JPH03201990A - 遺伝子を目標に向つて変える方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、相同組換えにより、無傷の哺乳動物細胞のゲ
ノム内の遺伝子を目標に向って変える方法に関る、。

［従来の技術］ 種々の遺伝子的に制限された病気の原因の研究及び分子
平面上の病気を起こす欠失の局在化は、その使用時に常
に正確でかつ安全になる遺伝子技術により、常に急速に
進歩している。特に哺乳動物細胞中の重要な多くの遺伝
子の機能は、特に無傷の哺乳動物細胞の突然変異のため
の満足しつる方法がなお存在しないので、従来なお不明
のままである。そのような方法は、更に、既に公知の遺
伝子欠損の修正のために必要である。

このために、従来は、哺乳動物細胞中での第１退化器官
中で、欠損遺伝子の存在の場合には、その機能を相応る
、機能化遺伝子の他の位置での挿入により替える試みが
なされているが、この際には、変異すべき位置以外の位
置でのできるだけ長時間有効な変化が惹起されるのでこ
の方法は哺乳動物細胞での場合による病気処置のために
は排除される。

相同組換えを介して突然変異生成のための哺乳動物細胞
中での従来の実験法におけるもう１つの重要な欠点は、
実施突然変異の検出のために、マーカー遺伝子の導入が
必要であることである。この位置でのもしくは、主とし
てゲノム中での異種遺伝子であるこのマーカー遺伝子に
おいても、大きい確率で不所望の副作用を甘受しなけれ
ばならない。

従来使用されている生体内突然変異生成の方法における
成功率は、「遺伝子ターゲツティング（ｇｅｎｅ　ｔａ
ｒｇｅｔｔｉｎｇ）　Ｊとも称され、哺乳動物細胞では
なお比較的低い。

［発明の解決しようとる、課題］ 従って、遺伝子技術の開発の大きい目的の１つ及び本発
明の課題も、同時に不所望の他の突然変異作用をる、と
か必然的な異種配列を導入る、危険に遭遇る、ことなし
に、生細胞内での哺乳動物細胞ゲノムの特異部分の直接
的変化を可能にる、方法を提供る、ことである。

［課題を解決る、ための手段］ この課題は、本発明により、相同組換えによる無傷の哺
乳動物細胞のゲノム内で遺伝子を目標に向って変える方
法により解決され、この方法では、変えるべき遺伝子に
対して相同であるが、突然変異、欠損又は挿入により少
なくとも１個のヌクレオチド内でこの遺伝子の配列から
はずれているＤＮＡ−配列を、マイクロインジェクショ
ンにより相応る、細胞内に導入し、得られた変化を立証
る、ことのできる細胞を取得る、。

本発明方法は、意外にも、所望位置での相同組換えの特
に高い配分をもたらし、この際、６４０細胞当り１個よ
り多くで相同組換えが起こる。マイクロインジェクトさ
れた細胞１５０個当り１個の組換え率が、既に本発明方
法により達成る、ことができた。このことは、相同組換
え対従来から哺乳動物細胞中で使用された方法による非
正統的組換えの割合に比べて、効率の極端な上昇である
。更に、本発明の方法では、マーカー遺伝子の導入及び
このマーカー遺伝子に関る、適当な選択を行なう必要な
しに、行なわれた変化を立証る、ことができる。この変
化は、マイクロインジェクションされた細胞のクローニ
ングの後に、サイン・プロッティング又は配列決定によ
り立証る、ことができる。

本発明の特に有利な実施形では、行なわれた変化の立証
をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チエイン・リアクション）−
法（Ｒ、Ｋ　、５ａｉｋｉ等による５ｃｉｅｎｃｅ２３
９、（１９８８）４８７〜４９１）により実施る、。こ
の際、予めの細胞のクロニングなしに、既に、所望の突
然変異が行なわれたか否かを確認る、ことができる。こ
の際、この方法は、多くの細胞数を必要とせずに、既に
僅かなりＮＡ−分子を確実に分析できる程度に高い感度
である。この場合、この方法は、点突然変異すらも検出
できるような方法でも使用できる。

この検出のために、その１個がその遺伝子とは異なるＤ
ＮＡ−配列の位置に対して競争る、２個のプライマーを
使用る、。組換えが行なわれた場合にのみ、このプライ
マーから増幅を行なうことができ、検出できる。

変えるべき遺伝子と相同であるが少なくとも１個所でこ
の配列からはずされているＤＮＡ−配列としては、天然
で単離され、場合によりクローニングされたが合成によ
っても製造されたＤＮＡ−配列を使用る、ことができる
。この場合、従来は、ホモロジイの長さは、遺伝子変換
現象の頻度に正比例し、これに対しヘテロシイの長さは
逆比例る、ことから明らかである。従って、必要な位置
のみで変えるべきゲノム配列からはずれているができる
だけ大きいホモロジイを有る、ＤＮＡ−配列を用いるこ
とが特に有利であり、これにより、使用ＤＮＡ−配列が
長いほど組換え率は大きいことが判る。

本発明の有利な１実施形では、哺乳動物細胞として体幹
細胞を使用る、。このような幹細胞及びこのような細胞
中への遺伝子転移に関る、従来の知識は、例えばＰ、Ｍ
、デクスター（Ｄｅｘｔｅｒ）及びり、ベツティンガ−
（Ｂｏｅｔｔｉｎｇｅｒ）により　、　Ｇｅｎｅ　　Ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ　　１ｎｔｏ　　Ｈｅｍａｐｏｅｔｉｃ
　　Ｃｅ１ｌｓ　　ｂｙＲｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ　ＩＳｌ、＾ｔｌａｓ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ
１６７〜１７４にまとめられている。本発明による体幹
細胞のゲノムの変化は、細胞を哺乳動物内に導入の後に
、存在る、かつ周知の欠損を高めることを可能にる、。

それというのも、この幹細胞は、機能的細胞に対して区
別され、体内の欠損ポピユレーションは有効に交換され
るからである。欠損遺伝子を、本発明により突然変異さ
れた幹細胞の（再）導入による補修る、ための使用例と
しては、血液欠損例えばファクター■−欠損症（血友病
）が挙げられる。ランゲルハンス島細胞を分化る、幹細
胞内に記載のインシュリン遺伝子内の欠損が補修できる
場合には、もう１つの使用可能性が生じ、ここで、遺伝
子表面上の糖尿病に対抗る、チャンスが生じる。体細胞
は、いわゆるフィーダーセル（Ｆｅｅｄｅｒ−Ｃｅｌｌ
）層上で保持され、即ち、分裂失活の、もはや分割でき
ない細胞の層上での培養で保持されるか又は生長因子を
用いて（ＤＩＡ：Ａ、Ｇ、５ｓｉｔｈ等によるＮａｔｕ
ｒｅ　、Ｖｏｌ、　３３６（１９８８）、６８８頁、Ｌ
　Ｉ　Ｆ　：　Ｒ，Ｌ、１ｉｌｌｉａ園Ｓ等によるＮａ
ｔｕｒｅ　３３６　（１９８８）　６８４頁）、分化を
阻止し、これにより培養を可能にる、。

農業、特に有用動物畜産のために、例えば、動物内の生
長因子の分泌増加を目的とる、本発明の方法の用途は重
要であり、ここでは、畜産で変異遺伝子が生殖系列内に
、成熟卵内へのデイゴテンインジエクション（Ｚｙｇｏ
ｔｅｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又は胚幹細胞の使用により
導入る、ことができる。

体幹細胞又は胚幹細胞及び場合により成熟卵内へのデイ
ゴテンインジエクションの使用下における本発明方法の
もう１つの重要な使用可能性は、従来未知の遺伝子の機
能を、動物モデルで検査できることにより開発される可
能性である。例えば特定の位置で突然変異された遺伝子
を有る、マウスの幹細胞を成熟卵内に注入し、こうして
得られるキメラ動物上への影響を研究る、ことができる
。もう１つの極めて重要な使用可能性は、本発明により
、変異された細胞を、動物例えばマウスの生殖系列へ導
入して、ヒトで確認される病気に関る、マウス−モデル
を得ることである。これにより、医薬品の作用をマウス
−モデルで研究る、可能性が得られ、この際、このマウ
スモデルは、ヒトでの使用に関る、多大の供述能力を有
る、。

未来にとっても、本発明方法は、改良され又は変えられ
た例えば抵抗を有る、植物を栽培る、可能性を提供る、
。この場合、原則的に、哺乳動物細胞におけると同じ方
法を使用る、ことができ、直ちにこのような植物細胞内
にマイクロインジェクションによりＤＮＡを有効に導入
し、相同組換えを行なう可能性を提供る、ことができる
。

要る、に、本発明方法により、今日まで予想外及び意想
外な方法で、生細胞内での目標位置で、かつ相同位置以
外での変化を可能になり、体遺伝子治療で、補修を実施
る、ことを可能になり、この際、まったく付加的な異種
−ＤＮＡ−配列は細胞内に導入されず、長期間の欠損を
恐れる必要はない。

［実施例］ 次の例で添付図面を用いて本発明を詳述る、第１図は、
Ｈｏｘｌ、ｌ−遺伝子の変更を示す系統図である。

第２図は、マイクロインジェクションされた３Ｔ３−　
（ａ）及びＤ３−細胞プール（ｂ）からのＰＣＲ−増幅
されたゲノムＤＮＡのサインー分析及びＰＣＲ−ストラ
テジ−（Ｐ　ＣＲ−３ｔｒａｔｅｇｉｅ）　　（ｃ　）
を示す図である。

第３図は、クローニングされた胚幹細胞（ａｂ、ｅ）か
らのＫｐｎｌ−消化されたゲノムＤＮＡのサインー分析
結果及び変異された及び正常の１個ｏｘｌ、１一対立遺
伝子並びに予想制限フラグメントを示す図である。

第４図は、２腹の遺伝子変更されたマウスの尾−バイオ
プシーからのＰＣＲ−増幅ＤＮＡのサインプロットを示
す図である。

例　　Ｉ Ｈｏｘｌ、１−遺伝子の突然変異生成 １１ｏｘ１．１−遺伝子のＦｓｐ　ｌのフラグメント［
スタートコドンから数えてヌクレオチド３６７〜１９３
７、（第１図参照）（＾、　Ｍ、　ＣｏｌｂｅｒｇＰｏ
ｌｅｙ等によるＮａｔｕｒｅ　３１４　（１９８５）　
、７１３〜７１２、Ｍ、Ｋｅｓｓｅｌ等によるＰｒｏｃ
、　ＮａｔＪ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４　（１９８７）　、５３
０６〜５３１０）］をブルースクリプト（ストラタ遺伝
子；　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内でクローニングし、２
０ｂｐオリゴヌクレオチドをホメオボックス（Ｈｏｓｏ
ｅｏｂｏｘ）のＥｃｏＲＩ−位置に挿入した。この挿入
オリゴヌクレオチドの配列は、＾＾Ｔ　ＴＧＴ　ＧＡＧ
ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＡＣであった。この第１図の
第２段に記載の構成を、マイクロインジェクションによ
り、Ｎ１１ｌ−３Ｔ３−細胞（２００〜６００細胞）の
核又はＤ３−細胞（Ｔ、Ｃ，Ｄｏｅ　Ｌｓｃｈｍａｎｎ
等によるＪ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　ｅｘｐ、　Ｍｏｒｐ
ｈ、　ｇユ（１９８５）２７〜４５）（５０〜２００細
胞）の核内に３００μｇ　／ｍｌの濃度（細胞１個当り
ＤＮＡ５分子に相当）で、ＩＱ−１１，／のインジェク
ション量でマイクロインジェクションした。細胞をマイ
クロインジェクション後４〜７日間生長させ、トリプシ
ン処理し、同じプレート上に改めて生長させた。この細
胞を再び４〜７日後に集めた。細胞の半分をＤＮＡ−分
析に使用し、残りを液体窒素中で保管した。ゲノムＤＮ
Ａもしくは対照プラスミド（１μ９もしくは１５１）９
）を、加熱安定化されたＴａｑ−ポリメラーゼ［５ａｉ
ｋｉ、Ｒ，Ｋ、等による５ｃｉｅｎｃｅ２３９．４８７
〜４９１　（１９８８）　、Ｌｅｔｓｏｎ、＾、及び１
．１ｓｋａｙ、　Ｒ，Ｉｆ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１
７、（１９８７）、７５９〜７６９］の使用下に、ジメ
チルスルホキシ１１０邦ト　リ　スーｌＩＣ１（ｐ＋Ｉ
８．８　）　　６　７　ｇ＋Ｌ　Ｎ１１４ＳＯ４１６，
６−Ｍ、　ＭｇＣｌ２６　、７　ｍＬ２−メルカプトエ
タノールｌＯ■Ｌ牛血清アルブミン（１個ｓＡ）１７０
１１９／　ｍｅ、　４種のデオキシリボヌクレオシド三
燐酸（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ
）各４５０μＭ及び２ブライマー０．５μＭを含有る、
反応混合物５０μｌ中で、３０　ＰＣＲ−サイクルにか
けた。第１のプライマーは、配列ＴＴＣＣＧＣＡＴＣＴ
ＣＡ　ＣＣＣＴＧＧ　ＡＴの合成オリゴヌクレオチドで
、あり、これは、１ｌｏｘ１．１−遺伝子の第１エクソ
ン（Ｅｘｏｎ）中の配列に対して特異的であり、Ｆｓｐ
ｌ切断位置の５′一部位に結合し、第２のプライマーは
前記の合成オリゴヌクレオチドと同じＤＮＡ−配列であ
った。試料をパラフィンで被い各サイクルで、１分間９
１．５℃に加熱してＤＮＡを変性し、１分間５５℃に冷
却してプライマーを付着させ、７０℃に６分間加熱して
ポリメラーゼを活性化させた。正常な１個ｏｘｌ、Ｉ一
対立遺伝子は、第２のプライマーに対る、結合位置を有
せず、マイクロインジェクトされたフラグメントは、第
１ブライマーに対る、結合位置を有しないので、本発明
によ変異された細胞中でのみポリメラーゼ一連鎖反応に
より、所望フラグメントを増幅る、ことができた。反応
混合物の少量針（１０μ０を１％アガロースゲル中での
電気泳動にかけ、遺伝子スクリーンプラス（Ｄｕｐｏｎ
ｔ）上に転移させ、５０％ホルムアミド、Ｉ　Ｍ　Ｍａ
ｃｌ及び１％ＳＤＳ中で、３２ｐでマルチプライム−キ
ット（ｉｌｕｌｔｉｐｒｉｍｅ−Ｋｉｔｓ　（＾ｍｅｒ
ｓｈａｍ））の使用下にｌＸ１０９ｃｐ■／Ｉｇの活性
まで標識し、５　Ｘ　１０５ｃｐｓ　／ｍｌで使用され
る交雑ゾンデを用いて試験した。フィルタを２ＸＳＳＣ
中、次いで２ＸＳＳＣ−１％ＳＤＳ中及び最後に０．１
ｘＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ：ＮａＣ１８，７６５ｑ／ｌ、ク
エン酸ナトリウム４．４１ｇ／／５ｐＨ７，０＞中で、
６５℃で洗浄した。第２図は、この乾燥されたフィルタ
のオートラジオグラムを示している（ａ部は２時間露出
後、ｂ部は５時間露出後）。ここで、第２図ａは、マイ
クロインジェクトされた３Ｔ３−プールからのＰＣＲ−
増幅されたゲノムＤＮＡのサインー分析（ｌ〜３の痕跡
）を示し、痕跡４中のプラスミドｐＨ１，１１０−ＢＦ
のそれは、対照を示す。このプラスミドは全Ｈｏｘ１．
１−遺伝子及び挿入されたオリゴヌクレオチドを含有る
、。この図面のｂ部にはマイクロインジェクトされたＤ
３−細胞プールからのＰＣＲ−増幅されたゲノムＤＮＡ
のサイン分析が示されている。

第２図ＣはプラスミドｐＨ１，１１０−ＢＦを図示して
いる。１Ｉｏｘ１．１−遺伝子の３．６４３塩基対長さ
の５−　Ｂａａ　ＨＩ　−Ｆｓｐｌ−フラグメント（翻
訳−スタートコドンに対してヌクレオチド−１，７１１
〜＋１．９３２）をブルースクリプト（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）中でクローニングし、中断オリゴヌクレオチド
をホメオボックス（ｔ（ｏｓｏｅ。

ｂｏｘ）のＥｃｏ　ＲＩ−位置内にクローニングした。

例　　２ 幹細胞の更なる研究 更に分析る、ため、例１からの胚幹（ＥＳ）−細胞Ｄ３
の２個の細胞プール（Ｇ、　Ｒ，Ｄｒｅｓｓｌｅｒ及び
Ｐ、Ｇｒｕｓｓ　、Ｔｒａｎｓ　Ｇｅｎｅｔ、　４．２
１４〜２１９　（１９８８）　、Ｔ、Ｃ，Ｄｏｅｔｓｃ
ｈａｎｎ等によるＪ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｍ
ｏｒｐｈ、　８ユ（１９８５）２７〜４５）を使用した
。これらのプールからの個々の細胞クローンを、ガラス
毛細管を用いる個々の細胞の吸収により（ｍ、＾、Ｒｕ
ｄｎｉｃｋｉ　＆　１個、Ｗ、１ｌｃＢｕｒｎｅｙｉｎ
　　Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｍｏｍａｓ　　ａｎｄ　　
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　　Ｓｔｅｍ　　Ｃｅ１ｉｓ　；　
ｅｄ、Ｅ、Ｊ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　１９〜４９　（
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、　Ｔｏｗｎ、１９８７））取り出
した。この細胞からます９５ウエルを有る、シャーレ中
、次いで直径１．５ｃｍの２４ウエルを有る、シャーレ
中で、かつ６ｃｍ組織培養シャーレ中での平板培養によ
りクローナルセルラインを製造した。これらのセルライ
ンの半分からＤＮＡを単離し、他の半分を液体窒素中で
保管した。全体のクローン化工程の間に、ＥＳ−細胞を
、培養液中のいわゆるフィーダ細胞上に保持した。この
ゲノムＤＮＡの少量性（１０ｐｇ）をＫｐｎｌで消化さ
せ、０．８％アガロースゲル中で電気泳動にかけ、遺ｔ
＝子スクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｉ
ＵＳ）転移させた。このフィルタを３２ｐでマークされ
たゾンデと、例えば例１に記載のようにハイブリット形
成させ、そこに記載と同様に洗浄した。挿入されたオリ
ゴヌクレオチドはＫｐｎｌ制限位置を有る、ので、第２
図ｄでの最初のエクソンに対して特異的なゾンデ（プロ
ーブ１）を用いるハイブリッド形成による正常の対立遺
伝子の１４ｋｂバンドに付加的な相同組換えクローン中
の新しい５　、４　ｋｂバンドの出現は予期されていた
。このバンドの出現は第２図ａの痕跡で示されている。

ＥＳ−細胞がサブクローニングの間に大きいコロニーを
形成る、のを阻止る、ので、ＥＳ−細胞−ＤＮＡはフィ
ーダー細胞ＤＮＡと混成されていた。従って、１４ｋｂ
１１ｏｘ１．１−フラグメントはＥＳ−細胞から野生型
一対立遺伝子を製造る、だけでなく、フィーダー細胞か
らの野生型一対立遺伝子をも生じる。合計して、プール
１からの１６１の個別クローン及び、プール７からの１
６５クローンがサインブロッティングにより分析された
。このサイン分析を確認し、評価る、ために、双方のプ
ールからのクローンをフィーダー細胞上に大きいＥＳ−
細胞コロニーが生じるまで培養したＥＳ−細胞−ＤＮＡ
の相対的な量は、第３図す及びＣから認められるように
、非常に高かった。プール１から誘導されたクローナル
ラインからのＫｐ■Ｉで消化されたＤＮＡのサインプロ
ットをプローブ１（第３図ｂ１行）及びプローブ２（第
３図す痕跡２）とハイブリッド形成させた。第３図Ｃに
は、プローブの詳細が示されている。５　、４　ｋｂ及
び８　、６　ｋｂバンドの相対的強度は、１４ｋｂフラ
グメントのそれと比較した５′及び３′−フラグメント
に相応しく第３図ｄ参照）、これにより、ＥＳ−細胞の
少なくとも５０％が変異された対立遺伝子を含有る、こ
とが明らかである。プール７からのクローナルラインの
ＤＮＡを５ｔｕＩ／ＫｐｎＩ　（第３図Ｃ痕跡２）及び
ＫｐｎＩ　（第３図Ｃ痕跡２）で消化し、サインプロッ
トを引続きプローブ３（第３図ｄ参照）とハイブリッド
形成させた、。生じる６００ｂｐ及び４．２７ｋｂフラ
グメント（第３図Ｃ１痕跡ｌ）は、変異された及び正常
な対立遺伝子から誘導されている（正確な記載に関して
は第３図参照）。変異された及び正常な対立遺伝子は、
５ｔｕｌｌＫｐｎｌ中及びＫｐｎＩ−消化バッチ中で同
量で表われており（第３図Ｃ１痕跡１及び２）、これに
より、ブール７からのＥＳ−細胞はクローナルであるこ
とが明らかになる。ブール１から引き出されたクローン
の種型分析は、細胞の７０％が染色体４０個を有る、こ
とを示していた。従って、このセルライン内の変異され
た対立遺伝子の僅かな存在が、変異されていないＥＳ−
細胞での混成に帰因し、染色体不安定性を暗示しないこ
とが解る。相同組換え対非正統的組換えの割合は１：３
０であることが見積もられた。

それというのも、マイクロインジェクトされた細胞の約
２０％は、核マイクロインジェクションにより安定に転
移されたからである（　ＥＲ，Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅ
１ｌ　２２、（１９８０）　、４７９〜４８８）。相同
組換えは、マイクロインジェクトされた細胞１５０個当
り１個で起こった。このことは、匹敵る、研究（Ｋ、　
Ｒ，Ｔｈｏｍａｓ等によるＮａｔｕｒｅ３１７　（１９
８５）　２３０〜２３４、Ｋ。

Ｒ，Ｔｈｏｍａｓ等１こよるＣｅ１１４４、（１９８６
）　、４１９〜４２８）に比べて予想外に高い。

例　　３ 例１で得られた胚幹細胞系（これは、第３図ａ、ｂ、腹
１：第４図の痕跡１〜４に、腹２：第４図の痕跡５〜７
に示されている）をＣ５７ＢＬＩ／マウスの胚盤胞内に
導入し、４キメラ動物の全数を有る、２腹（ｔｕｒｆ）
を得た。これらキメラ動物が変異対立遺伝子を有る、こ
とを確認る、ために、動物の尾からバイオプシー（８ｉ
ｏｐｓｉｅ）を取り出し、このバイオプシーのゲノムＤ
ＤＮＡ１００ｎを例１の記載と同様に３０ＰＣＲ−サイ
クルにかけた。

第４図の痕跡２．５．６及び７は、変異された対立遺伝
子が示す１　、１　ｋｂフラグメントの増幅を示してい
る（第１図及び第２図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｂｏｘ　１．１−遺伝子の変更を示す図であ
り、第２図は、マイクロインジェクトされた３Ｔ３−　
（ａ）及びＤ３−細胞ブール（ｂ）からのＰＣＲ−増幅
ゲノムＤＮＡのサイン分析結果及びＰＣＲ−ストラテジ
ーを示す図であり、第３図は、クローンニングされた胚
幹細胞（ａ　Ｓｂ　Ｎ　Ｃ）からのＫｐｎＩ−消化され
たゲノムＤＮＡのサイン分析結果及び変異された正常＋
１ｏｘ１．１一対立遺伝子並びに予想制限フラグメント
を示す図であり、第４図は、２１１１の遺伝子女史され
たマウスの尾バイオプシーからのＰＣＲ増幅ＤＮＡのサ
インプロットの結果を示す図である。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ７’ｏ−プ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、相同組換えにより無傷哺乳動物細胞のゲノム内の遺
   伝子を目標に向って変える方法において、変えるべき遺
   伝子に対して相同であるが少なくとも１個のヌクレオチ
   ド内で突然変異、欠損又は挿入によりその配列からはず
   れているＤＮＡ−配列を、マイクロインジェクションに
   より相応する細胞内に導入し、起った変化が検出できる
   細胞を得ることを特徴とする、遺伝子を目標に向って変
   える方法。 ２、哺乳動物細胞として体幹細胞を使用する、請求項１
   記載の方法。 ３、起った変化の立証のためにＰＣＲ−反応を実施する
   、請求項１又は２に記載の方法。４、変えるべき遺伝子
   は、病気症状を惹起する遺伝子であり、健康な遺伝子に
   相応するＤＮＡ−配列を使用する、請求項１から３まで
   のいずれか１項記載の方法。