JPH03503482A

JPH03503482A - ポックスウイルスベクター

Info

Publication number: JPH03503482A
Application number: JP1502516A
Authority: JP
Inventors: ボイル，デービッド・バーナード; クマー，シャラド
Original assignee: コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガナイゼーション
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1991-08-08
Also published as: ATE115187T1; CA1341251C; DE68919846T2; EP0414689B1; EP0414689A4; US5368855A; US5258294A; WO1989007644A1; ZA891067B; NZ227934A; EP0414689A1; AU3069889A; DE68919846D1; AU611263B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】のであり、一つの局面においては、本発明は組み換えニワトリポックスウィルスベクターおよびその使用法に関するものである。

ポックスウィルスは感染細胞の細胞質内で複製する巨大ＤＮＡウィルスである。

ワクチニアウィルスはポックスウィルスファミリーのなかで最も広く研究されているものであり、ワクチニアウィルスゲノム中に挿入した多数の外来遺伝子の発現に用いられてきた。近年ワクチニアウィルスゲノムの不必要な領域が明らかになり、続いてマツピングおよびヌクレオチド配列決定が行われたことにより、組み換えワクチニアウィルスの中間に広範囲の外来遺伝子を挿入して発現させることが可能になった。

このような組み換えワクチニアウィルスはワクチン抗原を多様な動物種へ供与する可能性がある。しかしながら、挿入された遺伝子の正確な発現のために、遺伝子を固有のウィルス性プロモーター領域の近傍におくことが重要である。

現在認識されている問題は、種間感染の危険であり、また、それにより動物にワクチニアウィルスを広範に使用することによるある動物種から別の動物種への疾患の拡張である。したがって、宿主特異的ポックスウィルスに基づいた組み換え体の構築、例えば、家禽類のためのニワトリポックスウィルスまたはヒツジワクチンのためのＯＲＦ、であることが望ましい。ワクチニアウィルスの多数の初期遺伝子および後期遺伝子に関するプロモーター配列が報告されているが、そのほかのポックスウィルスのプロモーター領域に関してはほとんど知られていない。

宿主特異的生ウイルスワクチンを構築するために、これらのウィルスの分子生物学、および特にポックスウィルスの転写調節因子あるいはプロモーター領域が理解されることが根本的に必要である。したがって、これらを適当な組み換えベクターに使用する以前にこれらの領域を解析し単離することが必要である。このようなベクターはウィルス性ワクチンなどの製造のために大きな可能性を持つものである。

したがって、以前の技術に関連したひとつ以上の欠陥および／または困難を克服、あるいは少なくとも軽減することが本発明の目的である。

したがって、本発明の第一の局面では、ニワトリポックスウィルス主要初期タンパク賞の発現のための第一のプロ七′−ターを含む遺伝子配列が与えられる。

本発明の望ましい態様においては、該遺伝子配列はさらに該第−のプロモーターと逆向きの、ニワトリポックスウィルス後期タンパク質の発現のための第二のプロモーターを含む。

該遺伝子配列は約４０塩基対であって、互いに逆向きの二つのプロモーター因子からなる。

上述のように、このプロモーター配列は、望ましい形態においては、主要初期機能および、初期機能と逆向きの後期機能を有するものであると特徴づけられる。

プロモーターの初期機能はワクチニアウィルスの既知の最強のプロモーター（ＰＬＩＩ）とよく対応する。このプロモーターの強度とその特徴的な双方向的性質のため、外来抗原の供給のためにワクシニア（ｙｖ）とＦＰＶベクターおよびその他の組み換えポックスウィルスの双方の構築において重要な応用性を有する。

その短さと決まった長さのため、該配列は以下に述べるようにポックスウィルス発現系中で目的の二つの外来遺伝子を同時に発現する多機能のＤＮＡ因子となる。その初期機能はＰＬＩＩの強度とよく対応し、ウィルス増殖周期の後期過程における外来遺伝子の発現にはｖｖプロモーターが広く用いられるので、これはウィルス増殖の初期過程で高水準の発現が必要とされる場合のプロモーターの選択枝のひとつである。そのプロモーター強度は、組み換えＶＶ、　ＦＰＶなどのポックスウィルスで遺伝子を発現させるためにこれまで広く使われてきたＶＶＰ７．５プロモーターよりも３−４倍強い（総説として、モス（ｌ［ｏｓｓ）および７レキシナー（Ｆｌｅｘｎｅｒ）、１９８７参照）。

後期テロモーターによって発現された遺伝子産物は細胞毒性Ｔリンパ球によって認識されないことがわかっているので（クーパー（Ｃｏｕｐａｒ）他、１９８６）、該遺伝子配列は発現された抗原に対する細胞毒性ＴＩＪンバ球反応を誘導するのに特に有用である。ＦＰＶ天然プロモーターであるので、該プロモーターは、家禽類に優先的にワクチン抗原を供給するためのＦＰマ由来のベクターを開発するためのよい選択である。

最後に、その小ささと決まったサイズおよびその特異的な構造のため、ポックスウィルスの経時的な制御を研究するための重要な道具が提供されることになる。

本発明のさらなる望ましい局面においては、ニワトリポックスウィルス主要初期タンパク質の発現のための第一のプロモーターを含む遺伝子配列が与えられる。

したがって、望ましい局面においては、上述のようなプラスミドｐｓｔｏ６およびｐｓに０７から選択されるプラスミドが供給される。

プラスミドｃ＋５ＫＯ６を含む精製されたＤＮＡ試料は、オーストラリア政府アナリティカル・ラボラトリーズ（１スアキン・ストリート、ビンプル、二二一すウスウエールズ、２０７３、オーストラリア）に１９８９年２月９日に寄託され、寄託番号Ｎ８９１００４６２１を与えられた。

ウィルス性ベクターまたはその誘導体は適当なプラスミドクローニングベクターを用いて構築される。適当なプラスミドクローニングベクターには、ｐＵＣ８，ｐＵｃ１２．　Ｍ１３１ｐ８および［１３−＋＊ｐ９が含まれる。

天然のプロモーター領域および外来ＤＮＡ断片はＦＰＶゲノムの非必須領域のＤＮＡに隣接する。ニワトリポックスウィルスの天然プロモーター領域を用いたＤＮＡ構築物の使用により高度に宿主特異的なウィルスを供給できるだけでなく、選択された遺伝子の発現を開始させるために他の材料、例えばワクチニアウィルス由来のプロモーター領域などの外来プロモーター領域を用いたこれまでの全ての他の組み換えポックスウィルスと比較してその翻訳効率の点ではるかにより効果的なウィルスも供給できる。

したがって、望ましい局面においては、ベクターウィルスのゲノムの一部を含むウィルス性ベクター；ニワトリポックスウィルス初期タンパク質の発現のための第一のプロモーター；該第−のプロモーターと逆向きにニワトリポックスウィルス後期タンパク質の発現のための第二のプロモーター；を含む遺伝子配列；および第一の問題となる外来遺伝子をコードし、第一のプロモーターの制御下にある第一のＤＮＡ配列が供給される。

第一の外来ＤＮＡ配列は鳥類の疾患に特徴的な第一の抗原をコードすることが望ましい。

本発明のこの局面の望ましい態様においては、ウィルス性ベクターは該第−のＩ）ＨＡ配列の代わりに、またはそれに加えて、第二のｒｊＩｇとなる外来遺伝子をコードし、第二のプロモーターの制御下にある第二のＤＮＡ配列を含む。

第二の外来ｔｌＮＡ配列は鳥類疾患に特徴的な第二の抗原をコードすることが望ましい。

特に望ましい態様では、ウィルスのゲノムの一部がニワトリポックスウィルスゲノムまたはワクチニアウィルスゲノムである。

望ましい態様では、プラスミドクローニングベクターはＦＰＶゲノムの非必須領域のＤＮＡ配列を含み、その中に適当な天然プロモーター領域と外来ＤＮＡのプロモーターを挿入することができる。

この態様では、天然プロモーター領域と外来ＤＮＡのプロモーターにＦＰＶゲノムの非必須領域のＤＮＡが隣接することができる。

したがって、本発明の本局面によるウィルス性ベクターはワクチン、特に鳥類疾患に対するワクチンの調製に使用することができる。

本発明のさらなる局面においては、ウィルス性ベクターの調製法が供給され、該調製法は、ニワトリポックスウィルス由来のウィルス性ＤＮＡ　、およびプラスミドクローニングベクター：を与えること：ウィルス性ＤｌｆＡからゲノムライブラリーを構築することニゲノムＤＮＡライブラリーから遺伝子配列を同定すること、を含むものであって、該遺伝子配列が、ニワトリポックスウィルス主要初期タンパク質の発現のための第一のプロモーター；および該第−のプロモーターと逆向−きにニワトリポックスウィルス後期タンパク質の発現のタンパク貿の第二のプロモーターを含むものであるもの；およびプラスミドクローニングベクターの適当な部位に遺伝子配列を挿入することを含む。

本発明の本調製法の望ましい局面においては、本調製法は適当な天然プロモーター領域のマツピングおよび塩基配列決定過程を含む。

本発明の本調製法のさらなる望ましい局面においては、本調製法はさらに、第二の適当なプラスミドクローニングベクターを与えること、および天然プロモーター領域を含む第一のプラスミドクローニングベクターの断片を第二の適当なプラスミドクローニングベクターにサブクローニングすることを含む。

望ましい調製法はさらに天然プロモーター領域のさらなる塩基配列決定を含む。

本発明の本調製法の望ましい態様においては、調製法は、第一の適当なプラスミドクローニングベクター、適当な天然プロモーター領域、ＦＰＶゲノムの非必須領域をコードするＤＮＡの第一の断片、第二の外来ＤＮＡ断片、を与えること；第一の断片を適当なプラスミドクローニングベクタ・−にクローニングすること、天然プロモーター領域を適当なプロモータークローニングベクターの第一のＤＮＡ断片中にクローニングすること、第二の外来ＤＮＡ断片を適当なプラスミドクローニングベクターの第一のＤＮＡ断片中にクローニングすることを含む。

この望ましい方法中で、天然のプロモーター領域および第二の外来ＤＮＡ断片が、上述のように作成された隣接するＦＰＶゲノムの非必須領域によってあらかじめ確立された領域において生育可能なＦＰＶに挿入されることは理解されるであろう。

このように形成された配列は、例えば相同的組み換えなどの適当な技術を用いてＦＰＶウィルス感染細胞に挿入することができる。

以下で本発明がニワトリポックスウィルスの初期遺伝子の単離および解析、およびプラスミドベクターへのニワトリポックスウィルスプラスミド配列の挿入に関して記述される場合、その技術はその他の天然動物ポックスウィルスプロモーター頭域の単離と解析、および適当な組み換えプラスミドへの挿入に同様に適用可能であることは理解されるべきである。これらのプラスミドは次に動物ポックスウィルスワクチンの産生に使用することができる。

プロモーター配列のマツピングと塩基配列決定の第一段階において、望ましい同定では、ＦＰＹゲノムにコードされた初期＠ＲＮＡの同定が行われる。このような同定により主要な約１．０ｋｂの転写産物が得られ、約１．５ｋｂのＣｌａＩ断片にマツピングされた。

１、５ｋｂ断片はｐＵＣ８とＩ［１３ベクターにクローニングされ、塩基配列が決定された。

したがって、本発明の望ましい態様において、適当なプラスミドまたはバクテリオファージクローニングベクターにクローニングされた約１．５ｋｂ　ＣｌａＩ断片を含むニワトリポックスウィルスベクターが供給される。このようなりローニックベクターとしてはｐＵＣ８、ｐＵｃ１２、Ｍ１３−ｍｐ８およびｍｐ９が含まれる。

さらなる同定は、別のプラスミドにサブクローニングされて塩基配列決定されるクローン断片を用いて行われる。ジデオキシチェーンターミネーション法が使用される。

したがって、本発明のさらなる態様においては、短い囲Ｎ配列に分断された後期ＲＮＡ開始部位と初期ＲＮＡ開始部位を含む遺伝子配列が含まれる。この遺伝子配列が双方向性プロモーターカセットを構成する。

さらなる局面においては、本発明は組み換えニワトリポックスウィルスを含む鳥類疾患ワクチンを供給するために使用され、それにおいて少なくとも該鳥類疾患に特徴的な抗原をコードする第一の外来りにＡ配列がニット、　ＩＪポックスウィルスの適当な遺伝子内または該遺伝子の発現を調節するウィルス性ＤＮＡ配列内に、少なくとも第一の天然ニワトリポックスウィルスプロモーター傾城の制御下に置かれるように挿入された。二つの外来ＤＮＡ配列が双方向性プロモーター因子の制御下で、どちらかの側に逆向きになるように挿入されることが望ましい。

本発明によれば、ウィルス、細菌、原生動物、後生動物、菌類などの病原生物によって引き起こされる多様な鳥類疾患に対する保護が、上で概略を述べたようにＦＰＶゲノムにこれらの疾患に特徴的な適切な抗原をコードするＤＮＡ配列を挿入することによって可能となることが想定される。

一つの局面においては、本発明により従来得られた物よりも生物学的により安全な範囲の宿主特異的組み換え鳥類ワクチンの構築が可能となり、該ワクチンはニワトリポックスウィルスの天然プロモーター頭域を含むものである。

したがって、本発明はまた、組み換えニワトリポックスウィルスまたは関連する鳥類ポックスウィルスの構築に有用な方法を提供し、該方法は外来ＤＮＡをニワトリポックスウィルスまたはウィルス性配列に挿入することによって特徴づけられ、該配列は天然ＦＰＶプロモーター領域を用いることができる。

本発明は以下で実施例を参考にしてより詳細に述べられる。しかしながら、以下の記述は例示的なものであって上述の発明の一般性に制限を与えるものでは全くないことが理解されるべきである。

第１図はニワトリポックスウィルスゲノムのＰｓｔＩ断片Ｆの制限酵素地図およびその中の主要Ｅ遺伝子のマツピングである。Ｌ５ｋｂ　ＣｌａＩ断片中の二つのＯＲＦの向きとその一つの上流を矢印で示す。０ＲＦＩと３は二つの後期遺伝子を示し、０ＲＦ２は主要初期遺伝子を示す。

第２図は初期転写産物をコードするＦＰＹ−ＰｓｔＩ断片Ｆのノザンプロット分析によるマツピングである。ＡｒａＣの存在下でインキュベートしたウィルス感染細胞から単離した全ＲＮ＆を、二γクトランスレーシツンしてゲル精製したＰｓｔＩ断片ＦのＣｌａＩ断片と／１イブリダイズさせた。Ａ、１゜５ｋｂ、　Ｂ、　２．Ｏｋｂ、　Ｃ，３，Ｏｋｂ：　Ｄ、　４．Ｏｋｂ、およびＥ、　４．８ｋｂ。

ＲＮＡは１．２％アガロース、５．４％ホルムアルデヒド変性ゲルで電気泳動し、ハイボンド−Ｎナイロンメンンブレン上にブクットし、ニックトランスレージランでＭｔＰで標識したプローブとハイブリダイズさせた。

第３図はＬ　５ｋｂ　ＣｌａＩ断片とその周辺領域の塩基配列である。塩基配列は、Ｉ［１３中の１．５ｋｂ　ＣｌａＩ断片のＥｃｏＲＩおよびＩ［１ｎｄＩＩＩサブクローンを用いてジデオキシ法によって双方の鎖から決定したものである。ＣｌａＩ部位の上流および下流傾城の塩基配列は、３．７ｋｂ　５ａｌＩ断片を含む［１３クローン由来の５ｓＤＮ＆テンプレート上で合成プライマーを用いて決定した（第１図参照）。二つのＯＲＦの翻訳開始部位および終止部位、およびＳ１ヌクレアーゼ解析で用いたプライマーの位置を示しである。３つの全ての遺伝子の１？Ｎλ開始部位は点線で示しである。本文で述べた二つのプロモーター因子（ＥおよびＬ）は本図に箱で示した。

第４図は１．５ｋｂ　ＣＬａＩ断片のＳ１ヌクレア一ゼ分析である。

ＣｌａＩ断片の相補的な鎖を含む二つの５５−Ｍ１３　ＤＮＡクローン（それぞれｍｐ８とｍｐＱ中）を非感染宿主細胞（レーン１および４）またはＡｒａ、Ｃ存在下（レーン２および５）または非存在下（レーン３および６）でインキュベートしたＦＰＶ感染細胞由来の全細胞性ＲＮＡとハイブリダイズさせ、続いてＳ１ヌクレアーゼで処理した。保護された断片を１％アルカリアガロースゲルで分離し、ナイロンメンンブレンに移してニックトランスレージ５ンで”ｐｍｍしたＣｌａＩ断片と／Ｎイブリダイズさせた。　１［１３＠ｐ８クローン（レーン１ −３）は初期ＲＮＡ様鎖であり、］［１３ｍｐ９クローン（レーン４−６）は初期遺伝子ＲＮＡに相補的な配列を含む。

第５図は０ＲＦ１をコードするＲＮＡの５゛末端のマツピングである。非感染ＣＥＳ細胞（レーン２）またはＡｒａＣ存在下（レーン３）または非存在下（レーン４）のＦＰＹ感染細胞由来の全細胞性ＲＮＡを１２Ｐ標識したＳＳプローブ（レーン１）と７１イブリダイズさせた。プローブの調製にはＣｌａＩ部位の４２４ｂｐ（プライマー１）および４８２ｂｐ（プライマー２）上流のＯＩ！ＦＩに相補的な合成プライマーをｓｓ−［１３ＤＮＡクローン（１１３−３ａｌ　３．７）上で”Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で伸長させて５ａｌＩで切断し、関連するＤＮＡ断片をシーフェンスゲルから単離した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを８１ヌクレアーゼで処理し、保護された断片を同一の１［１３ＤＮＡテンプレートとプライマーによって得られたシーフェンスラダーと隣接させて６％シークエンスゲルで泳動した。パネルＡおよびＢはそれぞれプライマー１とプライマー２を用いた実験を示している。保護された主要な断片の５′末端周辺の塩基配列がＲＮＡ様配列にｉして示されている。Ｓ１ヌクレア一ゼ分析の技術的な詳細はデービス（ｐａｖｉｓ）他（１９８６）によるものである。

第６図は０ＲＦ２をコードするＲＮＡの５°末端のマツピングでアル。ＲＮＡｔ１鎖に相補的なｊｌｐ標１ｔｓｓＤＮＡブローフヲ、１［１３−５ａｌ　３．７５ｓＤＮＡクローン上のＣｌａＩ部位から１２４ｂｐ上流の合成プライマーから伸長させることによって調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、４５３ｂｐのプローブをシーフェンスゲルから単離した。プローブ（レーン１）を非感染細胞（レーン２）、１００μｇ／ｍｌシクロへキシミド存在下（レーン３）または５ｈｇ／ｍｌ　ＡｒａＣ存在下（レーン４）または双方の非存在下（レーン５）でインキュベートしたＦＰＶ感染細胞から単離したＲＮＡとハイブリダイズさせた。ＤＮＡ− ＲＮＡハイブリッドの８１処理に続いて保護された断片を６％シークエンスゲルで解析した。ＤＮＡマーカー（１）はＨｐａＩＩで切断したｐＢＲ３２２断片を３２ｐで標識して調製した。左側のシーフェンスラダーは、／ヘイブリダイイーシランプローブの調製に用いたものと同じプライマーとテンプレートを用いて得たものである。

保護された断片の５′末端周辺の塩基配列はＲＮＡ様鎖に関して示しである。

第７図は０ＲＦ３をコードするＲＮＡの５′末端のマツピングである。ＲＮＡに相補的な”ＰｔＬ：Ｉした５ｓＤＮＡは、ＲＮＡ様鎖を含む）［１３−５ａｌ　３．７５ｓＤＮＡクローン上のＣｌａＩ部位から９１ｂｐ下流の合成プライマーを伸長させ、ＡｃｃＩで消化した後にシーフェンスゲルから２６０塩基のプローブを単離することによって調製した。その他の実験上の詳細は第５図と同様である。レーン１、プローブのみ；レーン２、非感染細胞ＲＮＡ　、　　レーン３、初期ＲＮＡ　（シクロへキシミド）；　レーン４、初期ＲＮＡ（ＡｒａＣ）　；　レーン５、後期ＲＮＡ、　？−カー（１）は第５図と同じものである。保護された二つの後期ＲＮＡ周辺の配列はＲＮＡ様鎖に関して示しである。

第８図は一過性発現実験で用いたプラスミドの構築である。５ａｌＩ部位にプロモーター因子ＣＰ）を含むｐｓＫＯ６のポリリンカー領域をパネルＡに示す。初期および後期転写の方向が示してあり、初期および後期ＲＮ＆開始部位は下線で示しである。ｐｓＫＯ９とｐＳ［２２の材料となったｐｓＫＯｌでは、ポリリンカーに対する５ａｌＩ断片の向きがｐＳＫＯ６と逆になっている：ｐＳに０８およびｐＳに０９は大腸菌ＬａｃＺ遺伝子をそれぞれｐｓｔｏ６およびｐｓ［０７のＢａｍＨＩ部位にクローニングして構築された（Ｂ）。一過性発現系で使用したｐｓＫＯ８およびｐｓＫＯ９欠失変位に関するプロモーター−ＬａｃＺ接合部周辺の配列も示しである。表３で詳述する実験で用いた他のプロモーターの基本的な構造をパネルＣに示す。パネルＣの図中で、プロモーターと遺伝子断片は実際のサイズに比例していない第９図はＦＰＶの初期および後期プロモーターを並べたものである。

主要初期遺伝子の同定とマツピング初期ｍＲＮＡをコードするＦＰｖは、ＡｒａＣの存在下で培養したＦＰＶｇ染ＣＥＳ細胞から調製した全細胞性ＲＮＡを、ＦＰＶゲノムの４つのクローン化されたＰｓｔＩ断片にハイブリダイズさせて検出した。ＦＰＶの全ゲノムの約１／６を示す４つの断片Ｅ、　Ｆ、　Ｊ、および【（それぞれ２０．５．１７．３．１２．５．および５．７ｋｂ）　（クーパー（Ｃｏｕｐａｒ）他、未公開データ）が解析され、ＲＮＡのノザン分析によって１１の初期転写産物が同定され（表１）、そのうち４個は断片Ｆにハイブリダイズした。

断片Ｆの制限酵素地図を第１図に示す。１７．３ｋｂ断片Ｆ中の初期転写産物のマツピングを行うために、それぞれ４．８゜４．０．３．０．２Ｘ２．Ｏおよび１．５ｋｂのサイズで分離した５個のＣｌａＩ断片を初期ＲＮＡとハイブリダイズさせた（第２図）。

主要ＲＮＡ転写産物（約１．０ｋｂ）は１．５ｋｂ断片にマツピングされた。３．２．２．３．および１．２ｋｂの３個の他の初期転写産物もそれぞれ検出された。この転写産物の量は、本研究で用いたＦＰＶゲノムの４個のＰｓｔＩ断片にハイブリダイズするどの他の転写産物と比較しても約１０倍である。

ＣＬａＩ断片の塩基配列決定１．５ｋｂ　ＣｌａＩ断片をｐＵＣ８のＡｃｃＩ部位にクローニングし、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出し、ｉ［１３ｍｐ８とｍｐ９に再クローニングした。このクローンのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片も蓋１３ベクターにサブクローニングし、双方の鎖の塩基配列決定を行うことによって得られた１、　５ｋｂ　ＣｌａＩ断片の完全な塩基配列を第３図に示す。塩基配列は二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなり、一方（ＯＲＦｌ）はＣｌａＩ部位を越えて伸び（１１０１ｂｐ）、他方（ＯＲＦ２）は逆向きで１．５ｋｂ　ＣｌａＩ断片中のみに含まれる（５０１ｂｐ）。これらのＯＲＦのうちのどちらが初期ＲＮＡをコードしているかをａ認ｔ　るために、１．５ｋｂ　ＣｌａＩ断片の相補的鎖からなる２種の一本領旧３クローンをＦＰＶ感染細胞由来の初期および後期ＲＮＡにハイブリダイズさせ、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、アルカリ変性ゲル上で電気泳動し、ナイロンメンブレンに移してニックトランスレージランしたＣｌａＩ断片とハイブリダイズさせた。ｍｐ８クローン（ＯＲＦＩに相補的）は１゜５ｋｂ後期ＲＮＡを保護し、ｓ＋ｐ９クローン（ＯＲＦ２に相補的）は一つの０．５５ｋｂ初期ＲＮ＾と１．５ｋｂと０．５５ｋｂの二つの後期ＲＮＡを保護した。このことは、０ＲＦＩと０ＲＦ２はそれぞれ後期および初期ｌ後期転写産物をコードしていることを示唆する。

感染の後期に保護された０、　５５ｋｂ断片（第４図、レーン６）はおそらく安定な初期メツセージの存在を表す。レーン６で保護された１、　５ｋｂの長いほうの断片は初期転写産物と同じ開始点から読まれて下流の遠いほうのＣｌａＩ部位で終結している転写産物であるか、または上流の近いほうのＣｌａＩ部位（初期遺伝子開始点の上流）から生じる後期転写産物であろう。ポックスウィルス後期遺伝子は決まった終結シグナルを持たず、不均一な３′末端を持つ転写産物が生じるので（モス（Ｍｏｓｓ）、　１９８５）、第４図のレーン６の保護された１、　５ｋｂ断片は初期開始部位の近傍または上流の後期ＲＮＡ開始部位からのみ生じた可能性がある。Ｓ１ヌクレア一ゼ分析（以下参照）から、前者の可能性が真実であることが明らかとなった。

０ＲＦＩをコードするＲＮＡの５°末端の分析前述のデータ（第４図）から、０ＲＦＩが後期ＲＮＡをコードすることが明らかとなった。この後期遺伝子の５゛末端を決定するために、後期ＲＮＡｔｌｊｉ鎖に相補的な２種の合成オリゴマー（プライマー１および２、第３図）を３．７ｋｂ　５ａｌＩ断片を含むｌ１１３クローン（第１図）上でｊ”Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で伸長させた。後期転写産物に相補的な５ｓＤＮＡプローブをＦＰＹ感染細胞由来の初期および後期ＲＮＡとハイブリダイズさせ、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した（藁５図）。第５図から、後期ＲＮ＆のみがプローブを保護し、主要な保護産物が翻訳開始部位近傍の’　ＴＡＡＡＴ’配列にマツピングされることが明らかである（第３図）。

０ＲＦ２をコードするＲＮＡの５′末端の分析遺伝子の５′末端の分析のために、完全なＣｌａＩ断片を含む５ｓ−１１１３−５ａｌＩ　３−７　ＤＮＡクローン（第１図）上でＣｌａＩ部位の上流のプライマー（プライマー３、第３図）を伸長させてプローブを調製した。極く初期、初期および後期ＲＮＡによって保護された断片の５′末端は０ＲＦ２のＡＴＧ近傍の配列ＴＡＡＡＴにマツピングされた（第６図）。より大きいサイズの保護された後期ＲＮ＆断片は見られなかったので、第４図に示されている初期および後期の双方のＲＮＡは同一の開始点から始まっていることが明らかである。我々の知る限り、これは同一の開始部位が感染初期と後期過程の双方でＲＮＡポリメラーゼによって認識されることが示された最初のポックスウィルスプロモーターである。しかしながら、該遺伝子の極く初期の機能が遺伝子の主要な局面のようであり、この理由から、および混乱を避けるために、初期ｌ後期機能を持つこのプロモーターを以下の本文では初期プロモーターと呼ぶ。

０ＲＦ２の上流で逆向きの後期プロモーターの存在Ｃ１ａＩ部位の上流のＤＮＡの塩基配列決定により、初期開始部位から３５ｂｐのところから逆向きのＯＲＦの存在が示された（ＯＲＦ３、第３図）。ＯＲＦ：］の開始は゛ＴλＡＡＴ’モチーフを含み、後期ｍＲＮＡが転写されることが示唆された。この後期遺伝子の５°末端の８１ヌクレア一ゼ分析により、後期Ｒ１ｆＡのみがＳ１消化からプローブを保護することが示された（第７図）。主要産物はＡＴＧの上流の予想された゛丁ＡＡＡＴ’モチーフにマツピングされたが、別の主要産物は３０ｂｐ上流の配列（ＡＴＴＡ）にマツピングされた。プローブのサイズまでの幾つかのより大きな断片も保護されたが、これはおそら＜　０ＲＦＩから生じた後期転写産物の不均一な３“末端を示すものであろう。後期転写産物は初期開始部位の３Ｏ− ３５ｂｐ上流の配列にマツピングされるので、二つの開始部位の間の配列は、逆向きに初期／後期および後期機能の双方を有する潜在的な双方向性プロモーター因子を構成していた。

４０ｂｐのＤＮＡは初期および後期双方の遺伝子の発現に十分であるプロモーター活性を判定するために、初期および後期双方の開始部位、および５ａＬＩリンカ−に隣接した最初の２アミノ酸コドン（ＡＴＧとそれに続く３塩基）からなるＤＮＡ配列を合成して、ｐＵｃ１２の５ａｌＩ部位に両方向にクローニングした（第８図）。ＯＲＦの最初の２コドンは、遺伝子の頭どうしが翻訳開始部位に非常に近接してマツピングされたために含めたものである。大腸菌のＬａｃＺ遺伝子（バーマン（Ｈｅｒｍａｎ）他、１９８６）を含むｐＧＨ１０１由来のＢａ＋＊ＨＩ断片を＄）ＵＣＬ２１Ｊンカーのプロモーター因子の下流（ＢａｍＨＩ部位）に挿入した。これらのベクターは、各プロモーターのＡＴＧとＬａｅＺのＡＴＧの読み枠が同じになるように考案された（第８図）。これらのプラスミドは背−過性発現系で用いられ、発現されたβ−ｇａｌのレベルによってプロモーターの強度を評価した（表２）。その結果、初期および後期の双方のプロモーター因子によってβ−ｇａｌが高レベルで発現されていることが示唆された。プロモーターの経時的制御も維持され、したがって初期プロモーター活性はＡｒａＣの添加、およびＤＮＡ＠成の阻害によって影響されないが、後期プロモーター活性は完全に失われた（表２）。ＣＶ−１細胞では、初期プロモーターの活性か後期プロモーターよりも約５−６倍高いという結果も示された。ｐｓＫＯ８のＣ１ａｒとＰｓｔＩ部位の間の領域が欠失している初期プロモーターの変異体では、初期プロモーターの活性はほぼ完全に失われた（表２）。

後期プロモーターの開始部位近傍の２ｂｐの欠失でも後期プロモーターの活性は失われた（表２）。

ワクチニアウィルスプロモーターとの比較によるＦＰＶ−初期プロモーター活性の評価二つの広く使われ、よく解析されているＹｖのプロモーター、ＰＬＩＩ（後期）とＰ７．５（初期ｌ後期）を−過性発現系で使用し、ＦＰＶ−初期プロモーターと活性を比較した。ＰＬＩＩ（ｐＤＢ２２−ＬａｃＺ）とＰ７．５（ｐＴＰ４）の制御下にあるＬａｃＺを含む構築物がすでに報告されており、ＦＰＶ（ｐＤＢ２２−ＬａｃＺ）またはマＶ（ｐＴＰ４）ＴＩ遺伝子のいずれかに隣接したＬａｃＺ−プロモーターキメラが含まれている。　ｐＤＢ２２−ＬａｃＺはＰ７．５の制御下の大腸菌ｇｐｔ遺伝子も含んでいる。初期プロモーターとＬａｃ２遺伝子を用いて同様なプラスミドも作成され、一過性β−ｇａ１発現系で使用された。結果を表３に示す。全てのプラスミドのトランスフエフシランにより一過性発現系で顕著な量のβ−ｇａｌ活性が見られることはデータから明らかである。

ｐｓ［１８，２０，２２ではＬａｃＺがＦＰＶの初期−プ０％−ター因千の制御下に置かれており、ＹｖまたはＦＰＶ　Ｔに遺伝子に隣接しており、匹敵するβ −ｇａｌ活性が生成された。ＡｒａＣの存在下では、β−ｇａｌの明らかな蓄積がみられ、表２のデータからも明らかである。また、ＦＰＶの後期プロモーター因子の活性は初斯−プロモーター活性の約１１５であった。Ｙｖの最もよく用いられている二つのプロモーターであるＰ７゜５およびＰＬＩＩと比較すると、初期−プロモーター活性はＰ７゜５よりも約３．５倍高く、ＰＬｌｌとほぼ等しかった。ＰＬＩＩはＶＶのなかで既知の最強のプロモーターなので、初期ＦＰＶプロモーターは同様に効果的である。全てのプロモーターの経時的制御は、全ての場合にＡｒａＣのＤＮＡ合成阻害が後期プロモーター活性を阻害しているので、一過性発現条件下で維持されていることも表２のデータから明らかである。しかしながら、ｖＹの初期／後期プロモーターであるＰ７．５は、別の研究者によっても観測されたように（チャクラパルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）他、１９８５）、我々の一過性発現系で感染の後期にのみ働くことが示された。

ＦＰマプロモーター因子の構造初期および後期遺伝子開始部位の間（２−ＡＴＧの間）のわずか３４ｂｐのＤＮＡ配列が初期および後期遺伝子のそれぞれの転写に十分であることが上述のデータから明らかである。ポックスウィルスの初期および後期プロモーターは非常に異なると思われるので（スミス（Ｓｍｉｔｈ）他、１９８４）、ＦＰＶプロモーター因子をポックスウィルス初期および後期遺伝子の経時的制御に必要なりＮＡ領域の決定に使用することができる。初期開始部位近傍、または後期開始部位のＴＡＡＡＴモチーフ中の変異がそれぞれの転写機能をほぼ完全に失わせる（表２）ことは上述の結果から明らかである。ポックスウィルス後期プロモーターは必須なｃｉｓ因子でありよく保存されている’　ＴＡＡＡＴ’モチーフによって特徴づけられている（ハンギ（Ｈａｎｇｇｉ）他、１９８６．ローゼル（Ｒｏｓｅｌ）他、１９８６）。したがってＦＰＶの後期プロモーターは他のすでに報告されているポックスウィルス後期プロモーター因子と類似している。しかしながら、ＦＰＹプロモーター因子の興味深い局面は、初期開始部位もＴＡＡＡＴモチーフにマツピングされることである。ＦＰＶプロモーター因子の２本の鎖を５′− ３°方向に並べてみると、顕著な相同性が見られる（第９図）。並べた４２塩基のうち、２８塩基が完全に欠失や置換がなく一致している。プロモーター因子のＡ−Ｔ含量は８３％であり、ほかのポックスウィルスプロモーター配列に匹敵する（ウェア（ｌｆｅｉｒ）とモス（ｌ［ｏｓｓ）、　　１９８３；−ｒ−ス（Ｍａｒｓ）とビュード（Ｂｅａｕｄ）、１９８７．　　リー・チャン（Ｌｅｅ−Ｃｈａｎ）他、１９８８）。この相同性の他には、ＲＮＡ開始部位の上流のプロモーター領域には顕著なりＮＡ因子はない。

１、　　　　Ｍｏ５ｓ、　　Ｂ、　　ａｎｄ　　Ｆｌｅｘｎｅｒ、　　Ｃ，ｔ　　（Ｌ９！Ｉ））　　Ａｎｎｕ、　　Ｒｅｖ、　　Ｉｍｒａ■獅盾k、　　：１゜３０５−３２４゜２、　　　Ｃｏｕｐａｒ、！！、Ｅ、Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、　　（１９８６）　　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｚｍｍｕｎｏｌ、　　、ＬＭ。

１４７９−１４８７゜３、　＝　Ｍｏ５ｓ、　　Ｂ、　　（１９１３５）　　工ｎ：　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　（Ｆｉ＠ｌｄｓ、　　Ｂ、Ｎ、　　ａｄ、）　　ｐo− ６８５−７０３＋　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、ａｎｃ！　Ｌｏｎｄｏｎ。

４、　　　Ｄａｖｉｓ、　　Ｌ、Ｇ−＠ｌ：　　ａＬ、　　（１９８６）　　　Ｂａ５ｉｃ　　ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　　ｍｏｌｅｃｕｌａ■ ｂｉｏｌｏｇｙｓ　Ｅｌｓ＊ｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｓ　Ｐｕｂｌｉｘｈｉｎｇ、　Ｎ、Ｙ。

５、　　　　Ｈａｒｍａｎ、　　Ｇ、Ｅ、　　ｅｔ　ａｌ、　　（１９１ｉ１６）　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　ｋｃｉ６ｓ　　Ｒｓｓ、　　よｉA　フ１３０６、　　　　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、　　　Ｓ、　　　ｅｔ　　ａｌ、　　　（１９８５）　　　Ｍｏ１．　　　Ｃ＠１１．　　　Ｂｉｏ戟A　　　５゜７、　　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｈ，（１８７２）　　Ｅｚｐａｒｉｍａｎヒｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｕｚ　　Ｌａｂｏｒａセｏｒｙ、　　Ｃ０Ｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｕｚ、　　Ｎ、Ｙ。

８、　　　５ｒｎｉｔｈ、　　Ｇ、Ｌ、　　　ａｔ　　ａｌ、、　　　（１９８４）　　　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　　Ｇａｎｔｔ、　　ＥｎｇｇA　　Ｒａｙ。

２、　３８３−４０７ ’、Ｈａｎ９９Ｌ、Ｍ、１！七ａｌ。、　　（１９ａ６）　　ＥＭＢＯｔ７．　ｆｉ、　７０７１−１０７６１０、　　　Ｒｏｓｅｌ、　　、７．Ｌ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　（１９８６）　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　五。、　　４３６− ４４９゜１工、　　Ｈａｉｒ、　Ｊ、Ｐ、　ａｎｄ　ＭＣｌ３３．Ｂ、　（１９８３）　　ｉ７．　Ｖｉｒｏｌ、　ｉｆＬ、　５３０−５３７１２、　　　Ｍａｒｓ、Ｍ、　　ａｎｄ　　ａｅａｕｄ、　　Ｇ、　　（１９４１））　　　Ｊ、Ｍｏ１．　　ｌ５ｉｏ１．１３Ｊ、　　６P９−６：１１１３、　　ｂｅｅ−Ｃｈｉｎ、　Ｇ、Ｊ、　ｓｔ　ａｌ、、　（１９８８）　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１ｆｉＸ、　６４−７９ＦＰＶゲノムの４つのＰｓｔＩ断片にハイブリダイズする初期転写産物のおよそのサイズ。ＡｒａＣ存在下のＦＰＶ感染細胞からｌｉ離した全細胞性ＲＮＡをノザンプロットで、ニックトランスレーシランしたＦＰＶゲノムのクローニングされｐＴＴ６３　　　Ｆ　（１７，３）　　　　　　　３．２．２．３．１．３．１．０ｐτＴ２８　　　Ｊ　（１２，５）　　　　　　　３．５．２．４．１．７嚢λ ｖｖ−過性発現系中のプラスミド構築物中のβ−ガラクトシダーゼ活性。ＥおよびＬはそれぞれ初期および後期プロモーター因子であり、Δは変異を表す（以下参照）。一過性発現実験はチャクラパルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）他（１９８５）に従い、ｃｖ−ｉ細胞と２５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて行った。

ミラー（ｌ［１ｌＬｅｒ）の方法（１９７２）によってアッセイしたβ−ｇａｌ活性は産生されたＯＮＰのｇａｏ１／３Ｘ１０’細胞／３０分、２８℃として表される。値は同一の実験からの３種の評価の平均で示されている。

ｐｓ［０８（ＬａｃＺ−ＥΔ）はｐＳに０８のＣ１ａＩ／ＰｓｔＩ断片を欠失させることにより作成された。ｐｓ［０９（ＬａｃＺ−ＬΔ）ではＲＮ＆開始部が作成された（第８図）。

プラスミド構造　　　　　　　　β−ｇａｌ活性−ＡｒａＣ（後期）　　　　　＋ＡｒａＣ（初期）ｐｓ［０８（ＬａｃＺ−Ｅ）　　　　　３５．７８　　　　　　　５０．７５ｐｓに０８　（ＬａｃＺ−ＥΔ）　　　　　０．１３　　　　　　　０．００ｐｓ［０９（ＬａｃＺ−Ｌ）　　　　　　６．５０　　　　　　　０．２７ｐＳに０９　（ＬａｃＺ−ＬΔ）　　　　　０．２７　　　　　　　０．００ｖｖ−通性発現系中のｖＹまたはＦＰＶプロモーターを含むプラスミド構築物中のβ−ｇａｌ活性。ＥおよびＬはＦＰＶプロモーターの初期および後期因子である。プラスミドｐｓＫ２０．２２および２４はＬａｃＺと逆にＣＡＴ遺伝子も含む。詳細は本文と第８図参照。実験的な詳細は表２と同様である。β− ｇａｌ活性は産生されたＯＮＰのμｌ１ｏｌ／３Ｘ１０’細胞７３０分、２８℃ として示されている。

プラスミド構造　　　　　　　　β−ｇａｌ活性−人ｒａＣ（後期）　　　＋ＡｒａＣ（初期）ｐｓ［１８（ＬａｃＺ−Ｅ、　ＦＰＶ−Ｔｌ：）　　　２５．１０　　　　３４．４４ｐＳＫ２０　（ＬａｃＺ−Ｅ、　ＴＶ−Ｔ［）　　　２６．７０　　　　３２．５０ｐｓに２２　（ＬａｃＺ−Ｅ、　ＦＰＶ−ＴＫ）　　　２４．５０　　　　２９．４０ｐｓに２４　（ＬａｃＺ−Ｌ、　ＦＰＶ−ＴＩ）　　　４．６　　　　　０．２７ｐＴＰ４　　（ＬａｃＺ−Ｐ７．５．　ＶＶ −ＴＩ）　　？、２　　　　　０．４ｐＤＢ２２−ＬａｃＺ（ＬａｃＺ−ＰＬＩｌ、　ＦＰＶ−ＴＩ）　　２４．８　　　　　０．２７ｐｓＫ２２　（ウィルス無’）　　　　　　０．０３　　　　　０．０１最後に、多様な就職および／または改質が、ここで述べた本発明の本質からはずれることなく行われ得ることは理解されるべきである。

ム浄書（内容（こ変更なし）Ｆ２Ｏ３ＡＧＩＴｒＡＧＡＡＡ　　ＡＴＡＴＧＴｒＡＡＣＡＡＡＴｒＧＴＧｒＴ　　３ＡＣＡＣＡＧＣＴｆｆ　　ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡ手続補正書坊幻１．事件の表示ＰＣＴ／ＡＵ８９１０００５５２、発明の名称ポックスウィルスベクター３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住所名　称　　コモンウエルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガナイイーション４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　　平成　３年　４月１６日　溌送日）６、補正の対象国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ニワトリポックスウイルス主要初期タンパク質の発現に必要な第一のプロモーターを含む遺伝子配列。
（２）該第一のプロモーターと逆向きにニワトリポックスウイルス後期タンパク質の発現のための第二のプロモーターをさらに含む請求の範囲第１項記載の遺伝子配列。
（３）互いに逆向きに双方のプロモーター因子を含む、約４０塩基対の請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。
（４）プラスミドクローニングベクター；およびニワトリポックスウイルス主要初期タンパク質の発現のための第一のプロモーター；および該第一のプロモーターと逆向きの、ニワトリポックスウイルス後期タンパク質の発現のための第二のプロモーター；を含む遺伝子配列を含むプラスミド。
（５）該プラスミドクローニングベクターがプラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ１２、Ｍ１３−ｍｐ８およびＭ１３−ｍｐ９から選択されるものである、請求の範囲第４項記載のプラスミド。
（６）前述のプラスミドｐＳＫ０６およびｐＳＫ０７から選択されるプラスミド。
（７）ベクターウイルスのゲノムの一部；ニワトリポックスウイルス初期タンパク質の発現のための第一のプロモーター；および該第１のプロモーターと逆向きのニワトリポックスウイルス後期タンパク質の発現のための第二のプロモーター；を含む遺伝子配列；および第一の目的の外来遺伝子をコードし、第一のプロモーターの制御下にある第一のＤＮＡ配列を含むウイルス性ベクター。
（８）第一の外来ＤＮＡ配列が鳥類疾患に特徴的な第一の抗原をコードするものである、請求の範囲第１項記載のウイルス性ベクター。
（９）該第一のＤＮＡ配列の代わり、またはそれに加えて、第二の目的の外来遺伝子をコードし第二のプロモーターの制御下にある第二のＤＮＡ配列をさらに含むものである、請求の範囲第７項記載のウイルス性ベクター。
（１０）該第二の外来ＤＮＡ配列が鳥類疾患に特徴的な第二の抗原をコードするものである、請求の範囲第９項記載のウイルス性ベクター。
（１１）ウイルスのゲノムの一部がニワトリポックスウイルスまたはワクチニアウイルスゲノムの一部である、請求の範囲第７項記載のウイルス性ベクター。
（１２）請求の範囲第１１項記載のウイルス性ベクターを含むワクチン。
（１３）ウイルス性ベクターの調製法であって、該調製法が、ニワトリポックスウイルスからウイルス性ＤＮＡ；およびプラスミドクローニングベクター；をあたえること；ウイルス性ＤＮＡからゲノムライブラリーを構築すること；ゲノムＤＮＡライブラリーから遺伝子配列を同定すること；　であって、該遺伝子配列が、ニワトリポックスウイルス主要初期タンパク質の発現のための第一のプロモーター；および該第一のプロモーターと逆向きのニワトリポックスウイルス後期タンパク質の発現のための第二のプロモーターを含み；さらにプラスミドクローニングベクター中の適当な部位に遺伝子配列を挿入すること；を含む調製法。
（１４）添付の図のいずれかを参考にして上で述べられたものと実質的に同じであるところの、請求の範囲第１項記載の遺伝子配列。