、カルシウムエントリー、他の成長因子および血清離脱 症状および多血症の増加を生じさせることができ、これらの効果は様々なタイプ の細胞において見られる「グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）およびシフ（ Ｚｉｆｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３１ユニ４３３−４３８　（１９８ ４）］。ｃ−ｒｏｍのような遺伝子は、ＤＮＡウィルスのごく初期の遺伝子にた とえられており［ゲレノト（Ｇｏｅｌｅｔ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　 ３２２：４１９−４２２　（１９８６）３、そのうちのい（つかはそれ自（本、 細胞機構を専用機能に再プログラムする転写的調節器をコードする。

ＮＧＦに対するＧＡＰ−４３の遅延応答は、ｃ−ｆｏｓ、　ＮＧＦ　Ｉ　Ａ、Ｎ ＧＦＩＢ等とは別で異なるクラスのＮＧＦ−調節遺伝子に当てはまり、即時応答 におけるよりもむしろ長期適合における役割を果すらしいことを示唆している。

これらの他の遺伝子とは異なり、ＮＧＦはＧＡＰ−４３ｍＲＮＡ蓄積の大きい増 加を生じるが、転写速度に与える効果は、ごくわずかである。したがって、その 作用は、転写後のメカニズムを介してもたらされるらしい。

神経系に与えるコルチコステロイドの影響は広範囲である［マクエラエン（Ｍｃ Ｅｗｅｎ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　　６６：１１２１−１ １８８　（１９８６）］。

ステロイドは、転写調節薬としてそれらのレセプターを介して作用するので、い ずれの二ニーロン遺伝子がコルチコステロイドによって調節されるのかを決定す ることは重要である。神経堤行数の細胞を考えると、細胞表現型に与えるフルチ フステロイドおよびＮＧＦの拮抗効果が遺伝子発現のレベルで反映されているか 否か、すなわち、同一の遺伝子が２つの薬物によって双峰的に調節されるか否か を決定するのは特に興味深い。

本発明者らは、ＧＡＰ−４３転写がコルチコステロイドによって抑制され、ＮＧ Ｆの同時存在がこの抑制を妨げないことを示した。

これは、培養したクロム親和性細胞のＮＧＦによってもたらされた二ニーロン分 化に対する糖質コルチコイド抑制効果と類似している［ダウペ（Ｄｏｕｐｅ）ら 、ジャーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｅｉ、）　５：２ １１９−２１４２　（１９８５）］。かくして、ＧＡＰ−４３は、細胞運命のこ れらのモジュレータ−の公知の分岐効果に少なくとも匹敵する方法で、ＮＧＦお よびフルチフステロイドによって双峰的に調節される。５ＣＧＩＯと称される他 の神経特異性遺伝子がＰＣＩ２細胞において双峰的に調節されることは興味深い ［スティン（Ｓｔｅｉｎ）ら、ＤｅｖｅｌｏＰ、Ｂｉｏｌ、　１２７：３１６− ３２５　（１９８ｇ）’］。ＧＡＰ−４３と同様に、ＳＣＧ　１０発現は、ＮＧ Ｆによって刺激され、糖質コルチコイドによって抑制されるが、抑制レベルは２ つの遺伝子間で多少異なる。

コルチコステロイドは、ＰＣ１２細胞の形状に顕著に影響を及ぼサナい。ＧＡＰ −４３が抑圧されるので、通常レベルのｍＲＮＡは、ＰＣＩ２細胞における神経 突起延長に必要ではないことは明らかである。しかしながら、これらの結果が、 ＧＡＰ−４３が神経突起成長に不必要であることを意味すると解釈し得ることは 明らかではない。第１に、低レベルのＧＡＰ−４３ＲＮＡは、ステロイド抑制の 後にも存在する。第２に、該タンパクは、長い細胞半減期を有する。さらに、Ｐ ＣＩ２細胞は、形質転換され、これらのｉｎ　ｖｉｖｏ相対物によってもたらさ れたものとは異なる構造制限を課せられるらニニーロン成長関連タンパクＧＡＰ −４３は非二ニーロン性細胞に成長円錐様形態を与える 本実施例において、本発明者らは、ＧＡＰ−４３が、おそらく細胞構造のレベル で、固有の二ニーロン表現型の確立に直接貢献しているという仮説を試験するこ とを説明する。かくして、本発明のもう１つの態様において、ラットＧＡＰ−４ ３をコード付けする発現ベクターを、いくつかのタイプの非二ニーロン性細胞に 導入する。

アデノウィルス主要後期プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、またはサイ トメガウィルスプロモーターの抑制下、５Ｖ４０ｉ製開始点を含有するプラスミ ドに挿入したラットＧＡＰ−４３ｃＤＮＡを用いて、発現ベクターを構築した［ カーンズ（Ｋａｒｎｓ）ら、サイエフ　ス（鋭−）　２３６：５９７　（１９８ ７）］ａ結果は、これらのベクターの全てを用いても同様であった。

ＣＯ５７細胞［グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｙ、　）、セル（Ｃｅｌｌ）　 ２３＋１７５　（１９８１）］を、開示に従ってトランスフェクトし［ソバ−（ Ｚｕｂｅｒ、　Ｍ、　Ｘ、）ら、サイエンス（ジ巨工弘仔）　２３４：１２５８ 　（１９８６）］、上記ウサギ抗−ＧＡＰ抗体を用いてＡＧＰ−４３免疫反応性 について試験した。Ｔ−細胞特異性膜タンパクＣＤ８を発現する同様のベクター を用いて、同じく、対照トランスフェクションを行ったＵンード（Ｓｅｅｄ、　 Ｂ、　）ら、プロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・イン・サイ エンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　８ ４：３３６５　（１９８７）］。細胞は平板培養の１時間後に試験した。

対Ｐ、ｃｏｓ細胞は、ＣＤ８に対する抗体を有するＣＤ８−）ランスフェクト細 胞の免疫蛍光標識化の後は実質的に丸かった。ＧＡＰ−４３トランスフエクト細 胞において、ＧＡＰ−４３免疫反応性は、細胞の約５〜２０％において顕著であ り、トランスフェクション効率に依存した。あるＧＡＰ−４，３は、細胞質ゾル 画分と膜画分を比較するウェスターンプロ、ト分析によって確認した観察のごと く、膜連結性のようであった。

高レベルのＧＡＰ−４３を発現する細胞は、それらの細胞周界から突起を伸延し ている多くの細胞を有する独特の構造を有していた。

これが対ＧＡＰ−４３抗体による細胞表面の良好な可視化によらなかったことを 確認するために、すべての細胞の表面をローダミン処理した麦芽凝集素によって 標識化した。ＣＤ８−トランスフェクト細胞、偽トランスフェクト細胞（ｍｏｃ ｋ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｇ）、またはＧＡＰ−４３を発現しなか った同一のＧＡＰ−４３トランスフ工クト皿における細胞は、短いまたは単一の 突起を生じたが、これらの伸延突起を有していなかった。長く細い突起は、高い レベルのＧＡＰ−４３発現だけに関連していると思われた。高いレベルのＧＡＰ −４３発現と突起成長の同様の関係が、ポリオーマＴ抗原を発現する３Ｔ３細胞 、ｗｏｐ細胞［ペイル（Ｖａｌｌｅ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ。

ＧＡＰ−４３発現ベクターによってトランスフェクトした場合、見つかった。こ れらの一時的トランスフエフ／コンアッセイにおいて、トランスフェク／ヨンの 効率および発現のレベルは共に変化し、該効果の定量化を困難にする。

定量化の問題点を解決するために、構成的にＧＡＰ−４３を発現する一連の安定 に形質転換されたクローンＣＨＯ細胞系を得た。平板培養の３０分後の対照細胞 系は、一般的に丸かった。ＧＡＰ−４３発現系において、ＧＡＰ−４３発現は、 突起伸延と明らかに関連していた。ＧＡＰ−４３を発現する多くの細胞は、狭く かつ長さ２０〜７５μｍの糸状足突起を伸延した。対照およびＧＡＰ−４３を発 現する細胞系の両方において、周界は、しばしば１８幅広く、細く、ひだ飾りの あるラメリボディラムを含んでいた。

Ｃａ−ＰＯ４共沈法およびＧ４１８選択法によってＣＨＯ細胞にＣＤＭ８−ＧＡ Ｐおよびネオマイシン耐性発現プラスミドを共トランスフェクトすることによっ て、ＧＡＰ−４３を構成的に発現するクローン細胞系を樹立した［マニアティス （Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレ牛コラ−・クローニング、ア・ラボラトリ−・マ ニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラホラトリー（Ｃｏｌｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング ・ハーバ−、ニューヨーク（］９８２）′１０対照のトランスフェクトした細胞 において、ＣＤＭ８−ＧＡＰの代わりに、プラスミドｐＣＤＭ８０シード（Ｓｅ ｅｄ、　Ｂ、　）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３２９：８４０　（１９８７ ）、：１を用いた。細胞が密集した後、これらをトリプシンで継代し、ポリーＤ −リシンー塗布したグラスカバースリップ上で平板培養した。

突起形成は、対照プラスミドによってトランスフェクトした４つの独立系、およ びウェスタンプロｊト法によって測定した最大量のＧＡＰ　　４３を発現する４ つの独立系から評価した。ノマルスキー光学系の使用によって、生きている細胞 を試験した。ＧＡＰ−４３免疫反応性を有する全ＣＨＯ細胞系は、対照細胞系よ りも突起を伸延させる傾向にあった。さらに、ＧＡＰ−４３を発現する細胞は、 対照セルライン（０，５％〜１％）と比較するとしばしば複数の突起を有してお り（細胞の６％〜１１％の間の範囲）、該突起の長さは対照細胞のものよりも長 かった。

したがって、ニューロン蛋白ＧＡＰ〜４３はこれらの非二ニーロン細胞の形状変 化をＣき起こす。細胞突出が成長円錐に似ているように、糸状足およびラメリボ ディラムは細胞体幹から直接伸延する。

非二ニーロン細胞において、ＧＡＰ−４３は、その正常な生物学的情況から取り 出され、調節されていない形態で発現されるので、ここで観察された変化は、そ の二ニーロン情況におけるＧＡＰ−４３の効果を疑似しない。しかしながら、実 際に、ＧＡＰ−４３は、成長円錐において豊富であるという点で、成長円錐機能 に関連しており［カップ（Ｋａｔｚ、　Ｆ、　）ら、ジャーナル・イン・二、− ロサイエンスＦ、）ら、ブロン−ディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・ イン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ）　８３：３５３７（１９８６）　；ス牛−二（Ｓｋｅｎｅ、　Ｊ 、　Ｈ，Ｐ、　）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３３ニア３８　（１９ ８６）］、ｉｎ　ｖｉｖｏまたは１ｎｖｉｔｒｏで軸索を伸延している二ニーロ ンにおいて最高レベルであり［スキｍ；（Ｓｋｅｎｅ、　Ｊ、　Ｈ，Ｐ、　）ら 、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　８９ ：８６　（１９８１）；ベノヴイノツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、　Ｖ、　Ｅ、　）ら 、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　）ＰＣ１２細胞で増加し、神経突 起成長を伴うという証拠がある。

本発明者らは、特定の理論によって結び付けようとするものではないが、これら のデータの１つの解釈は、ＧＡＰ−４３、ニューロン特異性分子はこれらの細胞 に全く新規な二ニーロン様構造を与えることができることである。別の説明は、 ＧＡＰ−４３が細胞の形状を制御するより一般的なメカニズムに関係するという ことである［プレイ（Ｂｒａｙ、　Ｄ、　）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 　２３９：８８３　（１９８ｇ）　；スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｓ、　Ｊ、　）、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４２ニア０ｇ　（１９８８）コ。

多くの細胞は、糸状足またはラメリボディアを伸延することができ、これは、細 胞サイクルの相、平板培養条件、および第２メ、センジャーのレベルを含めたい くつかの因子に依存する傾向にある「オールレッド（ＡＩ　１ｒｅｄ、　Ｌ、　 Ｅ、　）ら、サーフェイシズ・イン・ノーマル・アンド−７リグナント・セルズ （Ｓｕｒｆａｃｅｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ釦旦リ ハイネス（Ｒ，す０．　Ｈｙｎｅｓ）編（ジョーン・ウィリー・アンド・インズ （Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、二ニーヨーク、１９７９）、ｐ、 ２１コ。この理由で、まさに同一の厳格な平板培養条件下で細胞を検査した。細 胞に突起を伸延させることを可能とする細胞メカニズムは複雑であり、すべての 細胞に存在すると思われる要素を含んでいる。したがって、成長円錐の突起と線 維芽細胞の突起との類似性は、驚くべきことではない。実際、成長円錐構造は、 細胞運動を与える一般的な方法として用いられることができる皮質のアクチンの 流動および選択的付着のような細胞メカニズムを利用することが示唆されている ［プレイ（Ｂｒａｙ、　Ｄ、　）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３！ｌ ｊ：８８３　（１９８ｇ）　；スミス（Ｓ＋ｅｉｔｈ、　Ｓ、　Ｊ、　）サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４２ニア０８　（１９８８）ｌ。ＧＡＰ−４３がこ のような機構といかに関連するかを判断するかが残されている。

実施例■ さらにもう１つの本発明の態様において、ＧＡＰ−４３蛋白は、該ＧＡＰ−４３ 蛋白を細胞膜、特にニューロン細胞の成長円錐の領域へ定方向化する新規な膜− ターゲツティングペプチドドメインを含有することが判明した。この膜ターゲツ ティングドメインの構造を決定し、該ペプチドは、（通常は膜連結ではない）通 常は細胞質ゾルの蛋白を細胞膜へ定方向化するのに有効であることが示された。

本発明の本態様の組成物および方法により、とりわけ、通常は膜連結ではない蛋 白を包含する所望の蛋白のいずれも細胞膜へ定方向化することが可能である。さ らに、本発明の本態様の組成物および方法は、動物において、神経学的損傷およ び障害のｉｎ　ｖｉｔｒｏＳｉｎｖｉｖｏ、およびｉｎ　ｓｏｕ治療処置で利用 できるのは明らかである。

はとんどの膜連結蛋白は細胞膜と直接インターカレートする高疎水性ドメインを 含有することはよく知られている。しかしながら、驚くべきことに、Ｇ　Ａ　Ｐ 　−４，３は、細胞膜に連結し、特に発育または再生する二ニーロン細胞の成長 円錐と連結しているが、かかる高疎水性領域を欠くことが発見された。

今や、第２図に示すごとく、ＧＡＰ−４３蛋白は３つのエクソンにてフード付け されることが発見された。短い（１０個のアミノ酸残基）アミン末端エクソンは 、驚くべきことに、膜−ターゲツティングペプチドドメインをコード付けするこ とが発見された。第２のＧＡＰ−４３エクソンの大部分を除去した実験は残りの 蛋白の膜結合に影響を与えなかった。同様に、ＧＡＰ−４３のカルボキシ末端の 置き換えは膜結合に影響しないことが判明した。しかしながら、最初の４個のア ミノ酸（ＩＩＥＴ　　ＬＥＵ　　ＣＹＣＣＹＣ）を欠き、第５位のＭＥＴで開始 する合成ＧＡＰ−４３遺伝子はニューロンまたは非ニューロン宿主細胞の膜に結 合せず（第１１図）、これは最初のエクソンはこの膜−ターゲツティング機能の 原因であることを示す。

「膜−ターゲツティングペプチド」とは、以下の：ＭＥＴ　　ＬＥＵ　　ＣＹＣ ＣＹＣＭＥＴ　　ＡＲＧ　　ＡＲＧ　　Ｔ）ＪＲＬＹＳ　　ＧＬＮまたはその機 能的誘導体のいずれのアミノ酸配列もを意味し、それは、所望の蛋白またはペプ チドのアミノ末端またはその近くに結合した場合、該蛋白またはペプチドの細胞 膜への定方向化に影響するであろう。

本発明の膜−ターゲツティングペプチドは、手動による、または好ましくは自動 方法による直接合成を包含するがそれに限定されることのないよく知られた方法 によって所望の蛋白またはペプチドに結合させることができる。本発明の膜−タ ーゲツティングペプチドを所望の蛋白またはペプチドに結合させる別の好ましい 方法は、当該所望の蛋白またはペプチドをコード付けする遺伝子を、発現された 遺伝子産物がそのアミノ末端に膜−ターゲツティングペプチドを含むように修飾 することを含む。これは、本明細書中に記載するごとく、平滑末端または粘着末 端を結ぶ方法によって達成されるが、それらに限定されるものではない。

かくして、もう１つの態様において、本発明は、ヌクレオチド配列： ａｔｇ　ｃｔｇ　ｔｇｃ　ｔｇｔ　ａｔｇ　ａｇａ　ａｇａ　ａｃｃ　ａａａ　 ｃａｇまたはその機能的誘導体よりなる膜−ターゲノティングドメインについて コート付けするｃＤＮＡを提供するものである。

勿論、遺伝子暗号の縮ノｐのため、所望の結果をなお達成させつつヌクレオチド を変化させることは可能である。同様に、当業者ならば、ある種の例においては 、発現が特定の宿主において考えられる場合、好ましいコドン使用のため、ヌク レオチドを変更するのが望ましいことを理解するであろう。これらのおよび他の かかる修飾は本発明の範囲内のものであると考えられる。

ざらにＧＡＰ−４３膜−ターゲノティングドメインを明らかとするために、（Ｃ Ｏ５細胞、Ｎ　Ｔ　Ｈ３７３細胞、およびＣＨＯ細胞を包含する）非ニューロン 細胞およびニコーロン細胞（ＰＣ１２細胞）を、突然変異が３位（Ｃ３）および ４位（Ｃ４）の７ステインのヌクレオチド配列に導入されたＧＡＰ−４３遺伝子 を含有するプラスミドで形質転換して、代わりに、それらの位置においてアラニ ンを発現させた（第１１図）。

Ｃ３またはＣ４いずれかの突然変異の結果、膜結合か大いに減少することが判明 した。最も顕著な効果はＣ４を変更した場合に観察された。Ｃ３およびＣ４の両 突然変異は当該現象を完全に排除した。

この効果のメカニズムは明らかでないが、それらの位置にお（プる酸化状態の単 純な変更に関係しないことは明らかである。というのは、さらに、最初の４個の アミノ酸（ＭＥ１’　　ＬＥＵ　　ＣＹＣＣＹＣ）を欠き、５位のＭＥＴで開始 する合成ＧＡＰ−４３遺伝子を構築した。発現された蛋白はニューロンおよび非 ニューロン宿主細胞の膜に結合しなかった（第１１図参照）。これは、最初の４ 個のアミノ酸が膜結合に必要であることを示す。以下で考察するように、通常は 細胞質ゾルの蛋白での実験では、１０個のアミノ酸ペプチドで明らかに十分であ ることが証明された。予備データは、最初の４個のアミノ酸でも膜結合に対し十 分であることを示す。

かくして、もう１つの具体例において、本発明は、ＭＥＴ　　ＬＥＵ　　ＣＹＣ ＣＹＣ よりなるアミノ酸配列またはその機能的誘導体よりなり、その配列は、所望の蛋 白またはペプチドの膜結合を可能とするために、当該所望の蛋白またはペプチド のアミノ末端に結合させるごとができる。

さらに、エクソン１の最初の５．６．７．８または９個のアミノ酸を包含するペ プチドは、所望の蛋白またはペプチドに結合させた場合、膜結合を可能とするで あろう。当業者ならば、特定の適用における膜結合を指令するこれらの中間的長 さのペプチドの十分性は単にルーチン的技量の努力によって判断できることを理 解するであろうし、これは本発明の教示の利点でもある。従って、それと同一の もの、およびそれらと同等のものは、本発明の範囲内のものである。

追加の実験において、前記した最初のＧＡＰ−４３エクソンを、通常は細胞質ゾ ルであり、膜連結性ではない蛋白クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ（ＣＡＴ）をコード付けする遺伝子のアミノ末端に結んだ。この配列を含有 するプラスミドを用いてニューロンおよび非ニューロン細胞をトランスフェクト した（第１１図）。免疫蛍光アッセイにより、発現されたＣＡＴ蛋白は、トラン スフェクトした細胞において膜連結性であることが明らかとなった。これは、最 初のＧＡＰ−４３エクソンのアミノ酸は所望の蛋白またはペプチドの膜ターゲツ ティングを達成するのに十分であることを示す。

さらに、実験により、ＧＡＰ−４３の最初の４０個のアミノ酸は、トランスフェ クトされたＰＣＩ２細胞におけるＧＡＰ−４３と同位置へＣＡＴを定方向化する ことが示された。これらの細胞は、成長円錐によって傾いた長い突起を引き出す 点で二ニーロン細胞に似ている。ＧＡＰ−４３は、通常、特に二ニーロン細胞成 長円錐で豊富であり、データは、本発明の膜−ターゲノテイングベブチドはこの 観察された成長円錐富化の原因であることを示唆する。

さらに、本明細書中に記載した選択的な成長円錐蓄積現象を明確とするために、 本発明者らは、ＧＡＰ−４３およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼ（ＣＡ　Ｔ）を包含する融合蛋白の突然変異分析およびレーザー走査共焦 鏡検を使用した。その結果、ＧＡＰ−４３アミノ末端の短いストレッチは成長円 錐膜、特に糸状足における蓄積を指令するのに十分であることが確認された。レ ポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）ペプチドに融合した種々の量のＧＡＰ−４３アミ ノ末端をコード付けする構築体をＣＯ８およびＰＣＩ２細胞で発現すせた。クロ ラムフエニコールアセチルトランスフェラーセ（ＣＡＴ）は真核生物細胞で発現 された場合には細胞質ゾルであって、非常に安定であるので、レポーターペプチ ドとして選択した。完全なＣＡＴ蛋白に対しアミノ末端に融合したＧＡＰ−４３ の最初の１０個のアミノ酸ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱの融合蛋白（ＧＡＰ　１０ＣＡ Ｔ）、またはＣＡＴに融合したＧＡＰ−４３の最初の４０個のアミノ酸の融合蛋 白（ＧＡＰ４０ＣＡＴ）をコード付けするプラスミドを構築した。

免疫プロット法を以下のごとくに行った：　ＣＡＴに融合したＧＡＰ−４３のア ミノ末端を有するキメラ蛋白はＣＯ８細胞膜に連結する。ＣＡＴ、ＧＡＴ　１０ ＣＡＴおよびＧＡＰ４０ＣＡＴはＣＯ８細胞で一時的に発現された。抗−ＣＡＴ 抗体を用い、各トランスフェクションからの膜（Ｍ）および細胞質ゾル（Ｃ）画 分の免疫プロットを調製した。ＣＡＴ−トランスフェクトされた細胞において、 免疫反応性は細胞質ゾル画分でのみ発見され、精製したＣＡＴ蛋白と共に移動す る。免疫反応性のほとんどすべては膜連結性であり、ＣＡＴよりも大きい分子量 ４０００または１０００を有する融合蛋白について予期されるごとく、ＣＡＴよ りもゆっくりと移動する。１１６．８４．５８．４８．５．３５．６および２６ ．６キロダルトンの分子量標準を用いた。

ＧＡＰおよびＧＡＰ４０ＣＡＴの膜連結をＣＰ１２細胞で評価した。本明細書中 に記載するごとくに、ＣＡＴ、ＧＡＰ４０ＣＡＴ。

またはＧＡＰを発現する安定にトランスフクトされたＰＣ１２細胞を選択した。

膜（Ｍ）および細胞質ゾル（Ｃ）画分の免疫プロットを抗−ＣＡＴまたは抗−Ｇ ＡＰ抗体で染色した。ＣＡＴ−）ランスフェクトされた細胞（ＣＡＴ）は細胞質 ゾル中で免疫反応性を含有していたが、膜画分中では含有せず、この免疫反応性 ＣＡＴは精製したＣＡＴと共に移動した。対照的に、ＧＡＰ４０ＣＡＴトランス フェクトされた細胞（Ｇ４０ＣＡＴ）は、よりゆっくりと移動する膜一連結ＣＡ Ｔ免疫反応性を含有していた。う、ト脳（Ｂ　Ｒ）かろの画分は、すへてではな いが、はとんとの内因性Ｇ　Ａ　Ｐ　−４３免疫反応性は膜一連結性であること を示した。ＧＡ、Ｐ−４３を過剰発現するトランスフェクトＰＣＩ２細胞におい ては、ＧＡＰ−免疫反応性のほとんどすべては膜一連結性であり、精製したＧＡ Ｐ−４３と共に移動した。

ＧＡＰ−４３発現プラスミドｐＧＡＰにおいて、ＧＡＰ−４３をコード付けする 配列はシード・ビイ（Ｓｅｅｃｌ、　Ｂ、　）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３ ２９：８４０−８４６　（１９８７）によって記載されているＣＤＭ８プラスミ ドのＸｂａ１部位でスタツプ−０ｊｕｆｆｅｒ）を置き換えた。本明細書中で記 載するごとく、挿入されたＧＡＰ−４３配列は、翻訳のスタートのＮｌａ　　Ｉ １１部位から終始コドンから６８ｂｐ部位下流の５ａｕ３Ａ１部位までのラット ＧＡＰ−４３の全コーディング配列を包含していた。ＣＡＴ発現プラスミドｐＣ ＡＴについては、ＣＡＴフーディング配列およびｐＳＶ２ＣＡＴ　（ボルマン・ ンイ・エム、モファート・エル・エフおよびホワード・ビイ・エイチ（Ｇｏｒｍ ａｎ、　Ｃ，Ｍ、　、　Ｍｏｆ　ｆａｔ、’Ｌ、　Ｆ、　＆　Ｈｏｔｂａｒｄ、 　Ｂ、　Ｈ，）、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）２　：　１０４４−１０５１　　（１６８２）からのポ リアデニル化部位を含有するＨｉｎｄｌＩＩないしＢａｍＨＴ断片はスタツプ− （ｓＬｕｆｆｅｒ）およびポリアデニル化部位を含有するＣＤＭ８のＨｉ　ｎｄ ｌＩＩないしＢａｍＨＩ断片を置き換えた。

ｐＧＡＰ　１０ＣＡＴおよびｐＧＡＰ　１０ＣＡＴは、ポリリンカーの使用によ ってｐＣＡＴにおけるＣＡＴとイン・フレームにて融合シタ、各々、ＧＡＰ−４ ３の最初の４０個または１０個のアミノ酸ヲ包含する。ＣＯ８細胞の一時的トラ ンスフエクシヲンについては、ＤＥＡＥデキストランおよびクロロキンを、記載 されているごとくに用いり（ツバ−・エム・エックス、シンプソン・イー・アー ルおよびウォーター？　：／　−エム・アール（Ｚｕｂｅｒ、　Ｍ、　Ｘ、　、 　Ｓｉｍｐｓｏｎ、　Ｅ、　Ｒ，＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、　Ｍ、　Ｒ，）、サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３４　：　１２５８〜１２６１　（１９８６））。Ｐ ＣＩ２細胞の安定なトランスツクシランのたしたネオマインン耐性プラスミドを 本明細書中に記載したごとくに用いた。ＰＣＩ２細胞の選択の間に、４００μｇ ／ｍｇの活性ジェネティチン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）　（シブコ（ＧＩＢＣＯ） ）を用いた。ＰＣＩ２細胞の一時的トランスフェクションは、３００ボルトおよ び９６０マイクロフアラツドを用い、バイオ−ラド・インフーボレイション（Ｂ ｊｏ−Ｒａｄ　Ｉｎｃ、）の電気穿孔システムでの電気穿孔によって行った。

８時間後、培地を変えた。電気穿孔の２４時間後、５０ｎｇ／ｍ１２ＮＧＦの存 在下、ポリーＤ−リジンー被覆カバーガラス上で細胞を平板培養し、２４時間後 に分析した。

免疫化学アッセイのために、ラットＧＡＰ−４３のａａｌないし２４、ａａ３５ ないし５３、ａａ５３ないし６９、およびａａ２］２ないし２２Ｂを包含する４ 種のベプチＦ類に対してウサギを免疫化することによってウサキ抗−ＧＡＰ−４ ３抗体を作製した。抗−〇ＡＰ−４３抗体をＧＡＰペプチド寒天上でアフィニテ ィー精製した。臭化シアン法によってアガロースにカンブリングさせた各ペプチ ドの１０ｍｇ／ｍｃを含有する樹脂に抗−〇ＡＰ−４３抗体を結合させ、Ｔ）８ ３．５で抗体を溶出させた。ウサキ抗−ＣＡＴ抗体は５プライム（Ｐｒｉｍｅ） 　−３プライム（Ｐｒｉｍｅ）・インコーポレイテノドから入手した。第２の抗 体はオルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）、ジャクノン・ イミュノロジカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌ＋ｎｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、お よびベクター・ラブダ（Ｖｅｃｔｏｒ　ｊａｂｓ）から得た。

細胞の分画については、ＣＯ８またはＰＣＩ２細胞を１００ｍｍの密集したペト リ皿から掻き取り、２０００ｘｇにて１０分間ペレット化した。該ペレット化細 胞を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ２，１ｍＭＥＤＴＡ、Ｔ）８７．６　（３００μｆ ｆ／皿）中のポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によってホモジネート化１．４° Ｃ，２５０，ＯＯＯｘｇにて３０分間遠心した。上澄みを細胞質ゾル画分として 収集した。該ペレットを同緩衝液中のホモジネート化および遠心によって洗浄し 、次いで、細胞質ゾル画分として再懸濁して同容量とした。ラット脳を１日令ラ ットから得、１０ｍＭ！−リスーＨＣ１２，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，６（１ ０ｍ１２／ダラム湿潤重量組織）中のポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって ホ不ジ不一トした。細胞抽出物について記載したごとく、遠心によって、細胞質 ゾルおよび洗浄した膜画分をＭｌした。アンダーノンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ）　（２８）の方法の変法によってＧＡＰ−４３蛋白をうｙト脳から精 製し、免疫染色についての陽性対照として用いた。細胞質ゾルまたは膜画分の同 容Ｍ（通常１００μＱ）をポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に付した（２９ ）。蛋白を電気泳動的にニトロセルロースに移し、過剰の部位を４％ＢＳＡでブ ロックした。次いで、４０μｓ／ｍρアフィニティー精製の抗−ＧＡＰで、また は抗−ＣＡＴ抗体の１：１０００希釈で、４℃にて、膜を２４時間インキュベー トした。製造業者の指示に従い、抗−ウサギ・ベクタスティン（Ｖｅｃｔａｓｔ ａｉｎ）ホースラブイノシーベルオキシダーゼ法を用い、結合した抗体を検出し た。ペルオキシダーゼ基質としては、テトラメチルベンジジン（キルケガードお よびペリイ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ）、ガイセルスブルグ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を使用した。

免疫プロット法により、ＣＯ８細胞またはＰＣ１２細胞で発現されたＣＡＴは細 胞質ゾル画分にのみ存在することが明らかとなった。

対照的に、キメラ蛋白ＧＡＰＩＯＣＡＴおよびＧＡＰ４０ＣＡＴは膜連結性であ る。融合蛋白は洗剤によって抽出されるが、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、 またはＥＧＴＡによっては抽出されない。

かくして、この膜結合の性質はラット脳中における天然ＧＡＰ−４３の性質と同 様である（ペローネービゾゼロ・エヌ・アイ、シイネル・ディ、ハウザー・シイ およびベノビソッ・エル・アイ（Ｐｅｒｒｏｎｅ−Ｂｉｚｚｏｚｅｒｏ、　Ｎ、 　１．　、　Ｗｅｉｎｅｒ、　ＤｌＨａｕｓｅｒ、　Ｇ、　＆　Ｂｅｎｏｗｉｔ ｚ、　Ｌ、　１．　）、ジャ[ ナル・イン・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅ ｓ、　）２０：３４６−３５０　（１９８８）：エストライヘル・エイ・ビイ、 パン・ドンフン・シイ・ジェイ、ツビールス・エイチおよびジスペン・ダブりニ ー・エイチ（Ｏｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ、　Ａ、　Ｂ、　、　Ｖａｎ　Ｄｏｎｇｅ ｎ、　Ｃ，Ｊ、　。

Ｚｖｉｅｒｓ、　Ｈ，＆　Ｇ１５ｐｅｎ、　１．　Ｈ，）、ジャーナル・イン・ 二ニーロケミスドリー（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅａ、）４１　：　３３１−３４０ 　（１９８３）　　；シャン・ニス・シイ、ムラカミ・ケイおよびロウテンペル グ・エイ（Ｃｈａｎ、　Ｓ。

Ｙ、　、　Ｍｕｒａｋａｍｉ、　Ｋ、　＆　Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ、＾、）、 ジャーナル・イン・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）６　：　３ ６１８−３６２７　（１９８６）　　；スケネ・ジェイ・エイチ・ビイおよびビ ラグ・アイ（Ｓｋｅｎｅ、　Ｊ、　Ｈ，Ｐ。

＆　Ｖｉｒａｇ）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ）１０８・６１３−６２４　（１９８９）　）。

アミノ末端がニューロン細胞におけるＧＡＰ−４３の成長円錐富化を説明するか 否かを判断するために、ＰＣＩ２細胞のＮＧＦ−処理トランスフェクト体におけ るＧＡＰ−４３およびＧＡＰ−ＣＡＴキメラ蛋白の細胞分布を共焦鏡検によって 調べた。このアッセイによると、ＧＡＰ−４３は成長円錐が顕著に豊富な斑点状 パターン、二１−ロンにおける天然ＧＡＰ−４３のものと同様のパターンで分布 するのに対し、ＣＡＴは細胞質ゾルのままである。ＣＡＴに融合したＧＡＰ−４ ３のアミノ末端は、得られた融合蛋白をしてＧＡＰ−４３自体の分布に非常によ く似た分布を獲得せしめた。ＧＡＰ−４３およびキメラ蛋白双方の核周囲標識は 低レベルで検出され、これは天然ＧＡＰ−４３で観察されたように（パン・ホー ７・シイ・オー曇エム、ポルスイス０ンイーエム、ニストライへルーエイ−ビイ 、ブージストラ・ジェイ、デ・グラン・ビイ・エヌ・イーおよびジスペン・ダブ りニー・エイチ（Ｖａｎ　Ｈｏｏｆｆ、　Ｃ，０，Ｍ、　、　Ｈｏ１ｔｈｕｉｓ 、　Ｃ，Ｍ、　。

０ｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ、　Ａ、　Ｂ、　、　Ｂｏｏｎｓｔｒａ、　　Ｊ、　、 　Ｄｅ　Ｇｒａａｎ、　Ｐ、　Ｎ、　Ｅ、　＆　Ｇ１５ｐｅ氏A　Ｌ　Ｈ，Ｊ、 　） 、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　１ ０８：１１１５〜１１２５　（１９８９））、ゴルジへの局在のためであろう。

グルタルアルデヒド固定により、成長円錐の細い突起の良好な組織保存がなされ 、キメラ蛋白は特に糸状足内に蓄積することが明らかとなった。

トランスフェクトしたＰＣＩ２細胞におけるＣＡＴ、ＧＡＰ−４３および融合蛋 白の細胞下位置決めは以下のごとくに行った：ＰＣ１２細胞における（Ａ）ＣＡ Ｔ、（Ｂ）ＧＡＰ−４３、（Ｃ）ＧＡＰ４０ＣＡＴ、および（Ｄ）ＧＡＰ　１０ ＣＡＴの共焦免疫蛍光により、ＧＡＰ−４３は斑点状で膜に局在し、成長円錐で いくらか豊富であるのに対し、ＣＡＴ標識は散漫で細胞質ゾルであることが明ら かとなった。アミノ末端の４０個のアミノ酸（ＧＡＰ４０ＣＡＴ）または１０個 のアミノ酸（ＧＡＰ　１０ＣＡＴ）いずれかをＣＡＴに融合させた場合、免疫蛍 光の分布は、成長円錐での富化を含めてＧＡＰ−４３についての分布に似ていた 。固定に先立ち、すべての細胞をＮＧＦで２４時間処理した。Ｇ、ＡＰ−４３に ついては抗−ＧＡＰ−４３抗体を用イタノニ対し、ＣＡＴ、ＧＡＰ４０ＣＡＴお よびＧＡＰｌｏＣＡＴについては抗−ＣＡＴ抗体を用いた。この変異体の対照Ｐ Ｃ１２細胞は検出不可能なレベルのＧＡＰ−４３およびＣＡＴ免疫反応性を発現 した。５０μｇ／ｍＱの神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、免疫蛍光の２４時 間前に、ＰＣＩ２細胞をポリーＤ−リジン被覆カバーガラスに移した。３，７％ ホルムアルデヒドで７分間固定ｔ２．０．１％トリトン−Ｘ−１００を３分間浸 透させた。試料をＰＢＳ中の４％ＢＳＡで１時間ブロックし、−次抗体中で１時 間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ，Ｏ，にて１５分 間インキコベートして（バックグラウンドを減少させ）、再度すすぎ、二次抗体 中で１時間インキュベートした。ＰＢＳで数回洗浄した後、カバーガラスを水で すすぎ、０４％没食子酸ｎ−プロピルを含有するゲルハトール（Ｇｅｌｖａｔｏ ｌ）で処理して辺色を減少させた。細胞が特異的抗原を含有しない場合、または −次または二次抗体が省略された場合、免疫蛍光はバックグラウンドを超えては 検出できなかった。

抗−ＣＡＴ抗体で標識し、ノマルスキイ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）のオプティックス ・アンドφスキャンニング・コンフォーカル・イミュノフルオレセンス（ｏｐｔ ｉｃｓ　ａｎｄ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ ｒｅｓｃｅｎｃｅ）法で観察したＧＡＰ４０ＣＡＴを発現するＰＣ１２細胞の高 出力比較を用いて、ＰＣ１２細胞の成長円錐内のＧＡＰ４０ＣＡＴの局在を証明 した。細胞はＮＧＦで７日間処理したものであった。１の大きな成長円錐は明る く標識されて見えたが、小さなものはそうではなかった。たとえ同一の細胞であ ってもその異なる成長円錐で同等でない標識がニューロン中の天然ＧＡＰ−４３ で起こる（ゴスリン・ケイ、シュレイヤー・ディ・ジエイ、スケネ・ジェイ・エ イチ・ビイおよびバンカー・シイ（Ｇｏｓ　ｌ　ｉｎ、　Ｋ、　、　５ｃｈｒｅ ｙｅｒ、　Ｄ、　Ｊ、　、　５ｋｅｎｅ、　Ｊ、　Ｌ　Ｐ。

＆　Ｂｓｎｋｅｒ、　Ｇ、　）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３６　：　６７ ２〜６７４　（１９８８））。ノマルスキイ（Ｎｏａａｒｓｋｉ）および免疫蛍 光の像の比較により、糸状足は特に標識されることが示された。同様の結果がＧ ＡＰ１０ＣＡＴについて観察された。

高分解能共焦鏡検については、糸状足の細かい構造を保存するのに必須の新たに 作成した４％パラホルムアルデヒドおよび０．５％グルタルアルデヒド、続いて 、０．１％トリトン−Ｘ−１ｏｏで３分子ｌＪｊ、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍ（！ホ ウ水素化ナトリウムで］０分間細胞を固定した。共焦分析では、バイオラド（Ｂ ｉｏｒａｄ）のＭＲＣ−５００走査型共焦イメージングシステムおよびツェイス ・アキジオプラン（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｌａｎ）顕微鏡を使用した。

これらの実験は、ＧＡＰ−４３の最初の１０個のアミノ酸が成長円錐蓄積を指令 するのに十分であるという本発明者らの驚くべき発見を確認するものである。本 発明者らは、成長円錐膜中に蓄積する少なくとも１の他の非細胞膜内蛋白５ＣＧ ＩＯ（スティン・アール、モリ・エフ、マチコーズ・ケイ、ロー・エル・エイお よびアンダーノン・ディ・ジェイ（Ｓｔｅｉｎ、　Ｒ，、Ｍｏｒｉ、　Ｎ、　、 　Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｋ、　、　Ｌｏ、　Ｌ、　−Ｃ，＆＾ｎｄｅｒｓｏｎ、 　Ｄ、　Ｊ、　）　、ニューロン位置２２および２４）にもかかわらず、ＧＡＰ −４３アミノ末端に密接に関連する配列を有する他の蛋白を知らない。

偏光をかけた上皮細胞において、異なる蛋白は、膜蛋白および分泌蛋白の輸送を それらの個々の目的場所に向けて指令する信号と同様の、蛋白内の選別信号に依 存すると考えられる突起（ライフナ−・ダブリュー・ティおよびロデ、シュ・エ イチ・エフ（Ｗｉｃｋｎｅｒ、　Ｗ、丁。

＆　Ｌｏｄｉｓｈ、　Ｈ，Ｆ、　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０　： 　４００−４０７（１９８５）；ベルナー・ケイおよびシャ、ツ・シイ（Ｖｅｒ ｎｅｒ、　Ｋ、　＆　５ｃ−ｈａｔｚ、　Ｇ、）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４１　：　１３０７〜１３１３　（１９８８）；フェファー・ニス・アールお よびロスマン・シェイ・イー（Ｐｆｅｆｆｅｒ、　Ｓ、　Ｒ，＆　Ｒｏｔｈｍａ ｎ＋　Ｊ、　Ｅ、　）、アヌ・レブ・バイオケム（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｔ）５６　：　８２９〜８５２　（１９８７）　）を先端 および基底外側原形質膜に（マトリン・ケイ・ニス（Ｍａｔｌｉｎ、　Ｋ、　Ｓ 、　）、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 ）　１０３　：　２５８５−２５６８（１９８６）；ロジリゲスーボラン・イー ・ジエイおよびサバテーニ・ディ・ディ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌａｎ、 　Ｅ、　Ｊ、　＆　５ａｂａｔｉｎｉ。

Ｄ、Ｄ、）、プロシーディングズ・イン・ナショナル・アカデミ−・イン・サン エンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、／＋ｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ　７５　： 　５０７１〜５０７５　（１９７８）；シセンズ・ケイおよびフレー・ニス・テ ィ（Ｓｉｍｏｎｓ、　Ｋ、　＆　Ｆｕｌｌｅｒ、　Ｓ、　Ｄ、　）アヌ・レブ・ セル・パイオル（Ａｎｎ　Ｒｅｓ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１　：　２４３〜２８８　（１９８５）　）蓄積する。

上皮細胞の場合は、かかる信号は先端および基底外側としての原形質膜の異なる 領域も認識するであろう。

ニューロンにおいては、成長円錐膜はその蛋白構造でも区別される。ｌの興味深 い可能性は、成長円錐膜がＧＡＰ−４３のパルミチル化アミノ末端を認識しそれ を結合させる結合部位を有することである。本発明者らはいずれかの特定の説に 拘束されるつもりはないが、バルミチル化残基は脂質二層と直接相互作用するも のではないらしい。何故ならば、それはＧＡＰ−４３についてのより均一な膜分 布を引き起こすようだからである。この線に沿って、もう１つのアシル化蛋白の 脂肪酸部位、ポリオウィルスのＮ−ミリスチル化ＶＰ４は、Ｘ線回折によって、 他のウィルス蛋白の特異的アミノ酸残基と相互作用するが脂質二重層とは相互作 用しないことが示されている（シコルツ・エイ・エム、ヘンダーノン・エル・イ ーおよびオロスズラン・ニス（Ｓｃｈｕｌｔｚ、　Ａ、　Ｍ、　、　Ｈｅｎｄｅ ｒｓｏｎ、　Ｌ、　Ｅ、　＆　０ｒｏｓｚｌａｎ、　Ｓ、　）、アヌ・レブ・セ ル・パイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｓ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）４：６１１〜６４７　 （１９８Ｂ）；ショウ・エム、ニューマン・ジエイ・エフ、フィルマン・ディ、 ホグル・ジェイ・エム、ロウランズ・ディ・ジェイおよびブラウン・エフ（Ｃｈ ｏｗ、　Ｍ、　、　Ｎｅｗｍａｎ、　Ｊ、　Ｆ、　、　Ｆ　１ｌｓａｎ、　Ｄ、 　、　Ｈｏｇｌｅ。

Ｊ、　Ｍ、　、　Ｒｏｖｌａｎｄｓ、　Ｄ、　Ｊ、　＆　Ｂｒｏｗｎ、　Ｆ、　 ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）３２７　：　４８２〜４８６（１９８７’） ）。ＧＡＰ　　４３およびＧＡＰ−ＣＡＴ融合蛋白は非ニューロン細胞の膜に結 合するので、同様のまたは同一の結合部位が他の細胞タイプに存在しなければな らないが、ＧＡＰ−４３は二ニーロンー特異的である故に、これらの部位は恐ら くは非ニューロン細胞における異なる蛋白についての標的であろう。

ＧＡＰ−４３の選別ドメインは特に糸状足における富化を引き起こすことは注目 される。電子顕微鏡検査によって証明されたごとく（パンーホーフ・シイ・オー ・エム、ホルスイス・シイ・エム、エストライヘル・エイ・ビー、ブーンストラ ・ジエイ、デ・グラーン・ビイ・エヌ・イーおよびジスペン・タブリニー・エイ チ（Ｖａｎ　Ｈｏｏｈｈ。

Ｃ，Ｏ，Ｍ、　、　Ｈｏ１ｔｈｕｉｓ、　Ｃ，Ｍ、　、　０ｅｓｔｒｅｉｃｈｅ ｒ、　Ａ、　Ｂ、　、　Ｂｏｏｎｓｔｒａ、　Ｊ、　、　Ｄ■@Ｇｒａａｎ、　 Ｐ。

Ｎ、　Ｅ、　＆　Ｇ１５ｐｅｎ、　Ｗ、　Ｈ，）、ジャーナル・オプ・セル・バ イオロジーＵ。

Ｃｅ１１Ｂｉｏ１．）１０８：　１１１５〜１１２５　（１９８９））、これは 、これらの細胞におけるＧＡＰ−４３の通常の位置である。トランスフェクトさ れたＧＡＰ−４３が本明細書中に記載するごとき糸状足を延長させる非ニー−ロ ン細胞の性向を増強させる観察があれば、ＧＡＰ−４３の位置を特定の糸状足の 運動活性と関係付けるのは興味深いであろう。

かくして、本発明は、もう１つの態様において、所望の蛋白またはペプチドをニ ューロンまたは非ニューロン細胞の股領域に導入する方法、および所望の蛋白ま たはペプチドをニコーロン細胞の成長円錐領域へ定方向化する方法を提供する。

１の例示的具体例において、 （ａ） ！　、　　　　ＭＥＴ　ＬＥｔｌ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　 ＴＨＲＬＹＳ　ＧＬＮ　；Ｉｔ　、　　　　ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　 ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲＬＹＳ　。

１、　　　　　　ＭＥＴ　ＬＥＤ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　 ＴＨＲ；ＩＶ、　　　　　　　ＭＥＴ　ＬＥＤ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲ Ｇ　ＡＲＧ　。

Ｖ、　　　　　　　　ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　。

Ｖｌ、　　　　　　　　　ＭＥＴ　ＬＥＬＩ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　；■、 　　　　　　　　　ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　；および■　　　その機 能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなる膜−ターゲツティングペプチド を所望の蛋白またはペプチドのアミノ末端に結び；次いで、 （ｂ）該膜−ターゲノティングドメインよりなる得られた蛋白またハヘフチドを 細胞に導入することよりなり、工程（ｂ）の得られた蛋白またはペプチドは該膜 −ターゲノティングドメインにより該細胞の該膜へ定方向化されていることを特 徴とする該所望の蛋白またはペプチドを細胞の膜へ定方向化する方法が提供され る。

もう１つの非限定的例示具体例において、本発明は、前記アミノ酸配列またはそ れらの機能的または化学的誘導体よりなる膜−ターゲツティングペプチドをコー ド付けするヌクレオチド配列、ならびによく知られた方法によるＧＡＰ−４３以 外の蛋白またはペプチド（ならびにＧＡＰ−４３自体）をコード付けするヌクレ オチド配列へのこれらの配列の付加、および当業者によく知られた方法による得 られた配列の原核生物または真核生物宿主における発現を提供する。

勿論、本明細書中に記載するごとく、所望の蛋白またはペプチドを診断用または 治療用に標識することができ、本発明の本態様の組成物および方法の利用性は当 業者に明らかであろうし、単にルーチン的な技量の努力でもって、ヒトを含めた 動物において、ｉｎνｉ　ｔ　ｒｏ。

ｉｎ　ｖｉｖｏ、またはｉｎ　５ｉｔｕにての診断または治療目的で容易に利用 できる。

実施例■ ＧＡＰ−４３の全う／トゲノミツクＤＮＡのクローニングおよび調節部位の同定 本明細書中に記載するごとき本発明者らの成果は、ＧＡＰ−４３調節か遺伝子発 現のレベルで起こることを強く示唆する。しがしなカラ、現在まで、その発現を 調節し得る／スまたはトランス作用要素については何も知られていなかった。元 来、その応答性を成長因子に付与するＧＡＰ−４３遺伝子の要素を定義し、発現 の細胞制限を引き起こし、および神経系の発育の間に該遺伝子を調節するのは非 常に興味深い。調節要素を同定するために、ＧＡＰ−４３の全うノトゲノミノク ＤＮＡをクローン化した。

従って、ゲノミノクＧＡＰ−４３を単離し、そのイントロン−エクソン境界およ び転写スタート部位をマツプした。驚くべきことに、プロモーターはその構造が かなり異常であり、異常なフンフォメーションを形成できる反復配列を含有し、 いくつかの正準なプロモーター成分を欠いている。転写は１を超える部位から開 始でき、スタート部位のうちいくつかは中枢および末梢神経系で異なって利用さ れる。

さらに、本発明者らは、Ｇ　、Ａ　Ｐ　−４３プロモーターが脳−特異的核蛋白 によって認識される領域を含有するか否かを調べた。該ＧＡＰプロモーターの領 域をゲル電気泳動移動度ンフトによって調へ、脳核抽出物には存在するか肝臓核 抽出物には存在しない蛋白（類）を結合させるドメインを同定した。結合活性は 脳の成熟に伴って減少する。結合部位は約２０ヌクレオチドのストレッチに限定 され、それは、また、脳核抽出物によるＤＮａｓｅ保護アッセイにおいて特異的 に保護されるが、肝臓抽出物によるとそうではない。該領域はＰＯＵとして公知 のクラスのＤＮＡ結合蛋白によって認識される結合部位と同様の配列を有する。

これらの結果は、脳−特異的核蛋白かＧＡＰ−４３の上流の特異的領域に結合す ることを示唆する。

実験手法 ゲノミ２．ククローニングおよびマツピングクローニングで用いたすべての方法 はアウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔａｔ）Ｅｉ、カラント・プロトコルズ・ イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー・アンド・イン ズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、出版者、（１９８７）によって記 載されたものであった。すへての酵素は二ニー・イングランド・バイオロジー（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｊｏｉａｂｓ）から購入した。３つのＧＡＰ−４３ エクソンを含有するゲノミノククローンは、う、ト・ゲ／ミックＤＮＡのサイズ 分画５ａｕｌｌｌＡ部分消化物をバタテリオファージＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　−３のＢ ａｍＨＩに挿入することによって構築したライブラリーから単離した。

該ライブラリーを、まず、前記したごとく、コロニー・プラーク・スクリーン・ フィルター（デュポン（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ））　、続いてのランダムに初回 抗原攻撃したＧＡＰ　　４３ｃＤＮＡでの標準的なプロトコルにてスクリーニン グした。エクソンｌを見つけるために、該ライブラリーを再度平板培養し、ｃＤ ＮＡの最も５°領域に相補的な３のオリゴヌクレオチド（第１４図において、＃ ４．−６８ないし−３９；＃２．　　３８ないし−９およびｓｓ、−＋−ｉない し、＋２０）で重複リフ）　（ｌｉｆｔ）を順次プローブした。少なくとも２の オリゴヌクレオチドについて陽性のクローンをさらなる分析用に選択した。

種々の制限酵素でのマツピングのために、陽性ファージからのインサートをｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の５ａ１ １部位に継代クローン化した。

Ｈ−ＤＮＡゲル （酢酸でｐＨ７，４またはｐＨ４，０に調整した）４５ｍＭ）リス塩基を緩衝液 として用い、２０２５ｃｍ長の１．４％アガロースゲルを注いだ。負荷緩衝液は ５％グリセロール、Ｏｉ％ブロモフェノールブルーおよび０．１％キシレン／ア ノールを含有する電気泳動緩衝液であった。第１５図の凡例に掲げたプラスミド ｂｓ１．５ＲＩＸ４を含有するエクソンＩの消化物をゲルに負荷し、２０Ｖで１ ６時間泳動させ、ｐｌ）９のトリス酢酸塩中のエチジウムブロマイドで染色し、 脱色し、写真にとった。

配列決定 供給業者（ＵＳＢ）によって記載されているごと（にシクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅ ｎａｓｅ）を用い、リンガ−ら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａり、プロシーディング ズ・イン・ナショナル・アカデミ−・イン・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７４　：　５４６３〜５４６７　（１９７７）の ジデオキシ法によってＧＡＰ−４３プロモーターを配列決定した。

二本鎖配列決定についてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ストラタジーン（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ））および−重鎖配列決定についてはＭ１３ベクター（メシング （Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メス・エンザイモル（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）１ 旦１：２０〜７Ｂ　（１９８３））での標準的な方法によって、最初のエクソン を含有するパイテリオファージクローンの継代クローンを構築した。

ＲＮＡ５ｅマツピング クリーブおよびメルトン（Ｋｒｉｅｇ　ａｎｄ　Ｍｅｌｔｏｎ）、メス、・エン ザイモル（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）１旦５　：　３９７〜４１５　（ １９・８７）に記載されているごとくにＲＮＡ５ｅ保護分析を行った。該保護に ついては、翻訳スタート部位から−４７５のＸｂａ　Ｉ部位から＋８３の５ｓｐ １部位（最初のイントロン中）に至るＧＡＰ　　４３のゲノミ・ツク片をｐＳＰ ７２　（プロメガ（Ｐｒｏ＊ｅｇａ））のＸｂａ　ＩおよびＥｃ。

ＲＶ部位にクローンした。

ＲＮＡ５ｅ保護分析は翻訳スタート部位から−４７／４８、−５］１５２および 一７８塩基の３種の主要ＧＡＰ−４３転写体を示した。新生児ラットの肺、後根 神経節、および大脳皮質から調製したｔＲＮＡ、ＲＮＡについて保護を行った。

プローブは翻訳スタート部位（Ｘｂａ１部位）から４７５塩基上流に伸びるもの であった。

過剰暴露は、ＤＲＧとは反対に、大脳皮質にがなり豊富な長い転写体をさらに示 した。マーカーはＭＳＰＩＩ消化のｐＢＲ３２２であった。

他のＲＮＡ５　ｅ保護は、神経系の異なる領域およびＰＣ１２細胞でＧＡＰ−４ ３転写体の不均質性を示すよう行った。対ＭＰＣＩ　２細胞からのＲＮＡをＮＧ Ｆ処理のＰＣ１２細胞、ｔＲＮＡ、ＤＲＧ。

小脳、皮質、および海馬から得たものと比較した。ＣＮＳ由来のＲＮＡ試料はＤ ＲＧまたはＰＣＩ２細胞からの試料よりも高い割合の長い転写体を有していた。

もう１つのＲＮＡ５　ｅ保護分析において、前記したプラスミドをＮｄｅｌおよ びＨｉｎｄｌｌｌて消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で満たすことに よって、−２３３のＮｄｃ１部位がら上８３の同５ｓｐ１部位のＧＡＰ−４３の ゲノミック片をクローン化した。

ＨｉｎｄｌＩ部位を再形成した。すべての場合において、ベクターをＨｉｎｄｎ Ｉで直線化した後、転写体をＴ７ポリメラーゼで延長した。

かくして、この部位を超えて伸びるすべての転写体は−２３４の単一バンドとし て集まる。新生児ラットの心臓、肝臓、肺、小脳、を髄、皮質、海馬、および後 根神経節からのＲＮＡ試料を用いた。群としてのより長い上流スタート部位は中 枢神経系組織においてＲＮＡの重要な画分を構成していたが、後根神経節では構 成していなかった。

前記したごとく、ＧＡＰ−４３ｃＤＮＡから得たプローブでラット・ゲノミソク ライブラリーをスクリーニングした。放射能標識した全長ｃＤＮＡでの最初のス クリーニングにより２のクラスのファージが得られ、引き続いての分析により、 遺伝子の第２および第３エクソンに対応することが示された。第１のエクソンは 小さく、従って我々のｃＤＮＡプローブでは十分に表されていないことが判明し たので、該ｃＤＮＡの最も５′側領域からの３のオリゴヌクレオチドプローブを 用いるさらなるラウンドのスクリーニングが該遺伝子の５°末端を含有するクロ ーンを得るために必要であった。

ＧＡＰ−４３遺伝子のマツプを第１３ａ図に示し、それをマツプするのに用いた ファージも共に表示する。該遺伝子は少なくとも５０ｋｂにわたり、３つの小さ いエクソンを含有する。最初のは約８０ｂｐ　（５°末端の変異性の記載につい ては後記参照）、第２番目のは５６５ｂｐであって、第３番目のは６７２ｂｐで あり、それらは、各々、２４ｋｔ）および２０ｋｂを越える２つのイントロンに よって隔てられている。

第１のエクソンはｍＲＮＡの５“非翻訳配列を含有し、蛋白の最初の１０個のア ミノ酸をコード付けする。当該蛋白のこの短いアミノ末端領域は、前記したごと く、ＧＡＰ−４３（および異種融合蛋白）の成長円錐膜への結合を指令する一選 別配列二を含有する。第２のエクソンは蛋白バルクをコード付けし、カルモジュ リン結合部位としてアレキサンターら（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ジ ャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　）、λｌ１ニア５４４〜７５４９　（１９８８）によって同定された領域を 包含する。第３のエクソンはカルボキシ末端の２８個のアミノ酸をコード付けし 、非翻訳配列の５８７塩基およびボ’Ｊ−Ａ付加部位を含有する。

第１３ｂ図に示したイントロン−エクソン境界は配列決定法によって同定したも のであり、コンセンサススプライス部位（マウント（Ｍｏｕｎｔ）、ヌクレイツ ク・アシ、ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）上０：４５９〜４ ７２（１９８２））に適合する。ここに示したポリアデニル化部位はＲＮＡ５ｅ 保護によって確認したものであり、ローインタールら（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ　ｅ ｔ　ａｌ）、イー・エム・ビイ・オー（ＥＭＢＯ）６　：　３６４１−３６４６ 　（］、９８７）によって主要部位として予測されたものである。しばしば、ポ リＡ付加部位の直ぐ３°側に見い出されるコンセンサスモチーフ（＋ｏｔｉｆ） のタンデム対（ＹＧＴＧＴＴＹＹ）（７クラウヒラン（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ） 、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）］ 　３　：　１３４７〜１３６８（１９８５））には図中で下線を引いた。

ＧＡＰ−４３プロモーターはＨ−ＤＮＡを含有する。

遺伝子の５′領域の配列を第１４図に示す。それは、ＴＡＴＡまたはＣＡＡＴボ ックスを含有しないが、コンセンサスｐｉｔ−１結合部位と同一である配列ＴＡ ＴＴＣＡＴＧ　（上線）を含有する。このオクタマーはプロラクチンおよび成長 ホルモンを含めていくつかの遺伝子の転写を調節すると考えられるクラスの蛋白 を結合させる（ボンターら（Ｂｏｎｄｅｒ　ｅｔ　ａ、］）、セル（Ｃｅ１１） 、５５：５０５〜５１８　（１９８８ン　；イングラハムら（Ｉｎｇｒａｈａｍ 　ｅｔ　ａｉ）、セル（Ｃｅｌｌ）亜＝５１９〜５２９　（１９８Ｂ））。

プロモーター配列の驚くべき特徴は、８０％を超えるコーディング鎖がプリン類 よりなり（図中にて星印を下に記す）、各々、−１１８ないし−１８８、および −２３８ないし−３７０にわたる２の連続プリンホモポリマーストレッチがある ことである。ＧおよびＡを単に変更しないこれらのホモポリマーストレンチのい つくかの領域は、幾分鏡映対称性を持つタンデム反復を含有する（例えば、−１ ６８ないし−１１８）。−１１２、−２３２および−５０９に中心をもつ自己相 補的配列を形成するヘアピンはホモポリマー領域の両側にあり、二次構造に影響 し得る。

ブリンービリミジンホモボリマーストレノチ、特に鏡映対称性を持つもの（ミル キン（Ｍｉｒｋｉｎ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３３０　：　４９５〜 ４９７　（１９８７）’）は、Ｈ−ＤＮＡなる語の３Ｍ鎖コンフォメーションを とる可能性がある（レビューについては、ウェルズら（Ｙｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ ）、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ−Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅ！１１．）２６３　＋　１０９５−１０９８（１９８８）：フトーンおよびダ ルベルブ（ｌｌｔｕｎ　ａｎｄ　Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ ｃｅ）２４：３：１５７１〜１５７６　（１９８９）　）。

ＧＡＰ−４３プロモーターがｉｎ　ｖｉｔｒｏで強力な二次構造を含有すること がまず示されたのは、それを配列決定しているときであった。

配列決定は二本鎖ジデオキシ法を用いてルーチン的に達成されるが、この技術を ＧＡＰ−４３プロモーター・に適用する場合、読ろ取り可能な配列は−２５０に おけるホモポリマー領域に到達すると突然止まる。−重鎖配列決定のために小さ な断片をＭｌ　３に継代クローニングした後でのみ、本発明者らは該配列に到達 することかできた。

フトーンおよびクルベルブ（Ｈｔｕｎ　ａｎｄ　Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、づイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４１−：　１７９１〜１７９５　（１９８８）は、Ｈ −ＤＮＡがＤＮＡ中にひどいもつれを導入することを証明する単純なゲル系を発 明している。それらのアッセイは低ｐＨにおけるＨ−ＤＮＡの安定性の促進に基 づくものである。Ｈ−形成領域を含有するＤＮＡの断片を低ｐ）（で電気泳動に 付した場合、Ｈ−ＤＮＡ誘導のもつれは、Ｈ−Ｄ　Ｎ　Ａ形成に好都合でないｐ Ｈでの移動性ど比較して、移動を遅くする（フトーンおよびタルベルブ（Ｈｔｕ ｒ＋　ａｎｄ　Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、（１９８８）、前掲）。本発明者らは、Ｇ 　Ａ　Ｐ−４：３プロモーター中の−２４０ないし−３７０からのブリ／ホモポ ラ−領域が！ｎ　ｖｉｔｒ。

で直線状ＤＮＡ中で安定なＨ−ＤＮＡ構造を形成することができることを証明す るこの移動度シフト法を開発した。

第１５図は後記するごとくゲル電気泳動によって分析したＧＡＰ−４３プロモー ターの制限消化断片を表すものである。可能な１ｌ−ＤＮＡ形成ホモプリン−ホ モピリミジン領域を太線で示す。ゲル電気泳動を行うに際しでは、第１５図に表 した消化物の一部を、予めｐＨ７，４または４．０いずれかにてトリス−酢酸塩 で平衡化しである１、４％アガロースゲル上に負荷し、平行し２て泳動させた。

ｐＨ４でンフトしたバンドはＢないしＨ塩基転位に由来する可能性がある塗抹を 呈した（フトーンおよびダルベルブ（Ｈｔｕｎ　ａｎｄ　Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４１　：　１７９１〜ｌ　７９５（１９８８ ））。

ホモポリマー領域Ｉ　（すなわち、上流（−２４０ないし−３７０）オモプリン ストレノチを含有する断片）を含有するバンドのみが本ｒ７セイにおいてｐＨ４ ，０にて移動度の変化を示した。マーカーまたはプロモーター領域の外部からの プラスミドの断片、または領域Ｉから分離した場合の領域■および■を含有する 断片にあっても、観察可能なシフトはなか−）た。かくして、上流領域のみがそ れ自体についてのシ゛７トを示した。領域■および■を含有する断片はｐＨ４で はシフトしなかったことに注意されたい。ホモポリマー領域の外部のＤ　Ｎ　Ａ を徐々に除去すると、移動度の相対的シフトが増加した。領域Ｉを同様のサイズ とした断片中に単独で存在させた場合よりも領域■を領域■と共に断片中に包含 させた場合の方がかなり大きな移動度のシフトが観察された。本アッセイにおい ては、領域■および■はそれら自体のシフトに影響を与えることができなかった が、それらは上流領域と協同して作用するかも知れない。

ＧＡＰ−４３転写開始の不均質性 ＧＡＰ−４３上流配列のもう１つの注目すべき特徴はＴＡＴＡモチーフが存在し ないことである。転写の開始を指令するＴＡＴＡ配列を欠（遺伝子はしばしば多 １１ｍＲＮＡスタート部位を有する。これはＧＡＰ−４３について当てはまるこ とが判明した。ＲＮＡ　ｓ　ｅ保護分析を用いて、いつくかの組織で、ＧＡＰ− ４３についての転写スタート部位を決定した。肺、後根神経節（ＤＲＧ＞および 大脳皮質（ＣＴ　Ｘ）からのＲＮＡを、翻訳スタート部位から一４７５塩基まで 伸びるプローブで分析した。このプローブを用い、−４７／〜４８、−５１／− ５２、および−７８の転写スタート部位に対応させて、３つの主要バンドを保護 した。これらの同部位はブライマー伸長によって同一性を確認した。さらに、従 たるバンドは長時間の暴露の後、可視化された。

−２３０あたりのいくつかの転写体は、後根神経節と比較して、大脳皮質からの ｍＲＮＡにおいて、かなりの程度存在する。中枢神経系と末梢神経系におけるＧ ＡＰ−４３遺伝子発現の調節は異なる（スケネら）　５ｋｅｎｅ　ｅｔ　ａｌ） 、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー　（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）８旦 ：８６〜９５；ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ、）８９　：　９６〜１０３　（１９８１）　）ことを示唆する観察を考慮す ると、これは興味深いことである。よって、ＣＮＳの他の領域、ならびに（交感 神経副腎前駆細胞に由来すると信じられている）ＰＣＩ２細胞からのＲＮＡを分 析した。海馬、皮質および小脳からのＲＮＡは、ＤＲＧまたはＰＣＩ２細胞から のＲＮＡよりも、−２３０あたりの領域から開始する転写体の割合が高い。しか しながら、これらのより長いメツセージの各々の量は比較的少ない。−２３４を 越えてスタートするすべてのメツセージをプールするプローブを用いた場合、Ｃ Ｎ　ＳとＰＮＳにおけるスタート部位間の差異はより明確となった。この分析は 、より長いＧＡＰ−４３転写体は、現実に、−緒になって、全ＧＡＰ−４３転写 体の重要な両分を説明すること、およびこれらの転写体はＤＲＧまたはＰＣ１２ 細胞からのＲＮＡよりもＣＮＳからのＲＮＡにおいて普通であることを示した。

要するに、ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡの５′端部は異種起源であり、上流スタート部 位は、末梢神経系と比較すると、中枢神経系で使用するのが普通である。

考察 本発明の本具体例は、ＧＡＰ−４３遺伝子を含有するゲノミノク配列の単離およ び特徴付けに指向される。１．５ｋｂ　ｍＲＮＡに対応する３つの小さなエクソ ンは、各々、少なくとも２４および２０ｋｂのイントロンによって隔てられてい る。プロモーター領域はかなり異常である。３重鎖ｒＨ−ＤＮＡＪを潜在的に形 成できる上流領域にはいくつかの長いホモプリン−ホモピリミジン・ストレッチ か存在する（ウェルズらＱｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ）、エフ・エイ・ニス・イー・ ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　）２　：　２９３９〜２９４９（１９８ ８））。

ここに、事実、これらの領域のうちの１つがｉｎ　ｖｉｔｒｏでＨ−ＤＮＡを形 成することが示される。プロモーターは正準なＴＡＴＡボ、クスを欠き、多重転 写開始部位を有する。これらの部位のいくつかの利用は神経系の種々の部分で異 なる。

ラットＧＡＰ−４３遺伝子は、少なくと６５０ｋｂにわたる３つのエクソンと２ つのイントロンよりなる単一コピー遺伝子である。

本発明者らは、該エクソンが該蛋白における機能的ドメインに対応する証拠をい くつか得た。最初の１０個のアミノ末端残基のみをコード付けする第１のエクソ ンはＧＡＰ−４３の膜ターゲツティングの原因となるストレッチを含有する。蛋 白の３位および４位のシスティンはアシル化されており、前記したごとく、膜結 合に関与し得る。アミノ末端はＧＡＰ−４３の膜結合に必要であり、前記したご とく、異種蛋白を、成長円錐のものを含めたＧＡＰ−４３と同一の膜ドメインへ 向けるのに十分な情報を含有する。

第２のエクソンはアミノ酸４３ないし５１からのカルモジニリン結合領域（アレ キサンダーら（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・イン・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｉ、　）λ６３ニア５ ４４〜７５４９（１９８８））ならびにプロティンキナーゼＣについての基質で ある４１位のセリン（コギングおよびツビエルズ（Ｃｏｇｇｉｎｓａｎｄ　Ｚｖ ｉｅｒｓ）、ンサイエティ・イン・ニューロサイエンス（Ｓｏｃ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　）アブストラクト（１９８８））を包含する。エクソン■ および■は魚類およびいくつかの哺乳動物ＧＡＰ−４３蛋白の間でよく保存され ている領域を含有する（ラバテおよびスケ不（Ｌａｂａｔｅ　ａｎｄＳｋｅｎｅ ）、（１９８９））。

ＧＡＰ−４３のプロモーターは、配列および構造が異常である。

ＴＡＴＡボックスの欠如およびその結果としての多重スタート部位の使用は、Ｇ ＡＰ−４３プロモーターが、構成的に発現されるハウスキーピング（ｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉ　ｎｇ）遺伝子のプロモーターに似る原因となる。しかしながら、Ｇ ＡＰ−４３プロモーターはハウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝 子のプロモーターに関係付けられてきたコンセンサス５ｐ−１結合部位（ＧＧＧ ＣＧＧＧ）を欠く（ダイナン（Ｄｙｎａｎ）、トレンズ・ジェネト（Ｔｒｅｎｄ ｓ　Ｇｅｎｅｔ、　）　２　：　１９６〜１９７（１９８６））。さらに、発育 におけるＧＡＰ−４３の密接に調節された発現、ニューロンに対するその特異性 、および特に成人のニューロンにおけるその誘導可能性は、それがこのクラスの 遺伝子に属しないことを示唆する。

Ｇ　Ａ　Ｐ−４３は中枢神経系と末梢神経系では異なって調節される。

例えば、哺乳動物中枢ニューロンの軸索切断は、末梢神経の軸索切断がＧＡＰ− ４３の発現および輸送の増加を引き起こすのに対し、それを引き起こさない（ス ケ不およびウィリアード（Ｓｋｅｎｅ　ａｎｄＷｉｌｌａｒｄ）、ジャーナル・ イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）呈上：９６〜１０３　 （１９８＋）。前記したごとく、ＧＡＰ−４３はＣＮ　Ｓで不可逆的に抑制され るようには見えず、軸索成長における以外の形成性で役割を演じ得るが（ベノウ ィノッおよびロウテンベルブ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ　ａｎｄ　Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅ ｒｇ）、ティ・アイーｚヌ、ｚス（調節においては差異か存在することは明らか である。よって、異なるスタート部位の使用は、異なるニューロンからのｍ　Ｒ Ｎ　Ａはりホソームの結合または安定性を調節する５′端部で異なる可能性を示 唆する。

制限されるものではないが、ニューロンで発現される遺伝子Ｔｈｙ−１は、転写 レベルにて、発育に付随して調節され、組織特異的に発現されることが証明され ていることに注目するのは興味深い（スパ／ポウロウら（Ｓｐａｎｏｐｏｕｌｏ ｕ　ｅｔ　ａｌ）、モレキュラー・アンド・セリコラ−・バイオロジー（Ｍｏｌ ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）　８　：　３８４７〜３８５６（１９８８ ））ｃまた、ＧＡｐ−４３のように、Ｔｈｙ−１プロモーターにおける転写スタ ート部位の選択１１発現組織間で変化し得、上流スタート部位が脳においてより 顕著である（同よ）。これは、ＧＡＰ　　４３およびＴｈｙ−１双方についての 脳一対一他の組織における対照の付加レベルを示唆する。

ＧＡＰ−４３プロモーターに存在する可能な上流調節要素はコンセンサスＰｉｔ −１結合部位（ＴＡＴＴＣＡＴＧ）である。この配列および関連配列は、集合的 にＰＱＵ蛋白として公知の転写因子によって認識され結合する。この群は元来哺 乳動物において、Ｐｉｔ−１，０ｃｔ−１および０ａｔ−２を、および線虫にお いて、ｕｎｃ８６を包含するものであり（ヘールら（Ｈｅｒｒ　ｅｔ　ａｌ）、 ジーンズ・ディベロプ（Ｇｅｒ＋ｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ、）−２：　ｌ　５１３ 〜１５１６　（１９８８））、この科を特徴付ける２のペプチド領域を占める蛋 白をコード付けするｃＤＮＡの発見によって、最近、拡大された（へら（Ｈｅ　 ｅｔ　ａｌ）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）３４０　：　３５〜４２　（］　 ９８９））。以下の実施例に記載するごとく、本発明者らは、ＧＡＰ−４３のこ の領域を結合させ、その転写を調節し得る脳−特異的蛋白を同定し、クローン化 した。

ＧＡＰ−４３プロモーターのもう１つの顕著な特徴は、長いホモプリン−ホモピ リミジン・ストレッチの存在である。これらは興味深いものである。何故ならば 、それらはＧ　Ａ　Ｇ　Ａストレッチに特異的な蛋白を結合させ（ビギンおよび ティマン（Ｂｉｇｇｉｎ　ａｎｄ　Ｔｊｉａｎ）、セｅｔ　ａｌ）、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５　：　１４８７〜１４９０（１９８９）ＬそれらはＨ −ＤＮＡと呼ばれる３重鎖コンフｔメーションをとる可能性を有するからである 。かかるホモポリマー領域は真核生物遺伝子および真核生物ウィルス遺伝子の５ °端部において十分に表わされることが判明しており、それらは転写制御に幾分 関与しているらしいことが推測される（ウェルズら（ｉｌｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ ）、エフ・エイ・ニス・イー・ビイ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ　Ｊ、）２　：　 ２９３９〜２９４９（１９８８）；フトーンおよびダールベルグ（Ｈｔｕｎ　ａ ｎｄＤａｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３：　１５７）〜 １５７６　（１９８９））。例えば、恐ら（は蛋白相互作用によって安定化され ているＨ立体配置を採ると、ＤＮＡによじれを引き起こすと仮定されている。こ のよじれは、よじれた領域からの締出しによってヌクレオソームを順応させ得、 それにより、よじれの辺りのＤＮＡを転写因子により接近させる（フトーンおよ びダールベルグ（Ｈｔｕｎ　ａｎｄＤａｈｌｂｅｒｇ）、サイエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ）　２４↓：　１７９１〜１７９５　（１９８８）：ハンおよびグルンス テイン（Ｈａｎ　ａｎｄ　Ｇｒｕｎｓｔｅ４ｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）５５　：１ １３７〜１１４５　（１９８８）　）　、加えて、かかるよじれは上流の配列を それらの下流により近く並置させ、配列間またはそれらに結合した蛋白間の相互 作用を可能とするように働くであろう（フトーンおよびダールベルグ（Ｈｔｕｎ 　ａｎｄ　Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、サイ干ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４ユニ　ｌ 　７９１〜１７９５　（１９８８）”）。

代わりに、Ｈ−ＤＮＡは、その直ぐ隣接するＤＮＡへの接近を直接に遮断するこ とによって、転写のリプレッサーとして働くかも知れない（マヘールら（Ｍａｈ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５　ニア２５〜７３０ 　（１９８９）　）。

寒塵何■ ニューロン成長円錐膜の主要成分はＧＴＰ結合蛋白Ｇ０である。

ニ−ロン構長円錐はミクロ環境からの信号を軸索または樹状突起の定方向成長に 変換する特別の変換機構を持つ。成長円錐膜中で豊富な新生児ラット脳からの細 胞下画分は単純かつ区別される蛋白組成を有する。成長円錐膜調製物中の２種の 主要な非細胞骨格蛋白は４００００および３５０００の分子量を有する。電気泳 動的、免疫学的および部分的な蛋白配列評価基準によって、これらの蛋白はＧＴ Ｐ結合蛋白Ｇ。のアルファおよびベータ・サブユニ、トと同定された。ニューロ ン的に分化したラット褐色細胞腫細胞の免疫組織学的染色により、細胞突起の遠 位端に高濃度のＧ。のアルファサブユニットが示される。これらのデータは、成 長円錐運動性の調節はＧｏ信号変換メカニズムを利用するらしいことを示唆する 。

脳発育の間に達成され、シナプス形成性を通じて洗練される二ニーロン連結性の 複合状態はニューロン軸索による特異的標的の選択を要する。それによって、そ れらの細胞外環境からの情報を軸索が定方向成長に変換するメカニズムはあまり 理解されていない。ニューロン軸索の遠位端は成長円錐なる語のユニークな超構 造を有し、これはこの突起について臨界的であると考えられている（プレイ・デ ィら（Ｂｒａｙ、　Ｄ、　、　ｅｔ　ａｌ）、アヌ・レブ・セル・パイオル（Ａ ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）４　：　４３　（１９８８）　）　、幸いなことに、軸 索成長円錐の膜、および従ってその変換系は他のニーロン構成から分画すること ができる（フェニンゲル・レイ・エイチら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、　Ｋ、　Ｈ ，。

ｅｔ　ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５：　５７３　（１９８３）；ゴルドンーウ ィークス・ビイら（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ、　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ）、ニ ューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）＋　３　：　１１９　（１９８ ４）　　；エリス・エルら（Ｅｌｌｉｓ。

Ｌ、、ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・セル・バイオロジー　（Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ。

）１旦ユニ　１９７７　（１９８５））。それは、はんの数種の主要蛋白よりな り、これらの蛋白のうちいつくかは同定されているニチューブリン、アクチン、 および神経−特異的、成長−関連蛋白、ＧＡＰ−４３（フェニンゲル・レイーｘ イチらＣＰｒｅｎｎｉｎｇｅｒ＋　Ｌ　Ｈ，＋　ｅｔ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５ 　：　５７３　（１９８３）　；エリス・エルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ。

ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ、）上０１　：　１９７７（１９８５）ニジムコビッツ・ビイら（Ｓｉ＋ａｋ ｏｖｉｔｚ。

ｐ、、ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・ニューロサイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒ ｏｇｃｉ。

）旦：１００４　（１９８９）；チョンーｘヌら（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｎ、　、　 ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅ■、）７旦３：３９３５　（１９８Ｂ）：メイリ・ケイ・エフら （ｉｌｅｉｒｉ、　Ｋ。

Ｆ、、ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サ ブ・サイエンンズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ　８ ５　：　３５３７（１９８６）；スケネ・ジエイーｘイチ・ビイら（Ｓｋｅｎｅ 、　Ｊ、　）１．　Ｐ、　、　ｅｔａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３ ３　：　７８３　（１９８６）　）　。他の主要成長円錐膜構成の特徴付けによ り、細胞外キニーに対する軸索の応答が説明されるであろう。

新生児ラット脳から成長円錐膜画分を調製したくフェニンゲル・ケイ・エイチら （Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、　Ｋ、　Ｈ，、ｅｔ　ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５ 　：　５７３　（１９８３）；エリス・エルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ ）、ジャーナル・サブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　１ ０１　：　１９７７（１９８５）；／ムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ 、　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎ ｅｕｒｏｓｃｉ、）９　：　１００４　（１９８９）；アミン・エヌら（Ｃｈｅ ｕｎｇ、　Ｎ。、ｅｔａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリ ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩａ、　）　２旦３：　３９３５（１９８８）） 。この調製物は５ＤＳ−ＰＡＧＥによると単純な蛋白組成を有する（エリス・エ ルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、、ｅｔ、ａｌ）、ジャーナル・９８５）；シムコビノツ ・ビイら（Ｓｉｍｋｏｗｉｔｚ、　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ ・ニューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９　：　１００４　（１９８ ９）；アミン・エヌら（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｎ、　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル ・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　 ２旦３　：　３９３５（］、９８Ｂ））。５０〜５５０００ダルトンにて移動す る最も強く染色されるバンドはチューブリンと同定された（ンムコビノツ・ビイ ら（Ｓｉｎ＋ｋｏｖｉｔｚ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・二二一口 サイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９　：　１００４　（１９８９）　　： アミン・エヌら（Ｃｈｅｕｇ、　Ｎ、　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・ バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　２旦３： ３９３５（１９８８））。また、ｐ３４およびｐ３８と呼ばれ、特に成長円錐膜 に豊富な約３５０００および４００００のＭ、を有する重要な蛋白が存在する（ シムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏ豐ｉｔｚ、　ｐ、　、　ｅｔ　ａｌン、ジャ ーナル・サブ・ニューロサイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）９　：　１０ ０４　（１９８９）’）　。さらに特徴付けを行った２つの未同定蛋白がある。

細胞骨格蛋白を除き、それらは成長円錐膜調製物中で最も重要な蛋白である。

ｐ３４およびｐ３８はＧＴＰ−結合蛋白Ｇ。のアルファおよびベータ・サブユニ ットと同様の分子量を有することが注目された（ストリニル・エルら（Ｓｔｒｙ ｅｒ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　）、アヌ・レブ・セル・パイオル（Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）２　：　３９１　（１９８６）：ギルマン・エイ・ シイ（Ｇｉ　１ｍａｎ、　Ａ、　Ｇ、　）、アヌ・レブ・バイオケム（Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）５６　：　６１５（１９８７））。精製した ウシｇｒａｊｎＧａと成長円錐膜との共電気泳動により、ｐ３４はＧｏのベータ サブユニットと共に移動し、ｐ３８はアルファサブユニットと共に移動すること が示された。免疫プロット法により、ｐ３４は抗−ベータサブユニット抗血清と 反応し、ｐ３Ｂは抗−アルファサブユニソトＧ０抗血清と反応することが示され た。さらに、ｐ３８の顕著な蛋白種はアルファ。

にちがいない。何故ならば、コーマンーブルー染色によって判断して、等しい濃 度の蛋白濃度のｐ３８およびアルファ。は同一の免疫反応性を示したからである 。そのことはｐ３４およびＧ。のベータサブユニットについても当てはまる。ア ルファサブユニットはこの抗血清とはアルファ。の約１／１０の反応性であり（ ギルマン・エイ・シイ（Ｇｉ　１ｍａｎ、　Ａ、　Ｇ、　）、アヌ・レブ・バイ オケム（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ−ｏｃｈｅｍ、）５６：６１５（１９８７乃 、従って、アルファ０免疫反応性の主ｆｆパーセンテージを説明できない。

これらの免疫学的および電気得泳動的データを確かめるために、電気泳動で精製 したｐ３４およびｐ３Ｂから部分的な蛋白配列を得た（第１６図）。ｐ３４およ びｐ３８は共にアミン末端はブロックされていた。ＨＰＬＣによって分離したト リプシンの断片から、および５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したスタフィロコッ カス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ、　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ　８プロテア一ゼ部分消 化断片から配列を得た。ｐ３８からの３種の各ペプチドの配列はアルファ。のも のと同一であり、アルファ。はｐ３８蛋白の主要成分であることが確認された。

他の公知のアルファサブユニットは同様であるが独自の配列を有する。該３種の ｐ３４蛋白はＧ蛋白のベータサブユニットのものと同一の配列を有していた。２ 種のペプチドは、ベータ、およびベータ、サブユニットが同一である領域からの ものであり、第３のものはベータ、およびベータ、についての配列の混合物を含 有していた。かくして、Ｇｏのアルファおよびベータサブユニ、トは成Ｊ％円錐 膜細胞下画分の主要構成成分である。

これらの調製物は実質的には成長円錐膜に豊富であるが、それらは純粋ではない （フェニンゲル・ケイ・エイチら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、　Ｋ、　Ｈ，。

ｅｔ　ｎｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５　：　５７３　（１９８３）　　；ゴルド ンーウィークス・ビイら（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ、　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ ）、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）　１３　：　１１９（１ ９８４））。末画分組織の従前の免疫組織学は、Ｇｏは成長したラット脳の神経 網に濃縮されること（ウォーリイ・ビイ・エフら（Ｗｏｒｌｅｙ、　Ｐ、　Ｆ、 　、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サ ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８３　：　４５６１　（１９８６）　）　、および 関連Ｇ蛋白Ｇａ１ｔが成人における一次嗅ニコーロンの末端領域に位置すること （ジローンズ・ディ・ティら（Ｊｏｎｅｓ、　Ｄ、　Ｔ、　、　ｅｔ　ａｌ）、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４　：　７９０　（１９８９）　）　、およ びＧ、は培養された一次ニューロン全体を染色するが細胞−細胞接触の領域に濃 縮される（ジョーンズ・ディ・ティら（Ｊｏｎｅｓ、　Ｄ、　Ｔ、　、　ｅｔ　 ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４　：　７９０（１９８９））こと を示している。これらの研究は成長円錐におけるＧ。の局在と矛盾しないがそれ を証明するものではない。従って、ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞に免疫組織学的方 法を使用して無傷細胞におけるＧｏの分布を調べた。ＮＧＦは、これらの細胞が 成長円錐を先端とした長い突起を伸長させるのを可能とする。−次ニューロンの ものにおけるごとく、二１−ロン蛋白ＧＡＰ−４３はこれらの成長円錐で豊富で ある（パン・フーフ・シイ・オー・エムら（Ｖａｎ　Ｈｏｏｆｆ、　Ｃ，Ｏ，Ｍ 、　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、）１０８　：　１１１５　（１９８９））。アルファ。の免疫蛍光 はＰＣ１２細胞のこれらの成長端で高濃度であった（そこで専ら見い出されるの ではなかったが）。

従来法（フェニンゲル・ケイ・エイチら（Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ、　Ｋ、　Ｈ， 、ｅｔ　ａｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）３５　：　５７３（１９８３）　；エリス・ エルら（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ、）１旦：　］　９７７（１９８５）；　／ムコビッツ・ビイら（Ｓｉｍｋｏ ｗｉｔｚ、　Ｐ、　。

ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・ニューロサイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃ ｉ、　）９：　１００４（１９８９）；チオン・エフら（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｎ、 　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　２６３　：　３９３５（１９８８））を少し修 正して、成長円錐膜を調製した。

２４時間令未満のＳＤクラット首を切り、０．３２Ｍスクロース、］ｍＭ）リス −ＨＣｆｆ、ＩｍＭ　　ＭｇＣｆｆ、ｐＨ７，６の５倍容量中、ガラス／テフロ ン製ホモゲナイザー中の６通路にて、脳を４℃でホモジネートした。以下のプロ テアーゼ阻害剤を該手法の間に使用した：１００μｇ／ｍＱ大豆トリプシン阻害 剤、１Ｍｇ／ｍＱペプスタチンＡ、３０μＭＯイペブティン（ｌｅｕｐｅｐｔｉ ｎ）　、および１ｍＭ　　ＰＭＳＦｏｏ、７５Ｍ、１．０Ｍおよび２，２Ｍのス クロースの段階グラジェントの上に粗製脳ホモジネートを重ねた。該グラジェン トを２５００００ｘｇで４０分間遠心し、０．３２１０．７５Ｍ界面を成長円錐 粒子画分として収集した。この画分を５ｍＭ　　トリス−ＨＣ（、ｐＨ７，６中 に溶解し、４０分間の２５００００ｘｇでの遠心によって護膜を収集した。護膜 を２０Ｍｇ　／　ｍ　Ｑサポニンおよび０．３Ｍ　　Ｎａ、ＳＯ２中に再懸濁す ることによって洗浄し、遠心によって再度収集した。ウシ脳Ｇ０を前記したごと くに調製した（プレイ・ディら（Ｂｒａｙ、　Ｄ、　、　ｅｔ　ａｌ）、アヌ・ レブ・セル・パイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｙ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）４　：　４３ 　（１９８８）　）。

抗−血清の電性 ウサギにおける抗−ウシ脳アルファ。および抗−ベータ抗血清の生産およびキャ ラクタライゼーションは記載されている（フッ・アール・エムら（Ｈｕｆｆ、Ｒ ，Ｍ、、ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６０　：　１０８６４　（１９８５））。ＳＤ Ｓを含む１０％ポリアクリルアミドゲルに免疫プロット試料を通して電気泳動を 行い、次いで、電気泳動によりニトロセルロースに移した。非特異的蛋白結合部 位を１０ｍｇ／＋Ｊつ／血清アルブミンで遮断し、４°にて、該プロットを１： ４００抗〜アルフア抗血清または１：１００抗−ベータ抗血清と共に一晩インキ ユベートした（フッ・アール−ｘムら（Ｂｕｆｆ、　Ｒ，Ｍ、　、　ｅｔ　ａｌ ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　）　２６０・１０８６４　（１９８５））。ペルオキシダーゼ基質と してテトラヘンジジンを用い、アビジン・ビオチン複合体法（ベクタスタチン（ ｖｅｃｔａｓｔａＬｉｎ）、バーリンゲーム（Ｂｕｒ　ｌ　ｉ　ｎｇａｍｅ）、 カリフォルニア州）によって結合抗体を検出した。

成長円錐膜蛋白のアミノ酸配列決定 前記したごとくに成長円錐膜を分画１５た。蛋白をポリビニルフルオリジン（Ｐ ＤＶＦ）膜に移した場合、Ｔ）３４およびｐ３８についてのスポツト・は配列を 与えなかった。何故ならば、恐らくは、該蛋白はアミン末端が遮断されているか らであろう。従って、蛋白配列はＴ）３４およびｐ３８についての蛋白分解断片 から得た。トリプシン消化については、蛋白をニトロセルロースに移し、ポンソ ーＳで染色し、適当なバンドを切り出した。ノ・−バード・マイクロケミストリ ー・ファシリティ（）ｌａｒｖａｒｄ　Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｆａｃ ｉｌｉｔｙ）において、トリプシン消化をニトロセルロース膜上で行い、放出さ れたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分離し、気相自動配列決定器（モース・エ ムら（￥ｏｏｓ、　Ｍ５．ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６３　：　６００５　（１９８８ ）　）で配列決定した。さらに、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ 。

Ａｕｒｅｕｓ）Ｖ　８プロテアーセ（バーリンゲル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、 マンノ＼イム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ンでの部分的消化によりｐ３４についてアミ ノ酸配列を得た。ｐ３４を含有するポリアクリルアミド立方体をｖ８でｉｎ　５ ｉｔｕ消化し、ＤＳＤ−ＰＡＧＥで分画し、ＰＶＤＦ膜（ミリボア（Ｍｉｌｌｊ ｐｏｒｅ）、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセ’ｙツ州）に電 気プロットし１、コーマシーブルーで可視化した（ケネディ・ティ・イーら（Ｋ ｅｎｎｅｄｙ、　Ｔ、　Ｅ、　、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーデイングズ・サブ・ ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ８５　：　７００８（１９８８））。ペブチｌ’断片 を切り出し、コロンビア大学のハウワード・ヒユーゲス・７ノデイカル・インス テイテユート・プロティン・ケミストリー・コア・ファシリティ（Ｈｏｗａｒｄ 　Ｈｕｇｈｅｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐｒｏｔ、ｅｉｎ　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｏｒｅ　Ｆａｃｉ−１ｉｔｙ）にてアプライド・バイオシ ステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＠ｓ）　（フォスター・シイティ （Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ）、、カリフォルニア州）の４７ＯＡ気相シーケンサ −で配列決定して配列ｐ３４−Ｂを得た。

ＰＣＩ２細胞のアルファ。免疫染色 １１００ｎ／ｍｃ神経成長因子の存在下、ＰＣＩ２細胞をポリーＤ−リジン処理 カバーガラス上で４８時間増殖させた。該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ Ｓ）中の３．７％ホルムアルデヒドで固定し、次いで、０．１％トリトン−Ｘ− １００を浸透させた。

ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍ１２ウシ血清アルブミンでのインキコバーシコンの後、該 細胞を２３°Ｃにてｌ：１０００抗−ウシ脳アルファ。抗血清と共に１時間イン キュベートし、ＰＢＳですすぎ、０．３％Ｈ＝　Ｏ！　＆共に１５分間インキコ ベートしてバックグラウンドを減少させた。結合したウサギ免疫グロブリンはテ キサス・レッド・コンジュゲート（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ）０バ抗−ウサギＩｇＧ（ジャクノン・イミュノロジカルズ（Ｊａｃｋｓｏｎ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ））の使用によって検出した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥはＧ。アルファおよびベータ・サブユニットと共に移動する２ つのバンドを明らかにする。

軸索成長円錐膜の蛋白をＤＳＤ−ＰＡＧＥによって同定した。軸索成長円錐膜、 精製したウシ脳Ｇ。、および粗製脳ホモジネートの２の別々の調製物を、ＳＤＳ の存在下、１０％ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動に付し、コーマシー ブルーで染色した。粗製脳に対し成長円錐膜蛋白物におけるｐ３４およびｐ３８ と呼んだ２のバンドの豊化を観察した。これらの蛋白は精製したＧｏのアルファ およびベータサブユニ７１−と共に移動した。これらの条件下、アクチンおよび ＧＡＰ−４３は見掛は分子ｊ１４３０００で移動した。

成長円錐膜の抗−６０免疫プロツトはＧ。反応性を示す。

免疫プロット法は、精製したＧ。調製物および成長円錐膜調製物双方におけるア ルファ・コーマシーブルー染色の位置で移動するアルファ。免疫反応性を明らか にした。アルファ。のコーマシーブル−標識がＰ３Ｂのものと同一となるように ゲルを負荷し、同様に他の対について適合させた。コーマシーブルー染色ゲルを 平行（こて泳動させた。全蛋白が増加するにつれ、該対は固定度に免疫染色され 、これはｐ３８がこの抗血清に対して標品アルファ。と固定度に免疫反応性であ ることを示す。これは、はとんどまたはすべてのｐ３８がアルファ。であること を示唆する。Ｇ０試料にはアルファ。を越えて移動する少量の免疫反応性があり 、これはアルファ、でのわずかな汚染またはそれとの交差反応によるものである ようだった。これは、以前、各々、ベータおよびｐ３４についてコーマシーブル ーで同一に染色することが示された成長および成長円錐膜（Ａ）画分では観察さ れず、また、抗−ベータ抗血清との同様の免疫反応性が示された。

ｐ３４および９３８についての部分的蛋白配列はＧｏのものと同一である。

ｐ３４およびｐ３８についての部分的蛋白配列を第１６図に示す。

ｐ３８からの３種のペプチドの配列はラット脳由来のアルファ。からの３種のペ プチドの配列に調和する（ゴー・ジエイ・ダブり二一（Ｇｏｈ、　Ｊ、　Ｌ　） サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４　：　９８０（１９８９）　）。

ｐ３４からの３種のペプチドの配列はウシ脳からのベータ、およびベータ、サブ ユニ、トと比較される（フォング・エイチ・ケイ・ダブり二一ら（Ｆｏｎｇ、　 Ｈ，Ｋ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・サブ・ナショナル・アカ デミ−・サブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

）ＵＳＡ８４　：　３７９２　（１９８７）　）。２種のペプチドはベータ。

およびベータ！が同一である領域に同一であることに注意されたい。

他のペプチドはベータ、およびベータ、についての配列の混合物を含神経成長因 子で区別されるＰＣＩ２細胞のアルファ。染色により、細胞突起の遠位端におけ る抗原の高濃度が明らかとなった。また、核の回りの細胞質体の領域における低 レベルの散漫な染色もあった。

抗体の特異性は証明されている（フッ・アール・エムら（Ｈｕｆｆ、　Ｒ。

麗１．ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、）２６０　：　１０８６４　（１９８５）　　；ウオーレ イ・ビイ・エフら（ｆｏｒｌｅｙ、　ｐ、　Ｆ、　、　ｅｔ　ａｌ）、プロシー デイングズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　）　ＵＳＡ乱冬：４５６１　　（１ ９８６）が、さらに対照として、過剰の精製したウシ脳Ｇ。（３０μｇ／ｍＱ　 ）を、抗血清でのインキュベーション、または抗血清の代わりに通常のウサギ血 清で置き換えたインキュベーションに添加して同一の試料を調製した。これらの 対照は実質的に細胞突起の染色を示さなかった。

多基 本実施例で示された結果は、Ｇ蛋白、特にＧｏは成長円錐膜の主要構成成分であ ることを示す。事実、成長円錐膜には、他のいずれの非細胞骨格蛋白よりもＧ。

が多くある。脳において第一に明らかにされたことだが、Ｇｏの役割は明瞭では ないにもかかわらず、一般に、Ｇ蛋白は、膜内外レセプターを細胞内信号系にカ ップリングさせる（ストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ）、 アヌ・レブ・セル・パイオル（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）２　： 　３９１　（１９８６）　；ギルマン・エイ・シイ（Ｇｉｌｍａｎ、＾、Ｇ、、 ）、アヌ・レブ・バイオケム（イ（Ｎｅｅｒ、　Ｅ、　Ｊ、　）、ネイチ（−− （Ｎａｔｕｒｅ）　３３旦：　１２９（１９８８）；ロス・イー・エム（Ｒｏｓ ｓ、　Ｅ、　Ｍ、　）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）３　：　１４１（１９８９ ））。Ｇ、は多数の細胞表面レセプターと相互反応し、ホスホリパーゼＣ１ホス ホリパーゼＡ２、カリウムチャネルおよびカルシウムチャネルを含めた種々の細 胞内信号系に影響を与え得る（スケネ・ジェイ、ｘイチ・ビイら（Ｓｋｅｎｅ、 　Ｊ、　Ｈ，Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３　 ：　７８３　（１９８６）　；ストリニル・エルら（Ｓｔｒｙｅｒ、　ｔ、、　 ｅｔ　ａｌ）、アヌ・レブ・セルＩＩ）’ｅｅｔル（Ａｒ＋ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｃ ｅ１ｌＢｉｏ１．）２　：　３９１　（１９８６）　　；ネール・イー・ジエイ （Ｎｅｅｒ、　Ｅ、　Ｊ。

）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　３旦３：１２９　（１９８８）；ロス・イ ー・エム（Ｒｏｓｓ、　Ｅ、　Ｍ、）、二ニーロン（Ｎｅｕｒｏｎ）３　：　１ ４１　（１９８９）；ブラウン・エイ・エムら（Ｂｒｏｖｎ、　Ａ、　Ｍ、　、 　ｅｔ　ａｌ）、アメリカン・ジャーナル・オプ・フイジオロジー（ＡｔＪ、Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、）２５４　：Ｈ４０１（１９８Ｂ））。桿状体および錐状体外部 セグメントにおける網膜Ｇ蛋白トランスドウシン（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）と匹 敵する、成長円錐膜におけるＧｏの驚くべき高レベルは、成長円錐におけるＧ、 −＋こ基づ（変換系を強く示唆する。

ｃ　、Ａ　Ｍ　Ｐに同かう化学走性かＧ蛋白を介して変換される、枯菌ジクチオ ステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）における発育形態形成にとってＧ蛋 白は非常に重要であることが判明している（スナールージャガルス力・ビイ・イ ーら（Ｓｎａａｒ−Ｊａｇａｌｓｋａ、　Ｂ、　Ｅ、　、　ｅｔ　ａｌ）、エア ーイー・ビイ・ニス・レターズ（Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｌｅｔｔ、）２３２　：　１ ４８　（１９８８）；スナールージャガルス力番ビイ伊イーら（Ｓｎａａｒ−Ｊ ａｇａｌｓｋａ、　Ｂ、　Ｅ、　。

ｅｔ　ａｌ）、エフ・イー・ビイーｘス・レターズ（Ｆ、　Ｅ、　Ｂ、　Ｓ、　 Ｌｅｔｔ、　）　２３１（１９８８））。同様に、発育神経系における経路また は標的からの信号は、成長円錐膜における、Ｇｏ一連結レセプター、またはレセ プターに結合し得、それにより、細胞内二次メツセンジャーのレベル、従って成 長円錐移動度を変化させる。一般に、これらの信号、レセプター、および二次メ ツセンジャーは現在未知である。１のクラスの候補レセプターは細胞活着分子、 Ｎ−ＣＡＭおよびＬｌであり、ニニーロン成長円錐に局在する（ルトウルヮーノ ・ビイ・シイ細胞におけるカルシウムレベルおよびボスポチジルイノシトール代 謝を変化させ、これらの抗体の影響はＧ蛋白拮抗剤百日咳トキシンによって阻止 される（パン・フーフ・シイ・オー・エムら（ＶａｎＨｏｏｄ、　Ｃ，Ｏ，Ｍ、 　、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・パン・セル・バイオロジー（Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）↓０８＝１１１５　（１９８９））。

成人神経系における６０発現の持続性（つｔ−レイ・ビイ・エフら（Ｗｏｒｉｅ ｙ、　Ｐ、　Ｆ、　、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・パン・ナシロナル ・の調節以外の役割を意味する。もう１つの成長円錐富化分子、ＧＡＰ−４３も 成人脳の不連続領域に存在する（ベノビッッ・エル・アイら（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ 、Ｌ、　１．、　ｅｔ　ａｌ）、トレンズ・二二−口サイ（Ｔｒｅｎｄｓイ（Ｓ ｋｅｎｅ、　Ｈ，Ｊ、　Ｐ、　）、アヌ・レブ・二二一口サイ・ＣＡｎｎ、　Ｒ ｅｖ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

）ユニ　ｌ　２７　（１９８９））。ＧＡＰ−４３の局在、その遺伝子調節の性 質、および特にそのホスホリル化状態と海馬スライスにおける長期増強との関係 （ロウテンベルブ・エイ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ、　Ａ、　）、二ニーヨーク ・アカデミ−・パン・サイエンシズ（Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）± ４４　：　９８０　（１９８９）は、成人のシナプス形成性におけるＧＡＰ−４ ３の役割を示唆している（ベノビノッ・エル・アイら（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ、Ｌ、 １．、　ｅｔ　ａｌ）、トレンズ・ニューロサイ（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ。

）１０　：　５２７（１９８７）：スケネ・エイチ・ジェイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ 。

）！、　Ｊ、　Ｐ、　）、アヌ・レブ・ニューロサイ・（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ、）１２：１２７　（１９８９）＞。百日咳トキシンが長期増強を 阻止し、恐らくはやはりこの突起におけるＧｏを意味するものであることは注目 に値する（ゴー・ジェイ・ダブリュー（Ｇｏｈ、　Ｊ、　Ｗ、　）、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４　：　９８０　（１９８９）　）　、よって、Ｇ、は ニューロン発育の間の軸索伸長および成人神経系におけるシナプス形成性につい ての調節信号を変換し得る。

実施例■ ＧＡＰ−４３は蛋白結合の新規な内部調節器である。

もう１つの態様において、本発明は、ＧＡＰ−４３か細胞内でＧ、のちのを含め た他の細胞蛋白の結合能力を修飾するように作用するという驚くべき発見に指向 される。本発明者らが知る限り、これは、外部細胞レセプターに対する効果およ び利用性において匹敵する重要な新しいクラスの内部調節蛋白（ｒｌＲＰＪ）（ そのうち、ＧＡＰ−４３が代表的なものである）の最初の報告をなす。当業者な らば、本発明の本態様のＩＲＰ組成物および方法は、ニューワンおよび非ニュー ロン細胞において、蛋白活性の内部変調を可能とし、それにより細胞の活性およ び機能の内部変調を可能とする。

さらに、驚くべきことに、ＧＡＰ−４３のアミノ末端アミノ酸よりなる合成ペプ チドは、無傷ＧＡＰ−４３蛋白によって引き起こされたＧｏによるＧＴＰ結合に おける変調を正確に複製することが判明した。本具体例による合成ＩＲＰペプチ ドは、以下の配列＝１、　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤ ＧＶ。

ｎ、　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＧ＋ＩＩ１．　　 　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤ；ＩＶ、　　　　ＭＬＣ ＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱ；Ｖ、　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱ ＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥ；Ｖｌ、　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤ ＱＫＩ。

■、　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫ；■、　　　　ＭＬＣＣ ＭＲＲＴＱＶＥＫＮＤＥＤＱ；ＩＸ、　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮ ＤＥＤ；Ｘ、　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ。

Ｘｉ、　　　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ　；）ｆｆｉ、　　　　 　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮ　；ＸＩ［［、ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫ 　。

ＸＸ、　　　　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＥ　；ＸＶ、　　　　　　　ＭＬ ＣＣＭＲＲＴＫＱＶ　；ＸＶ！、　　　　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱ　；Ｘ ■、　　　　　　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ　；Ｘ■、　　　　　　　　　　 　ＭＬＣＣＭＲＲＴ　；ＸＩＸ、　　　　　　　　　　　ＭＬＣＣＭＲＲ；ＸＸ 、　　　　　　　　　　　　ＭＬＣＣＭＲ；ＸＸ　１．　　　　　　　　　　　 ＭＬＣＣＭ　。

ＸＸＩ［、ＭＬＣＣ；　および ｘｘｍ、　　その機能的誘導体 よりなる。

本発明の関連具体例は、前記した合成ＩＲＰペプチドをコード付けするヌクレオ チド配列に指向され、その配列は本発明の教示を理解した当業者によって容易に 決定されるであろう。

本発明のさらなる態様は、コンセンサスアミノ酸配列がＧＡＰ−４３およびベー タアドレナリン作動性レセプターで見い出されるという発見に指向され、該配列 は 疎水性−１ｅｕ−ｃｙｃ−ｃｙｃ−ｘ−塩基性−塩基性またはその機能的誘導体 よりなる。さらに、本発明のＩＲＰ類およびＩＲＰペプチド類のシスティンはパ ルミチル化し易いことも理解されるであろう。

また、当業者ならば、本発明のＩＲＰ蛋白類およびペプチド類の構造を変化させ ることによって、標的蛋白活性が増強され、所望ならば、前例のないことである が抑制され得ることを理解するであろう。かくして、もう１つの具体例において 、所望の蛋白およびその結合基質よりなる環境に有効量のＩＲＰペプチドを導入 することを特徴とする該所望の蛋白の結合活性を刺激する方法が提供される。

該所望の蛋白は、好ましくは、Ｇ蛋白であり、最も好ましくはＧｏである。該環 境は、好ましくは、中枢神経細胞または末梢神経細胞であってよい生きた細胞の 内部の環境である。

当業者ならば、本発明の方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、　ｉｎ　５ｉｔｕ、または １ｎｖｉｖｏで実施することができ、ここに考察するごとく、当該分野でよく知 られた許容される投与原理を一般に銘記すると、後者が最も好ましいことを理解 するであろう。

本発明の組成物および方法は、とりわけ、二ニーロン成長およびシナプス形成性 に関与するメカニズムに指向されるので、本発明の教示の利益を享受する当業者 ならば、蛋白活性の内部調節はヒトを含めた哺乳動物における障害の効果的治療 について重要な機会を提供すること、およびかかる治療は神経の病気または機能 障害の影響を防止し、改善しまたは逆行させるのに特に価値があることを理解す るであろう。所与の薬効指示にとっては、神経の成長または形成性を減少させな らびに増強させるのが望ましいであろう。これは、例えば、本発明のＩＲＰペプ チド、またはかかるＩＲＰペプチドが生理学的効果を有する部位へ定方向化され た抗体を投与することによって達成できる。また、かかる手段によって、所望の 蛋白の活性を、かなりの制御度でもって調節することが可能である。かくして、 もう１つの態様において、本発明は、本発明のＩＲＰペプチドへ定方向化された 抗体、好ましくは単クローン抗体、およびその機能的もしくは化学的誘導体に指 向され、該抗体またはその該誘導体は所望により検出可能にまたは治療可能に標 識されたものでよい。

もう１つの態様において、本発明は、医薬上許容される担体と共に本発明のＩＲ Ｐペプチドよりなる、および所望により１種またはそれ以上の治療上有効な剤よ りなる医薬組成物、ならびに、医薬上許容される担体と共に本発明のＩＲＰペプ チドへ定方向化された抗体よりなる、および所望により１種またはそれ以上の治 療上有効な剤よりなる医薬組成物に指向される。本発明の医薬組成物の使用は、 本明細書中に記載されかつ当該分野でよく知られた投与の原理を銘記しつつ、不 都合な実験を行うことなく当業者によって達成れさるであろう。

もう１つの態様において、本発明は、本発明の組成物の有効量を神経細胞に投与 することを特徴とする該神経細胞における構造再編成を変調する方法に指向され る。

さらにもう１つの本発明の具体例において、本発明のＧＡＰ−４３配列を用いて 神経細胞からＧ−膜蛋白を単離した。ＧＡＰ−４３カラムを用い、、ＭＷ３９０ ００の蛋白は高親和性をもってＧＡＰ−４３を特異的に結合させることが判明し た。５０ＩＩＩＭトリス、ｌｌｌ１ｌＩＣａＣＱ２、および１　ｍＭ　　Ｍ　ｇ 　ＣＱ　ｔよりなる緩衝液中にＧＡＰ−４３を含有するカラムに細胞抽出物を導 入した。等モルのＥＤＴＡ緩衝液にて蛋白を単一バンドで溶出させた。該蛋白は Ｇ蛋白に対する多クローン抗体と反応しない。かくして、それは、成長ニューロ ンに関連する独自で新規な蛋白であり、本発明のさらなる具体例を形成する。

また、本発明のＩＲＰペプチドは、いずれの公知手段、例えば前記した遺伝子組 換え法によっても生産でき、本発明のＩＲＰペプチドをコード付けするヌクレオ チド配列は、単にルーチン的技量の努力でもって所望の宿主発現系が推断され、 最適化される。

Ｇｏのごとき細胞変換系の修飾における本発明の新規組成物および方法の重要性 は、Ｇｏがニューロン成長円錐に存在する主要非細胞骨格蛋白であるという証明 と結合させて考えると増大する。その機能は従前知られていなかったＧＡＰ−４ ３がＧ。活性を変調するという発見は、ＧＡＰ−４３が細胞変換系における第１ および第２メツセンジャー間の長らく求められてきた「欠け−Ｃいる部分」であ るという証拠である。いずれか特定の理論に拘束されるつもりはないが、ＧＡＰ −４３によるＧｏの持続的活性化は細胞がその環境を無視し、よって構成的に増 殖するようにさせるであろう。また、今回の成果は、ＧＡＰ−４３のアミン末端 と同様の配列を含有し、よってＧ。を細胞の内部から調節する一群の他の分子が 存在することを示唆する。ＧＡＰ−４３のアミノ末端はいくつかの（ベータレセ プターのごとき）Ｇ蛋白−結合レセプターの細胞質ゾルドメインに対する大きな 類似性を有することは非常に興味深い。これは、Ｇ蛋白−結合レセプターの細胞 質ゾルドメインがそうであるように、ＧＡＰ−４３は分子中の同様の箇所でＧ。

と相互反応し得ることを示唆する。

同定された主要成長円錐膜蛋白に関し、本発明者らは、これらの成分は分子間複 合体を形成できるか否かを決定することを追及した。

特に、ＧｏおよびＧ、ＡＰ−４３を調べた。というのは、それらは、成長円錐膜 における主要な非細胞骨格蛋白だからである。ゲル排除クロマトグラフィー、免 疫沈澱およびアフィニティークロマトグラフィーによってＧＡＰ−４３／Ｇ、複 合体を物理的に単離する試みは不成功に終わった。

溶液中ての一時的ＧＡＰ−４３／Ｇ、相互作用を同定するために、精製したＧｌ 、に対するＧＴＰγＳ（グアニジン（・リホスフエートガンマ５３５）の結合を 種々の濃度の精製したＧＡＰ−４３の存在下で測定した。ＧＡＰ−４３自体ＧＴ ＰγＳを結合させないが、ＧＡＰ−４３はＧｏに対するＧＴＰγＳの結合を１６ ０＋３０％だけ刺激する。この効果は飽和し、１５０ｎＭ　　ＧＡＰ−４３の存 在下では最適の半分である。全脳中のＧ。およびＧＡＰ−４３双方の濃度は２μ ｍの桁であり、この親和性はｉｎ　ｖｉｖｏ状態に矛盾しない。すべてのアッセ イは２００μｇ／ｍＱ　ＢＳＡの存在下で行い、従って、ＧＡＰ−４３による非 特異的蛋白効果はＧＴＰγＳ結合の刺激を説明し得ない。ＧｏはＧＴＰγＳなく しての３０℃におけるブレインキュベーションの間に部分的に不活性化されるこ とは公知である。

ＧＡＰ−４３はＧ。の熱不安定性の程度に影響を与えないことが判明している。

Ｇ蛋白と相互作用するりガント−レセプター複合体は、ＧＡＰ−４３とほぼ固定 度ＧＴＰｙＳ結合を刺激する。その効果はＧｏの百日咳トキシン処理によって阻 止される。同様に、Ｇｏの百日咳トキシン処理はＧＡＰ−４３の作用をなくする 。

ＧＡＰ−４３はカルモジュリンを結合させることが示されており、相互作用はカ ルシウムの不存在によって増強される。この連合の生理学的関連は明らかでない 。カルシウムの有り無しにかかわらず、カルモジュリンの６０への添加はＧＴＰ γＳ結合を刺激するＧＡＰ−４３の能力を変化させない。

ＧＡＰ−４３デカペプチドはＧｏと相互作用する。

いずれのＧＡＰ−４３の領域がＧ。へのＧＴＰ７Ｓ結合の刺激に対して臨界的で あるかを判断するために、ＧＡＰ−４３配列からの一連の合成ペプチドをテスト した。ＧＡＰ−４３の最初の２４個のアミノ酸または最初の１０個のアミノ酸い ずれかを含有するペプチドは２ｅｕＭのＥＣ５０でＧＴＰγＳを刺激する。対照 的に、ＧＡＰ−４３の３つの他の領域からのペプチドは高濃度では効果的でない 。アミノ末端ペプチドは、ＧＡＰ−４３自体と同レベルまでＧＴＰγＳ結合を刺 激し、アミノ末端ペプチドと一緒でのＧＡＴＰ−４３蛋白の添加は高レベルの結 合を刺激しない。これは、ペプチドがＧＡＰ−４３について十分に競合的な作動 剤であることを示唆する。

これまでの実施例において、その膜連結にはＧＡＰ−４３のこの同一領域が必要 かつ十分であること、および２個のシスティンは臨界的であることを示した。同 システィン依存性が６０刺激について存在するか否かを判断するために、２個の システィンの代わりにスレオニンで置換したデカペプチドを合成した。このペプ チドはＧｏへのＧＴＰγＳ結合を刺激しなかった。

Ｇ蛋白へのＧＴＰ７Ｓ結合を刺激することが知られている他の群の蛋白はホルモ ンおよび神経伝達物質レセプターである。大きな細胞外領域および７つの膜内外 ドメインをもつそれらの全構造はＧＡＰ−４３のものとかなり異なっていたが、 それらに拘わらず、本発明者らは、これらの蛋白とＧＡＰ−４３のアミノ末端間 の相同性を追及してきた。β、−アドレナリン作動性レセプターと６５との相互 作用は蛋白の細胞質テール中のパルミチル化システィンにおける点突然変異によ って最も特異的に妨害される。ＧＡＰ〜４３のアミノ末端におけるシスティンも パルミチル化される。システィンがパルミチル化され易い疎水性−１ｅｕ−ｃｙ ｃ−ｃｙｃ−ｘ−塩基性−塩基性よりなる、ＧＡＰ−４３およびこれらのレセプ ターが共に有する共通の配列がある。

移 本データは、二、−ｏン形態形成の間における細胞内成長関連の発現に関する細 胞外信号の協力についての成長円錐メカニズムを提供する。成長円錐膜における Ｇｏのアルファおよびベータサブユニットの驚くべき高レベルは、神経突起調節 におけるＧｏについての主要な役割を示唆する。成長円錐膜中のＧ。濃度は、網 膜光受容体細胞の高度に特殊化された外部セグメントにおける、もう１つのＧ蛋 白トランスシュシン（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）の濃度を超える。

Ｇ蛋白機能が明瞭に定義される系において、それは、細胞外信号の膜内外レセプ ターへの結合と細胞内二次メソセンジャーを変調する酵素またはイオンチセネル の調節との間の連動である。第一にそのアルファサブユニットで異なる多くのへ テロトリマーのアルファーベーターガンマＧ蛋白がある。一般に、アルファポリ ペプチドは、作動剤−レセプター複合体がＧＤＰの代わりにＧＴＰの交換を引き 起こすまでＧＤＰ−結合状態で存在する。次いで、ＧＴＰ−結合活性化アルファ サブユニットは二次メツセンジャー系にその作用を及ぼす。内因性アルファサブ ユニットＧＴＰａ　ｇｅ活性は信号変換を終始させる。Ｇｏは顕著に脳で発現さ れ、そこでは、それはＧ蛋白の主要形態である。成人では、神経４１！！　（− ）で見い出され、本発明者らのデータは、それは主要非細胞骨格蛋白である増殖 細胞において神経突起の先端に６０を位置付ける。Ｇｏは種々のレセプターに応 答することができ、カルシウムチャネル、カリウムチャネル、ホスホリパーゼＧ およびホスホリパーゼＡ、を含めた多数の細胞内系を調製する。

成長円錐に対するいくつかの基盤たるおよび解決できる効果がＧ−蛋白変換を伴 うという証拠がある。成長円錐に局在する細胞粘着蛋白Ｎ−ＣＡＭおよびＬｌに 対する抗体はＰＣ１２細胞におけるカルシウムレベルおよびホスホチジルイノシ トール代謝を変化させる。

これらの抗体の効果はＧ。／Ｇ、抑制剤百日咳トキシンによって阻止される（シ ューヒ・ニーら（Ｓｃｈｕｃｈ、Ｕ、、ｅｔ　ａｌ）、ニニーロン（Ｎｅｕｒｏ ｎ）３：　１３　（１９８９）、）、ある種のヘリオソーム（ｈｅｌ　ｉｏｓｏ ｍｅ）ニューロンにおいて、Ｇ−にカップリングしたレセプターを介して作用す るセロトニンは神経突起延長の優れた抑制剤である。

Ｇ、の制限された局在は、蛋白の調節または作用が１種またはそれ以上のニー− ロン−特異的分子によって媒介されることを示唆する。ＧＡＰ−４３は二ニーロ ンにおいてのみ発現され、該蛋白は成長円錐に富化する。従って、本発明者らは 、ＧＡＰ−４３がＧｏと相互作用するか否かが不思議であった。ＧＡＰ−４３は ＧｏへのＧＴＰ７Ｓ結合を増強する。さらに、合成デカペプチドによって定義さ れるＧＡＰ−４３の小さな領域はこの作用を発揮する。ＧＡＰ−４３によるＧＴ ＰγＳ結合の刺激は、作動剤−レセプター複合体によるそれに同様であり、該デ カペプチド配列はこれらのレセプターと相同性を有する。特定の理論に拘束され るつもりはないが、最もありそうな解釈は、ｉｎ　ｖｉｖｏにて、ＧＡＰ−４３ が膜内外レセプターを模擬し、Ｇｏを活性化し、ＧＴＰ−結合アルファサブユニ ットを生じ、次いで、それが細胞内二次メツセンジャー系の引金となることであ る。あるいは、Ｇ、へのＧＡＰ−４３結合はまずＧｏ−レセプターまたはＧｏ− エフェクター相互作用を破壊するように機能するかも知れない。また、ＧＡＰ− ４３は、何等かのまだ知られていない方法により、レセプターによるＧ。活性化 のエフェクターであるということも考えられる。

成長関連蛋白ＧＡＰ−４３によるＧ０円錐変換系の変調は、細胞外信号をニュー ロン成長についての細胞内プログラムと統合するメカニズムを提供する。さらに 、該系の調節はＢＡＲＫのごときレセプターキナーゼによるレセプターのホスホ リル化、または蛋白キナーゼＣによるＧＡＰ　　４３のホスホリル化のような他 の修飾を介して起こり得る。本モデルにおいて、ＧＡＰ−４３は細胞外リガンド に対するＧ、の応答を相乗的に増強するか、またはＧｏのレセプターへの依存性 をくつがえすことによってリガンドに対する応答性を減少させるであろう。後者 の場合において、シナプス形成の間に起こるごとく、ＧＡＰ−４３の除去は、細 胞外リガンドに対する感受性を回復させるであろう。ＧＡＰ−４３の作用がレセ プターの効率に与える正味の効果は成分の相対的濃度に依存するであろう。

ＧＡＰ−４３は、直接に細胞外リガンドに応答する公知の能力を現在有していな い細胞内蛋白である点で、Ｇ−蛋白調節器の中でユニークである。しかしながら 、膜結合ＧＴＰａｇｅ蛋白の細胞内調節は優位を有する。通常のＲＡＳ蛋白は、 広範囲に分布した１２０ＫＤ細胞内蛋白ＧＡＰによって刺激される。それらの名 称の類似性に拘わらず、ＧＡＰ−およびＧＡＰ−４３は無関係な蛋白である。

ＧｏへのＧＴＰγＳ結合を刺激するＧＡＰ−４３の領域およびレセプターにおけ るシスティンをパルミチル化に付す。本発明者らの実験において、非バルミチル 化状暢においては、アミ／末端ペプチドおよび恐らくは（膜のｐＨ１１抽出によ って調製し、た）ＧＡＰ−４３が存在する。パルミチル化一対−非パルミチル化 ＧＡＰ−４３、およびＧ一連結レセプターがＧ蛋白を刺激する相対的能力は知ら れティない。急速なバルミチル化−説バルミチル化はこれらの蛋白についての調 節の役割を演しることは可能である。

成人神経系における００発現の持続性（ウオーレイ・ビイ・エフら（ｌｌｏｒｌ ｅｙ、　Ｐ、　Ｆ、　、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーデイングズ・サブ・ナシ冒ナ ル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｃ　ｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ旦３：４５８１　（１９８６）は、発育および再 生の間の神経突起延長の調製以外の役割を意味する。また、ＧＡＰ−４３は成人 層の不連続領域に存在し、小脳を除くと、２種の蛋白についての免疫組織化学的 マツプは驚くほど類似している（ベノウッツ・アイ・アイら（Ｂｅｎｏｖｉｔｚ 、　１．１．　、　ｅｔ　ａｌ）、トレンズ拳ニューロサイ（Ｔｒｅｎｄｓ　１ ｌｅｕｒｏｓｃｉ。

）１０　：　５２７（１９８７）；スケネ・エイチ・ジエイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ 。

Ｈ，Ｊ、　Ｐ、　）、アヌ・レブ・二二一口サイ（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ、）１至：１２７（１９８９））。ＧＡＰ−４３の位置決め、その遺 伝子調節の性質、および特にそのホスホリル化状態と海馬スラトスにおける長期 増強との関係（ロウテンプルグ・エイ（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ、　Ａ、　）、 アヌ・ニューヨーク・アカデミ−・イン・サイエンシズ（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、 　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）±４４　：　２０３　（１９８５）　）は、成人でのシナプス形成性 におけるＧＡＰ−４３についての役割を示唆している（ベノウノッら（Ｂｅｎｏ ｗｉｔｚ、　１．１．　、　ｅｔ　ａｌ）、トレンズ・二二一口サイ（Ｔｒｅｎ ｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ、）１０　：　５２７（１９８７）；スケネ・エイチ・ジ ェイ・ビイ（Ｓｋｅｎｅ、　Ｈ，Ｊ、　Ｐ、　）、　　アヌ・レブ＊二Ｊ−ｏサ イ（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

）１２＋１２７　（１９８９））。Ｇ、／Ｇ、拮抗剤、百日咳トキシンは長期増 強を阻止し、これは、恐らく同様にこの過程におけるＧｏを意味する（ゴー・ジ ェイ・ダブり二一ら（Ｇｏｈ、　Ｊ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）、サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）２４４　：　９８０　（１９８９）　）　、よって、発育間の神経 突起延長についての、および成人神経系におけるシナプス形成性についての細胞 内および細胞外信号を変換し得る。

ハイブリドーマ細胞系の寄託 本発明の好ましい単クローン抗体はＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）と名付けた 単クローン抗体の特異性を有するものである。さらなる具体例として、本発明は 、本発明の単クローン抗体を産生ずるハイプリドーマ株よりなる。本発明による 好ましいハイブリドーマ細胞系はＨ−５と名付け、ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ ５）と命名した単クローン抗体を産生ずる。該Ｈ５細胞系は、１９８９年１２月 ２１日に米国、メリーランド州２０５８１．０７クビル（Ｒｏｃｋｖｉ　１ｉｅ ）、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ）　ｌ　２３０１ 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ１ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号Ａ ＴＣＣ□が与えられた。

本明細書中に提示した実施例を含めた好ましい具体例のこれまでの記載を総括す ると、当業者ならば、本発明のさらなる具体例は、とりわけ、ゲノミックＧＡＰ −４３をフード付けする第１３図に示したヌクレオチド配列、またはその機能的 もしくは化学的誘導体、ならびにＧＡＰ−４３プロモーターをコード付けする第 １４図に示すヌクレオチド配列、またはその機能的もしくは化学的誘導体よりな ることを理解するであろう。さらに、本発明のＧＡＰ−４３プロモーターは、Ｇ ＡＰ−４３それ自体の活性の修飾のみならず、当業者によく知られた方法を用い ての、他の構造遺伝子の発現において所望の変形を達成する手段として大いに利 用性があることも理解するであろう。

かくして、広く言えば、本発明の本態様は、多重スタート部位およびコンセンサ スＰｉｔ−１結合部位を含有するが、ＴＡＴＡボックスおよびコンセンサス５ｐ −１結合部位を欠くことを特徴とする、およびさらに３重鎖（Ｈ−ＤＮＡ）コン フォメーシ璽ンを採ることができる長いホモプリン−ホモピリミジン・ストレッ チよりなることを特徴とする実質的に第１４図に示したごときプロモーターに指 向される。また、そのアミノ末端にて、同相で、本明細書中に記載したごときＧ ＡＰ−４３プロモーターのヌクレオチド配列、およびその機能的もしくは化学的 誘導体よりなる構造遺伝子、またはその断片も本発明の意図する具体例を形成す る。

さらにもう１つの具体例において、前記したごとき構造遺伝子よりなるＤＮＡ発 現ベクター、それらのベクターでトランスフェクトした宿主細胞、およびそれに より産生された蛋白が提供される。

ＦＩＧ、　３Ｂ ０〕　　　　（ｎ ＦＩＧ、　５Ｂ ＣＧ Ｕ ＣＧ ＣＧ　　　　　　ＵＡ ＵＡ　　　　　　ＵＡ ３１２υＣＣＵＧＣＧＵＣＵＧＵＣＣＵＡＣＡＵＵＵＦＩＧ、　５Ｃ 駆 く口 ＦＩＧ、　７Ｂ ＩＡ　　ＩＢ　　２Ａ　　２Ｂ　　５Ｅ　　　４　　１２　　１４細胞系 ＦＩＧ、イＯ ＧＡＰ−４３の膜ターゲツティング 構築　　　　　　雄 （３ＡＰ（−１−４）　　　　− Ｗコ＝＝＝＝：ｃ＾ゴニ＝＝＝：＝：：＝＝＝：コ　　　　　　　　　　　　　 ＧＡＰ（１−１０）ＣＡＴ　　＋！ ＦＩＧ、　ｆ６ 国際調査報告　−７１，。Ｉｎ＜ＮＩＲＴｈ１ｓ　　ａｐｐＨｅａｔｉｏｎ　　 ｃｏｎｔａｉｎｓ　　ｔｈｅ　　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　　Ｉｎｖ＠ｎｔｉｏｎｓ 　　ｏｒ　　ｑｘｏ浮垂■ ｏｆ　　１ｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　　ｗｈｌｃｈ　　ａｔｅ　　ｎｏ七　ｓｏ　　 １１ｎｋｅｄ　ａｓ　　ヒｏ　　ｆｏｚ＋ｎ　　ａ　　ｓｌ獅■撃■ ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｐｔ、　　Ｉｎ　ｏｒｄ＊ｒ　ｆｏｒ　ａｌｌ 　１ｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｂｅ　ｅｘａｍｉｎ＠ｄ。

ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｌａｔｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｅｘａｍｌｎａセｉ ｏｎ　ｆｅｅｓ　ｍｕｓｔ　ｂｅ　ｐａｉｄ。

Ｇｒｏｕｐ　１．ｃｌａｉ＋ａｓ　　１−７．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｐｏｌｙｐｅ ｐｔｉｄ＠。

Ｇ１：ａｕｐ　ＩＩＩ、ｃｌａｌｗ　１６−２４．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｎｔｌ ｂｏｄｙ　ａｎｄ　ｒｍセｈｏｃｌ　ｏｆ　ｕｓｅ。

Ｇｒｏｕｐ　ＩＶ、ｅｌａｉＭ　２５−２６．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｄｉａｇｎｏ ｓｔｌｅ　ｋｉｔ。

Ｇｒｏｕｐ　ＩＩＩ、ｃＬａｌｍ　４９．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐ ｏｌｙｐｅｐｔ１４ｅｓ。

ＧＴ：ｏｕｐ　ＸＶＩｒ、ｃｌａｉｍ　６１−７２．ｄｒａｗｎ　七ａ　　ｒＲ Ｐ　ｐ＠ｐｔｌｄ＠。

Ｇｒｏｕｐ　　ＸＶＸＸＩ、　　ｃｌａｉｍ　　７３．　　ｄｒａｗｎ　　ｔｏ 　　ｍｏｎｏｃｌｏｎａＬ　　ａｎｔｉｂｏｄｙ　畠ｑａｌ獅唐煤@　！ＲＰ。

Ｇｒｏｕｐ　Ｘ１ｒＸ、　ｃｌａｉｍｓ　　７４−７６、　ｄｒａｗｎ　ｔｏｃ ｏｍｐｏｓｉｔｌｏｎ　ａｎｄ　ｎｍｔｈｏｄ　ｆｏｘｓｔｒｕｅｔｕｚａｌ　 　ｚ＠ｍｏｄｅｌｌ口９゜Ｇｚｅｕｐ　　ＸＸ、　　ｃｌａｉｍ　　７７、　　 ｄｒａｗｎ　　ｔｏ　　Ｇ入Ｐ−４３ｂｌｒｏ！ｉｎｇ　　ｐｒｏｔ＠Ｉｎ。

Ｎｏ　　ａｄｄｉｔｌｏｎａｌ　　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　　ｆ＠ｅｓ　　ｗ ｚ会　ａｕｔｈｏｒｉｚｅｄ　　ａｎｄ　　ｏｎｌｙ　　ｏ獅■ ｉｎｖ＠ｎｔｉｏｎｗａｓｅｌ＠ｃｔｅｄ。

Ａｎｙ　１ｎｑｕｉｔｙ　ｃｏｎｃｅｒｎｌｎｇ　ｔｈｌｓ　ｃｏ圓ｎ１ｅａｔ ｌｏｎ　５ｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｌｚｅｃｔｅ＋５ｔｏ　Ｎｌ正０ｓｓａｎｎａ 　ａｔ　ｔｅｌｅｐｈｏｎｅ　ｎｕａｂ＊ｔ　（７０３１５５７−１ｉ９４０゜ ■出　願　人　　ストリテイマター、ステイーブン・エム ■出　願　人　　バレンズエラ、ダリオアメリカ合衆国０２１１４マサチューセ ッツ、ボストン、フルーツ・ストリート　（番地の表示なし） アメリカ合衆国０２１１４マサチユーセツツ、ボストン、フルーツ・ストリート 　（番地の表示なし）

Claims (77)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋な哺乳動物ＧＡＰ−４３、またはその機能的誘導体。
2. ２．該哺乳動物ＧＡＰ−４３がラットＧＡＰ−４３である請求の範囲第１項記載 の組成物。
3. ３．該哺乳動物ＧＡＰ−４３がヒトＧＡＰ−４３である請求の範囲第１項記載の 組成物。
4. ４．該ラットＧＡＰ−４３が第２図に示したアミノ酸配列、または第２図に示し たものと実質的に同様のアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記載の組成物。
5. ５．該ヒトＧＡＰ−４３が第５Ａ図に示したアミノ酸配列、または第５Ａ図に示 したものと実質的に同様のアミノ酸配列を有する請求の範囲第３項記載の組成物 。
6. ６．第２図に示したアミノ酸配列、または第２図に示したものと実質的に同様の アミノ酸配列よりなるポリペプチド、またはその機能的誘導体。
7. ７．第５Ａ図に示したアミノ酸配列、または第５Ａ図に示したものと実質的に同 様のアミノ酸配列よりなるポリペプチド、またはその機能的誘導体。
8. ８．第２図に示したヌクレオチド配列、または第２図に示したものと実質的に同 様のヌクレオチド配列よりなるｃＤＮＡ、またはその機能的誘導体。
9. ９．第５Ａ図に示したヌクレオチド配列、または第５Ａ図に示したものと実質的 に同様のヌクレオチド配列よりなるｃＤＮＡ、またはその機能的誘導体。
10. １０．請求の範囲第８項に記載のｃＤＮＡよりなるＤＮＡ発現ベクター。
11. １１．請求の範囲第９項に記載のｃＤＮＡよりなるＤＮＡ発現ベクター。
12. １２．請求の範囲第１０項または第１１項に記載の該ベクターで形質転換した宿 主細胞。
13. １３．該細胞が原核生物細胞および真核生物細胞よりなる群から選択される請求 の範囲第１２項記載の宿主細胞。
14. １４．請求の範囲第１３項記載の細胞によって生産されたＧＡＰ−４３、または その機能的誘導体。
15. １５．哺乳動物ＧＡＰ−４３をコード付けするｃＤＮＡよりなるベクターで原核 生物または真核生物宿主細胞をトランスフェクトし、該哺乳動物ＧＡＰ−４３の 発現を可能とする条件下、適当な培地中で該宿主細胞を培養し、次いで該哺乳動 物ＧＡＰ−４３を該培地から分離することを特徴とする哺乳動物ＧＡＰ−４３ま たはその機能的誘導体を生産する方法。
16. １６．哺乳動物ＧＡＰ−４３に対して定方向化された抗体、またはその機能性も しくは化学的誘導体。
17. １７．ラットＧＡＰ−４３に対して定方向化された抗体、またはその機能性もし くは化学的誘導体。
18. １８．ヒトＧＡＰ−４３に対して定方向化された抗体、またはその機能性もしく は化学的誘導体。
19. １９．該抗体が単クローン抗体および多クローン抗体よりなる群から選択される 請求の範囲第１６項、第１７項または第１８項いずれか１項に記載の抗体。
20. ２０．該抗体が検出可能に標識された請求の範囲第１９項記載の抗体。
21. ２１．該抗体が治療可能に標識された請求の範囲第１９項記載の抗体。
22. ２２．医薬上許容される担体と共に、請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４ 項、第５項、第６項、第７項または第１４項いずれか１項に記載の組成物よりな る医薬組成物。
23. ２３．さらに１種またはそれ以上の治療上有効な剤よりなる請求の範囲第２２項 記載の組成物。
24. ２４．ＧＡＰ−４３を含有する疑わしい試料を請求の範囲第２０項記載の抗体と 接触させ、ＧＡＰ−４３抗体複合体の形成を可能とするために該試料を該抗体と 共にインキュベートし、複合体化抗体を未複合体化抗体から分離し、次いで、標 識した複合体化抗体を検出することを特徴とする試料中の哺乳動物ＧＡＰ−４３ を測定または検出する方法。
25. ２５．１またはそれ以上の容器手段を閉じた区画に収容するように仕切られた担 体手段よりなり、１またはそれ以上の該容器手段が検出可能に標識された対ＧＡ Ｐ−４３抗体よりなることを特徴とするＧＡＰ−４３の測定または検出で有用な キット。
26. ２６．該抗体が多クローンおよび単クローンよりなる群から選択される請求の範 囲第２５項記載のキット。
27. ２７．細胞を有効量の神経発育因子に暴露することを特徴とする該細胞において ＧＡＰ−４３の発現を誘導する方法。
28. ２８．該細胞が神経細胞である請求の範囲第２７項記載の方法。
29. ２９．該細胞をｉｎｓｉｔｕにて該神経増殖因子に暴露する請求の範囲第２８項 記載の方法。
30. ３０．ＧＡＰ−４３をコード付けするｃＤＮＡよりなるＤＮＡ発現ベクターを細 胞に導入することを特徴とする該細胞においてＧＡＰ−４３の発現を増強する方 法。
31. ３１．トランスフェクション、形質導入、または直接マイクロインジェクション によって該ベクターを該細胞に導入する請求の範囲第３０項記載の方法。
32. ３２．請求の範囲第２８項、第２９項、第３０項または第３１項いずれか１項に 記載の方法によって神経細胞におけるＧＡＰ−４３発現を誘導することを特徴と する該細胞において構造再編成を促進する方法。
33. ３３．損傷した神経組織中でまたはその周囲においてＧＡＰ−４３発現を誘導す ることを特徴とする該損傷した神経組織の治癒を促進する方法。
34. ３４．該神経損傷が虚血を伴う梗塞、梗塞なしの一時的虚血、低酸素症、無酸素 症、無酸素性脳症、ハイポパーヒュージョン（ｈｙｐ−ｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ） 、または卒中によって引き起こされる請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．神経発育因子、ステロイドおよびそれらの機能的誘導体よりなる群から選 択される１種またはそれ以上の物質の有効量にニューロン細胞を暴露することを 特徴とする該ニューロン細胞において構造再編成を変調する方法。
36. ３６．神経発育因子、ステロイドおよびそれらの機能的誘導体よりなる群から選 択される１種またはそれ以上の物質の有効量にニューロン細胞を暴露することを 特徴とする該ニューロン細胞においてシナプス可塑性を変調する方法。
37. ３７．神経発育因子、ステロイドおよびそれらの機能的誘導体よりなる群から選 択される１種またはそれ以上の物質の有効量にニューロン細胞を暴露することを 特徴とする該ニューロン細胞のミクロ環境を変調する方法。
38. ３８．哺乳動物ニューロン細胞を有効量の１種またはそれ以上のステロイドに暴 露することを特徴とする該哺乳動物ニューロン細胞においてＧＡＰ−４３発現を 抑制する方法。
39. ３９．十分に分化した哺乳動物ニューロン細胞を有効量の１種またはそれ以上の ステロイドに暴露することを特徴とする該ニューロン細胞においてＧＡＰ−４３ 発現を変調する方法。
40. ４０．該ステロイドがコルチコステロイドである請求の範囲第３５項、第３６項 、第３７項、第３８項または第３９項いずれか１項に記載の方法。
41. ４１．該コルチコステロイドが鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイドよりな る群から選択される請求の範囲第４１項記載の方法。
42. ４２．該鉱質コルチコイドがデキサメタゾン、コルチコステロン、アルドステロ ンおよびプロゲステロンよりなる群から選択される請求の範囲第４１項記載の方 法。
43. ４３．ステロイドに暴露した哺乳動物ニューロン細胞を有効量のシクロヘキシイ ミドに暴露することを特徴とする該ニューロン細胞においてＧＡＰ−４３発現の ステロイド抑制を増大させる方法。
44. ４４．該細胞が非ニューロン細胞である請求の範囲第３０項または第３１項記載 の方法。
45. ４５．ヌクレオチド配列： ａｔｇ　ｃｔｇ　ｔｇｃ　ｔｇｔ　ａｔｇ　ａｇａ　ａｇａ　ａｃｃ　ａａａ　 ｃａｇまたはその機能的誘導体よりなる膜−ターゲッティングペプチドをコード 付けするｃＤＮＡ。
46. ４６． Ｉ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲ　ＬＹ Ｓ　ＧＬＮ；ＩＩ．ＭＬＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ 　ＴＨＲ　ＬＹＳ；ＩＩＩ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ 　ＡＲＧ　ＴＨＲ；ＩＶ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　 ＡＲＧ；Ｖ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ；ＶＩ．ＭＥＴ 　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ；ＶＩＩ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ ；およびＶＩＩＩ．その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列よりなる腹−ターゲッティングペプチド 。
47. ４７． Ｉ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲ　ＬＹ Ｓ　ＧＬＮ；ＩＩ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ 　ＴＨＲ　ＬＹＳ；ＩＩＩ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ 　ＡＲＧ　ＴＨＲ；ＩＶ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　 ＡＲＧ；Ｖ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ　ＡＲＧ；ＶＩ．ＭＥＴ 　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＭＥＴ；ＶＩＩ．ＭＥＴ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＣＹＳ ；およびＶＩＩＩ．その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード付けするヌクレオチドよりなる 腹−ターゲッティングペプチドをコード付けするＤＮＡ配列。
48. ４８．そのアミノ末端において、同相にて、請求の範囲第４６項記載の配列を有 する膜−ターゲッティングペプチドをコード付けするヌクレオチドよりなる構造 遺伝子またはその断片。
49. ４９．そのアミノ末端にて、請求の範囲第４６項記載の配列よりなる膜−ターゲ ッティングペプチドからなる蛋白またはペプチド。
50. ５０．（ａ）所望の蛋白またはベプテドのアミノ末端に請求の範囲第４６項記載 のアミノ酸配列よりなる膜−ターゲッティングペプチドを結び；次いで （ｂ）得られた按腹−ターゲッティングドメインよりなる蛋白またはペプチドを 細胞に導入することよりなり、工程（ｂ）の得られた蛋白またはペプチドは該膜 −ターゲッティングドメインによって該細胞の膜に対し定方向化されていること を特徴とする該所望の蛋白またはペプチドを細胞の膜に対し定方向化する方法。
51. ５１．該細胞がニューロンおよび非ニューロン細胞よりなる群から選択される請 求の範囲第５０項記載の方法。
52. ５２．該ニューロン細胞において、工程（ｂ）の該得られた蛋白またはペプチド が該細胞の成長円錐領域に対し定方向化されている請求の範囲第５１項記載の方 法。
53. ５３．ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）またはその機能的もしくは化学的誘導体 の特異性を実質的に有し、該ＭＡｂ抗−ＧＡＰ−４３（Ｈ５）がハイブリドーマ 株Ｈ５によって産生され、該ハイブリドーマ株が受託番号ＡＴＣＣを有する単ク ローン抗体。
54. ５４．受託番号ＡＴＣＣを有するハイブリドーマ株Ｈ５、またはその機能的もし くは化学的誘導体。
55. ５５．ゲノミックＧＡＰ−４３をコード付けする第１３図に示したヌクレオチド 配列、またはその機能的もしくは化学的誘導体。
56. ５６．ＧＡＰ−４３プロモーターをコード付けする第１４図に示したヌクレオチ ド配列、またはその機能的もしくは化学的誘導体。
57. ５７．多重スタート部位およびコンセンサスＰｉｔ−１結合部位を含有するが、 ＴＡＴＡボックスおよびコンセンサスＳｐ−１結合部位を欠くことを特徴とし、 さらに３重鎖（Ｈ−ＤＮＡ）コンフォメーションを採ることができる長いホモプ リン−ホモピリミジンストレッチよりなることを特徴とする実質的に第１４図に 示したプロモーター。
58. ５８．そのアミノ末端において、同相で、請求の範囲第５６項または第５７項に 記載のヌクレオチド配列よりなる構造遺伝子またはその断片、またはその機能的 もしくは化学的誘導体。
59. ５９．請求の範囲第５８項記載の構造遺伝子よりなるＤＮＡ発現ベクター。
60. ６０．請求の範囲第５９項記載の該ベクターで形質転換した宿主細胞。
61. ６１．内部調節蛋白（ＩＲＰ）。
62. ６２． Ｉ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＧＶ；ＩＩ．ＭＬＣＣＭ ＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤＧ；ＩＩＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥ ＫＮＤＥＤＱＫＩＥＱＤ；ＩＶ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥ Ｑ；Ｖ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩＥ；ＶＩ．ＭＬＣＣＭＲＲ ＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱＫＩ；ＶＩＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥＤＱ Ｋ；ＶＩＩＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＥＫＮＤＥＤＱ；ＩＸ．ＭＬＣＣＭＲＲＴ ＫＱＶＥＫＮＤＥＤ；Ｘ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤＥ；ＸＩ．ＭＬＣＣ ＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮＤ；ＸＩＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫＮ；ＸＩＩＩ． ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶＥＫ；ＸＩＶ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＱＶＥ； ＸＶ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ； ＸＶＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱ； ＸＶＩＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ； ＸＶＩＩＩ．ＭＬＣＣＭＲＲＴ； ＸＩＸ．ＭＬＣＣＭＲＲ； ＸＸ．ＭＬＣＣＭＲ； ＸＸＩ．ＭＬＣＣＭ； ＸＸＩＩ．ＭＬＣＣ；および ＸＸＩＩＩ．その機能的誘導体 よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＩＲＰペプチド。
63. ６３． 請求の範囲第６２項記載のＩＲＰペプチドをコード付けするヌクレオチド配列。
64. ６４． コンセンサスアミノ酸配列： 疎水性−ｌｅｕ−ｃｙｃ−ｃｙｃ−ｘ−塩基性−塩基性有するＩＲＰペプチドま たはその機能性誘導体。
65. ６５．該システインがパルミチル化し易い請求の範囲第６２項または第６４項記 載のＩＲＰペプチド。
66. ６６．所望の蛋白およびその結合基質よりなる環境に有効量のＩＲＰペプチドを 導入することを特徴とする該所望の蛋白の結合活性を刺激する方法。
67. ６７．該所望の蛋白がＧ蛋白である請求の範囲第６６項記載の方法。
68. ６８．該Ｇ蛋白がＧ０である請求の範囲第６７項記載の方法。
69. ６９．該ＩＲＰペプチドが請求の範囲第６２項、第６４項または第６５項記載の ペプチドである請求の範囲第６６項記載の方法。
70. ７０．該環境が生きた細胞の内部である請求の範囲第６６項記載の方法。
71. ７１．該細胞が中枢神経または末梢神経細胞である請求の範囲第７０項記載の方 法。
72. ７２．該結合基質がＧＴＰである請求の範囲第６７項記載の方法。
73. ７３．請求の範囲第６２項または第６４項記載のＩＲＰペプチドに対し定方向化 された単クローン抗体、またはその機能的もしくは化学的誘導体であって、該単 クローン抗体またはその該誘導体が所望により検出可能にまたは治療可能に標識 されたことを特徴とする当該単クローン抗体、またはその機能的もしくは化学的 誘導体。
74. ７４．医薬上許容される担体と共に、請求の範囲第６２項または第６４項記載の ＩＲＰペプチドよりなり、かつ、所望により、１種またはそれ以上の治療上有効 な剤よりなる医薬組成物。
75. ７５．医薬上許容される担体と共に、請求の範囲第７３項記載の単クローン抗体 よりなり、かつ、所望により、１種またはそれ以上の治療上有効な剤よりなる医 薬組成物。
76. ７６．請求の範囲第７４項または第７５項記載の組成物の有効量を神経細胞に投 与することを特徴とする該神経細胞において構造再編成を変調する方法。
77. ７７．ＧＡＰ−４３に特異的に結合し、３９０００の分子量を有し、５０ｍＭト リス緩衝液中のＥＤＴＡの適用で単一のバンドにて溶出し、かつ対Ｇ０多クロー ン抗体と非反応性であることを特徴とする神経成長関連蛋白。