JPH03209167A - ウイルス特異的中和抗体を選択するイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、中和抗体、さらに詳しくはウィルス特異的中
和抗体を選択する免疫化学的検定方法に関する。

発明の背景 病原体が原因となる疾患に対する防御は、病因因子への
暴露の回避、その因子の病理を限定する有効な体液性ま
たは細胞性免疫応答、および暴露前また（゛ヨ後の予防
接種を包含する多くの因子に依存する。

体液性免疫は血中における抗体の存否、ならびにその種
類および濃度に関連する。抗体はウィルス疾患を限局す
るのに重要な因子であるが、すべての抗体が防御的に働
くわけではない。多くのウィルス特異的抗体はウィルス
感染を低下させないし、また悪影響を与えるものさえあ
る。

この理由から、特定のウィルスに対する総抗体ｍを測定
するイムノアッセイは免疫性の予知にはほとんど役に立
たない。

保護体液性免疫の臨床検査的証明は、したがって、培養
細胞中の生存ウィルスの中和を測定するパイオアッセイ
で評価されることが多い。

このようなウィルスの中和バイオアッセイは、特定の血
清が、感染を受けやすい細胞への生存ウィルスの感染能
の阻害に有効であるかどうかを決定する。ウィルスのパ
イオアッセイは経費と時間がかかるばかりではなく、明
らかにバイオハザードを提供し、特別な封じ込め設備や
他の注意が要求される。

抗体がウィルスを中和する機構は完全には理解されてい
ないが、それはウィルスがエンベローブを有するか（た
とえばインフルエンザウィルス、レトロウィルスおよび
ラブドウィルスのように、脂質膜で囲まれている）また
エンベローブをもたないか（たとえばビコルナウィルス
、アデノウィルス、パポバウィルス）によって異なるよ
うである（たとえばＤｉｍｍｏｃｒ，　Ｎ．　Ｊ．，　
Ｊ．Ｇｅｎ，　Ｖｉｒｏｌ．　６５：　１０１５〜１０
２２．　１９８４参照）。実際の機構がどうであれ、中
和抗体はウィルス構造のある部位に結合し、ついで感染
を受けやすい細胞および組織にウィルスが感染する能力
を阻害することは明らかである。

ヒト免疫不全症ウィルスＩ型（　ＩＩ　Ｉ　Ｖ　−　１
　，またＨＴＬＶ−ｍ　’）の増殖を遮断する抗体（中
和抗体）または細胞培養液中で１１　Ｉ　Ｖ感染および
非感染細胞の融合を遮断する抗体（融合遮断抗体）の血
清レベルは、ウィルスに対する体液性免疫の全応答（す
なわち、ＨＩＶ特異的抗体の総レベル）に比較すると比
較的低いことが知られている。

多くのＨＩＶ−１ペプチドおよび蛋白質が動物で中和抗
体を誘導するが報告されている。これらにはｇａｇ−１
−ド蛋白質（Ｓａｒｉｎら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２
：１１３５　〜１１３７．　　１９８６）、ｅｎｖコー
ドトランスメンブ２６２　：　５７６９〜５７７４．　
　１９８７）およびｅｎｖコードｇｐ１２０蛋白質の保
存領域に相当する数種のべプチド（Ｓｕｎら．　　Ｊ．
　　Ｖｉｒｏｌ．　　６３：　３５７９〜３５８５．　
　１９８９；Ｈａら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９　：　
１０２１〜１０２３．　　１９８８）からのアミノ酸配
列に相当する合成ペブチドも含まれている。

多くの最近の研究ではＨＴＬＶ−　ＩＩＩのｅｎｖコー
ド外エンベローブ糖蛋白質（ｇｐ　１２０）内のドメイ
ンがウィルスの結合および中和に重要なことが述べられ
ている。この情報はＪａｖａｈｅｒｉａｎ，　Ｋ，らに
よってまとめられている（　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ，　
Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．　　ＵＳ＾８６　：　６７６８　〜
６７７２．　１９８９）。

ワクチンの開発研究は、Ｒｕｓｃｈｅ，　　Ｊ．　　Ｒ
．らにドメインを含有する領域としてｎＴＬＶ−ｍ　．
のアミノ酸番号２８７〜４６７に相当するｇｐ　１２０
のＣ末端ドメイン（Ｐａｌと命名された組換えフラグメ
ントで表される領域）に対し集中的に行われてきた。

他の研究では、動物にウィルス型特異的な中和反応を誘
発するｇｐ　１２０の抗原部位を地図化するために合成
ベブチド（すなわち化学的に合成されたアミノ酸鎖）が
使用されてきた。アミノ酸番号３０］〜３２４　（Ｌｏ
ｓ＾Ｉａｍｏｓの配列決定データ，ｔｌｕｍａｎ　Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ．　　１９８
９．　Ｌｏｓ＾１ａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，　Ｌｏｓ＾ｌａｍａｓ，ＮＭ．による
番号付け）が、感染チンパンジーおよびヒト、ならびに
［１　　１２０またはＰＢＩ領域で免疫処置した動物か
らのＨＩＶ中和抗体の結合部位である免疫学的優生ドメ
インとして報告される。

主要中和ドメイン（ＰＮＤ）はアミノ酸配列番号２９６
と３３１に位置する２個のシステインの間のルーブ領城
と表示されている，． これらのアミノ酸配列は、保存性の高いアミノ酸β一タ
ーンテトラマ−ＧＰＧＲと、そのβ一夕一ンの両側に可
変性の配列を含んでいる（Ｐａｌｋｅｒ．　　Ｔ．　　
Ｊ．ら，　　Ｐｒｏｃ，　　Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．ＵＳ＾８５：　１９３２〜１９３６．　　１
９８８；　Ｒｕｓｃｈｅ，　　Ｊ．　　Ｒ　ら，Ｓｃｉ
．　　ＵＳＡ　　８５　：　４４７８〜４４８２．　　
１９８８　；　Ｓｋｉｎｎｅｒ，　　Ｍ．＾　ら，Ｊ，
Ｖｉｒｏｌ．６２　＋　４１９５〜４２００．１９８８
　；Ｌｏｏｎｅｙ，　　Ｄ．　　Ｊ，ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　２４１　：　３５７〜３５９，１９８８゜Ｄｒｕｍ
ｍｏｎｄ，　　Ｊ．　　Ｅ．ら，　　ＴＶ　　Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　　ｏｎ　　
ＡＩＤＳ，　　Ｊｕｎｅ　　１２−１６．　　１９８８
．　　Ｓｔｏ−ｃｋｈｎｌｍ．　　Ｓｗｅｄｅｎ　；お
よびＪａｖａｈｅｒｉａｎ，　　Ｋ　　ら，Ｐｒｏｃ．
　　Ｎａｔｌ．　　＾ｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳ＾
　８６　：　６７６８　〜６７７２，１９８９）　　。

ＩＩ　Ｉ　Ｖ−１の主要中和ドメインはＨＴＬＶ−ｍ．
株のｇｐ　１２０アミノ酸２９６〜３３１に囲まれたシ
ステインーシステイン「ルーブ」領域内に含まれると報
告されテイル。他（７）　ＩＩ　Ｉ　Ｖ株（ＩＩＴｌ．
Ｖ−１１１Ｍ．，　ＨＴＬＶ■餞，　，　ＨＴＬＶ−　
ｍ　ｚ　ｓほか）の相当する領域は、アミノ酸配列ホモ
ロジーを整える標準的なコンビュ−タープログラム（た
とえばＩｎｔｅｌｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｉｎｃ．，
　　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，　　Ｃ＾またはＧｅ
ｎｅｔｉｓ　Ｃｏｍ−ｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｂｉｏ
−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，　ＷＩから入手できる）を用いれば容易に同定で
きると思われる。

主要中和ドメインの構造を変えない保存アミノ酸の置換
も包含される。本明細書において、＋１ＩＶ−１株に関
して用いられる「主要中和ドメイン」の語には、ウィル
ス中和抗体を誘導する旧ｖ−１株のループ領域からの様
々の長さのアミノ酸配列が包含される。最近、保存性の
高いｃ１ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌ！／配列を囲む８個のわずか
なアミノ酸が主要中和ドメインを構成すると報告されて
いる（Ｊａｖａｈｅｒｉａｎら，　　Ｐｒｏｃ，　　Ｎ
ａｔｌ．　　Ａｃａｄ，　　Ｓｃｉ，　　ＵＳＡ８６　
：　６７６８〜６７７２．　１９８９）。主要中和ドメ
インは実際のウィルス起源のものでも、また合成もしく
は組換えペブチドもしくは蛋白質であってもよい。主要
中和ドメインは単独で使用することちまた大きなベプチ
ドもしくは蛋白質の部分として使用することもできる。

免疫学的優生領域とは必ずしも、ＨＩＶ，他のウィルス
または他の病原体における主要中和ドメインと同義語で
はない。本発明の目的では一般に、主要中和ドメインは
、天然に生じる保護抗体によって認識され、このような
保護抗体と結合した場合に病原因子の不活性化を生じる
アミノ酸配列を意味する。他の中和ドメインは存在した
としても、これらのべブチド配列と抗体との反応では宿
主からの病原因子の効率的な除去は生じない。

既知のＨＩＶ−１株またはアイソレートについて報告さ
れている主要中和ドメイン（ＰＮＤ）領域内のアミノ酸
残基の可変性は、ワクチンおよび診断薬の開発に重要な
点は、ｉ）様々なヒト集団内での別個のウィルス株によ
る有病率、および■）この領域を含む抗原に対する免疫
応答の性質である。

調査の結果、現在のところ、世界のＦＴＩＶ感染患者の
大部分、とくに欧州および米国での大多数（９０％以上
）の患者はＦＩＴＬＹ−１１１ｕｖと抗原的に関連のあ
るウィルスに感染していることが明らか？鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を用いた、ＨＴＬＶ−Ｈｌ株からの主要中和ドメイ
ン（　１’　Ｎ　Ｄ　）配列の直接的分析により、＋１
　Ｔ　Ｉ’．　Ｖ　−　［１　，　Ｎ配列７７ミリ−（
これにはＭＮ．　ＳＣ，ＷＭＪＩ　，　ｌＦＭＪ３．　
ＳＬおよび関連逸脱変異体が包含される）の有病率が確
認された（　Ｐｕｔｎｅｙ，　Ｓ．　Ｄら，　　Ｖ　　
Ｉｎｔｅｒｒ＋ａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ　ｏｎ　　＾ＩＤＳ［８！１，　Ｊｕｎｅ　４−９，
　Ｍｏｎｔｒｅａ］．Ｃａｒ＋ａｄａ）　。本明細書で
用いられるＨＴＬＶ−ｌ１’ｉ■はＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ〜
ＴＩＩＭＮ配列ファミリーを包含する。

最近、「ループ」領域の主要中和ドメイン内でのアミノ
酸変化は宿主によってはも早中和されない株を生じると
報告されている。このような「逸脱変異体」はＧＰＧＲ
配列のいずれもの側の超可変性領域内でアミノ酸変化を
示す。このような逸脱変異体に対する中和抗体の検定に
はこのような突然変異変化を反映する抗原性ペブチドを
使用しなければならない。

発明の要約 本発明は、生物学的サンプル中の中和抗体の免疫化学的
選択にあたり、中和ドメインからなる抗原と上記生物学
的サンプルとを、抗原一抗体反応が強く結合する抗体の
結合に有利で弱く結合する抗体の結合に不利な条件下に
接触させ、中和抗体と抗原の中和ドメインの免疫学的反
応を検出する方法を提供する。

好ましくは、本発明は、１種または２種以上のウィルス
中和ドメインを用い、ウィルス特異的中和抗体を選択す
る方法に関する。さらに好ましくは、１種または２種以
−ヒのＩｔ　Ｉ　Ｖ中和ドメインを用い、ＨＩＶ巾和抗
体を選択する。好ましくは、１種または２挿以上のｉ’
ｌＩＶ中和ドメインにはｇｐ　１２０蛋白質からの主要
中和ドメイン（ＰＮＤ）が包含される。２種以上のＲＩ
Ｖ株からの主要中和ドメインに相当する検定抗原を包含
することが望ましく、とくにｌｌＴＬｖ−Ｉ［［Ｍ．配
列ファミリーからの１種または複数種の主要中和ドメイ
ンを包含することが好ましい。

本発明は、母体および，／または新生児中における■１
ｖ中和抗体の存在が新生児の非感染の重要な指標である
ことを明らかにした。したがって本発明の方法は新生児
が感染しているかいないかを決定するのに使用できる。

さらに詳しくは、本発明は、主要中和ドメーインからな
るＨＩＶ　ｇｐ　１２０の免疫学的優生領域に由来する
合威ベブチドに対する抗体で、ウィルスの中和の原因と
なる抗体を測定するイムノアッセイに関する。本発明の
抗原限定イムノアッセイによって生じる結合の像および
強度は、使用抗原の様々なコーティング濃度における様
々な抗体集団の測定結果を反映する。抗原のコーティン
グレベルが高いと、抗体集団の大部分が結合する。この
場合には交差反応性が最高に観察されることになる。抗
原のコーティングレベルが低いとこのような交差反応性
は消失し、強固に結合する抗体のみが測定される。驚く
べきことに、抗原の低コーティング１ノベルで得られる
結果はパイオアッセイで測定されたウィルス中和パター
ンと相関する。すなわち、抗原限定イムノアッセイは、
Ｉ（　Ｉ　Ｖ中和と相関しない抗原一抗体交差反応を消
失させるので、抗体の生物学的機能を、通常のイムノア
ッセイで得られるより高度に反映させることができる。

抗原一抗体相互作用に影響し、弱い抗原一抗体相互作用
を消失させるような池のイムノアッセイ条件／試薬も同
じ結果を得るために利用できる。

本発明の免疫化学的方法は、経費がかかり、実施に何日
も要し、しかも特殊な実験設備と技術が必要になるＨＩ
Ｖ感染細胞を使用するＨＩＶ中和パイオアッセイに比べ
て著しい利点を提供する。

これらの方法は、ＨＩＶ感染患者、とくに小児患者にお
ける疾患の進行をモニタリングするための重要な診断お
よび予知手段を提供する。このような免疫化学的方法お
よび検定には、＋１　Ｉ　Ｖに対するワクチンまたはワ
クチン候補物質への中和抗体の応答のモニタリングに著
しい有用性も期待できる。さらにまた、本発明は様々な
病原体に対する新しいワクチンのスクリーニングのため
に、その開発過程において利用することもできる。

本発明の方法はキットの形で使用するのも有利である。

このようなキットは、本発明の方法による中和抗体の検
出に使用される主成分を含有する材料に、中和ドメイン
からなる抗原を含む容器を包含する集合体とすることが
できる。

たとえば、母体または新生児からの生物学的サンプル中
の中和抗体の検出に適したキットは病院臨床検査室のセ
ッティングにきわめて有用である。

図面の簡単な説明 第１ａ図および第１ｂ図はそれぞれ５０２５．　２９．
　１および５０２３．　２４．　４と命名されたモノク
ローナル抗体の免疫化学的検定（抗原限定ＥＬＩＳＡ）
におけるｎＴｔｖ−ｍ　ｓおよびＨＴＬＶ−Ｉ［１．Ｎ
株かラノＰＮＤヘフチトへの結合を示す。両抗体とも、
ＩＩＴＬＹ−ｍ　Ｂ主要中和ドメイン（ＰＮＤ）ペブチ
ドに対して誘導された。

両モノクローナル抗体ともＨＴＬＶ−ｍｓベプチドに強
固な結合を示すが、Ｉｔ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　Ｉ［Ｉ　Ｍ
Ｎペプチドに対しては５０２５．　２９．　１抗体のみ
が強固な結合を示す。

免疫化学的検定の結果はウィルス中和パイオアッセイの
データと完全に対応し、中和抗体の活性の定量に至適化
できる。

発明の詳細な説明 「発明の背景」の項で上に引用した研究では、抗体は、
固相に結合されたｇｐ　１２０の主要中和ドメインから
のＰＨＩ蛋白質または合成ペブチドを用いて検出された
。一般に、イムノアッセイの開発に用いられた方法論で
は、検定は活性を最大にする方法で実施されるように各
工程の至適化が強調されている（たとえばＤｅｎｍａｒ
ｋ，　Ｊ，Ｒ，＆　Ｃｈｅｓｓｕｍ，　Ｂ．Ｓ．，　Ｍ
ｅｄ．　Ｌａｂ．　Ｓｃｉ．　３５：　２２７，１９７
８　；　Ｉｅｒｍａｎｎ，　　Ｊ，　Ｅ、＆　Ｃｏｌｌ
ｉｎｓ，　Ｍ，Ｆ．，　Ｊ．丁ｍｍｕｎｏｌ，　　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　１０：　３６３，　　１９７６参照）。

本発明の免疫化学的方法で重要な点は、抗原一！κ体相
互作用の検出系すなわちレポーター系に土として影響す
る条件ではなくて、抗原一抗体相互作用に影響する条件
である。抗原一抗体相互作用に影響し、検定の設計過程
で個々に経験的に至適化が必要になる条件および試薬に
は、抗原濃度、イオン強度、温度、界面活性剤の性質お
よび濃度、ならびに非特異的蛋白質のような担体物質の
性質および濃度が包含される。

これらの試薬／条件のそれぞれについて、親和性もしく
は結合能とは無関係な抗原一抗体結合または結合の「強
固性」を最大にする至適な状態または範囲がある。この
ような至適条件下では中和ドメインからなる抗原に特異
的な抗体の大部分が結合される。本発明の方法を実施す
るに際しては、しかしながら、弱い抗原一抗体相互作用
を除外するために、上述の条件または試薬の１種もしく
は２種以上を至適条件以下にすることが必要である。カ
オトロビックな試薬たとえばグアニジンＨＣｌ，　Ｎａ
Ｃｌまたはチオシアン酸アンモニウムもしくはナトリウ
ムの存在も、弱い抗原一抗体反応を破壊できる。この観
察を用いた標準的ＥＬＩＳ＾ブロトコールの改変の原則
１９４．　１９８８）に記載されている。また、イムノ
アッセイのフォーマットが、例えば抗原は固相に結合し
ているのではなく溶液中に存在する捕捉アッセイの場合
のように、それ自体、弱い抗原−抗体相互作用を排除で
きることもある。このような検定フォーマットでは、低
親和性抗体は溶液中の抗原へは効率よく結合しないこと
が知られているので、抗体が標識抗原を捕捉できる能力
は高い親和性を反映している。

Ｄｒｕｇｓ，　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　　１９７８．　
　３５９〜３７２）が例示しているように任意の競合的
イムノアッセイとして創案することもできる。この場合
、特定の主要中和ドメイン（ＰＮＤ）への抗体の結合は
、他の検出可能な標識抗体（ポリクローナルまたはモノ
クローナル）の存在下に起こる。主要中和ドメインに対
する特異性が、添加される抗体集団（すなわち試験され
る生物学的サンプル）中に存在すれば、既知の検出可能
な標識抗体の結合を置換しまたそれと競合する。その結
果、添加されたサンプル中の特異的抗体の濃度に比例し
て、検定応答は低下する。この種類の競合アッセイは、
標的抗原に対して少なくとも同じ親和性をもつ抗体を含
む生物学的サンプルのみが標識抗体を置換できることか
ら、標識抗体の親和性に著しく依存する。したがって、
標識抗体として主要中和ドメイン（ＰＮＤ）に対する高
親和性モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用い
るように試験を組立てることにより、検定を強固に結合
する抗体に有利にできることが明らかになった。

上述のように、至適以下の抗原濃度が、弱い抗原一抗体
相互作用を除去するために利用できる。検定法の開発技
術における熟練者には、たとえば、標準抗血清を用いる
抗原の反応性の滴定には、抗原による固体表面のコーテ
ィングを使用できることが一般的に知られている。この
ような滴定は通常、検定応答のＳ字状曲線を生じる。抗
原のコーティング濃度が高く、固相を飽和する場合には
、最高の検定応答が認められる。これは「平坦コな、す
なわち抗原の量の変化には無関係に抗体の検出量はほと
んど変化しない滴定曲線の領域として認められる。抗原
濃度を非飽和または「至適以下」のレベルに低下させる
と、それに比例して検定応答が低下する。

最高の検定感度（イムノアッセイの通常の目標）を達成
するためには、本技術分野の熟練者は、上部平坦上の、
すなわち最大検定応答の最小抗原濃度である抗原コーテ
ィング濃度を選択するのが通常である。この領域は非特
異的シグナルからの特異的シグヂルの分離を最大にする
。

滴定藺線の直線部分におけるコーティング濃度は検定応
答の変動に最も感受性があると考えられ、したがって再
現性の問題の可能性がある。

滴定曲線の低末端のコーティング濃度は、個々の免疫応
答の大部分が失われるので感度の低い検定になると考え
られる。Ｐｏｌｌａｃｋら（ＰｒＯＣ．Ｎａｔｌ．　　
　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ　　８５　　二　
２２９　８　−２３０２．　　　１９８８）は、ハプテ
ン、ｐ−アゾフェニルアルソン酸塩の抗原限定ＥＬＩＳ
Ａが抗原に対する結合能が高いモノクローナル抗体を選
択したことを報告している。

すなわち、主要中和ドメイン（ＰＮＤ）抗原を用いる本
技術分野で既知のイムノアッセイは（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ
，　　Ｊ．Ｅ．ら，ＩＶ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　ＡＩＤＳ，　１９８８
，　Ｊｕｎｅ　１２〜１６，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗ
ｅｄｅｎ　；　Ｄｅｖａｓｈ，　　Ｙ．ら，■．Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ＾
ＩＤＳ，　１９８９，Ｊｕｎｅ４　〜９．　Ｍｏｎｔｒ
ｅａｌ，　Ｃａｎａｄａ；Ｒｏｓｓｉ．　Ｐ．Ｌ．ら，
　　Ｖ，　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅ
ｒｃｎｃｅｏｎ　ＡＩＤＳ，＋９８９，　Ｊｕｎｅ４　
〜９　．　Ｍｏｎｔｒｅａｌ，　Ｃａｎａｄａ　゜およ
び抗原滴定曲線の上部末端または平坦部レベルでのべブ
チドをコーティングすることによって定量される非律速
濃度でのＰＮＤ抗原を含有する。

この形の至滴化の効果は、弱い抗原一抗体相互作用を最
大にすること、すなわち弱い抗原抗体交差反応性を最大
にすることである。これは、ＰＮＤでコーティングした
固相を用いるＥＬＩＳＡ（醇素連結イムノソルベントア
ッセイ）ｆｉｇｐ　１．２０の組換えフラグメントまた
は特定のＰＮＤに対しで調製された抗血清に対するヒト
、チンパンジーおよびヤギ血清が様々なＰＮＤ　（異な
るＩＩ　Ｉ　Ｖ単離体に相当する）間で高レベルの交差
反応性を示す予告を生じたとの研究にその例をみること
ができる（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，　　Ｊ．Ｅ．ら，　　Ｉ
Ｖ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
　ｏｎ　　＾ＩＤＳ，　　１，９８８，Ｊｕｎｅ１２〜
１６、Ｓｔｏ−ｃｋｈｏ］ｍ，　Ｓｗｅｄｅｎ　；およ
びＤａｖａｓｈ．　Ｙ，ら，　ＡＩＤＳＲｅｓ．　　ａ
ｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，　　印
刷中）　これは、限られた数のＦＩＩＶ株にのみ中和活
性を示す同じ血清のパイオアッセイの既知の中和パター
ンと相関しなかった。

パイオアッセイでの中和パターンと相関しないイムノア
ッセイ反応の問題はｇｐ　１２０のアミノ酸配列３０１
〜３２４領域に限らない。Ｓｕｎら（Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．
　　６３　：　３５７９〜３５８５．　　１９８９）は
ｇｐ　１．２０のアミノ酸配列４２３〜４３７　（ＣＤ
４結合ドメインと提案されている）である合成ベブチド
を７種のモノクローナル抗体の結合を地図化するために
使用した検定を報告している。これらの抗体（１７ＴＩ
ＪＩＩ１ｎに対して調製された）はＥＬｉＳ＾およびＲ
ＩＰ＾（放射免疫沈降検定）では、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ，
，　ＩＩＴＩＪｍｔ＋ｒ．　ＨＴＬＶ−ＩＩＩＡＩ．，
　ＩＩＴｌ４−ｎ［ｗｍ＋，　ＨＴＬＶ−Ｉ［ｒｚａ４
およＵ　ＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　ｍ　ｚ　３　４を含む
別（７）ＨＴＬＶ−１１１単離体と交差反応を共有する
ことが示された。しかしながら、中和パイオアッセイで
は、モノクローナル抗体ハＨＴＬ■−ＴＩＴ　ｅ，　Ｈ
ＴＬＶ−ｍ　！ＩＦおよびＨＴＬＶ−．ＩＩＩ　ＡＬノ
みを実際に中和した，１ 抗原を至適な非律速濃度で使用する標準のイムノアッセ
イと異なり、本発明の免疫化学的方法は、Ｈ　Ｔ　Ｖ主
要中和ドメイン、および／またはＩＩ　Ｉ　Ｖ中和ドメ
インからなる他の抗原を含む抗原を至適以下の律速条件
で使用する。驚くべきことに、この検定では、生物学的
サンプルがウィルス中和パイオアッセイで測定される生
物学的に電要な抗体の中和機能とよく相関する結合像と
反応強度を示すことが明らかにされた。これらの抗体の
生物学的中和活性とは相関しない弱い免疫学的交差反応
性の反応は、この検定では消失することが明らかである
。実施例に示すように、正確な至適以下の濃度または他
の至適以下の試薬もしくは条件は、検定設計の過程で経
験的に決定され、通常は一連の検定が準備され、得られ
た結果を信頼できるパイオアッセイの結果と比較するこ
とが必要になる。

本発明は、中和活性に相関する、強固に結合する抗体集
団を選択する免疫化学的方法に関する。本出願の目的に
おいて「強固に結合する」とは、至適以下の検定条件た
とえば中和ドメインからなる抗原の律速濃度で検出され
る抗体苓意味する。この強固な結合は、見掛けの高い親
和性（少なくとも１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも１
．０−６Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１０９ＭのＫ
ｄを示す）、高い結合能（抗体上の抗原結合部位の数の
性質）、または協力活性（他の分子による結合の増加）
に寄与できる。ウィルス中和抗体を選択的に測定するこ
との重要性は一般に認識されているにもかかわらず、従
来の免疫化学的検定ではウィルス中和パイオアッセイと
相関する結果は得られなかった。

ー態様においては、本発明の方法は、１種または２種以
」二の異なるＲＩＶ株に由来する１種または２種以上の
合成ベプチドで固相をコーティングすることにより準備
された間接Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａであり、この場合、各ベ
ブチドは＋１　Ｉ　Ｖ主要中和ドメイン（ＰＮＤ）を包
含し、好ましくはＨＴＬＶ−　Ｉ［Ｉ　Ｍ．ノ主要中和
ドメインに相当するアミノ酸配列を包含する抗原からな
る。各ベブチドを様々な濃度（ナノモルからフェムトモ
ルの範囲）でコーティングするだけが違う一連の検定を
準備した。

固定化ペブチドをＰＮＤ免疫血清またはＩＩ　Ｉ　Ｖ感
染患者の血清と接触させた。結合した患者または動物の
抗体を酵素標識抗一稲接合体を加えて検出した。生成し
た色は結合抗体に比例した。低いｒ不適以下または律速
）抗体コーティング濃度は中和抗体の選択に使用できて
、Ｅ　Ｉ．　Ｔ　Ｓ＾の結果はウィルス中和パイオアッ
セイの結果と相関することが見出された，、 この方法は、パイオアッセイ（たとえばヒ１・Ｔ細胞お
よび生存｝１１Ｖウィルスを用いる感染性の検定）のき
わめて望ましい代替法を提供し、これは特殊な実験設備
および技術を必要とせず、きわめて迅速な結果を与える
ものである。

本明細書に記載の方法には、ＩＴＩｖバイオアッセイ、
冗長な（２〜７日）、複雑な、バイオハザードの操作を
行う必要のない、生物学的サ〉・プル中の［Ｖ中和抗体
の定量的評価を含めた様々な用途がある。しかも、パイ
オアッセイはＩ　ｒ　ｖのすべての株、またはＢ型肝炎
ウィルスのような他の病原体に利用できるものではない
。

ＩＩ　Ｉ　Ｖ中和抗体の存在およびレベルは患者の予知
に重要な指標であり、同時に治療方法の指示に有用な情
報を提供する。新生児におけるＩＩ　Ｉ　％’中和抗体
の存在は非感染の重要な指標であることから、本発明の
方法は、Ｈ■ｖ感染母体からの新生児がやはりＩＩ　Ｉ
　Ｖに感染しているかどうかの決定に使用できる。この
方法はまた新生児がその危険にあったかどうかの、新生
児の定常的スクリーニングに使用できる。ある種の■ｇ
Ｇサブクラスの抗体は胎盤を通過することが知られてい
ることから、保護抗体のモニタリングは母体、胎児、新
生児、麿帯、胎盤または羊水起源のサンプルについて実
施できる。本明細書で用いられる「生物学的ザンブル」
の語は、任意の体液または他の抗体を含有する可能性の
ある溶液のような任意の抗体含有液体を意味する。感染
の早期診断は、恐らく感染している小児または胎児のみ
に早期の治療または他の処置を可能にする。

本発明の方法はまた、ＨＩＶワクチン受容者の反応のモ
ニタリングまたはワクチン候補物質の可能性のスクリー
二〉・グにおける価値が期待できる（Ｄｕｆｆｙ，　　
Ｊ．Ｉ．，　　ｌ’ａｃｃｉｎｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉ
ｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ｐａｒｋ　Ｒｉ．ｄｇｅ
．　Ｎ．Ｊ，，　Ｎｏｙｅｓ　ＤａｔａＣｏｒｐ．．　
１９８０）。この教示は参考として本明細書に導入する
。現在のワクチン開発の努力は、サブユニットワクチン
、すなわち１種または２種以上の中和ドメインを包含す
る単離天然蛋白質、組換え蛋白質および／または合成ベ
ブチドを含むウィルスベブチドの利用に集中している。

ワクチン開発の重要な手段としてＨＩＶ中和パイオアッ
セイに代わる迅速な信頼できる力法が期待されている。

新しいワクチンの開発はワクチンの候補物質の適当な抗
原性に刻する可能性、すなわち適当な保護免疫応答の誘
発能をスクリーニングする能力に依存している。ネ発明
はこのスクリーニングの時機を得た方式での実施を可能
にする方法論を提供する。

本発明の方法はウィルス中和抗体の定量に限定されるも
のではない。中和抗体の発生は多くの病原体に対して高
等動物が生存するのに重要である。したがって、本明細
書に記載した原理は、保護体液性応答の発生が生物学的
にまたは診断的に重要な他の病原体にも適用可能である
ことが著しく期待されているものである。一旦感染した
ならば（そして初期の感染を乗り越えたならば）個体が
再感染に対する抵抗性を獲得する一部のウィルス（たと
えばはしか）については、そのウィルスの構造蛋白質に
対する抗体のレベルがいくつでも保護の証拠であるから
、中和抗体の実際のレベルを試験する必要はない。

他のウィルス（たとえば単純ヘルペスウィルス）では、
ウィルスは個体の神経細胞中で休眠していることが可能
で様々な時期に（感冒、生理期間、ストレス等）にだけ
再現するので、感染および中和抗体の発生は症状の再発
からの保護を意味しない。しかしながら、ワクチンが存
在するウィルスの場合は、中和抗体の証明は保護を裏づ
ける好ましい手段である。ワクチンの目的は、以ｉ；ｊ
に感染したことのない個体を、関連病原物質に対する保
護的な体液性および細胞性応答を免疫系が発生する引き
金になる抗原刺激に暴露することである。そのウィルス
に暴露されていると、免疫系はすでに、ウィルスが何ら
かの病原性を確立する前にウィルスを不活化できる中和
抗体を発生していしかしながら、予防接種が成功したか
は多くの場合、定常的には使用できない難しいパイオア
ッセイに頼らねばならないか、動物実験による変法があ
るのみである。

実際、Ｂ型肝炎や狂犬病ウィルスはワクチンが効かなか
った例が報告されている。これらの不幸な患者は一般に
ある程度の抗体応答は生じたことを示しているが、その
応答のレベルまたは質が以後の暴露に際しての保護には
不適当であったものである。このような場合、パイオア
ッセイで明らかにされる免疫の型と相関する免疫応答を
反映する免疫化学的方法が重要になる。

たとえばＢ型肝炎の予防接種を前に受けていた個体がそ
のウィルスに暴露されたことがわかった場合、必要に応
じて適当な処置（たとえば肝炎免疫グロブリンの投与）
がとれるように、真の免疫レベルを測定することができ
る。高い抗体力価は必ずしも高親和性抗体と相関しない
ように、抗体力価自体は、保護的な中和抗体を指示する
ものではない。ＥＬＩＳ＾で高力価を示す低親和性抗体
集団が大量に存在する例はしばしば認められる。

「中和抗体」の語は、ウィルス感染に対する保護抗体応
答を意味するように用いられることが多い。しかしなが
ら、このような保護抗体に仲介される応答はウィルスに
対するものに限らず、細菌、かび、寄生体または他の微
生物感染に対する生存にも関与している。様々な新生物
疾患に対する抵抗性も機能性免疫系に依存し、その一部
は抗体応答である。したがって、本明細書に用いられる
「中和抗体」の語はウィルス中和抗体に限定されるもの
ではなく、保護抗体仲介応答を与える任意の抗体を包含
する。ｒｌＩＶに関しては、「中和抗体」は融合遮断お
よび／または感染性検定においてウィルス感染阻止を示
す抗体を包含する。

本発明の方法はＨ　Ｉ　Ｖ−１に対して保護作用のある
抗体の検定に限定されるものではなく、ピコルナウィル
ス、レトロウィルス、レオウィルス、トガウィルス、オ
ルトミクソウィルス、パラミクソウィルス、ラブドウィ
ルス、アレナウィルス、コロナウィルス、ブンヤウィル
ス、バポウィルス、アデノウィルス、ヘルベトウィルス
、ヘパトナウィルスまたはボックスウィルスに対する保
護抗体の検出にも使用できる。同じ方法論が細菌、寄生
体、かびもしくはマイクローブ、または悪性細胞、形質
転換細胞もしくは異常細胞に対する保護抗体の検定に、
保護作用を有する抗体を誘発する中和ドメインからなる
残基がある限り、それらの検定に使用できる。

本明細書ではアミノ酸残基を、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　　２版，７２頁，　　ｌｌ
ｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．　（１９７
５）に記載されている一文字表記法によって示す。本明
細書に示した本発明の教示から、本技術分野の熟練者に
は本発明を実施することが完全に可能であると考える。

付加的な情報の有用なソースを多数引用したが、これら
の引用文献は参考として本明細書に導入する。次に本発
明を以下の実施例によって例示するが、これらは本発明
を限定するものではない。

実施例 以下のベプチドはＡｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｉ＋ｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）　４０３Ａ
ペブチドシンセサイザーにより、製造業者によって供給
された試桑およびプログラムサイクルを用いて合成され
た。

この研究では様々なＨＩＶ株からのｅｎｖコードアミノ
酸３０７　〜３１９　（番号はＬｏｓ　Ａｌａｍｏｓの
配列データによる）に相当する一連の合成ペプチドを使
用した（下記第１表参照）。表から明らかなように一部
の配列は異なる数株の間で同一であった。

第　　１　　表 ＳＣ　　　　　　　　　ＲＳＩＩＩＩ　　ＧＰＧＲ　　
ＡＦＹ＾ＭＮ　　　　　　　　　ＫＲＩＩＩＩ　　ＧＰ
ＧＲ　　ＡＦＹＡ３Ｂ（ＢＩＩＩＯ）　　　ＩＲＩＱＲ
　ＧＰＧＲ　ＡＦＶＴ　　”ＲＦ　　　　　　　　　Ｋ
ＳＩＴＫ　　ＧＰＧＲ　　ＶＩＹＡＷＭＪＩ　　　　　
　　　ＲＩＩＩＩＩＩ　　ＧＰＧＲ　　ＡＦＹＴＷＭＪ
２　　　　　　　ＲＳＬＳＩ　　ＧＰＧＲ　　ＡＦＲＴ
ＷＭＪ３　　　　　　　ＲＲＩＩＩ　　ＧＰＧＲ　　Ａ
ＦＹＴＡＲＶ２　　　　　　　ＫＳＩＹＩ　　ＧＰＧＲ
　　ＡＦＩＩＴ　　”Ｚ３　　　　　　　　　ＱＳＩＲ
Ｉ　　ＧＰＧＫ　　ＶＦＹＡＺ６　　　　　　　　　Ｑ
ＳＴＲＩ　　ＧＬＧＱ　　ＡＬＹＴＮＹ５　　　　　　
　　ＫＧＩ＾Ｉ　　ＧＰＧＲ　　ＴＬＹＡＳＬ　　　　
　　　　　　　　ＴＲ丁ＨＩ　　ＧＰＧＲ　　ＡＦＹＴ
ＬＡＶＭＡ　　　　　　ＲＧＩＩＩＦ　ＧＰＧＱ　　Ａ
ＬＹＴＬＡｌ’ＥＬ　　　　　　ＱＲＴＰＩ　　ＧＬＧ
Ｑ　　ＳＬＹＴＣＤＣ４２　　　　　　ＳＲＶＴＬ　Ｇ
ＰＧＲ　　ＶＴＹＴ　　””＊　　　３８ＯＩＸＢ２）
，　　１１９，　　ｌ、＾ＶＩＡ，　　ＢＲＵ，　　Ｂ
Ｉ１８．１１ＸＢ３およびＰＶ２２の配列も同じ＊＊　
　ＳＦ２の配列も同じ 零零＊　ＣＤＣ４の配列も同じ 合成後、ペプチドを脱保護し、トリフルオロメタンスル
ホン酸で支持樹脂から切断し、ついで逆相１１ＰＬＣで
精製した。次にペブチドをスペクトル分析、アミノ酸組
成および配列決定によって分析した。合成ベブチドの長
さは選択的に１３マーにセットしたが、もっと長いある
いはやや短い他のサイズでも実質的に同じ結果が得られ
た。同様に、もっと大きい組換え蛋白質または天然蛋白
質でも、関連主要中和ドメイン（　ＰＮＤ）が使用した
蛋白質とイムノアッセイフォーマット（すなわち競合的
イムノアッセイ）内にある限り使用でき、一貫して関連
主要中和ドメイン（ＰＮＤ）に強固に結合する抗体の検
出を有利にする力が認められた。

血清 ヒト血清，Ｉｌｌ感染患者からの血清がウィルスに対す
る抗体を含むことは、ＩＩ　Ｉ　Ｖウィルス溶解物ＥＬ
ＩＳ＾，ウェスタンプロットならびにＥＮＶ９”（ｅｎ
ｖアミノ酸４７４　〜７４９からなる）組換えＨＩＶ　
ＥＬＩＳ＾（　［）ｕＦｏｎｔ）における反応性によっ
て決定した。

モノクローナル抗体の製造 Ｂａｌｂ／ｃＸｃ５７Ｂｌ／６Ｆ１マウス（８週齢）を
Ｆｉｓｃｈｂｅｒｇ，　　Ｆ．Ｄ，Ｅ，らの報告した方
法（Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ７　：　３４４
〜３４６．　　１９８６）によって免疫処置した。要約
すれば、１００μ９のへブチド接合体を完全ソロインド
アジュバントと１１に混合して１回腹腔内接種により投
与した。

４週後１＝マｌクスから採血し、ベブチド特異的抗体応
答を評価した。マウスは抗体力価が低下するまで休ませ
た。その時点で不完全プロインドアジュバント中ベブチ
ド接合体１００１１９をブースター投１ｊ，　Ｌた・ ７１口後にマウスを屠殺し、その牌臓細胞を標準方法に
よりＳＰ２／（ｌＡｇ　１４骨髄腫細胞と融合させた。

免疫処置ベブチドに特累的なハイブリドーマを、ＰＮＤ
ペブチド抗原を用いる非抗原限定Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａお
よびＨＴＬＶ−Ｉ１１ウィルス溶解物を用いるウェスタ
ンプロットによって選択した。本発明の方法がハイブリ
ドーマを強固に結合する中和抗体の産生についてスクリ
ーニングするために使用できたことは明白である。ハイ
ブリドーマは安定化し、限界希釈法で２回クローン化し
、シードロットを凍結した。バルク抗体はＢａｌｂ／ｃ
ＸＣ５７Ｂ１／　６Ｆ１マウスの腹水形成により、標準
方法を用いて製造した。腹水からの抗体は硫酸アンモニ
ウム沈降およびプロテインＡアフィニティークロマトグ
ラフィーによって精製した。モノクローナル抗体の作成
方法は一緒に譲渡された出願、米国特許ＳＮ　０７／３
２４．０２７　（１９８９年３月２０日出願）に詳細に
記載されている。この教示を参考として本明細書に導入
する。

ＥＬＩＳ＾アッセイ（抗原限定ＥＬＩＳＡ）ポリスチレ
ンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、濃度を１
　ｐｔｉ〜０．　５ｎｇ／　ｍｌに変えたコーティング
溶液１００ＩＩＡ／ウェルを用いて合威ペブチドでコー
ティングし、ついで市販のＥＬＩＳＡキット希釈剤（Ｄ
ｕ　Ｐｏｎｔ）により遮断工程を実施した。しかしなが
ら、固体支持体の性質ならびにベブチド結合後に固体支
持体上の部位を遮断する手段は本発明には重要でない。

他のタイプの固相、ビーズ、チューブ、粒子等を含めて
、また別の材料たとえばポリプロピレンまたは二酸化ク
ロムを含む磁性粒子を使用することもできる。

ヒト（または他の動物）の抗体を１：２０に希釈し、ベ
ブチドコーティングプレートと室温で１時間インキユベ
ートした。非結合抗体はウェル≦９　５％Ｔｗｅｅｎ■
２０含有リン酸緩衝食塩溶液（ＰＩＩＳ）で糺けて６回
洗浄して除去した。結合抗体は、アルカリホスファター
ゼに接合した適当なウサギ抗一種ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ．
　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）を添加し、ついで基質
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ，　Ｓｉｇ
ｍａ）と反応させ、標準ＥＬＩＳＡ法で知られているよ
うに分光測光器により４０５ｎｍ波長で読み取った。

血清についてのカットオフは１０個の血清陰性サンプル
の平均光学密度（ＯＤ）値＋標準偏差の５倍と定義した
。活性血清はカットオフ以上のＯＤの読みを与える血清
と定義した。

ＥＬＩＳＡ法を構威する他の手段は本技術分野の熟練者
に知られているように採用することができた。たとえば
イムノアッセイには抗一種抗体に接合させた様々な酵素
を使用できたくたとえば、西洋ベルオキシダーゼ、また
はビオチンついでアビシン酵素接合体）。反応の検出方
法も蛍光、化学発光またはバイオ発光測定法が使用でき
た。シグナル発生速度も測定することができた。抱合体
は放躬標識されてもよ＜　、Ｒｅａｇａｎ，Ｋ４ら（Ｊ
．　ＶｉｒｏＬ．　４８：　６６０〜６６６．　１９８
３）によって原理が報告されている免疫放射測定検定（
　ＩＲＭＡ）として創案されたイムノアッセイとしても
よい。

さらに、本発明の方法はＥＬＩＳＡフォーマットに限定
されるものではなく、検定のある成分を強固に結合する
抗体集団の検出に有利なように検定を調整できる限り、
一般的にイムノアッセイを適用できる。たとえば、ベブ
チドは放射標識またはビオチン化して（下記参照）、捕
捉原理で使用できた。このような検定フォーマットにお
いては、低親和性抗体は溶液中の抗原を結合するには不
十分なことが知られているから、標識抗原を捕捉する抗
体の能力は高い親和性を反映する。

上述のように、検定は、Ｙｏｒｄｅら（Ｐｒｏｃ．　Ｉ
ｎｔ，Ｓｙｍｐ．　ｏｎ　Ｅｎｚ−Ｌａｂｅｌｌｅｄ　
Ｉｍｍｕｎｏ．　ｏｆ　ｌｌｏｒｍｏｎｅｓａｎｄ　Ｄ
ｒｕｇｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９７８．　３５９
〜３７２）によって例示されている競合的イムノアッセ
イとじて組立てることもできた。この場合、特定の主要
中和ドメイン（ＰＮＤ）への抗体の結合は、強固に結合
する、検出可能に標識された抗体くポリクローナルまた
はモノクローナル）の存在下に起こる。

他のフォーマットでは、強固に結合する抗体集団の検定
に有利にするために、抗原一抗体反応のカオトロビック
剤たとえば塩（たとえばグアニジンＭＣＩ，　ＮａＣ／
，　チオシアン酸アンモニウム）、界面活性剤、温度ま
たはｐｌ＋に対する感受性の差を利用する。この所見を
用いた標準ＥＬＩＳ＾ブロトコールの改良はＭａｃｄｏ
ｎａｌｄら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．　ｌ　０
６　：　１９１〜１９４．　１９８８）によりその原理
が記載されている。

合成ベブチドのビオチン化 様々な合成ベプチドが標準方法（製造業者Ｐｉｅｒｃｅ
による説明）により、ビオチンのＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル（ＮＩＩＳ−　Ｌ　−　Ｃ一ビオチン
）またはビオチンーＬ−Ｃ−ヒドラジド、一級アミンま
たはカルボキシル基と反応する延長スベーサー腕をもつ
水溶性試薬を用いてビオチン化できた。ビオチン化され
た主要中和ドメイン（ＰＮＤ）ペブチドをついでポリス
チレンプレート上に適用し、ペプチドコーティング効率
は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰ）に接合させ
たストレプタビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、ペブチド
に連結したビオチンの検出により測定された。

中和検定 感染性検定，抗体のウィルス中和はＣＥＭ−ＳＳ細胞の
感受性クローンを用いるマイクロタイターシンシチウム
阻害検定によって検定した（Ｎａｒａ，Ｐ．１．．ら，
　　Ｊ，　　Ｖｉｒｏｌ．　　６１：　３１７３〜３１
８０．　　１９８７）。

要約すれば、ＩＩ　Ｉ　Ｖウィルスに感染させる細胞５
０，　０００個をポリ　（Ｌ−リジン）コートしたマイ
クロタイターウェルに付着させた。ＨＴＬＶ−ＩＩ［ウ
ィルスを包含するＨＴＬＶ−１１Ｉ感染株を２００〜３
００シンシチウム形成単位（ＳＦＵ）の濃度で、中和抗
体の２倍希釈系列または緩衝液と混合した。細胞を感染
溶液と２２℃で１時間インキユベートしたのち、洗浄し
、完全ＲＰＭＩ　１６４０　（Ｇｉｂｃｏ，　Ｇｒａｎ
ｄＩｓｌａｎｄ，　ＮＹ）に置換した。シンシチウムを
第５日に計数し、ウィルス対照ウェル（抗体を添加せず
）の値と比較した。終点中和力価は総ＳＦＵの９０％が
阻害された抗体希釈の逆数と定義した。

細胞融合検定：細胞融合検定は報告されているようにし
て実施した（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，　　Ｔ，Ｊ，ら，Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　
８４　：　５４２４〜５４２８．１９８７）。要約すれ
ば、３０μｌ中の５００個のＩＩ　Ｉ　Ｖ感染細胞をマ
イクロタイターウェル中に接種した。

細胞をついで３０℃で３０分間インキユベートしたのち
、ＲＰＩＪＩ培地中７５．　０００個のＭＯＬＴ　４細
胞を含む液３０μｌを加えた。次にプレートを３７℃で
２４時間インキユベートし、シンシチウムの形成を計数
した（細胞融合）。中和力価は抗体がシンシチウム形成
の５０％を阻害した力価として定義した。

実施例　１ 限定ＥＬＩＳ＾） モノクローナル抗体（５０２５．　２９．　１と命名、
ＡＴＣＣ受人番号＃　ＪＩＢ　１００４１．　ＨＴＬＶ
−Ｉ［Ｉ　ＩＩＰＮＤヘフｆ　トニ対して誘導）の反応
性を、様々なＨＴＬＶ−　ＩＩＩ株からのｇｐ　１２０
の主要中和ドメインからなる抗原に対して１．５ｐｙ　
　ＩｇＧで試験した。抗原コーティング濃度１０００ｎ
ｇ／　＊ｌでインキユベートした場合、このモノクロー
ナル抗体は著しく反応性で、アミノ酸配列ＧＰＧＲＡＦ
を含有するすべてのＰＮＤで高いＯＤシグナル（３．５
〜４０Ｄ）を生成した。しかしながら、抗原コーティン
グ濃度を１００．　５０．　１０、５，１およびＱ，５
ｎｇ／ｍｌに低下させると、反応性の等級づけが観察さ
れた（第２表参照）。最低のベプチドコーティングレベ
ル−０．５ｎｇ／ｍ／で抗体が結合したベプチドはｎＴ
ｔ．ｖ−ｍ　ＩＩ　ＰＮＤペブチドのみであった。この
モノクローナル抗体が低い抗原コーティングレベルで他
のすべてのＰＮＤと結合しなかったことは、抗体がＨＴ
ＬＶ−ｎ［ｎＰＮＤと最強の結合性をもっていることを
示唆している。すべてのＰＮＤベブチドはポリスチレン
プレートへのビオチン化ＰＮＤの結合で測定して均等な
コーティング効率を示したことから、プレートコーティ
ング効率の変動は除外された。

５０２５．　２９．　１抗体の様々なＰＮＤとの結合の
差から結合力のランクは、３Ｂ＞ＳＣ＞ｌＦＭＪ３＞Ｍ
Ｎ＞ｌｌＭＪ２＞ＷＭＪ１＝ＳＬ＞ＣＤＣ４２＞ＲＦ＞
Ｚ３＝Ｚ６＞ＮＹ５＞ＬＡＶＭＡ＝ＬＡＶＥＬであるこ
とが示唆された。

第２表に示すように、低い抗原コーティング濃度では、
反応性は比較的強固な結合が生じる抗原とのみ認められ
た（　０．　５ｒ＋ｇ／　Ｈ／でＨＴＬＶ−Ｉ［［　Ｂ
，５　ｎ　９　／　ｘ　ｌコーティング濃度でＩＩＴＬ
■−■ＭＮおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｓｃ）。この抗体
をＲＩＶ中和について試験した場合、ＨＴＬＶ−１１１
ｓ株はモノクローナル抗体にヨリ５ｌｌｇｒｇＧ／ＩＩ
１テ中和された。ＨＴＬ％’−１１１ｘ＋＝株も中和さ
れたが、その程度は低く、抗体のｔｌＴＬＶ−ｍｓ株に
対する強い結合は、この抗体の大きな生物活性と相関す
ることが示唆された。すなわち、本発明者らは、抗原の
至適以下の濃度（抗原限定ＥＬＩＳＡ）がＨＴＬＶ−　
ｍ中和抗体を検出する検定に有利に働くと結論した。

第 表 ５０２５．　２９．　１モノクローナル抗体の、低濃度
におけるＰＮＤペブチドとの免疫反応性３Ｂ ＳＣ ＭＮ ＷＭＪＩ ｆＭＪ３ １ＭＪ２ ＾ＲＶ２ ＳＬ ＣＤＣ４２ ＲＦ Ｚ３ ｚ６ ＮＹ５ ＬＡＶＭＡ ＬＡＶＥＬ 〉４．２ 〉４２ 〉４．２ 〉４．２ 〉４２ 〉４２ 〉４２ 〉４．２ ０．５ ０．２ ０．１８ ０．０１ 〉４．２ 〉４．２ 〉４．２ 〉４．２ 〉４．２ 〉４．２ 〉４．２ 〉４．２ ０．４ ０．３ ０．２ ０．２ ０，０１ ０．０１ ０．０１ ＞４．２　　＞４．２　　＞４．２ ＞４．２　　＞４．２　　　３．４５ ＞４．２　　＞４．２　　　２．９ ＞４．２　　　３．７３　　２．０ ＞４．２　　　３．５　　　３．０５ ＞４．２　　　２．９　　　２．０ ３．４　　　２．３６　　０．０３ ＞４．２　　＞４．２　　　３．０１ ０．０１　　０．０１　　０．０１ ０．０１　　０．０１　　０．０１ ０．０１　　０．０１　　０．０１ ０．０１　　　０．０１　　　００１ ０．０１　　０．０１．　　０．０１ ０．０１　　０．０１　　０．０ｉ ｏ．ｏｉ　　　Ｏ．０ｉ　　　ｏ．ｏｉ〉４．２ ０．９５ １．１ ０．９ １．２ ０．８ ０．Ｏｌ １．０ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ １．０ ０，２ ０．０９ ０．０５ ０．１５ ０．１ ０．０Ｉ Ｏ．１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０，０１ ０．５ ０．０１ ０．０１ ０．　００５ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．ＯＪ Ｏ．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０，０１ ウィルス中和における抗体結合力の重要性は、５０２３
．　２４．　４と命名された他のモノクローナル抗体（
ＡＴＣＣ＃ＨＢ　１００４３）を用いてさらに明らかに
された。５０２３．　２４．　４もＨＴＬｖ−■ＢＰＮ
Ｄヘフチトヲ指図するものである。第１図に示すように
、両モノクローナル抗体ともＨＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｂ　Ｐ
ＮＤベブチドに強固な結合を示した（第１図ａ，　ｂ　
；０．５ｎｇ／　＊ｌコ７　イ：’グ濃度テ（７）　Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩ　．　ＰＮＤヘプチドに対する結合）。

５０２５．２９．１はＨＴＬＶ−ｍ　ＭＮＰＥＤペブチ
ドにも強固な結合を示した（１０ｎｇ／ｍｌコティング
濃度でのＰＮＤ−ＭＮへの結合）が、５０２３．　２４
．　４モノクローナル抗体はこのタイプの強固な結合は
示さなかった（第ｉｂ図，　＜　１０００ｒ＋ｇ／　ｍ
　（コーティング濃度でのみＭＮに結合）。抗原限定Ｅ
ＬＩＳＡ桔合データは、５０２３．　２４．　４が感染
性検定および融合阻止検定でｌｌＴｌ．Ｖ−１［［．株
を中和したがＨＴＬＶ　−　ｎ［−ｓ株は中和しなかっ
たウィルス中和データと完全に相関した。

感染性検定でＨＴＬＶ−ｍｓに対して中等度の中和能を
示した５０２５．　２９．　１モノクローナル抗体は（
５ｐｑ　ＩｇＧ／萬１．　５０２３．２４．４抗体の場
合の０．５１１９　１ｇＧ／＊１に対Ｌ／　テ）　、Ｔ
ＩＴＬＶ−ｍ　ｓ株（５　１１９　ＩｇＧ／＋＋Ａ’）
おヨＵ　ＩＴＬＶ　−　ｍ　Ｍ　Ｎ株（５ｈｖ　ＩｇＧ
／　ｍｌ）の両者に対して融合阻止活性も示した。した
がって、抗原限定ＥＬＩＳＡはＨＩＶ中和抗体の活性の
定量のために容易に至適化できる。

これらのデータを合わせると、ｉ）強い抗原抗体相互作
用と弱い抗原一抗体相互作用を識別しない従来技術によ
るＥＬＩＳＡ法〔すなわち、高い（非律速）　ＰＮＤコ
ーティング濃度を使用するＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　）は抗
体集団の生物学的機能（すなわち＋１ＴＬＶ−１１１中
和能）と相関しない結果を生じ、ｉ１）抗原限定濃度を
用いる検定は強く結合する抗体亜集団の選択および測定
に有利に作用し、＃ｆ１）抗原に強固に結合する抗体は
生物活性に関しての測定に好ましい集団である。

実施例　２ 低抗原濃度における抗体結合をウィルス中和と定量的に
相関させることができることは、様々なＰＮＤペプチド
に対してヤギに産生させたポリクローナル抗体を用いて
も明らかにされた。

各ヤギ抗血清を３種の異なるＨＴＬＶ−１ＩＩ株からの
ＰＮＤベブチドに対して、上述の抗原限定ＥＬＩＳＡで
試験した。

結果は以下の第３表にまとめる。検定は最も強固な結合
が存在するｒｌＩＶ株を検出し、この結果は抗血清のウ
ィルス感染性の中和能と完全に相ｉ１／ｌ　ｔ，た。高
い抗原コーティング濃度では様々なＰ　Ｎ　Ｄ　ｉ．’
．　’＞ｔする交差反応性が認められ、ウィルスの中和
に相当する結果はみられなかった。

第 表 異なるＦＩＴＬＹ株からのＰＮＤに対するヤギ抗血清の
免疫反応性 ヤギ（３Ｂ）　　　１２８　　　＜４　　＜４　　　　
１０　　　１０００　　　５００ヤギ（ＲＦ）　　　＜
４　　４５００　　＜４　　　１０００　　　０．５　
　　１００ヤギ（ＭＮ）　　　＜４　　　＜４　　４８
　　　　１００　　　５００　　　５０＊　総ＳＦＵ　
（シンシチウム形成単位）の９０％を阻害する抗体希釈
の逆数 ネネ　カットオフ以上のＯＤシグナルを生成する最小抗
原コーティング濃度 実施例　３ 抗原限定検定により、低抗原濃度でのＰＮＤに対する抗
体の結合をウィルス中和と相関させることが可能なこと
は、また、ＩＩ　Ｉ　Ｖ　−　１に感染したヒトまたは
チンパンジーを用いて試験した。各血清は３種のＰＮＤ
ベブチドに対して、上述の抗原限定ＥＬＩＳＡにより試
験した。結果は第４表にまとめる。この検定では、強固
に結合する抗体集団が指図するＨ　Ｉ　Ｖ株を検出した
が、結果は血清がウィルスを中和する能力と完全には相
関しなかった。天然のＨＩＶ感染では、体液性免疫系が
すべてのＨＩＶエビトーブに向けらＣＤ４結合部位のよ
うなエビトーブ（Ｓｕｎ，　Ｎ．Ｃ．ら，　Ｊ．　Ｖｉ
ｒｏ１６３　：　３５７９〜３５８５，　１９８９　：
　Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，　＾．らＮａｔｕｒｅ　３３
９　：　６８〜７０．　１９８９　；およびＪａｍｅｓ
ｏｎ＾．Ｒ．ら，　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２４０　：　
１３３５　〜１３３９．　　１９８８）または他のエン
ベローブエビトーブ（Ｉｌｏ，　Ｄ，ＤらＳｃｉｅｎｃ
ｅ　２３９　：　１０２１〜１０２３．　１９８８　；
およびＤａｌｇｌ＋・ｉｓｈ，　　Ａ．Ｇ，ら，　　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇ）＋　１６５　：　２０９〜２１５．１９
８８）による中和抗体の誘導が確立されている。

事実、第４表に示した結果は、本発明で使用されたｇｐ
　１２０ドメインのほかに他の中和ドメインがあること
を確証している。ヒトおよびチンパンジー血清はいずれ
もＲＦに対する中和能を示したが、抗原限定ＥＬＩＳＡ
でも高抗原濃度ＥＬＩＳＡでも１１ＴＬＶ−ｍ　−　ｒ
株のＰＮＤに対する抗体は検出されなかった。さらにＨ
ＩＶ中和ドメインが同定されれば、このようなドメイン
を含む設計される他の適当なイムノアッセイは、各種の
ＰＮＤと交差反応する抗体と生物学的に機能する中和抗
体を選別するのに有用であろう。

第４表 １１ＴＬＶ−ＩＩ１感染ヒトおよびチンパンジーの免疫
反応性と中和 木本 零本本 ０．５　　　　　＞２５６　　　　　５　　　　　　　
＞６４ＮＯＮＥ”＊＞１２８　　　　　１　　　　　　
　＞２５６ＮＯＮＥ””　　　＞２５６　　　　　ＮＯ
ＮＥ”本　　　〉８カットオフ以上のＯＤシグナルを生
威する最小抗原コーティング濃度 総ＳＦＵの９０％を阻止する抗体希釈度の逆数１０００
ｎｇ／ｍｌまでの抗原コーティング濃度ではＥＬＩＳ＾
シグナルを発生しない 実施例　４ 母親の［ｌＩＶの新生児への感染の測定および疾患の予
知 最近Ｒｏｓｓｉら（Ｖ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎ　Ａｉｄｓ，　　Ｊｕｎｅ　
　４〜９．　１９８９，　Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａ
ｄａ）はＨＴＬＶ−ＩＩＩ感染母親から３１％の非感染
新生児が出生し、その児はｇｐ１２０　ＰＮＤに対する
母体からの抗体をもっていること、一方、感染新生児は
そのような抗体をもたないことを報告している。これら
の実験に用いられたＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法は、ｉ）中和
に重要なアミノ酸、ＰＮＤを除いた抗原（　ｅｎｖアミ
ノ酸３２４〜３３８）が利用された、ｉ）抗原濃度が限
定されていないので抗体集団の結合力の識別がなされて
おらず、したがって予知的に限られた価値しかない、そ
して由）ＨＩＶ感染患者中に優位な感染株であるＩＩＴ
ＬＩＩＩＩＭ，株に由来する配列が使用されていない。

これに対し、本明細書に記載の抗原限定ＥＬＩＳ＾検定
は、効果のない、ＰＮＤに対する交差反応性を示す抗体
と、ＰＮＤに強力に結合しウィルスの中和の原因となる
抗体とを識別できる。

第５表には、出生時に母親および新生児から血清が採取
され、保存されていて、本発明抗定限定ＥＬＩＳＡで試
験された１５組の母親／新生児からのデータをまとめる
。強固に結合するＰＮＤに対する抗体をもっていた■■
ｖ感染母親からの新生児はすべて健康であった。ＨＴＬ
Ｖ　−　ＩＩＩ感染集団の大部分がＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　
−　Ｉ［　Ｍｓ株にも感染していることが最近明らかに
なったので、この試験ではＭＮＰＮＤを用いれば十分と
考えられる。これらの結果から、胎児および新生児のモ
ニタリングは、本発明の方法を用いた母体の保護抗体の
モニタリングで十分といえる可能性のあることがわかる
。

第 表 母親／新生児間のＨＩＶの伝達： 強固に結合するＰＮＤ抗体との相関 （計１５＆ｌｌＩの母親／新生児サンプル）健康新生児
　　　　４１ 感染新生児　　　　０１０ 図面の簡単な説明 第１図は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩ
ＭＮ株からのＰＮＤペプチドに対する、低ペプチド濃度
でのモノクローナル抗体の免疫反応性を示すグラフであ
り、（ａ）は５０２５．　２９．　１抗体、（ｂ）は５
０２３．　２４．　４抗体υ）ｊ！１合の結果である。

第 図 ，１ ＰＮＤ　（ＮＧ／ＭＬＩ ＋ｏｏｏｏ ＰＮＤ（ＮＧ／ＭＬ） ＋０００ ＋ｏｏｏｏ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物学的サンプル中の中和抗体の免疫化学的選択
   にあたり、中和ドメインからなる抗原と上記生物学的サ
   ンプルとを、抗原−抗体反応が強く結合する抗体の結合
   に有利で弱く結合する抗体の結合に不利な条件下に接触
   させ、中和抗体と抗原の中和ドメインの免疫学的反応を
   検出する方法。 （２）生物学的サンプルをウィルス中和ドメインからな
   る抗原と接触させ、ウィルス中和抗体を検出する請求項
   （１）記載の方法。 （３）生物学的サンプルをＨＩＶ中和ドメインからなる
   抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を検出する請求項（２
   ）記載の方法。 （４）生物学的サンプルをＨＩＶｇｐ１２０蛋白質から
   のＨＩＶ主要中和ドメインからなる抗原と接触させ、Ｈ
   ＩＶ中和抗体を検出する請求項（３）記載の方法。 （５）生物学的サンプルをＨＩＶｇｐ１２０蛋白質から
   のアミノ酸番号３０７〜３１９に相当する配列からなる
   抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を検出する請求項（４
   ）記載の方法。 （６）生物学的サンプルをＨＩＶｇｐ１２０蛋白質から
   のアミノ酸番号３０９〜３１７に相当する配列からなる
   抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を検出する請求項（４
   ）記載の方法。 （７）生物学的サンプルを、ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質か
   らのアミノ酸番号３０７〜３１９に相当し、ＨＴＬＶ−
   III＿Ｍ＿Ｎ配列ファミリーの株に由来するアミノ酸配
   列からなる抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を検出する
   請求項（５）記載の方法。 （８）生物学的サンプルを、ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質か
   らのアミノ酸番号３０９〜３１７に相当し、ＨＴＬＶ−
   III＿Ｍ＿Ｎ配列ファミリーの株に由来するアミノ酸配
   列からなる抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を検出する
   請求項（６）記載の方法。 （９）生物学的サンプルをアミノ酸配列：ＲＩＨＩＧＰ
   ＧＲＡＦＹからなる抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を
   検出する請求項（４）記載の方法。 （１０）生物学的サンプルをアミノ酸配列：ＩＨＩＧＰ
   ＧＲＡＦからなる抗原と接触させ、ＨＩＶ中和抗体を検
   出する請求項（４）記載の方法。 （１１）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾６Ｍである抗体を選択する請求項（
   １）〜（１０）のいずれかに記載の方法。 （１２）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾８Ｍである抗体を選択する請求項（
   １）〜（１０）のいずれかに記載の方法。 （１３）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾９Ｍである抗体を選択する請求項（
   １）〜（１０）のいずれかに記載の方法。 （１４）生物学的サンプルは、同一ウィルスの少なくと
   も２種の異なる株からの相当する中和ドメインからなる
   抗原と接触させる請求項（２）記載の方法。 （１５）生物学的サンプルは、少なくとも２種の異なる
   ＨＩＶ株からの相当するＨＩＶ中和ドメインからなる抗
   原と接触させる請求項（３）記載の方法。 （１６）生物学的サンプルは、少なくとも２種の異なる
   ＨＩＶ株のＨＩＶｇｐ１２０蛋白質からのＨＩＶ主要中
   和ドメインからなる抗原と接触させる請求項（１５）記
   載の方法。（１７）生物学的サンプルは、少なくとも２
   種の異なるＨＩＶ株のＨＩＶｇｐ１２０蛋白質からのア
   ミノ酸番号３０７〜３１９に相当する配列からなる抗原
   と接触させる請求項（１６）記載の方法。 （１８）生物学的サンプルは、少なくとも２種の異なる
   ＨＩＶ株のＨＩＶｇｐ１２０蛋白質からのアミノ酸番号
   ３０９〜３１７に相当する配列からなる抗原と接触させ
   る請求項（１６）記載の方法。 （１９）配列の少なくともひとつはＨＴＬＶ−III＿Ｍ
   ＿Ｎ配列ファミリーからのＨＩＶ株に由来する請求項（
   １７）記載の方法。 （２０）配列の少なくともひとつはＨＴＬＶ−III＿Ｍ
   ＿Ｎ配列ファミリーからのＨＩＶ株に由来する請求項（
   １８）記載の方法。 （２１）生物学的サンプルは、アミノ酸配列：ＲＩＨＩ
   ＧＰＧＲＡＦＹからなる抗原と接触させる請求項（１６
   ）記載の方法。 （２２）生物学的サンプルは、アミノ酸配列：ＩＨＩＧ
   ＰＧＲＡＦからなる抗原と接触させる請求項（１６）記
   載の方法。 （２３）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾６Ｍである抗体を選択する請求項（
   １４）〜（２２）のいずれかに記載の方法。 （２４）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾８Ｍである抗体を選択する請求項（
   １４）〜（２２）のいずれかに記載の方法。 （２５）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾９Ｍである抗体を選択する請求項（
   １４）〜（２２）のいずれ一かに記載の方法。 （２６）生物学的サンプルは少なくとも２種の異なるＨ
   ＩＶ中和ドメインと接触させる請求項（３）記載の方法
   。 （２７）生物学的サンプルは少なくとも２種の異なるＨ
   ＩＶ中和ドメインと接触させ、そのひとつはＨＩＶｇｐ
   １２０蛋白質からの主要中和ドメインである請求項（２
   ６）記載の方法。 （２８）生物学的サンプルは少なくとも２種の異なるＨ
   ＩＶ中和ドメインと接触させ、そのひとつはＨＩＶｇｐ
   １２０蛋白質からのアミノ酸番号３０７〜３１９に相当
   する配列からなる請求項（２７）記載の方法。 （２９）生物学的サンプルは少なくとも２種の異なるＨ
   ＩＶ中和ドメインと接触させ、そのひとつはＨＩＶｇｐ
   １２０蛋白質からのアミノ酸番号３０９〜３１７に相当
   する配列からなる請求項（２７）記載の方法。 （３０）生物学的サンプルは少なくとも２種の異なるＨ
   ＩＶ中和ドメインと接触させ、そのひとつはＨＩＶｇｐ
   １２０蛋白質からのアミノ酸番号３０７〜３１９に相当
   し、ＨＴＬＶ−III＿Ｍ＿Ｈ配列ファミリーの株に由来
   するアミノ酸配列からなる請求項 （２８）記載の方法。 （３１）生物学的サンプルは少なくとも２種の異なるＨ
   ＩＶ中和ドメインと接触させ、そのひとつはＨＩＶｇｐ
   １２０蛋白質からのアミノ酸番号３０９〜３１７に相当
   し、ＨＴＬＶ−III＿Ｍ＿Ｎ配列ファミリーの株に由来
   するアミノ酸配列からなる請求項 （２８）記載の方法。 （３２）生物学的サンプルはアミノ酸配列：ＲＩＨＩＧ
   ＰＧＲＡＦＹからなる抗原と接触させる請求項（２７）
   記載の方法。 （３３）生物学的サンプルはアミノ酸配列：ＩＨＩＧＰ
   ＧＲＡＦからなる抗原と接触させる請求項（２７）記載
   の方法。 （３４）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾６Ｍである抗体を選択する請求項（
   ２６）〜（３３）のいずれかに記載の方法。 （３５）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾８Ｍである抗体を選択する請求項（
   ２６）〜（３３）のいずれかに記載の方法。 （３６）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾９Ｍである抗体を選択する請求項（
   ２６）〜（３３）のいずれかに記載の方法。 （３７）ＨＩＶ中和ドメインはＨＩＶｇｐ１２０蛋白質
   のＣＤ４−結合ドメインおよび主要中和ドメインを包含
   する請求項（２６）記載の方法。 （３８）抗原は最適以下の濃度で存在する請求項（１）
   〜（１０）のいずれかに記載の方法。 （３９）抗原は最適以下の濃度で固相に固定化される請
   求項（１１）記載の方法。 （４０）抗原は最適以下の濃度で固相に固定化される請
   求項（１２）記載の方法。 （４１）抗原は最適以下の濃度で固相に固定化される請
   求項（１３）記載の方法。 （４２）中和ドメインからなる抗原を検出可能なように
   標識し、生物学的サンプルと溶液中で、検出可能な標識
   抗原を生物学的サンプル中の強固に結合する中和抗体と
   結合させることができる条件下に接触させ、この場合、
   標識抗原−抗体複合体が中和ドメインからなり非標識の
   、固相に固定化された抗原によって捕捉される請求項（
   １）〜（１０）のいずれかに記載の方法。 （４３）中和ドメインからなる抗原を検出可能なように
   標識し、生物学的サンプルと溶液中で、検出可能な標識
   抗原を生物学的サンプル中の強固に結合する中和抗体と
   結合させることができる条件下に接触させ、この場合、
   標識抗原−抗体複合体が中和ドメインからなり非標識の
   固相に固定化された抗原によって捕捉される請求項（１
   １）記載の方法。 （４４）中和ドメインからなる抗原を検出可能なように
   標識し、生物学的サンプルと溶液中で、検出可能な標識
   抗原を生物学的サンプル中の強固に結合する中和抗体と
   結合させることができる条件下に接触させ、この場合、
   標識抗原−抗体複合体が中和ドメインからなり非標識の
   、固相に固定化された抗原によって捕捉される請求項（
   １２）記載の方法。 （４５）中和ドメインからなる抗原を検出可能なように
   標識し、生物学的サンプルと溶液中で、検出可能な標識
   抗原を生物学的サンプル中の強固に結合する中和抗体と
   結合させることができる条件下に接触させ、この場合、
   標識抗原−抗体複合体が中和ドメインからなり非標識の
   、固相に固定化された抗原によって捕捉される請求項（
   １３）記載の方法。 （４６）生物学的サンプルを中和ドメインからなる抗原
   と、主要中和ドメインに特異的な強固に結合する、検出
   可能なように標識された抗体の存在下に接触させる競合
   的イムノアッセイである請求項（１）〜（１０）のいず
   れかに記載の方法。 （４７）強固に結合する、検出可能なように標識された
   抗体の、主要中和ドメインに特異的な見掛けのアフィニ
   ティー、Ｋｄが少なくとも１０＾−＾６Ｍである請求項
   （４６）記載の方法。 （４８）強固に結合する、検知可能なように標識された
   抗体の、主要中和ドメインに特異的な見掛けのアフィニ
   ティー、Ｋｄが少なくとも１０＾−＾８Ｍである請求項
   （４６）記載の方法。 （４９）強固の結合する、検知可能なように標識された
   抗体の、主要中和ドメインに特異的な見掛けのアフィニ
   ティー、Ｘｄが少なくとも１０＾−＾９Ｍである請求項
   （４６）記載の方法。 （５０）抗原−抗体相互作用はイムノアッセイにおける
   最適以下の条件の存在により強固に結合する抗体の検出
   に有利であり、この最適以下の条件は抗原濃度、イオン
   強度、温度ならびに界面活性剤の性質および濃度からな
   る群より選ばれる請求項（１）〜（１０）のいずれかに
   記載の方法。 （５１）最適以下の検定条件は見掛けのアフィニティー
   、Ｋｄが少なくとも１０＾−＾６Ｍである抗体を選択す
   る請求項（５０）記載の方法。 （５２）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾８Ｍである抗体を選択する請求項（
   ５０）記載の方法。 （５３）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾９である抗体を選択する請求項（５
   ０）記載の方法。 （５４）生物学的サンプルは母体または新生児からのサ
   ンプルであり、ＨＩＶ中和抗体の存在を検出する新生児
   のＨＩＶ感染の予知に用いられる請求項（４）〜（１０
   ）のいずれかに記載の方法。 （５５）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾６Ｍである抗体を選択する請求項（
   ５４）記載の方法。 （５６）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾８である抗体を選択する請求項（５
   ４）記載の方法。 （５７）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾９である抗体を選択する請求項（５
   ４）記載の方法。 （５８）中和ドメインを含む抗原からなるワクチンまた
   はワクチン候補物質の受給者からの生物学的サンプル中
   の中和抗体をモニタリングするために使用する請求項（
   １）〜（１０）のいずれかに記載の方法。 （５９）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾６Ｍである抗体を選択する請求項（
   ５８）記載の方法。 （６０）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾８Ｍである抗体を選択する請求項（
   ５８）記載の方法。 （６１）検定条件は見掛けのアフィニティー、Ｋｄが少
   なくとも１０＾−＾９Ｍである抗体を選択する請求項（
   ５８）記載の方法。 （６２）中和抗体の定量的評価を与える請求項（１）〜
   （４）、（５４）または（５８）のいずれかに記載の方
   法。 （６３）生物学的サンプルはハイブリドーマ細胞系に由
   来するサンプルであり、強固に結合する中和モノクロー
   ナル抗体が選択される請求項（１）記載の方法。