JPH03179263A - タンパク質結合酵素の相補性アッセイのための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技査公立 本発明の技術分野は、酵素イムノアッセイである。

１−２匙 従来技術は、Ｙａｌｏ−及びＢｅｒｓｏｎ（１９６０，
Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　３９　：　１１５７）によるラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）の進歩に基づく多くのイムノ
アッセイを教授する。ＲＩＡは、固定量の特定の抗体の
ために固定量の放射性ラベルされた分析物と未知量のラ
ベルされていない分析物とを競争することを特徴とする
。抗体に結合されるか又は溶液に開放される放射性分析
物の量が適切なカウンターで定量化され、そして非放射
性分析物の濃度が決定される。この−船釣なスケムにお
ける改良点は、（１）酵素又は螢光トレーサーによる放
射性トレーサーの交換、（２）モノクローナル抗体によ
る動物のポリクローナル抗体の置換、（３）分光光度計
、螢光計、螢光偏光子及び粒子カウンターを含むシグナ
ル検出の改良された方法、及び（４）結合されたトレー
サーと遊離トレーサーとの物理的な分離を必要としない
均質アッセイの導入を包含している。結合されたトレー
サーと遊離トレーサーとの分離は、時々、固体支持体、
たとえばプラスチツク、紙、ガラス又はアクリルアミド
を必要とする。従来、抗体は固相に結合され、そしてト
レーサー及び未知のものは溶液中にフリーである。結合
／遊離分離法は、固相の１又は複数回の洗浄により達成
される。次に、残留する結合活性が測定される。これら
のアッセイは、不均質イムノアッセイとして集合的に知
られている。対照的に、均質アッセイは、不正確で且つ
浪費の分離段階の必要性を伴なわない。

イムノアッセイの商品化は、ラジオイムノアッセイから
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）　、
すなわち均質アッセイへの使用法の移行が見られる。こ
の移行は、速度、簡単さ、自動化及び放射能の不在の商
業的な要求によるものである。均質アッセイは、いくつ
かのタイプ：　（１）非濁法、（２）粒子計数法、（３
）螢光消光法、（４）螢光偏光法及び（５）酵素アッセ
イから成る。

免疫反応を定量化するために光の分散を測定する最初の
比濁計は、１９６０年代の後期に発明された。

これらの初期の比濁計は、新しい化学、すなわち分散角
度を測定するための低角度及び反応体を混合した後、初
めの数秒間、抗原−抗体反応の速度を測定する能力によ
り１０年後、改良された（Ｒｉｔｃｈｔｅ。

Ａｌｐｅｒ及びＧｒａｖｅｓ　１９６Ｌ　Ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、１２　：６９３　；　Ｄｅａｔｏ
ｎなど、、１９７６、　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅａ＋、２２　
：　１４６５）　。

これらのアッセイは、ひじょうに良好でない感度のもの
であり、モして１０−＠Ｍ以上の濃度で、たとえば血清
１ｇＥ、　ＩｇＡ及び１ｇＭレベルでの分析物の決定に
適用できる。均質粒子計数アッセイにおいては、直径０
．８−のポリスチレン粒子（ラテックス粒子）が、抗体
により被覆される。抗原濃度は、凝集されなかった粒子
と凝集された粒子とを区別することができる装置により
決定されるように、凝集されたラテックス粒子の濃度に
より決定され得る（ｃａｍｂｉａｓｏなと、＋　１９７
７、　Ｊ、ｉｎ＋ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ。

１８　：　３３）。均質螢光消光アッセイは、螢光間に
より抗原又は抗体のいづれかをラベルする。分析物−抗
体一螢光団複合体は、抗原−螢光間又は抗体−螢光間の
みに比べて、有意に少ない螢光を生成する　（ＵＩＩｓ
＋ａｎなど、、　１９７９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、２５１　：４１７２　、　［１，Ｓ、特許第３．９９
８．９４３号；第３，９９６．３４５号；第４，１７４
．３８４号；第４．１６１，５１５号；第４．２０８，
４７９号及び第４，１６０．０１６号）。これらのすべ
てのアッセイは、消光の量がサンプル中の未知の分析物
又は抗体の量に関係するような種々の螢光消光方法を包
含する。これらのアッセイは低い感度のものである（１
０−１０Ｍ以上の流体濃度での分析物）。

この低い感度は、内在性血清螢光及び非酵素的に増強さ
れた静的態様での螢光の使用による。螢光偏光アッセイ
は、抗原−螢光間に結合する抗体により有意に減じられ
る溶液中の抗原−螢光間の自由回転に基づかれており、
そして低分子量（１０００ドルトン以下の分子量）の分
析物に関して相当に商業的な好結果をもたらすことが見
出された（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒなど＋ｌ　１９７３＋　
Ｉｎｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０　：２１９）。

種々のイムノアッセイ方法は、それぞれ、商業的な欠点
及び利点を有する。ＲＩＡは感度が高く、そして容易に
組立てられ得るが、しかし放射能、分離段階及び高価な
装置を必要とする。酵素又は螢光間による不均質アッセ
イは放射能及びある装置を排除するが、しかし分離段階
を必要とする。

商業的な観点から、いくつかの理由のために分離段階を
排除することが所望される。分離は、（１）集中的な労
働であり、（２）時間がかかり、（３）追加の装置を要
し、（４）結果的に変動性を高め、そして（５）高レベ
ルの自動化を排除する。均質イムノアッセイの多くの商
業的な利点にもかかわらず、たった３種のシステム、す
なわちＲａｂｅｎｓｔｅｉｎなど、、　Ｕ、Ｓ、特許第
３．８１７．８３７号の酵素−ラベルシステム、Ｂｕｒ
ｄなど−，，１９７７、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｓ、２３　；
１４０２の基質−ラベルシステム及び螢光偏光法（Ｄａ
ｎｄｌｉｋｅｒなど＋ｌ　１９７３＋　Ｉｖａｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）が、商業的に底切しているように思
える。今なお、これらの３種のアッセイシステムは、低
（１０００以下）分子量の分析物及び１０−１０Ｍ以上
の濃度で見出される分析物に対して制限される。

掴」し幼駄 酵素イムノアッセイは、ひじょうに良好なタイプの均質
イムノアッセイである。均質酵素イムノアッセイのいく
つかの変法、すなわち（１）酵素によりラベルされた分
析物システム；及び（２）基質によりラベルされた分析
物システムが商業的に成功しているように思える。酵素
ラベルシステムにおいては、ラベルの酵素活性は、特異
的抗体が分析物−酵素複合体を結合する場合、低められ
る。測定されるべき分析物は、固定量の分析物のために
固定量の特異的抗体と競争する。酵素活性は、未知の分
析物濃度を直接比例する。次の特許が、このイムノアッ
セイシステムに基づいて発行された：アメリカ特許第３
．８１７．８３７号；第３，８５２．１５７号；第３．
８７５，０１１号；第３，９６６．５５６号；第３，９
０５，８７１号；第４．０６５，３５４号；第４．０４
３．８７２号；第４．０４０．９０７号；第４，０３９
，３８５号；第４，０４６，６３６号；第４，０６７．
７７４号；第４．１９１，６１３号及び第４．１７１．
２４４号。この技術の商業化は、低分子量の分析物及び
低感度に対して制限される（１０００ドルトン以下の分
子量の分析物、１０−　”　Ｍ以上の濃度での分析物）
。

基質ラベル螢光イムノアッセイは、酵素のための螢光間
基質への分析物の共有結合を包含する。

この分析物−基質接合体は螢光性でない。抗体の不在下
で、分析物−螢光間基質は酵素により加水分解され、螢
光分子種を生成する。特異的抗体の存在下で、酵素によ
る基質への接近が縮小され、低められた螢光を発する（
Ｂｕｒｄなと、、　１９７７、　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、２３　：　１４０２　；　Ｂｕｒｄなど、、
　ＡｎａＬ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７７　：５６；及びＫｏ
ｈｅｎ、　Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ及びＢｏｇｎｓｌａｓｋ
ｉ＋　１９７９＋Ｊ、５ｔｅｒｉｏｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、１１　：　１６１）。このアッセイシステムの商業化
は、立体的な考慮のために低分子量の分析物及び上記螢
光消光アッセイに関する考慮に類似する考慮のために流
体における１０−”Ｍ以上の濃度での分析物に対して制
限されて来た。

制限された商業化に直面して来た多くの均質酵素イムノ
アッセイがこれまで記載されて来た。

アメリカ特許第４，１３４．７９２号は、ラベルとして
酵素モジュレーター、たとえば酵素インヒビタースはア
ロステリックエフェクターを使用するイムノアッセイ技
法を記載する。特異的抗体が酵素モジュレータ−により
ラベルされた分析物に結合する場合、その酵素モジュレ
ータ−は、もはや酵素の活性を阻害することはできない
。従って、酵素モジュレータ−によりラベルされた分析
物とフリー分析物との競争は、酵素モジュレータ−の阻
害を回復せしめる。この分野における他の特許は、アメ
リカ特許第３．９３５．０７４号；第４．１３０．４６
２号；第４，１６０，６４５号及び第４．９１３，９８
３号を包含する。

アメリカ特許第４．２１３，８９３号及び第４，３１８
．９８３号は、補因子−アポ酵素システムを使用する酵
素イムノアッセイを記載する。特に、Ｈｏｒｎｂｙなど
により１９８２年３月９日に発行されたアメリカ特許第
４．３１８．９８３号は、フラビンアデニンジヌクレオ
チド（ＦＡＤ）によりラベルされた接合体及びＦＡＤが
補欠分子族として作用するアポ酵素を用いる方法を記載
する。　　Ｃａｒｒｉｃｏなどにより１９８０年７月２
２日に発行されたアメリカ特許第４，２１３，８９３号
は、）１ｏｒｎｂｙなとの方法に使用するために適切で
ある特異的なＦＡＤラベル接合体、たとえばＦＡＤ−ラ
ベルチロキシンを記載する。ＦＡＤによりラベルされた
接合体は、触媒活性のためにＦＡＤを必要とするアポ酵
素と共にそのような接合体をインキヱベーシゴンするこ
とにより生成されるハロ酵素活性を測定することによっ
てモニターされる。分析物は、ラベルされた補因子がデ
ヒドロゲナーゼ酵素とのその反応性を保持するようにＦ
ＡＤに共有結合される。デヒドロゲナーゼ活性により形
成された還元されたＦＡＤの量は、分析物に対して特異
的な抗体の存在下で低められる。還元されたＦＡＤの螢
光分析的にモニターされた外観は、分析物の量に直接比
例する（（：ｏｈｅｎなと、１９７Ｂ　。

Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ　ｆｏｒ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄＤｒｕｇｓ、　
Ｓ、Ｎ、Ｐａｌ、　ｅｄ、＋　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅＧｕ
ｉｔｅｒ＋　Ｂｅｒｌｉｎ及びＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、　６
７〜７９ページ）。乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラ
ーゼを用いるビオチン及び２４−ジニトロフルオロベン
ゼン分析物のための類似するシステムが記載されている
（ｃａｒｒｉｃｏなど。

１９７６、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、７３　：　
２７１）、両システムは、分析されるべき血清サンプル
中に共通する内因性補因子及び酵素から妨害される。

いくつかの酵素は、ペプチドフラグメントから再形成す
ることが観察されているが、しかしある酵素は、たとえ
ばりボヌクレアーゼＡ　（Ｒｉｃｈａｒｄｓ及びＶｉｔ
ｈｏｙａｔｈｉｌ、　１９５９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２３４　：　１４５９）、スタフィロコーカル（
Ｓ　ｔａｐｈ　１ｏｃｏｃｃａ　ｌ）のヌクレアーゼ（
Ｌｉｇｈｔなと、、　１９７４．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２４９　：　２２８５）、及びβ−ガラクトシダ
ーゼ（ＬａｎｇｌｅＶ及びＺａｂｉｎ。

１９７６、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　：　４
８６６）を含む酵素活性を回復することが観察された。

ズブチリシンによるウシ膵臓のりポヌクレアーゼのタン
パク質加水分解は、２種の成分、すなわちペプチド（Ｓ
−ペプチド）及びタンパク質（Ｓ−タンパク質）を生成
する。Ｓ−ペプチド又はＳ−タンパク質のいづれも単独
で、適切なりボヌクレアーゼ活性を示さない。これらの
成分がモル当量で混合される場合、はとんど十分な酵素
活性が回復される。Ｓ−ペプチド及びＳ−タンパク質は
、ひじょうにすばやく且つ強く再会合し、そしてＫ　ｅ
　ｑ　＝　５　Ｘｌ０−９Ｍを伴う（Ｒｉｃｈａｒｄｓ
及びＶｉｔｈａｙａｔｈｉｌ、　１９５９　、前記）。

スタフィロコーカスのヌクレアーゼは、不活性なペプチ
ドフラグメントから生物学的に活性な酵素の再構成を示
す。完全な１４９個のアミノ酸のスタフィロコーカスヌ
クレアーゼ構造体のアミノ酸６〜４８を含むヌクレアー
ゼ−Ｔ（６〜４８）は、少々の温度変動性を伴って０．
０３〜０．０５／秒の一次速度定数を有する活性ヌクレ
アーゼ−Ｔｌを形成するためにヌクレアーゼ−Ｔ　（５
０〜１４９）と再会合する（Ｌｉｇｈｔ、前記）。ひじ
ょうに詳細に論ぜられたように、旦、互」の欠失突然変
異体からのポリペプチドフラグメント（たとえばＭ２Ｓ
）は、熱又は臭化シアン処理されたβ−ガラクトシダー
ゼ酵素に由来する小さなペプチドフラグメントと組合さ
れる場合、酵素活性を再回復するフラグメントであるこ
とが知られている。１つの臭化シアンにより生成された
フラグメントは、ＣＮＢｒ２と呼ばれ；他はＣＮＢｒ２
４と呼ばれる。

つい最近、そのようなペプチドフラグメントの再会合に
基づくイムノアッセイが、Ｆａｒｉｎａ及びＧｏｌｋｅ
（１９８３年３月２９日に発行されたアメリカ特許第４
，３７８，４２８号）及びＧｏｎｅｌｌｉなど、、（１
９８１゜Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１０２　：　　９１７〜９２３）
により記載された。この中に開示されるすべての実験例
は、リボヌクレアーゼ触媒活性を生成するためにＳ−ペ
プチド／Ｓ−タンパク質の再会合に基づかれた。分析物
は、リボヌクレアーゼの小さなズブチリシン切断ペプチ
ド、すなわちＳ−ペプチド（アミノ酸１〜２０）に共有
結合された。

これは分析物に結合され、そして活性リボヌクレアーゼ
を再形成するためにＳ−タンパク質（アミノ酸２１〜１
２４）と組合された。分析物に対して特異的な抗体は、
リボヌクレアーゼ活性の再形成を阻害する。このアッセ
イは、すべてのオートクレーブされていない生物学的溶
液において内在性リボヌクレアーゼ活性により制限され
る。

このシステムにより決して論ぜられていない他の同等に
重大な欠点は、会合ポリペプチドの平衡定数の調整の不
能性及び高分子量タンパク質に結合することができ、そ
してさらに活性酵素を再形成することができる免疫反応
性ポリペプチドの構成不能性を包含する。使用されるす
べてのポリペプチドは、活性リボヌクレアーゼを形成す
るために再会合することができる新規でない触媒的に不
活性なペプチドであった。

分析物をＣＮＢｒ２又はＭ２Ｓに結合するためのＦａｒ
ｉｎａ及びＧｌｋｅ　（アメリカ特許第４．３７８，４
２８号）により提案された化学に関するより重大な欠点
が発見された。ポリペプチドのいづれか上の利用できる
Ｎｌ２．　Ｃ０ＯＨ及びＳｌｆ基を通しての分析物の結
合は、相補性でないポリペプチドを、試験されたすべて
の場合において生成した。多くのアミノ酸、カルボン酸
及びスルヒドリル官能基を有する共役Ｍ１５は、注意し
て調整された条件下でさえ、すべての場合においてＭ２
Ｓを活性化した。運動学は、活性を不活性化するために
十分である１つの適評を示す。ＣＮＢｒ２は、内部リシ
ン、単一のスルフヒドリル基及びいくつかのカルボン酸
基を含まない。

Ｌａｎｇｌｅｙ（Ｐｈ、Ｄ、単位論文、標題”Ｔｈｅ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＮａｔｕｒｅ　ｏｆ　β−ｇａｌａ
ｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｃｒ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎＵＣＬＡ、　１９７５）に同意すれば、Ｎ−末端
のα−アミノ基への共役は、ＣＮＢｒ２の相補性活性を
不活性化する。ＣＮＢｒ２の調製においては（Ｌａｎｇ
ｌｅｙ、　Ｆｏｗｌｅｒ及びＺａｂｉｎ、　１９７５．
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５０　：　２５８７）　
、位置７６でのスルフヒドリルが還元され、そして臭化
シアン切断の前、ヨード酢酸によりアルキル化される。

スルフヒドリルがアルキル化されない場合、ＣＮＢｒ２
活性は、精製の初期段階において保持され得るが、しか
し均質化への精製の前、失なわれる。

また、スルフヒドリルがヨード酢酸の代わりに分析物の
マレイミド誘導体によりアルキル化される場合、接合体
の不溶性が精製を妨げる。最後に、試験されたすべての
場合において、ＣＮＢｒ２のＣ００Ｉ＋戒分への共役は
、相補性活性を不活性化した。従って、適切な免疫反応
性で且つ相補性の試薬を調製するためにＣＮＢｒ２及び
Ｍ２Ｓを使用するのは難かしいように思える。

β−ガラクトシダーゼに由来する突然変異体ポリペプチ
ドは、適切なβ−ガラクトシダーゼ陰性突然変異体の抽
出物に添加される場合、酵素活性を補足し、又は自発的
に修復することができるポリペプチドであることが知ら
れている。この現象は、シストロン内相補性として知ら
れている。α−相補性の例は、ＭＩ５／ＣＮＢｒ２相補
性システムにより供給される。Ｍ１５突然変異体ポリペ
プチドは、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸１１〜４１
を欠き、そして酵素的に不活性なダイマーとして溶液中
に存在する。臭化シアン（ｃＮＢｒ）切断によりβ−ガ
ラクトシダーゼに由来するポリペプチド、すなわちＣＮ
Ｂｒ２ペプチド（ｃＮＢｒ２）　は、アくノ酸３〜９２
から成る。ダイマーＭ１５と共に混合される場合、ＣＮ
Ｂｒ２は、十分な酵素活性を有するβ−ガラクトシダー
ゼテトラマーの自発的な再構成を促進する（Ｌａｎｇｌ
ｅｙ及びＺａｂｉｎ、　１９７６、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　１５　：　４８６６）。

Ｍ１５ペプチドはα−受容体として知られており、そし
てＣＮＢｒ２はα−供与体として知られている。

これは十分に研究された相補性システムを表わすと同時
に、ＣＮＢｒ２４、β−ガラクトシダーゼ内のアミノ酸
２３〜３１を欠失するＭ１１２ダイマーのためのα−供
与体として作用することができる（Ｌｔｎ＋Ｖｉｌｌａ
ｒｅｊｏ及びＺａｂｉｎ、　１９７（Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
＋ｗ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｏｎ、４０　：　２４９　；　Ｃｅ１
ｅｄａ及びＺａｂｉｎ、　１９７９゜Ｂｉｏｃｈｅ＋＋
＋、　１８　：　４０４　；　Ｗｅｌｐｈｙ、　Ｆｏｉ
ｙｌｅｒ及びＺａｂｉｎ＋１９８１、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、２５６　：　６８０４　；　Ｌａｎｇｌｅｙ
など、。

１９７５、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ　７２　：　１２５４）　、他のα−供与体は、
β−ガラクトシダーゼをオートクレーブすることにより
由来するポリペプチドを含む。しかしながら、このペプ
チドは精製されておらず、そしてその配列は未知である
。Ｍ２Ｓ及びＭ１１２以外のα−受容体は記載されてい
ない。ＣＮＢｒ２によるＭ２Ｓの相補性の例においては
、アミノ酸配列３〜ＩＯ及び４２〜９６の両者が、酵素
的に活性な複合体において重複して存在する。

シストロン内相補性はまた、β−ガラクトシダーゼのＣ
−末端（ω−領領域で存在する。利用できる最とも知ら
れている配列データは、最後の１０個のアミノ酸１０１
１〜１０２１を欠失するＸ９０ω−受容体ペプチドのた
めのものである。Ｘ９０ペプチドはモノマーとして存在
し、そして酵素的に活性なテトラマーを再形成するため
に、ＣＮＢｒ２４、すなわちβ−７４ノ酸９９０〜１０
２３の臭化シアン消化生底物により補なわれ得る（Ｗｅ
ｌｐｈｙなど、、　１９８０゜Ｂｉｏｐｈｙ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｏｎ、９３　：　２２３）。

Ｂｉｏｃｈｅｓ。

先」Ｒど４組 本発明は、リガンド及び受容体のための新規アッセイ及
びそのアッセイで使用するための組成物を提供し、ここ
で前記組成物は、酵素相補性フラグメントを含んで成り
、このフラグメントの１つは特異的結合対のメンバーに
接合され、ここで分析物は前記特異的結合対の接合され
たメンバーと交差反応し、又はそのような接合されたメ
ンバーに対して相補性である。試薬は適切なアッセイ媒
体においてサンプルと共に混合され、そして酵素生成物
の形成の速度が媒体中における分析物の存在の指示とし
て決定される。特異的結合対メンバーに結合するための
官能基を有するアミノ酸の存在を提供する合成配列が特
に興味の対象である。

笠淀セ４０１帽廷較 本発明によれば、診断アッセイ及びその診断アッセイに
使用するための試薬が提供される。試薬は、複合体化さ
れる場合、活性β−ガラクトシダーゼ酵素を供給する２
種の相補性フラグメントを含んで成る。また、突然変異
を受けたフラグメントをコードする核酸配列、対象のエ
ピトープを定義するアミノ酸配列を含む融合タンパク質
を含む突然変異化されたフラグメントの調製方法及びそ
のような生成物の発現方法が提供される。

β−ガラクトシダーゼは、約５４０ＫＤの分子量を有す
る四量体タンパク質である。４個の同一のサブユニット
又はモノマーが１０２３個のアミノ酸から成り、個々の
サブユニットは１１６ＫＤの分子量を有する。モノマー
は、２種の部分、すなわちＮ−末端の約７０〜１００個
のアミノ酸からのα一部分及びα一部分と一部オーバー
ラップすることができる分子の残る部分に分けられ得る
。これらの種の分子は、活性酵素である複合体を形成す
るために補足するために使用され得る。本発明の目的の
ためには、α−領域又はＮ−末端部分は、酵素供与体（
ＥＤ）として言及され、そして残る部分は酵素受容体（
ＥＡ）として言及される。酵素供与体は通常小さなフラ
グメントである。但し、それが融合タンパク質として作
用する場合を除く。酵素受容体は通常大きなタンパク質
であろう。大部分、ＥＤが接合の部位であろう（但し、
いづれのフラグメントでも接合の部位であることができ
るけれども）。

舅１叩１１供 β−ガラクトシダーゼの天然の配列は、挿入、欠失、置
換及びそれらの組合せにより変えられ得る。大部分、１
つの置換が行なわれるであろうが、しかし約３以下の置
換、通常約２以下の置換が行なわれるであろう。大部分
、置換は、１つのアミノ酸を、その部位での接合を可能
にする官能基、たとえばスルフヒドリル、アミノ、ヒド
ロキシル又はカルボキシル基を有する異なったアミノ酸
とを置換することを含むであろう。好ましくは、置換は
システィン又はリシンに対して存在するであろう。言及
されるであろう塩基配列は、次の通りである： ６ 文字の下の数字は、野生型のβ−ガラクトシダーゼの番
号を示す。＊印は、Ｃ（システィン）又はＫ（リシン）
によるアミノ酸の置換を示す。

置換のための好ましい領域は、アミノ酸１〜アミノ酸３
０；アミノ酸３５〜アミノ酸４５；アミノ酸６０〜アミ
ノ酸８９の領域を含む。複数の置換が行なわれる場合、
少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約
１０個のアミノ酸及びより好ましくは約２０〜６０個の
アミノ酸により分離される置換が好ましい。置換のため
の特定の部位は接合体の性質に相当な程度依存するであ
ろうが、好ましくはアミノ酸４８〜６１の領域は、置換
のために使用されない、従って、一方の部位は、他方の
接合体に比べて、一方の接合体を調製する場合、他方の
部位よりも好ましい。

特に興味ある部位は、アミノ酸１　、３．２３，３９゜
４２　、４５　、４６　、６１及び６８を含み、ここで
領域１〜５及び４０〜４７、特に４６が複数の置換のた
めの部位である。欠失のための領域は、アミノ酸１〜２
０、特に５〜２０又はそれらのいづれかの配列を包含す
る。

接合部位以外の置換のための興味ある領域は、約７０〜
８５、特に約７２〜８０、より特定には７４〜７７の領
域を包含し、ここで多数又は少数のアミノ酸が導入され
、そしてそれらの置換は保存的であり、又は非保存的で
もあり得る。保存によっては、同じ又は実質的に同じ電
荷タイプ及び−船釣なコンホーメーションを有すること
が意図され、たとえば天然のアミノ酸は他の天然のアミ
ノ酸と、芳香族アミノ酸は他の芳香族アミノ酸と、荷電
されたアミノ酸は同じ電荷タイプの他の荷電されたアミ
ノ酸と及び同様にして置換され得る。さらに、親水性領
域に比べて疎水性領域を保持する保存的な変化を考慮す
ることができ、ここで非保存性は疎水性〜疎水性の領域
の性質を変えるために存在し、又は逆もまた同様である
。

多くの数の結合基が、広範囲の種類の特異的結合対メン
バーをＥＤに存在する官能基に結合するために使用され
得る。すでに指摘したように、大部分、結合のためにＥ
Ｄ上に存在する官能基はメルカプタン又はアミノ基であ
ろう。メルカプタンに関しては、広範囲の種類の容易に
利用できる試薬、たとえば活性化されたハロゲン、活性
化されたオレフィン又はメルカプト（ここで初めの２つ
の形はチオエーテルであり、そして最後の形はジスルフ
ィドである）が特に興味の対象である。特異的化合物は
、Ｎ−マレイミド安息香酸、α−ブロモアセトアミドシ
クロヘキサン−カルボン酸、Ｎ−マレイミド琥珀酸、メ
チルジチオ酢酸、等を包含する。７５ノ基に関しては、
広範囲の種類の活性ハロゲン又はカルボン酸基が使用さ
れ、特にカルボン酸基が使用され、ここでそのカルボン
酸基は、カルボジイミド、活性エステル、たとえばＮ−
ヒドロキシスクシンイごド、０−ニトロフェノール、Ｐ
−ニトロフェノール、等により活性化され得る。接合の
ための方法は、文献において良く知られており、そして
アメリカ特許第３，８１７，８３７号；第４．２６２．
０８９号；第４．２３３，４０１号：第４．２２０，７
２２号及び第４．３７４，９２５号に包含される。

結合基は、単に、たとえばリガンドがＥＤのアミノ基と
反応するために活性化され得るカルボン酸基を有する結
合であることができ、又は水素以外の１又は複数の原子
、通常約１〜２４個の原子、より普通には約１〜１２個
の原子のものであり得る。

炭素原子の他に、鎖中の原子は窒素、硫黄、酸素又は同
様の原子を含むことができる。

化学反応を通しての接合の他に、対象のペプチドと免疫
学的に交差するアミノ酸配列に連結されるＥＤをコード
する核酸配列を調製することによって融合されたタンパ
ク質を供給することができる。ＥＤと対象のエピトープ
（該エピトープはＥＤのＮ−又はＣ−末端、好ましくは
Ｎ−末端で存在する）との融合タンパク質を供給するデ
オキシヌクレオチドの適切な鎖を合成することができる
。

その融合タンパク質は、いづれの大きさのものでもあり
得、普通、約５００個よりも多くないアミノ酸のもので
あり、より普通には約２００個よりも多くないアミノ酸
のものであり、そして好ましくは約１５０個よりも多く
ないアミノ酸のものであり得、そしてＥＤ配列を含む。

園」しし左、倦 酵素受容体は天然に存在し又は合成のものであり得る。

合成とは、所望するアミノ酸配列を供給するために組換
えＤＮＡ技法の使用を意図する。

大部分、Ｍ２Ｓの配列は、酵素受容体（ＥＡ）のための
塩基配列として使用されるであろう。その配列に存在す
る利用できるスルフヒドリル基の数の低下は特に興味の
対象である。ＥＡ　Ｍ２Ｓは、その表面上で利用できる
５個のシスティン残基を有するように思える。いくつか
のＥＡは、システィンの置換、特に保存的置換の結果と
して５個よりも少ないシスティン残基、たとえばＧ、Ａ
、Ｍ、Ｓ。

Ｔ１等を有することができる。

分捉塵 分析物は、相補的対メンバーが他の対メンバーに対して
高い親和性を有するリガンド及び受容体を、通常少なく
とも約１０−’１モル含んで成る特異的結合対のいづれ
かのメンバーであり得る。リガンドは、少なくとも約１
２５０　（ドルトン）及び通常それ以上、より普通には
少なくとも約１５０Ｄのものであり、そして５００．０
０００又はそれ以上でもあり得る。大体、リガンドは、
２００ＫＤ以下、より普通には１００ＫＤ以下であろう
。多くの場合、リガンドが高分子量、すなわち５０ＫＤ
以上のものである場合、免疫学的にそのリガンドと交差
反応するりガンドのフラグメントが接合体に使用され得
る。

多数のりガントがアメリカ特許第３．９９６．３４５号
に列挙されており、そしてこの対応する開示を本明細書
に引用により組込む。大部分、リガンドは薬物、薬物代
謝物、生物学的に活性な分子、たとえばステロイド、ビ
タミン、タンパク質、受容体、リンフ才力イン増殖因子
、等、産業汚染物、殺虫剤及びそれらの代謝物、除草剤
及びそれらの代謝物、調味料、食物性の毒、病原体の成
分、毒素及びいづれか他の興味ある物質であろう。

受容体分析物は、リガンドが結合する割れ目又は表面の
くぼみを通常有する、任意に受容体として選択されるい
づれかのタンパク質、核酸又はサツカリドであり得る。

大部分、受容体は、免疫グロブリン、表面膜タンパク質
（Ｔ−細胞受容体を含む）、ＭＭＣ抗原、血液タンパク
質、たとえばチロキシン結合グロブリン、リポタンパク
質、等、酵素、アビジン及び同様のものである。

従って、相補的結合メンバーが見出され又は調製され得
るためのいづれかの化合物が、本発明のアッセイにより
決定され得る。分析物は単一化合物である必要はないが
、しかし化合物の凝集が、微生物、たとえばウィルス及
び細菌、膜フラグメント又は分子の他の凝集体又は複合
体構成体に見出され得る。

割１しｆ太 本発明のポリペプチド配列は、いづれか便利な手段によ
り調製され得る。従って、その配列は、市販の合成機に
より台底され得る。しかしながら、配列が約５０個以上
のアミノ酸である場合、合成の効率は低下し、その結果
、他の方法がより魅力のあるものになる。他の方法の１
つは、組換え技法の使用であり、ここで対象の配列又は
それに相補的な配列の部分をコードする一本鎖のデオキ
シリボヌクレオチド配列が調製され得る。その鎖は大部
分、オーバーラツプし、その結果、ハイブリダイズされ
、そして連結される場合、その得られた二本鎖ＤＮＡ配
列は、所望するアミノ酸配列をコードする。次に、その
配列が、いづれか便利な発現ベクター中に挿入され得る
。多数の発現ベクターが、商業的に入手され得、又は文
献に記載されている。大部分、原核宿主が使用されるで
あろうが、ある場合、特に融合タンパク質が存在し、そ
してその融合タンパク質の処理が所望される場合、真核
宿主が所望される。ベクターは、発現カセットを供給す
るために通常、コード配列の５′側に転写の方向に転写
開始調ｗＭ域又はプロモーター及びコード配列の３′側
に転写の方向に転写及び翻訳終結調ｉｆｆ　ＳＲ域を含
むであろう。特に、原核生物中への形質転換のためには
、宿主において機能し、そしてベクターの安定した維持
を提供する複製システムが存在するであろう。広範囲の
種類の複製システムが同定されており、モして真核生物
及び原核生物に使用されて来た。また、ベクターにより
形質転換されたこれらの宿主細胞の選択のためのマーカ
ーも通常存在するであろう。多くの場合、マーカーは、
毒素、たとえば抗生物質に対して耐性であり、又は原栄
養性を付与するために栄養要求宿主の相補性を提供する
であろう。

形質転換は、ウィルスベクターを用いてのトランスフェ
クション、プロトプラスト融合、カルシウム沈殿ＤＮＡ
を用いての形質転換又は他の便利な技法により達成され
得る。形質転換の方法は従来通りであり、そしてＭａｎ
ｉａｔｉｓなど、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｙ　
：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ
ｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、　Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１
９Ｂ２に見出され得る。

所望により、その配列は、宿主からのポリペプチド生成
物の分泌のためのシグナル配列を含むことができる。広
範囲の種類のシグナル配列が、特に真核生物のために利
用できる。シグナル配列が使用されない場合、所望する
ポリペプチドを抽出するために細胞を溶解する必要があ
る。

形質転換された宿主細胞は、所望するポリペプチドが形
成されるように十分な時間、適切な培地中で増殖せしめ
られ、そして生成物が分離され、その方法は生成物が分
泌されるか又は細胞質に保持されるかいづれかに依存す
る。生成物が分離された後、それは従来の手段、すなわ
ちクロマトグラフイー処理、電気泳動、傾斜密度分離又
は同様の手段により精製され得る。

酵素受容体は同じ手法で調製され、又はＭ１５配列を本
来、生成する宿主から分離され得る。酵素受容体が生成
される特定の方法は、本発明で臨界ではない。

フラグメントが得られた後、それらは前に記載したよう
にして変性され得る。酵素受容体の場合、スルフヒドリ
ル基はキャブされ又は適切なように変性され得る。結合
基がポリペプチドに導入され得又は他方、ポリペプチド
は接合体の特異的結合対メンバ一部分との反応のために
変性され得る。

次に、ポリペプチドは特異的結合対メンバー又はそのＭ
似体と共に組合され、そして官能基の性質及びその反応
のために必要とされる条件に従って反応せしめられ得る
。多くの場合、水性培地が、温緩な条件、普通約６０″
Ｃ１好ましくは約４０°Ｃ下で使用されるであろう。

１ツセイ アッセイのための手段は、手動システム又は自動システ
ムが使用されるかいづれか、アッセイの感度、アッセイ
が行なわれる速度、分析物の性質及び同様のものに依存
して、広く異なる。アッセイは、再び分析物の性質に依
存して競争的又は非競争的であり得る。アッセイの種々
の成分は、連続的に又は付随的に添加され得る。サンプ
ルは、従来の調製法にゆだねられ、又は使用され得る。

多くの場合、アッセイ媒体は、便利な緩衝液、たとえば
リン酸緩衝溶液、トリス又は同様のものにより、約６〜
８の範囲のｐＨで緩衝化されるであろう、その有意な要
因は、緩衝液が酵素反応を阻害しないことである。その
イオン強度は臨界でない。アッセイのための温度は、普
通約２０″Ｃ１好ましくはそれ以上であるが、しかし６
０°Ｃ以下、好ましくは約４０’Ｃ以下であろう。アッ
セイは大気圧下で行なわれる。

アッセイ媒体中の酵素供与体接合体の濃度は、普通約５
　ｎＭ〜５０ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜２５ｎＭで
あろう。酵素受容体は普通、実質的にモル過剰、通常少
なくとも約１．５モル過剰、好ましくは少なくとも約５
モル過剰で存在するであろう。酵素供与体接合体：酵素
受容体のモル比は、便利には約１：３０−ｉ：８０、よ
り普通にはｌ：５０〜１：６０の比で存在する。酵素供
与体接合体の濃度は普通、サンプル中で遭遇される予定
の分析物の最とも高い濃度を越えるであろう。

リガンドが接合体に存在する場合、ＥＤ−分析物接合体
：抗−分析物抗体の最適比が、アッセイの機能的な範囲
を広げ、そしてまた、バックグラウンド活性を最少にす
るためにＥＡの存在下で決定されるであろう。バックグ
ラウンドレベルに関して分析物濃度に対する酵素触媒さ
れた速度の応答が最適化される。

ＥＤ−分析物接合体：抗−分析物抗体の濃度の比は、所
望するアッセイ範囲にわたって分析物濃度により変化す
る速度の直線性を維持しながら、リガンド分析物の不在
におけるアッセイ条件下で最小の酵素速度を実質的に達
成するように存在するであろう、普通、抗体及び接合体
の濃度は、条件を最適化するために必要な濃度の少なく
とも約８５％以内、より普通には少なくとも約９５％以
内であろう。

種々の量のサンプルが、分析物の濃度、サンプルの性質
及びアッセイの感度に依存して使用され得る。アッセイ
が血清である場合、普通、サンプルは、アッセイ媒体の
体積の約１％〜１０％であろう。

酵素により分解される場合、アッセイ媒体の光の吸光度
（光学密度）又は放射の量の変化をもたらす酵素基質が
使用される。すなわち、基質の分解は、着色された又は
螢光生成物の出現又は沼田をもたらす。好ましい酵素基
質は、０−ニトロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＧ）及
びクロロフェニルレッド−β−ガラクトシド（ｃＰＲＧ
）を包含する。０ＮＰＧ。

ＣＰＲＧ及び他の相当する酵素基質は市販されている。

０ＮＰＧは、−船釣に、約０．５〜２．０　ｍｇ／ｒｎ
ｌの濃度で使用されるであろう。他の基質は、０ＮＰＧ
に相当するシグナルを供給するように濃度で使用される
であろう。

サンプル及び接合体は、適切なアッセイ媒体中に混合さ
れ得る。ＥＡは存在しても良く又は続いて添加されても
良い。接合体の特異的結合対メンバーに対する相補的メ
ンバーは、サンプル中に分析物として存在しても良く、
又は試薬として添加されても良く、通常、ＥＤ接合体及
びＥＡの混合よりも遅くない時期に存在する。しかしな
がら、順序を逆にすることができ、そして酵素の形成を
可能にし、続いて相補的な特異的結合対メンバーの添加
を伴い、そして時間と共に酵素活性の変化を観察するこ
とができる。酵素基質は、いづれの時間でも添加され得
るが、しかし普通、アッセイの種々の成分のインキュベ
ーションの後、添加されるであろう。

普通、１又は数回の読み取りが、インキュベーションの
後、行なわれ、その読み取り間の間隔は約３０秒〜約２
０分、普通約１〜１０分である。酵素基質の添加に基づ
く最初の読み取りのための時間は、一般的に３０秒〜約
１０分、より普通には約５分以内であろう。１回の読み
取りが行なわれても良いが、普通、１回以上の読み取り
が取られることが所望され、その結果、一般的な誤差か
はふかれる。

所望により、対照溶液は、サンプルとの比較のために対
照として作用する既知濃度の分析物から調製されるであ
ろう。この手段で、正確な定量決定が得られる。

次の例は、例示的であって、本発明を限定するものでは
ない。

夫−狡 酵素−供与体 ｐ１２５酵素−供与体 プラスミドｐ１２５を、温度誘発性プロモーター（λＰ
ｒ）の調節制御下にα−供与体配列を置くために遺伝的
に処理した。さらに、発現されたα−供与体ペプチドは
、Ｃ−末端近くにユニークシスティン残基を含む。これ
は、プラスミドｐｌＪｃ１３をＢｇｌ　Ｉにより切断す
ることによって遠戚され、そしてその得られた一本鎖末
端は、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理により除去された。

次に、このプラスミドをＢａｍＨｌにより消化した。次
に、β−ガラクトシダーゼをコードする約１７０ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により
精製した。（アメリカ特許第４．７０８，９２９号、第
２図を参照のこと）。

プラスミドｐβｇａ１２は、温度誘発性λＰｒプロモー
ターの調節制御下にｌａｃオペロンを担持するプラスミ
ドｐＣＶ口２（Ｑｕｅｅｎ、　１９８３＋　Ｊ、Ｍｏ１
ｅｃ、ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ　２　：　１　
）の誘導体である。他の遺伝子構成体のために利用でき
るλ調節配列を製造するために、プラスミドｐβｇａ１
２を変性した。プラスミドｐβｇａ１２をＢａｗｌ　Ｉ
及びＳａｌ　Ｉにより消化し、そしてｌａｃオペロンを
コードするＤＮＡ配列を除去した。ｐＢＲ３２２配列（
ａａ＋ｐ’及びｏｒｉを含む）及びλＣ１を含むＤＮＡ
フラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し
た。Ｂａｗｌ　Ｉ　＋　ＥｃｏＲＩ　＋Ｈｉｎｄ　ｍ　
、　　Ｓａｌ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉのための認識配列を含
む合成ＤＮＡリンカ−を連結し、そして次にＢａｓ＋Ｈ
Ｉ及び５ａｉ１により切断し、Ｂａｗｌ　Ｉ及びＳａｌ
　Ｉ付着端と有する短い多重リンカ−セグメントを創造
した。これらのＤＮＡフラグメントを、ｐβｇａ１２か
分離されたＢａｍＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｉフラグメントに
連結した。その得られたプラスミド、ｐ１２１Ｂは、そ
のベクターのＢａ＋ｗＨＩ及びＳａｌ　Ｉの間にＥｃｏ
ＲＩ及びＸｂａ　Ｉ認識部位を含む。プラスミドｐ１２
１Ｂを、ＢａｍＨＩ及びＰｖｕ　Ｕにより消化した。β
−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性、すなわちａ
ｍｐ’を付与する）、ファージλＣＩ遺伝子（温度調製
されたリプレッサー）及び複製のプラスミド起点（ｏｒ
ｉ）を含むＢａｍＨＩ　／　Ｐｖｕ　ＩＩ　ＤＮＡフラ
グメントを、アガロースゲル電気泳動により精製した。

　　ｐＵｃ１３からのＢｇｌ　Ｉ　　（１／ＢａｍＨＩ
　　ＤＮＡフラグメント及びｐ１２１ＢからのＢａｍＨ
Ｉ　／　Ｐｖｕ　ＩＩ　ＤＮＡフラグメントを、第２Ａ
図に示されるようにしてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結した。岨換えプラスミドを一本鎖ファージＭ１３の増
殖のためにＪＭ８３、すなわちＥ、コリ細菌宿主中に形
質転換し、モしてβ−ガラクトシダーゼ突然変異体ポリ
ペプチドＭ１５（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１９７９゜Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ、　ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ
、７９〜９９．２．　Ｎｏ、　２　：　４３〜４Ｂ）及
びプラスミドｐ１２５をコードするその組換え体を選択
した。インビボ相補性は４２゛Ｃで生じたが、しかし３
２°Ｃでは生じなかった。これは、プラスミドｐ１２５
が温度誘発性β−ガラクトシダーゼα−タンパク質を生
成することを示す。

Ｈ，Ｂ、Ｍ及びＰシリーズの酵素−供与体実験の１つの
シリーズにおいて、分析物共役ドメインを含むタイプの
酵素−供与体ペプチドを得るために、種々の大きさのα
−領域を、ＨａｅｌＩ。

Ｂｇｌ　Ｉ　、　ＭｓＬ　Ｉ又はＰｖｕ　Ｉにより消化
されたｐＵｃ１３（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ、
　１９８２．　Ｇｅｎｅ　１９　：　２５９〜２６８　
ｉ　Ｍｅｓｓｉｎｇ＋　１９８３＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｌ　　二　２０〜７８
　　；　　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｇａｉｔｈｏｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）から分離し、それ
ぞれＨ−シリーズ、Ｂ−シリーズ、Ｍ−シリーズ及びＰ
−シリーズを得た。Ｂ−、Ｐ−及びＨ−シリーズを７４
　ＤＮＡポリマラーゼ及び３１ヌクレアーゼにより処理
した。Ｍ−シリーズは処理しなかった。個々のシリーズ
のＤＮＡを複数クローニング部位に位置するＳａｃ　Ｉ
により消化し、そしてα−相補的ベブチドをコードする
その小さなりＮＡを、アガロースゲル精製により精製し
、ＤＥＡε−セルロース紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び
５ｃｈｕｅ１１．にｅｅｎｅ、　Ｎｉ１）上で電気泳動
し、溶離し、そして製造業者により記載されるようにし
てエタノール沈殿せしめた。

ｐＢＲ３２２の２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ　　Ｐｖｕ　Ｉ
Ｉフラグメントにクローン化されたＥ、コリｔｒｐプロ
モーター（ＥｃｏＲＩ　−３ｓｔ　Ｉ　、　１２０ｂｐ
）を担持するプラスミドｐ１４１をＮｄｅ　Ｉにより消
化し、そしてＤＮＡポリマラーゼクレハウフラグメント
並びにｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ（ＰＬ　Ｂｔｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ＋　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｍｌ）により処理
した。得られたＤＮＡをＳａｃ　Ｉにより消化し、そし
てＤＮＡのＭ、Ｂ、Ｈ及びＰシリーズを受けるためのベ
クターとして使用した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによる処
理の後、そのＤＮＡをＥ、コリ株Ｅ９００１（Δｌａｃ
　ｐｒｏｌ　ｔｈｉ、　５ｕｐＥ、　　Ｆ　’　ｐｒｏ
ＡＢ、　１ａｃＩ”Ｚ　Ｍｌ５かまた株７１．１８とし
て言及される；　Ｍｅｓｓｉｎｇなど、１９７７＋　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｊ！、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７５
　：　３６４２〜３６４６　）中に形質転換した。その
ＤＮＡ構成体を、Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ（１９
８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６
７　：　４９９）の方法により配列決定し、そして第４
図に示す、また、（”）印は、分析物の共有結合のため
の部位である。

Ｅ、コリ株Ｅ９００１においてＴｒｐ制御下でα−領域
をコードするその得られた株は、シリーズＢのために、
プラスミドｐ１３０を担持する株）ＩＣ１３０；シリー
ズＭのために、プラスミドｐ１２９を担持する株？１Ｇ
Ｉ２９　；及びシリーズＨのために、プラスミドｐ１３
１を担持するＭＧ１３１であった。

種々のクローン化されたα−領域の発現レベルを改良す
るために、そのα−領域を新規のプラスミドに移し、モ
してλＰｒオペレーターープロモーターの制御下に配置
した。たとえば、ＭＧ１４１を構成するために、Ｈ−シ
リーズからのＨ６のＤＮＡ配列をコードする遺伝子を、
下記に記載されるようにしてλＰｒ及びλＣ１遺伝子と
Ｔｒｐプロモーターとの置換によりＰｒ制御下に置いた
。

Ｔｒｐオペレーター−プロモーター制御下でＨ６を含む
プラスミドｐ１３１をＥＣＯＲＩにより消化し、そして
約２．１ｋｂの大きな方のフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動により分離した。λＰｒ及びλＣＩ遺伝子を
、ｐ１２５のＥｃｏＲＩ消化物の小さなフラグメントか
らゲル精製した。ｐ１３１の２．１ｋｂフラグメントを
ｐ１２５からの小さなフラグメントに連結し、要するに
λＰｒ及びλＣｌプロモーターシステムとＴｒｐプロモ
ーターとを交換した。この方法をまた、ｐ１３０及びｐ
１２９に関してくり返し、λＰｒｌ１１ｍ下での次のプ
ラスミド及び株を得、すなわちシリーズＢのためには、
プラスミドｐ１３９を担持する株ＭＧ１３９　、シリー
ズＭのためには、プラスミドｐ１４０を担持する株ＭＧ
１４０　；及びシリーズＨのためには、プラスミドｐＦ
Ｉ６を担持する株ＭＧ１４１を得た。そのＤＮＡ構成体
を、Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６７　
：　４９９（１９８０）の方法により配列決定し、そし
て第４図に示される。

ｐ１４８酵素−供与体 ｐ１２５からのλＰｒ配列を用いて、新規プラスミドを
構威し、そのペプチドのＮ末端に対してシスティン残基
を供給した。このプラスミド、ｐ１４８はまた、そのペ
プチドのＣ−末端近くに位置する３個のシスティン残基
を含んだ。プラスミドｐ１２５をＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩにより消化し、約１１００ｂｐのフラグメントをそ
のベクターから切断し、そしてアガロースゲル電気泳動
により精製した。このフラグメントは、ｐＵｃ１２のユ
ニークＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ制限部位中に連結さ
れたλＰｒ配列を含む（Ｍｅｓｓｉｎｇ。

１９８３、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　１０１　：　２０〜７Ｂ）。

この組換えプラスミドをＪＭ８３細胞中細胞質転換し、
そしてそれは、前記のｐ１２５の構成に類似する態様で
４２°Ｃでインビボにおいて相補的であることが見出さ
れた。酵素−供与体ｐ１４８の構造はまた、第４図に示
され、ここで分析物の結合のために本発明に従って利用
されるアミノ基及びスルフヒドリル基の位置が含まれる
。

酵素−供与体３ 酵素−供与体３（ＥＤ３）を、Ｈ６から構成された酵素
−供与体（Ｅｏｌ）から構成される酵素−供与体（ＥＤ
Ｉ）から構成した。ＥＤＩを次の通りにして構成した： ＤＮＡフラグメントの合成を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、（ＡＢＩ、　Ｆｕｓｔｅｒ
　Ｃ３ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆ、）のＭｏｄｅｌ　３Ｂ０Ａ
　ＤＮＡ合或合成より行なった。個々の配列をプログラ
ム記憶に入れ、そして所望する一本鎖のＤＮＡを自動的
に製造し、調節された細孔ガラス支持体から個々のフラ
グメントを切断し、そしてＤＮＡをバイアル中に集めた
。ＤＮＡサンプルを、濃ＮＨ，ＯＨ溶液１．５　ｄによ
り５５°Ｃで６〜２４時間処理し、そして５ａｖａｎｔ
　５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒにお
いて乾燥せしめた。

乾燥された個々のＤＮＡフラグメントペレフトを、少量
のホルムアミドに溶解しく１００〜２００μ／ｌ）、そ
して１２％アクリルアミドゲル上で精製しくＢＲＬ　Ｍ
ｏｄｅｌ　Ｓｏ、　３４〜４０ｃｍ　、　１．６　ｆｉ
ｌの厚さ）、そして２００ボルトで一晩電気泳動せしめ
た。所望するバンドを、螢光バックグラウンドとしてＢ
ａｋｅｒ−ｆｌｅｘシリカゲルＩ　Ｂ　−Ｆ　（Ｊ、Ｔ
、Ｂａｋｅｒ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）を用いて可視
化した。所望するＤＮＡバンドを、レーザー刃によりゲ
ルから切断し、そしてそのＤＮＡを、製造業者の指針に
従ってＩｎｔｅｒｎａｔｉ。

ｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、
（ＩＢＩ）Ｍｏｄｅｌ　ＵＥＡユニットによりアクリル
アミドゲルフラグメントから電気泳動せしめた。ＤＮＡ
を少量の緩衝液に集め、そしてエタノール沈殿せしめた
。フラグメントを、製造業者の指針に従ってＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼにより処理した。相補的ＤＮＡ鎖を
組合し、９０°Ｃに２分間加熱し、そして室温にゆっく
りと冷却した。アニールされたＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動により精製し、ハイブリダイズされなかった鎖
を除き、そして連結反応に使用した。

出発プラスミドは、制限部位Ｂａ＋ａＨＩ及びＳａｌ　
Ｉの間に挿入されたλＰｒ制御下でのＨ６遺伝子を含む
ｐ１６９であった。Ｈ６からＥＤＩへの変更は、損われ
ない型でα−ドメインを残しながら、Ｈ６のＮ−末端及
びＣ−末端の両者を変えることを包含する。２種のｐ１
６９のアリコートを制限酵素により切断した。第１のア
リコートをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ　１により消化し、そ
して小さな１５０ｂｐのフラグメントをゲル精製した。

ｐ１６９の第２のアリコートをＢａｍＨ■及び５ａｌＩ
により消化した。これは、プラスミドをベクター及びα
−供与体遺伝子領域に切断する。そのベクタ一部分をゲ
ル精製した。

ＥＤＩの新規Ｎ−末端コード領域は、ＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍ、　Ｉｎｃ、の機械により合成された
７ｓｂｐのＤＮＡフラグメントであった。その新規Ｃ−
末端コード領域、すなわち５０ｂｐのＤＮＡフラグメン
トをまた、合成した。２種の新規ＤＮＡフラグメントを
、小さなＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉ　　）１６　ＤＮＡ
フラグメントに連結した。この混合物をＢａｍＨｌ及び
５ａｉｌにより切断し、約２７５ｂｐの新規ＥＤ遺伝子
を生成した。このＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そ
してベクターＢａ■−３ａｔ　ＤＮＡフラグメント中に
連結した。

ＥＤＩ配列を確かめた後、このプラスミド（ｐ１８１）
をＢａａ＋ＨＩ及びＥｃｏＲＩ　　（７５ｂｐのＥＤＩ
Ｎ−末端を除く）により切断した。この領域を、Ｂａｒ
ａ−ＥｃｏＲ１空間中に置換された新しく合成された３
０ｂｐのフラグメントにより置換した。

従って、ＥＤ３は、ＥＤＩよりも１５個のアミノ酸だけ
短かく、そしてそのＮ−末端近くにシステイン残基を有
する。ＥＤＩは、その配列中にシスティン又はリシンを
有さない。第１４図は、ＥＤ３のアミノ酸配列を示す。

酵素−供与体３Ａ 酵素−供与体３　Ａ　（ＥＤ３Ａ）のアミノ酸配列は、
第１４図に示される。ペプチドは、Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｐ
ａｌｏ　Ａｌｔ。

Ｃａ１ｉｆ、）９９０８Ｎペプチド合戒機により合成さ
れる。

台底のための方法は、Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ（
ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｃｌｅ　５ｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ、　１７６ｐｐ、　ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬＬ、、　１
９８４）により記載される通りである。−船釣な化学物
質は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｈａｕｋｅｒ、　Ｈｉｓ
、）からである。ＢＯＣアミノ酸は、Ｐｅｎ１ｎｓｕｌ
ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ。

Ｃａ　Ｉ　ｉ　ｔ、　）からである。側鎖保護は、Ｂｏ
ｃ−Ｔｈｒ（ＯＢｚＪ）。

Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　　Ｂｏｃ−Ｓｅｔ（Ｏ
Ｂｚｌ）、　　Ｂｏｃ−八５ｐ（ＯＢｚｌ）。

Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ａｓｎ／ＨＯＢＴ
、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ＴＯＳ）及びＢｏｃ−Ｈｉｓ　（
ＴＯＳ）である。Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆ、）からのア
ミノメチルポリスチレン固相樹脂ビーズは、Ｓｔｅｗａ
ｒｔ及びＹｏｕｎｇ　（１９８４）により記載されてい
るようにしてジシクロヘキシルカルボジイミドによりｐ
−ヒドロキシメチルフェニル酢酸Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ＯＢ
ｚｌ）にエステル化される。

使用される合成規模は、固相樹脂に結合される１ｍモル
のＢｏｃ−Ｔｈｒ及び３ｍモルのそれぞれのＢｏｃアミ
ノ酸である。次に、台底機をプログラム化し、合成を行
なう。得られたペプチドを無水弗化水素酸により樹脂か
ら切断し、そして酢酸により抽出した。水素化の後、ペ
プチドを、０．１％ＴＦＡ及び０、１％エタンチオを含
む水溶液中、０〜８０％アセトニトリルグラジェントの
Ｗａ　ｔａｒｓフェニルカラムを用いて分離用逆相ＨＰ
ＬＣにより精製する。一部端製されたペプチドを、ｌ醜
ＨのＮＨ４ＨＣ０，１ｍＭの２−メルカプトエタノール
中に徹底的に透析し、そして凍結乾燥せしめる。ペプチ
ドのアミノ酸分析は、第１表に示される。

第１表 上Ｄ３Ａのアミノ アミノ酸　　　理論的　　　実　測 分子量は４９４２．５３に等しく、そしてアミノ酸の平
は１１４．９４３である 要約すれば、第４図に示されるポリペプチドは、必要と
されるα−相補的配列から種々の距離で便利な共役側鎖
を供給する。組換え方法により製造されたペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を、標準のＭａｘａｍ及びＧ１１ｂ
ｅｒｔ技法により決定し、予測される構造体を確めた。

Ｈ６のアミノ酸組威を、アミノ酸分析により確めた。

ＥＤ酵素−供与体シリーズ ＥＤシリーズと呼ばれる一連の酵素−供与体を、紐換え
ＤＮＡ技法により構成した。ＥＤ３はすでに記載されて
いる。他のシリーズのメンバーは、ＥＤ４　、　ＥＤ５
　、　ＥＤ７　、　ＥＤ８　、　ＥＤＩ３．　ＥＤＩ４
．　ＨＤｌ、５及びＥＤＩ７を包含する。ＥＤシリーズ
の酵素−供与体のアミノ酸配列は、第１５図、Ａ−Ｉに
見られる。

ＥＤ４をコードする遺伝子を、次の配列のＤＮＡフラグ
メントをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎ＋ｓ、　
Ｉｎｃ、Ｊ１ｏｄｅ１３８０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ　（すでに記載されたような）によりまず台
底することによって構成した：ＧＧＣＣＴＣＧＡＧ　Ｔ
ＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＧＣＡＴＧ　（５７
マー）星印により示される °“Ｔ” は、 “Ｃ″ からの変更 を示す。このフラグメントを、プラス逅ドｐ１８１（Ｅ
ＤＩ）からのＢａｍＨＩ　−Ｐｖｕ　Ｉ断片に連結した
。

その得られた断片を、ＢａｍＨＩ　−３ｐｈ　Ｉ　ｊＩ
域を除去されたベクター（ＥＤ　１−ｐ１８１からの）
中に連結した。ＣからＴへの変更は、システィン（ｃｙ
ｓ）残基を創造し、そして連結の後、Ｐｖｕ　１部位を
破壊する。（付着端は、連結のためにその同じＰｖｕ　
１部位を存続する）。

ＥＤ５をコードする遺伝子を、次の配列のＤＮＡフラグ
メントを、まず合成することによって構成した： 星印により示される°“Ｔ　１１は、“Ｃ＋＋からの変
更を示す。二重の星印により示される“°Ｔ”は、“Ａ
　”からの変更を示す。ＣからＴへの変更はＰｖｕ　Ｕ
部位を破壊する。ＡからＴへの変更はセリン残基をシス
ティン残基に変える。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ
　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片及びプラスミドｐ１８２（ＥＤ　
２又はＭ２Ｓ）ＤＮＡからのＰｖｕ　Ｉ　−３ａｌ　ｒ
断片に連結した。その連結された材料をＢａｍｔｌｌ及
び５ａｉｌにより切断し、そして除去されたＢａｍＨｌ
−５ａｌｌ領域を有するｐ１８２中に挿入した。

ＥＤ７をコードする遺伝子を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　
Ｉの両者によりｐ１８３　（ＥＤ３）及びｐ１８４（Ｅ
Ｄ４）プラスミドを切断することによって構成した。ｐ
１８３からのベクターをゲル精製した（ＥｃｏＲＩ　−
５ａｔ　Ｉ　（α）領域を効果的に除去する）。対照的
に、ｐ１８４からの小さなＨｃｏＲＩ　−３ａｔ　Ｉ　
　（α）領域をゲル精製した。次に、ｐ１８４のＥｃｏ
ＲＩ　　Ｓａｌ　Ｉ　ｅｌ域を、ｐ１８３のＥｃｏＲＩ
　−５ａｌ　Ｔベクター中に挿入し、そして連結した。

ＥＤ８をコードする遺伝子を、Ｍ１３ｍｐＨファージＤ
ＮＡにおける部位特異的突然変異誘発を用いて製造した
。プライマー（配列ＧＧＴ　ＡＡＣＧＣＡ　ＡＧＧ　Ｇ
ＲＴＴＴＣＣＣＡ　ＧＴＣ）を製造した。このプライマ
ーは、アミノ酸１５〜２２をコードする領域のセンス鎖
に対して相補的である。所望する変更は、コドン２０に
おけるＧからＴであり、これはＭ１３ｍｐＨＤＮＡのα
領域におけるアミノ酸２０でのＧＩｙからＣｙｓへの変
更であった。これは、プライマーを一本鎖Ｍ１３ｍｐＨ
ファージＤＮＡにハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリ
マラーゼ■“°フレノウフラグメント”及びＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼを用いて室温で一晩前記プライマーを延長す
ることによって達成された。このＤＮＡをＳｌヌクレア
ーゼにより処理し、非二本鎖ＤＮＡを排除し、そして次
に、ＪＭ１０３細胞中に形質転換せしめた。この形質転
換からのファージを分離し；そのＤＮＡを精製し、そし
てそのプライマー延長及び形質転換を合計３回くり返し
た。それぞれの反復は、所望する生成物を富化した。最
後に、最少予備分析を、個々のプラークからのＭ１３　
ＲＦ　ＤＮＡに対して行なった。所望する塩基の変更が
ＢｓｔＮ１部位を排除した。ＢｓｔＮｌによるＤＮＡの
最少−予備制限分析が候補体を同定した。所望する変更
を担持する二本鎖Ｍ１３　ＲＦ　ＤＮＡから、ＢａｍＨ
Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉ断片を切断し、そしてＥＤ２をコード
するプラスミドにおけるＢａｍＨＩ　−Ｂｇｌ　Ｉ断片
と交換した。

ＥＤＩ３（ｐ１９３）をコードする遺伝子を、次の配列
のＤＮＡフラグメントをまず合成することによって構成
した： この合成されたフラグメントを、ＥＤ３を構成する場合
、上記のようにｐ１８２（ＥＤ２）中に置換した。

ＥＤＩ４（ｐ１９４）をコードする遺伝子を、次の配列
のＤＮＡフラグメントをまず合成することによって構成
した： この合成されたフラグメントを、ＥＤ４のために使用さ
れるのと同じ手段により構成したが、しかしシスティン
置換の代わりにリシン残基をもたらした。

ＥＤ１５　（ｐ１９５）をコードする遺伝子を、次の配
列のＤＮＡフラグメントを合成することによって構成し
た： このフラグメントを、ＥＤ５をｆＩ威するために使用さ
れるのと同じ方法でρ１８２（ＥＤ２又はＭ２Ｓ）中に
挿入した。

ＥＤ１７（ρ１９７）をコードする遺伝子はＥＤ１３及
びＥＤ１４遺伝子の組合せであり、ＥＤ７をコードする
遺伝子と同じ手段で構成される。

次のものは、酵素供与体のＥＤシリーズにより使用され
得る酵素受容体の列挙である。

ＥＤ３　　　　　　　　　　Ｍ２Ｓ、ＥＡＩ　　、ＥＡ
ｌ４　　、ＥＡ２０　　、ＥＡ２２ＥＤ４　　　　　　
　　　　Ｍ２Ｓ、ＥＡｌ　　、ＥＡｌ４．Ｅへ２０　　
、ＥＡ２２ＥＤ５　　　　　　　Ｍ２Ｓ　、　ＥＡ　１
　　、　ＥＡｌ４　、　ＥＡ２０　、　ＥＡ２２ＨＤ７
　　　　　　　Ｍ２Ｓ　、　ＥＡ　１　　、　ＥＡｌ４
　、　ＥＡ２０　、　ＥＡ２２ＥＤ８　　　　　　　Ｍ
Ｉ５　、ＥＡ　１　　、ＥＡｌ４　、ＥＡ２０　、ＥＡ
２２ＨＤ１３　　　　　　　Ｍ２Ｓ　、　ＥＡ　１　　
、　ＥＡｌ４　、　ＥＡ２０　、　ＥＡ２２ＥＤ１４　
　　　　　　　　Ｍ２Ｓ　　、ＥＡ　１　　、ＥＡｌ４
　　、ＥＡ２０　　、ＥＡ２２ＥＤ１５　　　　　　　
Ｍ２Ｓ　、　ＥＡ　１　　、　ＥＡｌ４　、　ＥＡ２０
　、　ＥＡ２２ＥＤ１７　　　　　　　　　　Ｍ２Ｓ　
　、ＥＡ　１　　、ＥＡｌ４　　、ＥＡ２０　　、ＥＡ
２２の　　　　　は−　　されなかった 前記酵素−供与体及び酵素受容体対のうち、ＥＤ４及び
ＥＡ２２の組合せが、本発明の相補的アッセイに使用す
るために最とも好ましい対である。

酵素−受容体 １つの実験群において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
一連のイン−フレーム配列の欠失が、上記方法に従って
一連の酵素−受容体を調製するために構成された。ｐｕ
ｃｔａをＰｖｕ　Ｕにより消化しくブラシ末端を生成す
る）、そしてＸｈｏ　ｌ￥ｆｔ１］限部位を８ｂｐＯ合
戒ＤＮＡリンカーに連結し、新規プラスミド、ｐＵｃ１
３Ｘを創造した。

次に、Ｘｈｏ　Ｉ制限部位を含むα−領域を、１ａｃＺ
遺伝子又はバックグラウンドプラスミドの残留物を破壊
しないで、天然のβ−ガラクトシダーゼをコードする完
全なＩａｃＺ遺伝子遺伝直中した。Ｚ遺伝子は２つのＢ
ｇｌ　Ｔ部位を含む。これらのＢｇｌ　Ｉ部位の初めの
ものは、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−が挿入されるＰｖｕ１１部
位から下流のｐＵＣ１３のα−領域内に含まれる。従っ
て、ｐＵｃ１３Ｘからのα−領域は、Ｂａｍ１ｌ　Ｉ及
びＢｇｌ　１により消化することによってそのプラスミ
ドの残りから除去され、そしてその１７０ｂｐのフラグ
メントはＢＩＸと命名された。

β−ガラクトシダーゼをコードする１ａｃＺ遺伝子の残
りを、プラスミドｐβｇａ１２（口ｕｅｅｎ、　１９８
３＋Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　　２　：　
１　）から得た。このプラスミドを、Ｂｇｌ　Ｉ及びＥ
ｃｏＲｌにより消化し、モしてＺ遺伝子の９３％を表わ
す２種のＤＮＡフラグメントを分離した０個々のフラグ
メントの末端は、この構成に使用されるいづれか他の末
端と異なっていた０分離されたフラグメントは、２１１
５ｂｐ　（この後、Ｂ２として言及される〉及び７３７
ｂｐ　（この後、Ｂ３として言及される）であった。Ｚ
遺伝子におけるＥｃｏＲＩ制限部位は、その遺伝子のＣ
−末端近くに存在する。この末端は、Ｘｈｏ　１部位を
含むＺ遺伝子が構成される場合に存在すべきである。

突然変異体Ｚ遺伝子をＰＦ２９中に挿入した。プラスミ
ドＰＰ２９は、ＥｃｏＲ１部位でＺ遺伝子のＣ−末端に
融合されるＺ遺伝子α−領域を含む。このα−領域は、
ＢａｍＨ１部位で挿入されるλＰｒプロモーターにより
制御される。ｐＦ２９を構成するためには、２種の中間
プラスミド、ｐＦ１５及びｐＦ１６を構成した。

ｐβｇａ１２をＡｖａ　Ｉにより消化し、そして３′付
着端をフレノウフラグメント及び４種のｄＮＴＰを用い
てフィルインし、プラント末端を創造した。Ｓａｌリン
カ−（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
ＢｉｏＬａｂｓ。

Ｂｅｖｅｒｌｙ＋　ＭＡ）を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを
用いて線状化されたプラスミドに連結した。その得られ
たＤＮＡをＥｃｏＲＩ及び５ａｉｌより消化し、モして
β−ガラクトシダーゼＺ遺伝子のオメガ（ω）端を表わ
す３００ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電
気泳動により精製した。そのω−領領域次の通りにして
λＰｒの制御下でα−領域に融合せしめた。ｐＵｃ１２
０ＮＡ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）をＢｇｌ　Ｉによ
り消化し、そしてプラント末端をフレノウフラグメント
及び４種のｄＮＴＰによる処理により創造した。Ｅｃｏ
ＲＩリンカ（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ。

ＭＡＳＳ）を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによりプラント末
端に連結した。そのＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ
により消化し、そしてＺ遺伝子のα−領域を表わす１８
０ｂｐのフラグメントをナガロースゲル電気泳動により
精製した。α−及びω−遺伝子フラグメントを受けるた
めに使用されるベクターは、ＢａｍＨＩ及び５ａｉｌに
より消化され、そしてＩａｃオペロン配列を除去するた
めにアガロースゲル電気泳動により精製されたｐβｇａ
１２であった。ベクター、α遺伝子及びω−遺伝子フラ
グメントをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結し
た。ＤＮＡフラグメントのユニーク末端は、これらのフ
ラグメントクローン化される順序を指図する。その生成
物のプラスミドは、ｐＦ１５と命名された。

ｐｐｔｓを、そのユニークＰｖｕ　ＩＩ部位を、ｐＦ１
５をＰｖｕ　ＩＩにより消化することによって創造され
たプラント末端に連結されるＳａｌ　Ｉリンカ−を用い
てベクターのＳａｌ１部位に転換することによって、さ
らに変性した。次にこの変性されたｐＦ１５をＢａｍＨ
Ｉ及び５ａｉｌにより消化し、そして最大のＤＮＡフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動により精製し、α−
ω−遺伝子配列及びＳａｌ　１部位とＰｖｕ　ＩＩ部位
との間に位置するＤＮＡフラグメントを除去した。変性
されなかったｐｐｉｓをまた、Ｂａｎ＋ＨＩ及び５ａｉ
ｌにより消化し、そしてα−ω−フラグメントを精製し
た。変性されたｐＦ１５からの大きなフラグメントをα
−ω−フラグメントに連結し、プラスミドｐＦ１６を生
成した。

ｐＦ１６は、ｐＦ１６よりも小さな、約１３５０塩基対
のものであり、モしてＳａｌ　Ｉ部位にひじょうに近い
ユニークＮｄｅ　１部位の移動効果を有する。この方法
は、続く構成を通して実施される方法から不必要なりＮ
Ａ配列を排除する。

ｐＦ２９を構成するためには、ｐＦ１６をＣ１ａ　Ｉ及
びＮｄｅ　Ｉにより消化し、そしてλＣ１，λＰｒ及び
βガラクトシダーゼのα−及びω−領領域コードする１
４００ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により精製した。ｐＵｃ１３をＡｃｃ　Ｉ及びＮｄ
ｅ　Ｉにより消化し、そしてそのベクターをアガロース
ゲル電気泳動により精製した。Ａｃｃ　Ｔ及びｃ１ａｌ
ｉｌＪ限部位は同一の付着端を有し、そしてＮｄｅ　Ｉ
制限部位は同一の末端を共有するので、ｐＦＩ６からの
ＤＮＡ挿入体及びｐｔｌｃ１３ベクターの連結は、１つ
の配向でのみ存在することができる。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによる連結は、ｐＦ２９を生成し
た。

ｐＦ２９は１つのＥｃｏＲ１部位を含み、モしてＣ１ａ
　１部位を含まず、そしてこれは、第二のＥｃｏＲＩ及
びＣ１ａ　１部位が変性されたプラスミド（たとえばｐ
１４９）の構成及び下記ｐ１５０から創造された欠失突
然変異体の続く分析を妨害するので所望される。

ｐＦ２９をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、介
在α−供与体を除き、そしてこのベクターをＢＩＸ、Ｂ
２及びＢ　３　（ＢＩＸ十８２　＋８３　）を用いてフ
ィルインした０個々の断片のユニーク−本鎖末端は、そ
れらの断片が一緒に連結され得る順序を定義する。

ＢＩＸ、Ｂ２及びＢ３フラグメントを、上記のＢａｍＨ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＦ２９ベクター中
に連結し、従ってλｐｒ制御下でアミノ酸３４をコード
するｂｐ１０２でＸｈｏ　Ｉリンカ−によりＺ遺伝子を
再構成した。その得られたプラスミドをｐ１４９と命名
した。

Ｘｈｏ　Ｉ及びＢａ１３１消化に続いて効果的に機能す
る酵素−受容体の創造のためのスクリーニング方法を創
造するために、Ｘｈｏ　１部位を有さない別々のα−供
与体をｐ１４９中に挿入した。ＩａｃＺオペレーター、
プロモーター及びα−供与体を含むｐＵｃ１３からのＦ
ｎｕＤ　Ｉｆ消化フラグメントを、フレノウフラグメン
トによりフィルインされたｐ１４９のＳａｌ　１部位中
に挿入した。得られたプラスミドをｐ１５０として命名
した。欠失は、χｈｏｌによりｐ１５０を消化し、そし
て次にＢａ１３１エキソヌクレアーゼによるＤＮへの消
化により創造された。８ａ１３１処理の後、そのプラス
ミドを７４　ＤＮＡリガーゼによりＡＭＡ１００４宿主
細胞（Ａ？１Ａ１００４はｇａｌＵ＋　ｇａｌＫ、　５
ｔｒＡ’　、　ｈｓｄＲ−１ｅｕＢ６ｔｒｐｃ９８３０
．　Δ（ｌａｃＩＤＵＺ）Ｃ２９である）に連結し、そ
して形質転換しくＣａ５ａｄａｂａｎなど、１９８３．
　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　１０
０　：　２９３）、そしてインデューサ、イソプロピル
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及びクロモシン基質５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−Ｂ−〇−ガラク
トピラノシド（Ｘｇａｌ。

Ｓｉｇｔｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、Ｌ
ｏｕｉｓ、　ＭＯ）を含むＬｕｒ　１ａ−Ｂｅｒ　ｔａ
ｎ　ｉ　プレート上でスクーンした。３０°Ｃで白色で
あるコロニーは、効果的に機能する酵素−受容体の創造
を示した。コロニーを選択し、そしてプラスミドＤＮＡ
を調製した。プラスミドＤＮＡを５ａｉｌにより消化し
、α−供与体を除去し、ＡＭＡ１００４宿主細胞中に再
連結し、そして形質転換した。配列の欠失を、Ｍａｘａ
ｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ配列決定により６１Ｈｕし、そし
て酵素−受容体タンパク質を下記のようにして精製した
。

酵素−受容体を、ＤＮＡ合成技法を用いて構成した。た
とえば、酵素−受容体１（ＥＡＩ）をｐ１４９から構成
した。但し、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−を含むα領域を、次の
合成されたＤＮＡフラグメント（５′→３′）を交換し
た： （１）　　ＣＡＡ　　ＣＡＧ （２）　ＡＧＧ　ＣＴＧ （３）　ＡＣＣＣＡＡ （４）ＧＴＡ　ＴＡＡ （５）　ＣＡＡ　ＣＧＴ （６）　ＧＴＣＡＣＧ ＧＣＴ　　ＣＧＣ （７）　　ＧＡＴ　　ＣＣＣ ＧＴＴ　　ＴＴ八 ＴＴＧ　　ＣＧＣＡＧＣ ＣＧＣＡＡＣＴＧＴ ＣＴＴ　　ＡＴＴ　　ＡＣＣ ＡＧＴ　　ＴＧＧ　　ＧＴＡ ＣＧＴ　　ＧＡＣＴＧＧ ＡＣＧ　　ＴＴＧ　　ＴＡＡ ＣＣＧ　　［Ｇ ＣＧＧ　　ＧＣＧ　　ＡＧＣＴＣＧ　　ＡＡＴ　　ＴＣ
Ａ　　ＣＴＧ　　ＧＣＣＣＧＡ　　ＴＣＧ ＴＣＣ ＣＣＴ　　ＴＣＣＣＡ ＧＧＣＧＴＴ ＣＡＧ　　ＴＧＡ　　ＡＴＴ ＣＴＧ　　ＡＡ ＴＧＧ　　ＧＡＡ　　ＧＧＧ ＧＡＴ　　ＣＧＣＣＣＴ ＡＣＣＣＣＡ　　ＧＧＧ ＧＡＡ　ＧＧＣＣＣＴ ４八ＣＧＡＣＧＧＣ ＣＴＧ ＣＣＡ これらのフラグメントは、１ａｃＺ遺伝子のアも）酸２
６〜４３のイン−フレーム欠失をコードし、そしてＢａ
ｌ１ｌｌ　Ｉ及びＢｇｌ　Ｔ付着端を担持する。これら
のフラグメントをアニールし、ゲル電気泳動により精製
し、Ｂａｗｌ　Ｉにより処理し、そしてＢ２＋Ｂ３及び
ρＦ２９ベクターに連結した。陽性コロニーを選択し、
ＤＮＡ配列分析により確認した。

前記フラグメントによれば、分析物は、（１）サンプル
；　（２）酵素−供与体ポリペプチド接合体；　（３）
前記分析物に対して特異的な分析物−結合タンパク質；
及び（４）β−ガラクトシダーゼのフラグメントから実
質的になる酵素−受容体ポリペプチドを媒体中で混合す
ることによって反応混合物を形成することにより決定さ
れ得る。酵素−供与体ポリペプチドは、該接合体に結合
する分析物−結合タンパク質の不在下でβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を有する活性酵素複合体を前記酵素−受容体
ポリペプチドと共に形成することを特徴とする。酵素−
供与体ポリペプチド接合体は、内部アミノ酸配列として
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸６〜５１を実質的に有
し、１つのシスティン及び該システィンに連結される分
析物を有し、そしてＮ−末端配列及びＣ−末端配列を有
し、又はそのアミノ酸配列としてβ−ガラクトシダーゼ
のアミノ酸７〜４４を実質的に有し、１つのシスティン
及び該１つのシスティンに連結される分析物を有し、そ
して少なくともＮ−末端配列を有することを特徴とする
。さらに、活性酵素複合体と反応することができる基質
は、媒体に含まれ、その結果、その活性酵素複合体によ
る転換の速度がモニターされ得る。酵素−供与体接合体
は、活性酵素複合体の形成の阻害をもたらす分析物−結
合タンパク賞に競争的に結合できることをさらに特徴と
する０反応混合物が上記成分を混合することによって形
成された後、反応混合物中の基質の転換速度が測定され
、そして分析物の量が、既知濃度の分析物を用いて得ら
れた基質の転換速度とサンプルを含む媒体における基質
の転換速度とを比較することによって決定される。

β−ガラクトシダーゼに基づいて、アミノ酸位置２，２
０．４０又は４６で１つのシスティンを有する酵素−供
与体組成物が本発明において特に興味の対象である。他
方、１つのシスティンがＮ−又はＣ−末端配列に存在し
、ここでＮ−末端配列は２７個までのアミノ酸であり、
そして２７個のアミノ酸を含み、モしてＣ−末端配列は
１７個までのアミノ酸であり、そして１７個のアミノ酸
を含む。

次のようなＮ−末端配列： ＭＤＰＳＧＮＰＹＧＩＤＰＴＥＳＳＰＧＮＩＤＰＲ５Ｓ
　Ｎ。

Ｍ　Ｄ　Ｐ　Ｓ　Ｇ　Ｄ　Ｐ　ＲＡ　Ｓ　Ｓ　Ｎ。

ＭＤＰＲＡＳＳＮ、又は ＣＩＴＤ； 及び次のようなＣ−末端配列： Ａ　Ｑ　Ｐ　Ｅ　Ｗ　Ｇ　Ｌ　Ｅ　Ｓ　ＲＳ　Ａ　Ｇ　
Ｍ　Ｐ　Ｌ　Ｅ。

Ｒ５ＬＮＧＬＥＳＲ５ＡＧＭＰＬＥ、又はＲ５ＬＮＧＥ
ＬＣＧＶＫＹＲＴＤＡ を有する酵素−供与体ポリペプチドが、特に興味の対象
である。

相補性効率の比較 上記のようにして調製された酵素−受容体の相補性効率
を評価するために、代表的な酵素−受容体調製物を、酵
素−供与体としてＨ６を用いて比較した。２．５　Ｘｌ
０−”Ｍの適切な酵素−受容体調製物及び１．２５■／
−のＯ−二トロフェノール−β−ガラクトピラノシド基
質を含むＰＭ２緩衝液（０，５ＭのＨａＪＰＯ４，ｐＨ
７，０，１ｍＭのＭｇ５Ｏａ　、　０．１８ｍＭのＭｎ
５Ｏ，、１ｍＭのＥＤＴＡ　、　０．０２％のＮａＮ３
　、０．０５％のＴｉ１ｅｅｎ　２０）２００ｍの合計
体積を含むマイクロタイタープレートを用いた。Ｈ６の
一連の希釈溶液（１：２０；　ｌ　：４０；　１　：８
０）を添加し、相補性を開始した。光学密度（４１４ｎ
ｍ）を、３７℃での３０及び４５分のインキュベーショ
ンで測定した。その結果は、第２表に示される。

第２表 １　／２０　　　　．１１８　　．７３６１　／４０　
　　　．０６２　　．３５１１　／８０　　　　．０３
０　　．１７１Ｂ、ＯＤｎ＋４３７“Ｃで４５　　のイ
１　／２０　　　　．２９９　　１．５８５１　／４０
　　　　．１５４　　．７７６．７０８　　　．２７３
　　　．５２６．３６１　　　．１４２　　　．２７７
．１７４　　　．０７１　　　．１２８ンキユベーシヨ
ンの １．４０２　　．５７９　１．１４８ ．７１５　　．２９９　　．６１０ 第２表に示されるように、酵素−受容体の相補性効率は
相当にそれぞれ異なる。相対的な相補性効率は、ＥＡ１
４＝ＥＡ２２＞ＥＡ２０＞ＥＡ２４＞ＥＡ２３であった
。

例：チロキシンについての酵素イムノアッセイこの例は
、分析物−結合タンパク質としてチロキシンに対して特
異的な抗体を用いてのチロキシンについてのイムノアッ
セイを示す。使用される酵素−供与体−抗原はＥＤ４で
あり、そして酵素−受容体はＥＡ２２である。

酵素−受容体の調製 β−ガラクトシダーゼの欠失突然変異体ポリペプチドを
、ＴＹブイヨン（Ｉｆ中に、バクトドリプトン１０ｇ、
酵母抽出物５ｇ、Ｎａ（／！５ｇ及びグルコース１ｇを
含む、ｐＨ７，５）に所望する酵素−受容体株を増殖す
ることによって調製した。細胞を４２°Ｃで増殖した。

細胞を遠心分離により収穫し、分解緩衝液（ＢＢ）（０
，２ＭのＴｒｉｓ＠　−ＨＣｆ　、　ｐＨ７，６，０，
２ＭのＮａＣｌ、０．ＯＩＭの酢酸マグネシウム、０．
ＯＩＭの２−メルカプトエタノール、５％のグリセロー
ル）により洗浄し、次に遠心分離によりペレット化し、
そして凍結せしめた。

細胞ペレット（１，５ｇ）を、ＢＢ４０−に懸濁した。

リゾチーム（Ｓｉｇｎ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ
、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を添加し、最終濃度を０．２０
■／Ｉｄにし、そしてその懸濁液を氷上で３０分間イン
キュベートした。インキュベーションの後、その懸濁液
を一７０°Ｃのアルコール槽中で凍結し、モして３７゛
Ｃの水槽中ですばやく融解した。注意して、その融解懸
濁液を４　’Ｃ以下の温度で維持すること。分解物の粘
度を、Ｖｉｒｓｕｎｉｃ細胞破壊機（Ｍｏｄｅｌ　１６
−８５０＋　Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏ、。

Ｇａｒｄｉｎｅｒ、　ＮＹ）による音波処理により減じ
た。弗化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、　Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加し、０．１ｍＭの最
終濃度にし、そして不溶性物質を遠心分離（１６，０Ｏ
ＯＸ　ｇ、３０分）により除いた。　３０％ストレプマ
イシンスルフェート溶液の１７１０体積をゆっくりと、
上清液に添加した。氷上に１５分間放置した後、沈殿し
た核酸を、１６．０００　Ｘｇで２０分間遠心分離する
ことにより除いた。透明な分解物を、（ＮＨ４）！ＳＯ
４の８０％飽和溶液の同体積をゆっくり添加することに
よって、４０％の飽和にした。４°Ｃで２時間の撹拌の
後、沈殿物質を、１．ＯＯＯＸｇで３０分間の遠心分離
により集めた。

ベレットをＢＢ中に再溶解し、そしてＯ，ｌ　ＭのＮａ
Ｈ，ＰＯ，、ｐＨ７，２、５０ｍＭのＮａＣ１、１ｍＭ
のＭｇ５Ｏａ。

１０ｍＭの２−メルカプトエタノールの水溶液１０００
体積に対して透析した（６時間後、１回の交換）。

透析された酵素−受容体抽出物を、同じ緩衝液において
アガロースに共有結合されたｐ−アミノフェニル−１−
チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシドの２．５　Ｘ　６　
ｃｍカラムに適用した。カラムを、まず０．１ＭのＮａ
ＰＯａ、り）ｌ　７．２　、５０ｍＭのＮａＣ１、１０
ｍＭの２メルカプトエタノール溶液により、次に０．１
　ＭのＮａＰＯａ　、　ｐＨ７，２、５０ｍＭのＮａＣ
１、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール溶液により、
及び最後に、２．５ＭのＴｒｉｓＯ−ＨＣｌ　、　ｐＨ
７，０の同体積中、０．１ＭのＮａＰＯａ　、ｐＨ７，
２、５０ｍＭの硼酸ナトリウム、ｐｌ＋９、０　、１０
ｍＭの２−メルカプトエタノール溶液により洗浄した。

すべてのカラム操作は、４℃で行なわれた。

溶出された酵素−受容体を、すぐに０．１　ＭのＮａＨ
ｚＰＯａ　、　ｐＨ７，２、７０ｍＭのＮａＣ１、１ｍ
ＭのＦ’ＩｇＳＯａ及び１０ｍＭの２−メルカプトエタ
ノール溶液に対して広範囲にわたって透析した。透析の
後、グリセロールを添加し、ｌ０％の最終濃度にし、そ
して抽出物を一２０°Ｃで貯蔵した。これらの調製物は
、Ｌａｅｍｍｌｉの不連続ポリアクリルアミドゲルシス
テム（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ　２
２７　：　６９０）に単一バンドを生成した。

酵素−供与体の調製 前で記載された種々の酵素−供与体ポリペプチドは、宿
主細胞から直接精製されなかった。たとえば、Ｅ、コリ
株ＡＭＡ１００４に見出されるこれらのペプチドのレベ
ルは無意味であった。対照的に、相補的ペプチドをコー
ドするプラスミドが株Ｅ９００１（Δ１ａｃ−ｐｒｏ、
　ｔｈｉ、　５ｕｐＥ、Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、　ＩａｃＩ
Ｑ、２Ｍ１５がまた７１．１８に言及される；　　Ｍｅ
ｓｓｉｎｇなど、１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５　：　３５４２〜３６４６
）に移される場合、活性β−ガラクトシダーゼがインビ
ボ相補性により形成された。β−ガラクトシダーゼを精
製し、モして相補的ペプチドを６Ｍの尿素による酵素複
合体の変性により回収した。

細胞を、０．１％グルコース、５Ｏａｇ／ｌｎｉのアン
ピシリン及び０．３ｍＭのＩＰＴＧにより補足されたＬ
ｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地において４２°Ｃで１６
時間増殖せしめた。

細胞を遠心分離により収穫した。すべての次の段階は、
特にことわらないかぎり、４°Ｃで行なわれた。

１２ｆｆの体積の合計培養物からの細胞約４０ｇを、緩
衝液Ａ　（５０ｍＭのＴｒｉｓＯ、ｐＨ７，５、５０ｍ
ＭのＮａＣｆ。

１０ｍＭのＭｇＣｌ　！＋　１０ｍＭの２−メルカプト
エタノール）８０ＩＩ１１に再懸濁した。リゾチーム（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を添加し、最終濃度を０．
２０■／−にし、そしてその懸濁液を一７０°Ｃのアル
コール槽中において凍結し、モして３７°Ｃの水槽中で
すばやく融解した。融解懸濁液の温度を４°Ｃ以下に維
持すること。分解物の粘度を、Ｖｉｒｓｏｎｉｃ細胞破
壊機（Ｍｏｄｅｌ　１６−８５０）による音波処理によ
り減じた。

弗化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、　Ｓｉｇｍ
ａＣｈｅ釦１ｃａｌ）を添加し、Ｏ０■−の最終濃度に
し、そして不溶性物質を１．ＯＯＯＸｇで３０分間、遠
心分離することによって除去した。３０％のストレプト
マイシンスルフヱート溶液の１７１０体積を上清液にゆ
っくり添加した。氷上で１５分後、沈殿した核酸を１６
．０００ｘ　ｇで２０分間の遠心分離により除去した。

透明な分解物を、（ＮＨＪｚＳＯａの８０％飽和溶液の
同体積をゆっくり添加することによって４０％飽和にし
た。４℃で２時間撹拌した後、沈殿した物質を、１６．
０ＯＯｘ　ｇで３０分間遠心分離することによって集め
た。ペレットを、緩衝液Ｂ　（４ＯＮＭのＴｒｉｓＯ＋
１）Ｈ７、５、０，１ＭのＮａＣ１、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ　ｚ、　１０＋＊Ｍの２−メルカプトエタノール）の
最少体積に溶解し、そして同じ緩衝液２００体積に対し
て一晩透析した。

透析された溶液を、緩衝液Ｂにより平衡化された、３０
Ｍｌ１のＤＥＡＲ−セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ　ＤＥ
−５２）により充填された２、　５　Ｘ２０ｃ＋ａカラ
ム上に負荷した。

そのカラムを、１５０ｄの緩衝液Ｂにより洗浄し、吸収
されていない物質を除去した。酵素を、直線ＮａＣｌグ
ラジェント（４０ｍＭのＴｒｉｓＯ、ｐＨ７，５、１０
−の’ｇＣｆ　！＋　１０−の２−メルカプトエタノー
ル中、０．０１〜０．５ＭのＮａＣｌ　）により溶出し
た。個々の緩衝液成分の体積は７５−であり、そしてそ
の流速は０．５０ｍ／分であった。画分を、前記のよう
にして酵素活性についてアッセイした。ピーク活性は約
０６３ＭのＮａＣｌで出現した。酵素活性を含む両分を
プールし、そしてそのプールを（ＮＨ４）　ｔｓＯａに
より４０％飽和にした。２時間の撹拌の後、沈殿した物
質を、１２，０ＯＯｘ　ｇで３０分間遠心分離すること
によって集めた。ペレットを最少体積の緩衝液Ｂに溶解
し、次にＢｌｏ−Ｇｅ１　Ａ　−１，５ｍ　（ベツド体
積８６−　、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　　ＣＡ）により充填さ
れた１、　ＯＸ　１２０　ｃｍカラム上に負荷した。カ
ラムを、０．１０ｄ／分の速度で緩衝液Ｂにより展開し
た。両分を酵素活性についてアッセイし、そしてピーク
活性を含む両分をプールした。同体積の１００％飽和さ
れた（ＮＨ４）　ｔｓＯａ溶液をゆっくりと添加した。

氷上で２時間放置した後、沈殿した物質を、１２．００
０Ｘ　ｇで３０分間遠心分離することによって集めた。

ベレットを、最少体積の５０ｍＭのＫＨｚＰＯａ　、ｐ
Ｈ１，３゜１−のＥＤＴＡに溶解した。溶液ｌＩｄ当た
り固体電気泳動純粋尿素（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈ
ｍｏｎｄ、　（Ａ）　　０．４９６　ｇをゆっくりと添
加し、プールの最終尿素濃度を６．０Ｍにした。プール
を、基質の添加後５分間、氷上に維持し、酵素を不活性
化した。次に、変性された酵素プールを、５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−７５により充填された１、　ＯＸ１２０　ｃ
ｍカラム（ベツド体積８４ｄ。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、
　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）上に負荷した。その
カラムを、６．０Ｍの尿素、５０輪ＨのＴｒｉｓ＠、　
ｐＨ７，６、０，１５ＭのＮａＣｆ！　、　１ｍＭのＥ
ＤＴＡにより０．１０ｄ／分の流速で展開した０画分を
、Ｍ２Ｓによる相補的活性についてアッセイした。相補
的活性を含む両分をプールした。その両分プールを、１
＋ｓＭのＮＨＪＣＯｉ溶液４ｊ２に対して３度透析し、
そして凍結乾燥せしめた。

チロキシンイムノアッセイ ｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｌ−チロキシン−ＨＤ、
の酵素−供与体接合体を、次のようにして調製した： Ｌ−チロキシン遊離Ｍ　（６８０■）を、無水メチルア
ルコール（６，０ｄ）により被覆し、そしてその溶液を
無水塩化水素の激しい流れに飽和した。冷却の後、その
飽和方法をくり返し、そして溶媒を減圧下で除去した。

得られた結晶沈殿物を濾過し、無水エチルアルコール、
次にジエチルエーテルにより洗浄し、そして最後に乾燥
せしめた。乾燥されたチロキシンメチルエーテル塩酸塩
を５０％水性エチルアルコールに溶解し、そしてその溶
液を２Ｎの水酸化ナトリウム（１当ｉＦ）により処理し
た。多量の白色沈殿物がすぐに形成され、そして追加の
水が添加され、沈殿を完全にした。沈殿されたＬ−チロ
キシンメチルエステル遊離塩基を１時間冷却した後、生
成物を遠心分離により回収し、そして真空乾燥せしめた
。Ｌ−チロキシンメチルエステル遊離塩基（１０■）及
び５■のｍ−マレイミドベンゾイル−ｂ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（ＭＢＳＥ）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

ＩＬＬ）を、無水テトラヒドロフラン１．０　ｄに溶解
し、続いて粉末化された無水炭酸ナトリウム１０■を添
加した。その混合物を３０分間還流した。螢光指示剤及
び溶媒システムとして酢酸エチルを含む、Ｓｔ　＆　２
５０Ｆ　ＴＬＣブレー）５０Ｘ２０ｃｍ（Ｂａｋｅｒ、
　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ。

ＮＪ）を用いてのシリカゲルＧの薄層クロマトグラフィ
ーによる反応混合物の試験は、約７０％の反応が完結し
たことを示した。Ｌ−チロキシンメチルエステル遊離塩
基、ＭＢＳＥ、及びｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｌ−
チロキシン（ＭＢＴＭ）の生成物を、溶出溶媒としてク
ロロホルム：メタノールの混合液を用いてシリカゲルカ
ラムにより精製した。単離されたＭＢＴＭの淡黄色粉末
は、ＴＬＣにより評価される場合、約８０％の純度であ
り、そして？１ＢＳＥ又はＬ−チロキシンメチルエステ
ルといづれかとは完全に異なるＲｆを有した。螢光指示
薬を含むシリカゲルＧ上への短い波長のＵＶ光の照射に
基づいてチロキシンのために特徴的なオレンジ色を付与
するＭＢＴＭは、ニンヒドリン陰性であり、そしてマレ
イミド基の存在が、５．５′−ジチオビス−（２−ニト
ロ安息香酸）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ
、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）と反応するその能力により確認
された。

ＥＤ４酵素−供与体ポリペプチド（１０，ｇ）を、０、
１　ＭのＮａＰＯ，溶液（ｐＨ７，０）　０．１５ｄに
溶解し、そしてその撹拌溶液に、テトラヒドロフラン１
．Ｏｄ中ｍ−マレイミジベンジルーＬ−チロキシンメチ
ルエステル０．３■の溶液の２種の５１アリコートを添
加した。室温で１時間撹拌した後、その反応混合物を、
０．１Ｍの硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）により
Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−２カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　（Ａ）　０．６　Ｘ１６．Ｏｃｍ
を溶出することによって精製した。　１０滴の両分が集
められた。それぞれの両分のアリコートを、ＥＡ２３二
量体及び０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シドの存在下で相補的活性についてアッセイした。両分
１０及び１１は、最高の相補的活性を含み、そしてプー
ルされた。

この例は、酵素−供与体としてＨ６−チロキシン接合体
、酵素−受容体としてＥＡ２３、抗−チロキシン抗体及
び一連の濃度のチロキシンを用いての、分析物としての
シロキシンについてのイムノアッセイを示す。

アッセイのための試薬は、次のようにして調製された： Ｌ−チロキシン対照：２．６ｄのＬ−チロキシン（Ｓｉ
ｇｗｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　
ＭＯ）を無水エタノール２００　ｄに溶解して、そして
０．１５ＭのＮａｆｌＣ０３８００１を添加し、そして
その混合物を２５°Ｃで貯蔵した。

２倍希釈度のチロキシンを、エタノール：０．１５Ｍの
ＮａＨＣＯｓ　（１：　４　）により調製した。

Ｌ−チロキシン抗体：チロキシン（Ｔ４）に対する抗血
清をＷｅｓｔｅｒｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｃｏｒｐ、＋Ｄｅｎｖｅｒ＋　ＣＤから入手した
。いくつかのロフトを力価について試験し、そして平均
定数をＩｇＭ　Ｓｏｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｅｎｔｅｒ
＋　Ｍａｉｄｅｎ、　ＭＡ）によるラジオイムノアッセ
イにより決定した。ロフトは、１：１００〜１：８００
０の力価で異なった。平均定数は、４．５ＸＩＯ”　Ｌ
１モル／Ｉ　ＸＩＯ”Ｌ１モルであった。ロフト＄Ａ４
２０　（力価１　：　８０００　（ゼロ結合−６７％）
及びＫｅｑ＝　２　ＸＩＯ”Ｌ　１モル〕が使用された
。

ＥＡ２３受容体−酵素：貯蔵緩衝液中、６．３　Ｘｌ０
−’Ｍ、７５ｆ（：　ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）が２．５　Ｘ　Ｚ緩衝液
に溶解され、最終濃度が１０■／ｄにされた。

アッセイを、マイクロタイタープレー）　（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈＣａｔ、＃００１−０１２−９２００　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｆｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

５ｕｎｎｙｖａｌｅ＋　（Ａ）で行ない、そして４１４
ｎｍのフィルターを固定されたＴｉｔｅｒｔａｋ　Ｍｕ
ｌｔｉｓｃａｎマイクロタイタープレートリーダー（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、　ＭＤ）上で読み取った。それぞれのウェルに、０
．０５％のＴｗｅｅｎ２０　（ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレー））（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、＋ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を含むＰＭ２
緩衝液１００１１１を添加した。それぞれのウェルに、
Ｈ６−チロキシン接合体２．５〆、抗−チロキシン抗体
２．５ｄ、チロキシン対照２．５ｄ及び４０ｕｌのＥＡ
２３を連続的に添加した。

結果は第３表に示される。

第３表 チロキシンについての酵素イムノアッセイ６．２５ １２．５ ５ ０ ０．００２ ０．００１ ０．５９５ ０．３００ ０．３１２ ０．３２０ ０．３６４ （ａ）　ＥＤａ−Ｔ４は、ｍ−マレイミド−ベンゾイル
−Ｌ−チロキシン−ＨＤ、接合体を表す。

Ｎ−末端融合 ユニークＥｃｏＲ１部位に挿入されたＨＢＶの完全なゲ
ノムを含むプラスミドｐＢＲ３２２を旧ｎｃＩ［により
切断した。フラグメントＢ　（Ｓｎｉｎｓｋｙなど、１
９７９、前記）を、ｐＵｃ１３（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１
９８３、前記）のユニ−り旧ｎｃ［部位中にクローン化
した。このクローンから、ＨＢシーＳＡｇ遺伝子のほと
んどを含むＢａｍＨＩ−八ｈａＩＩ［フラグメントを、
ＢａｒａＨＩ及び５ａｌｌにより消化されたｐＵｃ１３
中に挿入した。この組換えＤＮＡプラスごド１２２をＥ
、コリのＪＭ８３株中に形質転換し、モしてＸｇａ　１
プレート上でＨＢＶ−ＳＡｇ酵素−供与体によりインビ
ボ相補性を示す淡青色のコロニーを選択した。このクロ
ーン、ＭＧ１２２は、Ａｂｂｏｔｔ　Ａｕｓｚｙｍｅｌ
Ｉ　（１）試験（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬＬ）における交着反応に
よりＨＢＶ　−ＳＡｇを含むことが見出された。この）
ＩＢＶ−５Ａｇα−供与体融合体を、多量の融合生成物
を生成するために他の発現ベクターにトランスファーす
ることができる。

Ｃ−末端の融合 たとえば、肝炎Ｂ型ウィルス表面抗原（）ＩＢＶ−ＳＡ
ｇ）を、酵素−供与体ポリペプチドのカルボキシ末端で
クローン化した。使用され得る１つの方法は、例として
下記に簡略されている。

１．２ｋｂのＦｎｕＤ　ＩＩフラグメントを完全なＨＢ
Ｖゲノムのクローンから分離し、そしてｐＢＲ３２２中
に挿入した。次に、Ｓ１ヌクレアーゼ及びウシ腸ホスフ
ァターゼにより処理されたｐ１２５の一部Ｐｖｕ　Ｉ消
化物を精製し、十分な長さの線状分子を分離した。

ｐ１２５の線状ＤＮＡへのそのＦｎｕＤ　ＩＩフラグメ
ントの結合の後、そのＤＮＡをＥ、コリ宿主（たとえば
ＪＭ８３　）中に形質転換した。次に、Ｘｇａｌプレー
ト上において３０°Ｃで白色及び４２°Ｃで青色の耐ア
ンピシリンコロニーを選択し、そしてＨＢＶ−ＳＡｇ（
たとえばＡｂｂｏｔｔ　Ａｕｓｚｙｍｅ　Ｕ試験により
）に基づいての生成のためにスクリーンした０次に、融
合タンパク質を、相補性についてアッセイする標準のイ
オン交換及びアフィニティーカラム技法により精製した
。

ＨＢＶ−５Ａｇについての酵素イムノアッセイサンプル
中のＨＢＶ　−ＳＡｇの存在又は量を測定するためのイ
ムノアッセイを、相同の抗体と未知のＨＢＶ　−ＳＡｇ
融合タンパク質とを競争せしめることによって調製する
ことができる。活性β−ガラクトシダーゼを生成する相
補的ＥＡ２３に利用できる遊離α−ＨＢＶ　−ＳＡｇタ
ンパク質の量は、測定された未知の遊＃　ＨＢＶ−ＳＡ
ｇの量に反比例するであろう。

例：肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＢＶ）のゲノムＤＮＡを、制
限酵素ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＩにより切断し、２つの
大きなりＮＡフラグメントを生成した。これらの大フラ
グメントの１つは、コアー抗原（ＨＢ　Ｖ　−ＣＡ　ｇ
　）をコードするコアー遺伝子を担持する。このフラグ
メントを、Ｍ　１３ｍｐｌＯＲＦ　ＤＮＡの複数クロー
ニング部位中に挿入した。このＨＢＶ挿入体を担持する
Ｍ１３ファージについて選択し、そしてスクリーンした
後、ファージの少々の調製物を精製した。コアー遺伝子
の（−）極性鎖（メツセンジャーＲＮＡに対して反対の
極性）を担持する一本鎖ＤＮＡを、ファージから分離し
た。

はとんどの遺伝子のように、コアー遺伝子はＡＴＧコド
ンで始まる。コアー遺伝子がすでにクローン化されてい
る発現ベクターはＡＴＧコドンを供給するので、第二の
コアーコドンで始まるＤＮＡフラグメントを得る必要が
あった。これは、コアー遺伝子のコドン２〜５の（＋）
鎖（メツセンジャーＲＮＡと同じ極性）を示す１２対の
一本鎖オリゴマーを（ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴ）を台
底することによって達成された。このオリゴマーを一本
鎖Ｍ１３ファージＤＮＡにハイブリダイズし、モしてＥ
、コリのＤＮＡポリマラーゼ■　（フレノウフラグメン
ト）ニより４’ｙ　　ビトロで延長した。この調製物を
旧ｎｃＩ［により消化し、翻訳終結コドンの３′側のコ
アー遺伝子の外側のＩ（ｅＶ　［ｌＮＡを切断した。そ
の後、ヌクレアーゼＳ１を用いて、コアー遺伝子の第２
コドンの５′側の一本鎖ＤＮＡを消化した。

これは、６８６塩基対フラグメント及び種々の長さの多
くの小さな二本鎖フラグメントを付与する。

この６８６塩基対のフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動により調製した。使用されるプラスくド発現ベク
ターは、Ｂａ＋ｍＨＩ制限部位の次にλＰｒプロモータ
ー及びＡＴＣ出発コドンを担持した。そのベクターをＢ
ａｒａＨＩにより消化し、そしてベクターをプラント末
端化するためにヌクレアーゼ３１により処理した。

次に、プラント末端化された発現ベクター及びコアー遺
伝子フラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて一緒
に連結し、そしてコンピテント細菌中に形質転換した。

得られたコロニーをスクリーンし、そして正しい配向で
挿入されたコアー遺伝子を担持するプラスミドを同定し
た。コロニーを、Ａｂｂｏｔｔ　Ｃｏｒｅ　Ａｎｔｉｇ
ｅｎ　ＥＬＩＳＡ試験（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａ−
ｔｏｒｉｅｓ）により、細胞分解物におけるコアー抗原
タンパク質の存在について試験した。プラスミドｐ１５
２を含むＭＧ１５２と呼ばれる強い免疫反応性の陽性ク
ローンを選択し、そしてそのＤＮＡ配列をＭａｘａｍ及
びＧ１１ｌｅｒｔのＤＮＡ配列決定法により確証した。

コアー抗原を精製し、そしてそれを用いて抗体を生成し
た。

ｐＦ２９のα−頭域のアミノ末端での制限部位はα−領
域へのコアー遺伝子の融合のために適合しないので、α
−遺伝子のアミノ末端での複数−クローニング領域にお
いて種々の制限部位を有する第ニブラスミドを構成する
ことが必要であった。

ＰＯＣｌ２をＥｃｏＲＩにより消化し、そして付着端を
ＤＮＡポリマラーゼ大フラグメント（フレノウフラグメ
ント）＋すべでの４種のｄＮＴＰによりフィルインした
。　Ｐｖｕ　Ｕ　８ｂｐ（ＧＣＡＧＣＴＧＣ）　　リン
カ−ＤＮＡをこの部位中に連結した。この変性されたプ
ラスミドをＢａｍＨＩ及びＰｖｕ　ＩＩにより消化し、
そして複数−クローニング部位におけるＰｖｕ　ＩＩリ
ンカの付加によるα−断片のＮ−末端を単離した。ｐＦ
２９プラスξドＤＮＡをまた、Ｂａｓ＋ＦＩ　Ｉ及びＰ
ｖｕ　Ｉにより消化し、モしてｐＦ２９のα−領域を除
き、そしてαｅＮ域のＮ−末端の複数−クローニング領
域に新規の配列を含むα−領域により置換した。この新
規のプラスミドをｐ１５４と命名した。

コアーα融合タンパク質を構成するために、ｐ１５２か
らのコアー遺伝子を、ｐ１５４のα−遺伝子の複数−ク
ローニング部位中にλＰｒ制限下で挿入した。　　ｐ１
５４ＤＮＡ制限酵素Ｂｃｌ　Ｔ及びＡｖａ　Ｉにより消
化した。この切断により創造された介在ＤＮＡフラグメ
ントは、はとんどのλＣＩ遺伝子及びλＰｒプロモータ
ー並びにコアー遺伝子を担持するが、しかしコアー遺伝
子の４種の３′−末端コトンは有さなかった。このＤＮ
Ａフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製し
た。プラスごドｐ１５４を制限酵素Ｂｃｌｌ及びＸｍａ
　Ｉにより消化し、そして介在断片を除き、そしてｐ１
５２からのＢｃｌ　Ｉ　−Ａｖａ　Ｉ　　ＤＮＡフラグ
メントにより置換した（Ｘａｎａ　Ｉ及びＡｖａ　Ｔは
適合する付着端を有する）。従って、４個の３′末端コ
ドンを有さないλＰｒ制限下でのコアー遺伝子を、ＨＢ
Ｖコアー抗原−α融合ペプチドを発現するイン−フレー
ム遺伝子融合体を創造するｐ１５４におけるα−領域の
複数−クローニング部位中に挿入した。この新規のコア
ーα発現プラスミドを、プラスミドｐ１５７として言及
する。融合ペプチドを精製し、そしてＨＢＶ　−ＳＡｇ
について概略された方法に類似する方法で肝炎コアー抗
原についてのイムノアッセイを構成するために抗体と共
に使用した。

例：ビオチンについてのアッセイ この例は、分析物−結合タンパク質として糖タンパク賞
アビジンを用いてのビオチンについての競争結合アッセ
イを例示する。

アビジン（ＭＷ＝６７．０００ドルトン）は、１０ＩＳ
Ｌ１モルの会合定数でもってビオチン（ＭＷ＝２４４ド
ルトン）を結合する。ビオチンを、Ｈ６の位置６５で及
びＮ−末端α−アミノ基でリシンに結合した。アビジン
溶液を、酵素−供与体に共役されたアビジンがＥ＾２３
との相補性を阻害するかどうかを決定するために、分析
物結合タンパク質として使用した。

酵素−供与体Ｈ６へのビオチンの共役は、次の通りにし
て行なわれた。上記のようにして調製された凍結乾燥Ｈ
６を０．１　Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）　０
．１５ｄに溶解し、そして室温で撹拌した。Ｎ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）における１０■／−での
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＯ）の２
種の５ｐ！アリコートを添加した。室温で１時間後、そ
の溶液を遠心分離し、そしてその上清液を、０．１Ｍの
硼酸ナトリウム（ｐＨ１９，０）により平衡化されたＢ
ｌｏ−Ｇｅ１　　Ｐ−２（０，６Ｘ１６ｃｍ）サイズカ
ラム（ＢｉｏＲａｄ　ｔ、ａｂｓｌ　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ
＋　（Ａ）に適用し、そして同じ緩衝液により溶出した
。１０滴の両分を集め、そしてビオチニル−Ｈ６接合体
（すなわち相補的活性）を含む画分をプールした。

予備実験において、滴定を、相補性を阻害するために必
要とされるアビジンの濃度を決定するために行なった。

ＰＭ２緩衝液、ビオチニル化されたＨ６、アビジン、Ｅ
＾２３及び基質０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドを、マイクロタイタープレートのウェルに添
加した。３７°Ｃで１５分後、４１４ｎｍ（ＯＤｎ＋４
）での光学密度を決定した。第４表はその結果を示す。

このデータは、０．５ｎのアビジン（７，５Ｘ１０−”
モル）が相補的反応の７５％を阻害することを示す。

第４表 １　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　０．５
４５２０．１０．４９９ ３　　　　　　　　　　０．２　　　　　　　　　０．
４３８４　　　　　　　　　　０．３　　　　　　　　
　０．３７０５　　　　　　　　　　０．５　　　　　
　　　　０．１３３６　　　　　　　　　　１．０　　
　　　　　　　０．１２３（ａ）　　上記のようにして
調製された２、　５　ＩＪｌのビオチニル化されたＨ６
；２０１１１のＥＡ２３　（３，６Ｘ　１０−’Ｍ）；
及び１００ｍの基質０−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラク
トピラノシド（ＯＮＰＧ）　（１０■／−）がウェル当
たりに使用された。十分なＰ？’１２緩衝液を個々のウ
ェルに添加し、最終体積を２００１１１にした。

ビオチンについての競争結合アッセイを、予備実験のた
めに記載されるようにして行なった。但し、種々の濃度
の遊離Ｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を添加し、競争結合曲線を
生成した。従って、個々のウェルは、５ＪｄのＥＡ２３
　（３，６ｘｌＯ−’Ｍ）　；　　１００ｐｆの０ＮＰ
Ｇ　（１０ｘ／ｄ）及び合計体積を約２００４にするの
に十分なＰＭ２緩衝液を含んだ。光学密度（４１４ｎｍ
）を１５分後に測定した。これまで示されたように、こ
のアッセイシステムは、１〜８■の範囲にわたってのビ
オチン又は４〜３２ＸＩＱ−”Ｍのビオチンについて良
好なアッセイを提供する。アビジン−ビオチンシステム
（Ｋ＆＝２ＸＩＯ１ＳＬ１モル）は、１５分のアッセイ
内に相補性を制御するのに十分な親和性（Ｋ、＝１〜２
Ｘ１０’Ｌ１モル）を有する。

例：ビオチンについての不均質相補的アッセイこの例は
、特異的分析物−結合タンパク質としてアビジンを用い
てのビオチンについての不均質アッセイシステムを例示
する。酵素−受容体はＥＡ２３であり、そして酵素−供
与体はビチオンに共役されたＣＮＢｒ２　（この後、Ｃ
ＮＢｒ　２−ビオチン接合体と言及する）である。

ＣＮＢｒ　２−ビオチン接合体を次の通りにして合成し
た：凛結乾燥されたＣＮＢｒ　２ポリペプチド９００ｊ
Ｉｇを０．１　Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
５）３００〆に溶解した。〔Ｎ−ヒドロキシ−（Ｄ−ビ
オチンスクシンイミドエステル又はＮ−ヒドロキシスク
シンイミドビオチン）スクシンイミド活性化ビオチン（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌ
ｏｕｔｓ、　ＭＯ）　）２．１■を含むＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｊ１１のアリコートを
、室温で撹拌しなから２０Ｊ１１のアリコートづつ添加
した。２時間後、その反応混合物を、０．１Ｍの硼酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，０）を用いてＢｉｏｇｅｌｐ
−２カラム（１，５Ｘ４８ｃｍ）上でクロマトグラフィ
ー処理した。ＣＮＢｒ２−ビオチン接合体を含む両分を
、ＥＡ２３との相補的反応により同定した。

アビジン固定化アガロース（アビジン−アガロース、　
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌ
ｏｕｉｓ、　ＭＯ＋懸濁液１ｉ１１当たり１７．５単位
、ここで１単位はｌｘ／ｇのビオチンピ結合する）原液
を、低いゲル温度のアガロース懸濁液に希釈しく６■／
−）、所望するレベルのアビジン−アガロースを得た。

アビジン−アガロースによるＣＮＢｒ　２−ビオチン相
補性活性の阻害 ＣＮＢｒ　２−ビオチン接合体原液（５Ｘｌ０−’Ｍ）
　２０メ、門２緩衝液９０ｄ及び種々の希釈度のアビジ
ン−アガロース２０バをＥｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル中
で十分に混合し、そして室温で１０分間インキュベート
した。次に、そのバイアルを５分間遠心分離し、そして
上清液１００ｔ１１を個々のバイアルからマイクロタイ
ターウェル中に移しくそれぞれＥＡ２３原液（１，５Ｘ
　１０−’Ｍ　）　１０ｄを含む）、モして３７°Ｃで
１５分間インキュベートした。次に、１ｌｏＮｐｃ　（
１０■／　ｒｎｌの１００ｍ）を添加し、モして３７°
Ｃで３０分後、４１４ｎｍでの個々のウェルの吸光度を
測定し、結果をグラフで示すことにより正確な値を得た
。

固定化されたアビジンについてのＣＮＢｒ　２−ビオチ
ン接合体とビオチンとの競争 上記で決定された力価値を用いて、ビオチン投与量応答
曲線が次のようにして得られる。アビジン−アガロース
懸濁液（合計０．３５単位）２０１及び種々のレベルの
ビオチンを含むＰＭ２１１衝液９０μｌを、Ｂｐｐｅｎ
ｄｏｒｆバイアル中で十分に混合し、そして室温で１０
分間インキュベートした。次に、ＣＮＢｒ　２−ビオチ
ン接合体原液（５ｘｌＯ−’Ｍ）　２０ｓを添加し、十
分に混合し、そして室温で１０分間インキュベートした
。次に、バイアルを５分間遠心分離し、そして懸濁液１
００１１！を個々のバイアルからマイクロタイターウェ
ル（個々はＥＡ２３原液（１，５Ｘ　１０−６Ｍ　）１
０Ｊを含む）に移し、そして３７℃で１５分間インキュ
ベートした。、基質０ＮＰＧ　（１０■／−の１．００
Ｊ）を添加し、モして４１４ｎｍでの個々のウェルの吸
光度を、３７°Ｃで３０分間のインキュベーションの後
、測の量を定量化することができる。

例：ジゴキシンについての酵素イムノアッセイこの例は
、分析物が強心性ジギタリスグリコシドジゴキシンであ
る酵素イムノアッセイを示す。

分析物−結合タンパク質は、ジゴキシンに対して特異的
な抗体である。例は、アッセイの作用の機構がＣａｓ　
ｔｒｏ及びＭｏｎｊｉ（１９８１，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ７３：５２３〜４２）により
記載されるβ−ガラクトシダーゼを用いての静的封鎖酵
素イムノアッセイに類似しないことをさらに示す。

ジゴキシン−ＥＤ、接合体の調製 ジゴキシゲニンのウレタン誘導体、特に３−３−０−（
マレイミドフェニルカルバミル）ジゴキシゲニン〔この
後、“°ジコキシンーマレイミドアダクト”として言及
される〕を次のようにして調製した： 磁気撹拌機、アルゴン入口及び還流冷却器を備えた乾燥
した１０ｄの丸底フラスコに、３−カルポキシフェニル
マレイ旦ド（６７■又は０．３０７ｍモル）、無水ベン
ゼン（３ｄ）及び無水トリエチルアミン（０，０４３ｄ
又は０．３０７ｍモル）を添加した。その混合物を３０
分間還流した。アリコートの赤外スペクトル分析（ＩＲ
）は、カルボニルアジド（２１５０ｃｍ−’　）への転
換を示した。次に、ジゴキシゲニン（８０■又は０．２
０５ｍモル）及び無水テトラヒドロフラン（２ｄ）をそ
の反応混合物に添加した。３．５時間の還流の後、反応
混合物を酢酸エチル（１００ｄ）により希釈し、５０−
の冷たい１％ＮａＯＨ水溶液により１度及び５０ａ！の
飽和ＮａＨＣＯ３水溶液により１度洗浄した０次に、有
機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥せしめ、濾過し、そして
溶媒を回転蒸発により除去した。

残留物を約１〜２−のアセトンに溶解し、そして２種の
分離用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（１
５００−５クロンのシリカゲル＾ｎａｌｔｅｃｈユニプ
レート、Ａｎａｌｔｅｃｈ、　Ｎｅｗａｒｌ＋　ＤＥ）
に適用した。アセトンを蒸発した後、プレートを、８０
／２０の酢酸エチル／ベンゼンにより溶出した。反応し
なかったジゴキシゲニンを、酢酸エチル３０ｄにより３
度洗浄することによってプレートから除去した。この方
法を、ジゴキシゲニンの上の次の２つのスポットについ
てくり返した。この精製は、ジゴキシゲニン（２６■）
、所望する生成物、ジゴキシン〜マレイξドアダクト（
３１■又はしなかった出発材料に基づいて３７％の収率
）及び３−０３−０−（レイミド−フェニルカルバミル
）〜ジゴキシゲニン（２８■又は反応した出発材料に基
づいて３３％の収率）をもたらした。

薄層クロマトグラフィー処理を、ジゴキシン−マレイミ
ドアダクトの純度を確かめるために２．５％のＭｅＯＨ
ＣＨｚＣｌ□により行なった。追加の精製が所望される
場合、これは３％ＭｅＯＨ／　ＣＨｚＣｆ　ｔによる分
離用ＴＬＣにより最良に遠戚される（２回の溶出）。ジ
ゴキシン−マレイミドアダクトは、次のスペクトル特徴
を有した：赤外（ｎｕｊｏｌ　ｍａｌｌ）　：３４９０
、３３５０．１８０５．１７６０．１７２５．１７００
．１６１５゜１５５０、１４６０．１３０５．１２４０
．１１６０．９６０．９３５．９０５゜８８０、８４０
．８１０．７９０．７１０Ｃ１１−’。（ＮＭＲ，核磁
気共鳴、アセトンｄ、）　：　０．８　（３Ｈ、Ｓ）　
、３．３８（ＩＨ，ｂｒｓ）、３．４０　（Ｉ　Ｈ、ｑ
　、　Ｊ　＝４．７８Ｈｚ）、４．８４（２Ｈ，ｔ　、
Ｊ＝１．５Ｈｚ）、５．００（ＩＨ，ｍ）、５．７８　
（ｌ　Ｈ、ｔ　、　Ｊ＝１．５七）　、６．９８　（ｓ
　、　２ｔｌＯ）。

６．８〜７．７　（４）（、ｍ）　、８．７５　（Ｉ　
Ｈ、ｂｒｓ）。質量スペクトル（ｃＤＩ−ＮＨａ）　：
　６２２（Ｍ　＋　ＮＨ４”）　６０５（Ｍ＋　Ｈ３０
）　５８７（Ｍ　＋　Ｈ＋　−Ｈ２）、３９１．３７３
．３５５゜３３７、２１４．１９１．１８９゜ 次に、ジゴキシン−マレイミドアダクトを、Ｂｅｃｋｍ
ａｎ　Ｍｏｄｅｌ　３３２の高性能液体クロマトグラフ
ィーシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｐａｌ。

Ａｌｔｏ、　（Ａ）を用いてＲＰ−８５ｙｎＣｈｒｏｐ
ａｋ　２５０Ｘ１０ｍｍ１、Ｄ、（ＳｙｎＣｈｒｏｎ＋
　Ｉｎｃ、、　Ｌｉｎｄｅｎ、　１０）上でさらに精製
した。グラジェント溶出を、流速１．５ｄ／分で、６０
分間にわたって水中、０〜８０％のアセトニトリルから
行なった。ジゴキシン−マレイミドアダクトをプールし
、そして凍結乾燥せしめた。

次に、精製されたジゴキシン−マレイミドアダクトを、
前記のようにして調製された酵素−供与体ＥＤａに共役
し、ジゴキシン−ＨＤ、、すなわち酵素−供与体分析物
接合体を形成した。ＨＤ、（１，５■）を、アセトニト
リル−３０ｍＭのリン酸ナトリウム（３：２）溶液２４
０１にｐＨ６，０で溶解した。ジゴキシン−マレイミド
アダクト（１，０■）を、３７°Ｃで２時間維持された
反応混合物に直接添加した。

共役反応の完結後、６０ｕｌのアリコートのその混合物
を、Ｂｏｎｄａｐａｋ　＠フェニルカラム１０Ｘ３０ｃ
ｍ（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃ１０Ｘ３０＋　Ｍｉｌｆｏ
ｒｄ、　ＭＡ）上に注入した。そのカラムを、６０分の
水中、０〜８０％のアセトニトリルグラジェント、０．
１％のトリフルオロ酢酸により展開した。酵素−供与体
活性を含むサンプルをプールした。

ジゴキシンについてのイムノアッセイ 本発明の方法に従って調製された酵素イムノアッセイの
システムにおいては、種々の濃度の酵素−受容体及び酵
素−供与体接合体（すなわち分析物に共役された酵素−
供与体）の組合せを用いて、相補的方法により一定のβ
−ガラクトシダーゼ濃縮物を生成することができる。低
い質量作用は、酵素−受容体の比較的高い濃度で、相補
的方法に対する抗体の阻害影響が緩和されることを必要
とする。これは、種々の濃度の分析物、たとえばジゴキ
シンによる平らな又は不在の用量−反応特徴により明ら
かにされる。逆に、酵素−供与体接合体（抗体に比べて
）の比較的高い濃度で、相補的方法に対する抗体の阻害
影響がまた失なわれる。

後者の状況はまた、平らな又は不在の用量−反応特徴及
び高められたバックグラウンドにより明らかにされる。

この例は、ちょうど従来の酵素イムノアッセイにおける
ように、酵素−受容体、酵素−供与体及び特異的抗体の
相対的濃度が、分析物のための診断アッセイに使用する
ために適切な精度（傾斜）及び感度を有する用量−反応
特徴を有するアッセイを作り出すために定義されるべき
であることを例示する。

マイクロタイター法を用いる１つの一連の実験において
、そのシステムの感度は、ジゴキシン−ＥＤ、酵素−供
与体及びＥＡ２３酵素−受容体の種々の濃度の組合せを
用いて決定された。

アッセイを、それぞれ５０ｉ！１のジゴキシン（分析物
）、酵素−供与体Ｈ６ジゴキシン接合体、ジゴキシンに
対して特異的な抗体（抗−ジゴキシン）及び酵素−受容
体（ＥＡ２３）及び基質としての５■／ｌの０−ニトロ
フェニル−β−り一カラクトビラノシド（ＯＮＰＧ）を
含む溶液の連続的な添加により行なった。すべての希釈
は、ＰＭ２緩衝液（０，５ＭのＮａ、ＨＰＯ，、１ｎ＋
ＭのＭｇ５Ｏａ　、　１　ｍＭのＥＤＴＡ　、　０．０
２％のＮａＮ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０　（ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート、　Ｓｆｇ
ｍａ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、＋Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ
、　ＭＯ）　）により行なった。ジオキシン分析物の濃
度は、０　、１．１０．　１００．　２００．　５００
及び１１０００ｎ／ｍであった。ジゴキシンに対して特
異的な抗体を、次のようにしてウサギ中にジゴキシン接
合体を注入することによって得たニー次筋肉内注射を、
完全フロインドアジュバント２．０−の合計体積中、接
合体５０ｕ！を用いて行なった。二次免疫注射（筋肉内
）を、完全フロインドアジュバント１．０　ｄの体積中
、接合体２５ｍにより４週間隔で行なった。５０ｍの血
液を、−次注射から９０日間、２週ごとに集めた。採血
は、正中動脈の切開により又は耳周囲の静脈を刺すこと
により行なわれた。

血液を凝集せしめ、そして血液５０ｄ当たり血清２５−
を、１１０００Ｘで３０分間遠心分離した後、上清液と
して回収した。その結果はグラフに示された。

用量−反応曲線の比較は、酵素−受容体又は酵素−供与
体接合体のいづれかの濃度の選択的低下が、急勾配及び
従ってより感受性の用量−反応曲線を生成することを示
した。

ジゴキシンイムノアッセイの機構 抗−ジゴキシン抗体と酵素−供与体ジゴキシン接合体と
の反応が重合されたβ−ガラクトシダーゼ酵素による基
質の転換よりもむしろ相補的工程を妨害するかどうかを
決定するために、相補的工程を、１つの一連の実験にお
ける抗体の添加の前、完結進行せしめた。

実験の方法は次の通りであった：ＰＭ２緩衝液３００　
ｄ及びジゴキシン−Ｈ６接合体と、酵素−受容体ＥＡ２
３　（４，Ｉ　ＸＩＯ−ｂＭ）１５０１１！とを６０分
間反応せしめた。これは、相補性の完全な進行を可能に
した。上記反応混合物のアリコート（１２５Ｊ１１）を
除き、そしてウサギ抗−ジゴキシン抗体（ＰＭ　２１１
衝液により１：１００に希釈された）のアリコート（５
０ｍ）に添加した０次に、その反応混合物を、３０分間
インキエベートした。この時の最後で、０ＮＰＧ基質（
最終濃度ｌ■／ｄ）を添加し、そしてその反応混合物を
３７°Ｃでインキュベートした。その反応混合物の光学
密度を、３７℃でのインキュベーションの後、７及び１
６分で決定した。対照の管を同じようにして処理した。

但し、（ＰＭ２緩衝液）又はＰＭ２緩衝液により１：１
００に希釈された正常なウサギ血清５０ｍを、ウサギ抗
−ジゴキシン抗血清の代わりに添加した。結果は第５表
に示される。

第５表 サンプル　　　　　　−エ立−−旦公一抗一ジゴキシン
（”　　　、４７５　　　　．９４７Ｎ　　ＲＳ　　”
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、４６
６　　　　　　　　　　　　．９５４Ｐ門２　”’　　
　　　　　　　、４５７　　　　．９３６基質ブランク
　　　　　、０５０　　　　．０５７（ａ）抗〜ジゴキ
シンはウサギ５３９を示す（５０１１１ＰＭ２緩衝液中
における１：１００の希釈）。

（ｂ）ＮＲＳは正常なウサギ血清を示す（５０ｐ！。

ＰＭ２緩衝液中における１：１００の希釈）。

＜ｃ＞ｐｎ２Ｉ！衝液：　０．５　ＭのＮａｔｌｌＰ０
４．　ｐＨ７，０。

ＩｍＭのＭｇＳＯ４，Ｑ、１８ａ＋ＭのＭｎ５Ｏａ　、
　１　ｍＨのＥＤＴＡ第５表に示されるように、 抗体は前で重合され たβ−ガラクトシダーゼによる基質の転換を阻害しなか
った（ジゴキシン−ＥＤ４及びＥＡ２３酵素−受容体の
完全な相補性）。従って、酵素アッセイを用いて観察さ
れた低められた基質転換は、抗体−阻害相補性の結果で
あり、減じられた酵素基質転換の結果ではない。従って
、本発明のアッセイの作用の機構は、Ｃａｓ　ｔｒｏ及
びＭｏｎｊｉ（１９８１，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏ、１ｏｇｇ　７３　：　　５２３〜５４２）によ
り記載されるβ−ガラクトシダーゼを用いての静的妨害
酵素イムノアッセイに類似しない。

種々の酵素−受容体を用いての相補性に対する抗−ジゴ
キシン抗体の効果 １つの一連の実験において、ジオキシンに対する特異的
抗体の阻害効果を、３種の酵素−受容体及び上記のよう
にして調製された酵素−供与体ジゴキシン−Ｈ６接合体
を用いて決定した。

反応混合物を次の通りにして調製した：ＰＭ２緩衝液５
０ｄ、ＰＭ２Ｅｌ街液におけるジゴキシン−ＥＤ。

接合体の適切な希釈溶液（１：２０．１　：４０．１　
：８０）　５０ｍ、適切な抗体（すなわち、正常なウサ
ギ血清に対する抗−ジゴキシン抗体）５０１及び酵素受
容体（Ｉ　Ｘｌ０−’ＭのＥＡ１４　、　ＥＡ２０又は
ＥＡ２２）及び基質０−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（５■／−）の適切な混
合物５゜ｄを、マイクロタイタープレートに添加した。

次に、そのプレートを、３７℃で特定の時間インキュベ
ートした。４１４ｒ＋ｎ＋での光学密度を、５分間隔で
４５分間にわたって決定した。

次の表は、α−領域酵素受容体配列を示す。

１５ １１２ Ａ５ Ｅ＾１１ Ａ１４ ＥＡ１７ アミノ酸欠失 １１−４１ ２３−３１ ３５−５２ ３５−５４ ３０−３７ ２１−５３ ＥＡ１８　　　　　　　　　　　１３　−　４５ＥＡ２
０　　　　　　　　　　２６　−４５ＥＡ２２　　　　
　　　　　　　１３　−　４０ＥＡ２３　　　　　　　
　　　　１６　−　３５ＥＡ２４　　　　　　　　　　
　２２　−３５このシステムにおける相補性に対する抗
体の阻害効果は、酵素−受容体における欠失の大きさに
関係していると思われる。アミノ酸１３〜４ｏを欠失し
、そしてこの実験において試験された最大の欠失である
酵素−受容体ＥＡ２２は、抗体により最少に阻害された
。酵素−受容体、すなわちアミノ酸３０〜３７を欠失す
るＥＡ１４は試験されたグループのうち最少であり、そ
して抗体によりほとんど阻害された。アミノ酸２６〜２
５を含み、そして大きさ的にＢＡ２２とＥＡ１４との中
間体であるＥＡ２０は、比較的軽く阻害された。しかし
ながら、ＥＡ２０の生来の相補性効率は、ＥＡ１４又は
ＥＡ２２のいづれかの効率よりも低い。酵素−受容体は
、次の２つの基準を満たすべきである：　（ａ）生来の
相補性効率、たとえばＥＡ１４及びＥＡ２２は等モル濃
度に基づいて他の配列よりもより効果的であり；そして
（ｂ）相補性を阻害する特異的分析物−結合タンパク質
の能力。

例：ジゴキシン酵素イムノアッセイに対する第二抗体の
効果 上記で示された結果は、本発明の酵素−供与体−ジゴキ
シン接合体への抗−ジゴキシン抗体の共役が、酵素−受
容体及び酵素−供与体接合体の相補性の速度を遅くする
ことを示唆する。しかしながら、そのような共役は、相
補性を完全に妨げない。従って、上記で述べたように、
このシステムは、酵素−受容体及び酵素−供与体接合体
の約１５分のインキュベーションで最大の感度を有する
。

そのシステムは、約１５分で最大の吸光度示差に達する
。この時点で、存在する抗−ジゴキシン抗体を有するシ
ステムにおけるβ−ガラクトシダーゼの濃度は、抗体が
不在であるか、又はジゴキシン抗体が中和されている（
たとえば高いジゴキシンレベル）システムにおけるその
濃度と同じである。β−ガラクトシダーゼの濃度が同じ
であるので、基質転換の速度は同じである。追加の吸光
度示差は存在しない。相補性に対する抗体の効力を制限
するこの現象は、用量−反応曲線についての狭い吸光度
範囲、単調な傾斜特徴及びある診断的な適用のためのア
ッセイの不適切な感度をもたらす。

次の例は、抗−ジゴキシン接合体抗体に対して特異的な
第二抗体の結合は、相補性の阻害を増強することを示す
。

全第二抗体の結合 １つの一連の実験において、ウサギ抗−ジゴキシン抗体
（１：１０００に希釈された）５０Ｉｌｌを、ジゴキシ
ン−Ｈ６（ＰＭ２緩衝液によりｌ：５０に希釈された）
５０１１１及び０　、１．２．５　、５．７．５．１０
゜１１００ｎ／Ｉ１１の濃度でのジゴキシン５０ハと共
にマイクロタイターウェルにおいて混合した。第二抗体
調製物（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂ、　Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒ
ｙ、　ＴＸ、ヤギ抗−ウサギ血清に５０〜１：８００）
の５０ｍアリコートをそれぞれのウェルに添加した。結
果は第６及び７表に示される。

第６表に示されるように、抗体−ジゴキシンＨ６接合体
への第二抗体の結合により達成される相補性に対する゛
阻害効果は、第二抗体の１＝５０希釈度又はそれ以上の
希釈度で最適である。第二抗体の１：２００〜１：３０
０の希釈度で、すべての相乗性阻害が失われる。従って
、第二抗体を伴っての又は伴わないでの相補性の阻害は
、この希釈度又はそれ以上の希釈度で同しである。

第７表に示されるように、第二抗体が存在しない場合、
基質転換の速度（すなわちβ−ガラクトシダーゼ濃度）
は、３０分以内で最大速度の７０％に達した。第二抗体
が１：４０の希釈度で存在する場合、基質転換の割合は
最大の割合の約２５％であった。第二抗体の１：４０希
釈度以上で、相補性に対する阻害効果は、時間にわたっ
て基質転換の速度を早めることにより明らかなように減
少した。

１：４０の希釈度又はそれ以上の希釈度で、その効果は
、基質転換の速度の上昇をもたらす。

試験された第二抗体のすべての濃度で、基質転換の速度
（すなわちβ−ガラクトシダーゼ濃度）は、β−ガラク
トシダーゼの最大濃度以下のレベルで直線になった（す
なわち、新規のβガラクトシダーゼは生成されなかった
）。これは、第二抗体の結合が第一抗体の静的妨害を高
め、そして結合される酵素二供与体集団により相補性を
完全に妨げることができることを示す。

第二抗体のフラグメントの結合 第二抗体が、沈降素複合体における酵素−供与体接合体
の静的妨害に帰する第−抗体一酵素一供与体接合体に共
役される場合に観察される増強された阻害性を決定する
ために、ヤギ抗−ウサギ免疫グロブリンの一価Ｆａｂフ
ラグメント（抗原結合フラグメント、約５０．０００ド
ルトンのＭＷ）を、第二抗体として使用した。Ｆａｂフ
ラグメントは抗原を交着することができないので、それ
らは沈降素又は凝集反応を誘導することができない。こ
の調製で観察される相補性の阻害は、相補性に対する増
強された静的効果によるものであり、そして接合体の増
強された妨害によるものではない。

マイクロタイタープレート法においては、ジゴキシン（
０、１、４、１０、１１０００ｎ／ｄ）　　；ジゴキシ
ン−Ｈ６接合体；ウサギ抗−ジゴキシン第一抗体（１：
　４０００）及びｌ：８０の希釈度での第二ヤギ抗−ウ
サギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｓ、　Ｍｏｎｔｇｏｍ
ｅｒｙ、　Ｔχ）のそれぞれ５０１１１の連続した５回
の等しい添加が存在する。すべての希釈はＰＭ２ｉ１衝
液で行なわれた。

第二抗体を、正意なウサギ血清（１：８０）及び１：１
０．１：２０，１：４０．ｌニー８０，１：　　１６０
；１：３２０の希釈度でのヤギ抗−ウサギ血清のＦａｂ
フラグメント（ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ＋　　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　　ＰＡ）により
交換した。室温で１０分後、５０！１１のＩ　Ｘｌ０−
’ＭノＥＡ１４及び５　ｍｇ／ｄ　ＯＭ質０ＮＰＧを添
加し、そしてインキュベーシゴンを３７°Ｃで３０分間
続けた。

００４１４を測定し、そしてＢｏｕｎｄ　／　Ｍａｘｉ
ａ＋ｕｍ　Ｂｏｕｎ（Ｂ／Ｂ１１ａ）を決定した。

結果は第８表に示される。

第８表 Ｆｂのフーグメントのｔ 基質転換の速度（Ｂ／Ｂ門ＡＸ） ヤギ抗−ウサギ １ｇ（、ｌＮ ５６．７ ６６．３ ８１．９ ９４．０ １．００ ナシ１０ ９５．４ ９１．３ ８８．７ ９７．１ ００ 第８表に示されるように、ヤギ抗−ウサギ免疫グロブリ
ン（Ｆａｂフラグメント）が第−抗体酵素−供与体接合
体に共役される場合、低められた相補性が明白である。

　　Ｆａｂフラグメントにより誘発された相補性の阻害
は、完全な抗体を用いる場合に観察されるその阻害にほ
ぼ等しい。

第８表に示されるように、第二抗体は、低い用量で相補
性に対してより高い阻害効果を有した（すなわち、より
高い抗体／酵素−供与体の相互作用が過剰のｉａ分析物
により引き起こされ得た）。

Ｆａｂｉｆｉ度の低下は、相補性の阻害において直線的
な減少をもたらした。第６表において、損なわれていな
い分子は、１：４０以上の希釈度で第二抗体の有効性の
低下を示した。同様に、同じ現象が、Ｆａｂ調製物の１
：４０希釈度での開始が見られる。

分析物−特異的抗体による相補性の阻害；ＥＤジゴキシ
ン接合体の比較 特異的分析物抗体による相補性活性の特異的阻害のため
の種々のＥＤ−ジゴキシン接合体の比較を行なった。下
記に示される実験において、ＥＡ２２により共役された
酵素−供与体の相補性活性を標準化した。種々のＥＤの
ジゴキシン−接合体を、上記のようにして調製した。但
し、共役のｐＨがジゴキシン−マレイミドをα−アミノ
基及びα−領域に近いシスティンの両者に共役するため
に、９．５に高められたＥＤ４（２−ジゴキシン）を除
く。

抗−ジゴキシン抗体及びヤギ抗−ウサギ抗体濃度を両者
とも標準化した。結果は第９表に示される。

第　　９　　表 分析物−特異的抗体による相補性の阻害群索二供与止　
　　　　徂且牲坐Ｘ里査王ＥＤ　５　　　　　　　　　
　６６ ＥＤ　４　　　　　　　　　　６８ ＥＤ　４　　　　　　　　　　５１ 第二抗体を用いる改良されたチロキシン及びジゴキシン
アッセイ チロキシン及びジゴキシン酵素相補性イムノアッセイを
、第二抗体を用いて行なった。

チロキシン（Ｔ４）アッセイを、Ｂａｋｅｒ　Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、　ＰＡ）からの
遠心分離分析機、ＥＮＣＯＲＥ　＠に基づいてＥＡ２２
及びＥＤ４によりさらに改良した。アッセイシステムは
、患者からのサンプル１０１１また抗−Ｔ４抗体及びサ
リチレートを含む酵素−受容体試薬１００ｍ及びまた第
二ヤギ抗−ウサギ抗体及び基ｆＯ−ニトローフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含む酵素−
供与体試薬２９０　ｕｌから構成された。最終システム
濃度は次の通りであった： 酵素−受容体（Ｅへ２２） １°Ｔ４抗体 サリチレート 酵素−供与体（ＥＤ４−Ｔ４） ２°ヤギ抗−ウサギ抗体 ０．６２５Ｘ１０−’Ｍ １／１２００ ０ｎＭ １／２７６ １／２００ 読み取りは９００秒で取られた。種々の患者のＴ４サン
プルが使用される場合、ＯＤ／分の変化が、個々の患者
のサンプルからの００４゜、での±５０ｍ０Ｄによりプ
ロットされるべきである。完全なヒト血清において調製
された検量針によるＴ４アッセイが行なわれた。９００
秒での検量計量の吸光度の変化を、血清Ｔ４濃度に対し
てプロットした。

ジゴキシンアッセイを、ＥＤ５及びＥＡ２２並びにＢａ
ｋｅｒ製のＥＮＣＯＲＥ　＠遠心分離分析機を用いて改
良した。ジゴキシン対照をヒト血清により調製した。

そのアッセイは、血清３０１１１、ＥＤ５−ジゴキシン
試薬２００ｐＺ及びＥＡ２２試薬１００ｄから構成され
た。

ＥＤ５−ジゴキシン試薬はまた、基ｆＯ−ニトロフェニ
ルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びヤギ抗−ウサギ抗
体も含んだ。ＥＡ２２試薬は、ウサギ抗−ジゴキシン抗
体を含んだ。最終システムの濃度は次の通りであった： 血　　　清　　　　　　　　　　　　　　９．１％ＥＡ
２２　　　　　　　　　　　　　　　　　２　ＸＩＯ−
７ＭＥＤ５−ジゴキシン　　　　　　１　：　１５００
１’ジゴキシン抗体　　　　　１　：　５９．４００２
°ヤギ抗−ウサギ抗体　　　１：２００このアッセイに
ついての標準曲線が得られた。

ジゴキシンイムノアッセイにおける遺伝子工学的に構成
された及び化学的に合成された酵素−供与体の性能の比
較 遺伝子工学的に構成された成分対化学合成された成分に
より行なわれる酵素イムノアッセイを比較するために、
２種の類似する酵素−供与体を調製し、ここで１つば組
換えＤＮＡ技法により、そして他は化学的ペプチド合成
によるものである。

遺伝子工学により創造されたＥＤ３のアミノ酸配列及び
ポリペプチド合成により創造されたＥＤ３Ａのアミノ酸
配列は次の通りである： Ｅｌ）３ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａ
ｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　５ｅｒＶａｌ
　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　ＧＩｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｐ　Ｔｒｐ　ＧＪｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＧｌｕ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　
　Ａｌａ　　Ｈｌｓ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　
　ＡｌａＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａ
ｌａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　５ｅ
ｒＬｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅａ　　Ａｓｎ　
　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　
　Ｓｅｒ　　ＡｌａＰｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ｌｅｎ　　Ａｌａ Ｖａｌ　　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　Ｔｒｐ Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ Ｄ３Ａ Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＡｒｇＴｒｐ
　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　
Ｇｉｎ　Ｌｅａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＬｅｕＨｉｓ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｔ
ｒｐ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｕｈｒ これらの２種のペプチドの目立った特徴は、分析物への
化学的共役のために使用される星印により示される類似
するシスティン残基（ｃｙｓ）及びＥＤ３においては、
アミノ酸１２〜５０　（１２、５０を含む）の間に位置
し、そしてＩｌ！Ｄ３＾においては、アミノ酸５〜４３
（５，４３を含む）の間に位置する類似するα−供与体
ドメインであり、そして野生型β−ガＡｒｇ　　Ａｓｐ Ａｌａ　　Ａｌａ Ａｌａ　Ａｒｇ ラクトシダーゼのアミノ酸６〜４４に対応することであ
る。

ＥＤ３及びＥＤ３Ａへのジゴキシンの接合は、上記のよ
うにして３−０−　（マレイミド　フェニルカルバ〔ル
）−ジゴキシン抗体により行なわれた。

ＥＤ３　、　ＥＤ３Ａ、ジゴキシン−ＥＤ３及びジゴキ
シン−Ｅ［１３４の調製は、溶離剤として０．１％のＴ
ＦＡを含む、水中、０．８０％のア七ト二トリルのグラ
ジェントを用いての分離用ＨＰＬＣフェニルカラム（Ｗ
ａｔｅｒｓｐＢｏｎｄａｐａｋ、　Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ
５ｏｃ、、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）に基づく高性能
液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬＣ）にゆだねられた
。個々の酵素−供与体のカラム画分を、酵素−受容体と
してＭ２Ｓを用いて上記のようにして相補性についてア
ッセイした。ＥＤ３−ジゴキシンの相対的相補性効率は
、ＥＤ３＾−ジゴキシンの効率よりも４倍高かった。

ジゴキシン−ＥＤ３及びジゴキシン−Ｅ０３Ａに対応す
るカラム画分を別々にプールし、そしてジゴキシンにつ
いての競争酵素イムノアッセイにより比較した。

９６−ウェルマイクロタイタープレートを、このアッセ
イのために使用した。このアッセイは、２５１のヒト血
清対照０．０．５　、１　、２　、４．１０．１００及
び１１０００ｎ／ｄのジゴキシン、４　Ｘｌ０−’Ｍの
Ｍ１５酵素−受容体及びジゴキシン抗体を含む試薬１１
００μｌ及び試薬ｎ　１３０ｍを含んだ。試薬■は、種
々の希釈度のジゴキシン−ＥＤ３又はジゴキシン−ＥＤ
３Ａ、第二ヤギ抗−ウサギ抗体及び１．１■／　ｒｎｌ
のＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを
含んだ。３７°Ｃでの３０分間のインキュベーション及
びＴｉ　ｔｅｒｔｅｋマイクロタイタープレートリーダ
ーでの４０５ｎｍでの読み取りの結果は第１０表に示さ
れ、競争イムノアッセイはジブキシン−ＥＤ３及びジゴ
キシン−Ｅ０３Ａの両者により創造された。ジゴキシン
−ＥＤ３によるジゴキシンイムノアッセイは、ジゴキシ
ン−Ｅ０３Ａよりも低い投与量の０．５及び１ｎｇ／ｍ
で良好なシグナル識別を付与した。この識別は、ＨＰＬ
Ｃ分析の間に検出されるＥＤ３ＡｇＮ製物における不純
物の存在によるものである。

これらの実験は、抗原−抗体反応によるβ−ガラクトシ
ダーゼポリペプチドの相補性の制御において、化学的に
合成されたポリペプチド及び遺伝子工学的に構成された
ポリペプチドの適用性を示す。従って、化学的なポリペ
プチド合成法を用いて、高分子量のタンパク質を検出す
るための酵素−供与体を創造することができる。α−供
与体ドメインに融合される免疫学的に反応性のポリベブ
チドエピトーブをコードする遺伝子融合体をまた、合成
することができる。このアプローチに対する制限は、ひ
じょうに大きなポリペプチドを合成する能力のみならず
、また、必要とされるα−供与体ドメイン及び免疫学的
に反応性のタンパク質ドメインの両者の配列の知識を包
含する。

第 ０ 表 ＥＤ３及びＥＤ３Ａによるジゴキシンアッセイ微生物の
寄託 列挙されたプラスミドを担持する次のＥ。

コリ 株を、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
、　Ｉｎｃ、（ＩＶＩ）（ＡｎｎＡｒｂｏｒ＋　Ｍｌ）
に寄託し、そして次の受託番号を付与された： Ｅ、ユ１　　プラスミド　　受託番号 Ｅ９００１　　　　　　ｐ１２２　　　　　ＩＶＩ　１
００３４Ｅ９００１　　　　　　ｐ１２５　　　　１Ｖ
Ｉ　１００３５Ｅ９００１　　　　　　ｐＦ２９　　　
　１ＶＩ　１００３８Ｊ？ｔ８３　　　　　　ｐ２５０
　　　　１ＶＩ　１００１００３６Ｊ　　　　　　ｐ１
５７　　　　　ＩＶＩ　１０１００３７Ａ　　１００４
　　　　　　　　　　　ｐＭＧ１４　　　　　　　　　
１ＶＩ　　１０１００５０Ａ　１００４　　　　　ｐＭ
Ｇ２２　　　　ＩＶＩ　１００５１Ｅ９００１　　　　
　　ｐ１６９　　　　　ＩＶＩ　１００５２Ｅ９００１
　　　　　　ｐ１８３　　　　１ＶＩ　１００５３Ｅ、
コリ株Ｅ９００１　、　ＩＶ１１０Ｑ３４及び株ＪＭ８
３　。

ＩＶ１１００３７は、肝炎Ｂ型ウィルス表面抗原の一部
及びα−供与体の融合タンパク質をコードする遺伝子を
担持する、プラスミドｐ１２２及びｐ１５７をそれぞれ
含み、そしてＥ、コリ株Ｅ９００１　、　ＩＶ１１００
３５は、酵素−供与体をコードする遺伝子を担持するプ
ラスＢ　Ｐ’ｐ１２５を含む。Ｅ、３１７株Ｅ９００１
　、　ＩＶ１１００３Ｂ及び株ＪＭ８３　、　ＩＶ１１
００３６は、ブーｙスミドｐＦ２９及びｐ１５０をそれ
ぞれ含み、ｐ１５０は酵素−受容体をコードする遺伝子
を担持する。Ｅ、コリ株ＡＭＡ１００４　。

ＩＶ１１００５０は、検出されるアミノ酸３０〜３７を
有するβ−ガラクトシダーゼタンパク賞（酵素−受容体
）のための遺伝子を担持するプラスミドｐＭＧ１４を含
む。Ｅ、Ｄり株ＡＭＡ１００４　、　ＩＶ１１００５１
は、検出されるアミノ酸１３〜４０を有するβ−ガラク
トシダーゼタンパク！（酵素−受容体）のための遺伝子
を担持するプラスミドｐＭＧ２２を含む。Ｅ、コリ株Ｅ
９００１゜ＩＶ１１００５２は、アミノ酸６２でシステ
ィン残基及びアミノ酸６４でリシン残基を有するβ−ガ
ラクトシダーゼのフラグメント（ＥＤＨ６）をコードす
る遺伝子を担持するプラスミドｐ１６９を含む。Ｅ、コ
リ株８９００１　。

ＩＶ１１００５３は、アミノ酸３でシスティン残基を有
するβ−ガラクトシダーゼのフラグメント（ＥＤ３）を
コードする遺伝子を担持するプラスミドｐ１８３を含む
。Ｅ、コリ株Ｅ９００１　、　ＩＶ１１００５４は、ア
ミノ酸３９でシスティン残基を有するβ−ガラクトシダ
ーゼのフラグメント（ＥＤ５）をコードする遺伝子を担
持するプラスミドρ１８５を含む。

塩基配列が次のような多くの追加の酵素供与体配列が調
製され、そして次の表は酵素供与体配列のための置換及
び欠失を示す： ５ ＭＰＬＥ 第 １ 表 ＩＳ ｌ、４６ 第　ｌｌ　　表（つづき） ＨＤＮｏ−ｃｘｖ　　　ｌｙｖ　　Ｘ迭ス運１１ｒ−０
２０ ５７４６１７ ７３４６３ ４２０ ”Ｄ＝ニアミノ６〜２０の欠失、Ｒ−３−Ｌ−Ｎ種々の
酵素供与体を、チロキシン及び／又はジゴキシンに接合
した。前で記載された方法に従って、多くの接合体を調
製し、そして次の表はその接合体を示す。

第 ２ 表 酵素供与体接合体を、接合体の免疫純度；動的比活性；
５０％飽和での％阻害率；相補性阻害の最大量及びリガ
ンドに対する抗体のための親和性定数を決定することに
よって特徴づけた。特にことわらない限り、アッセイ条
件は次の通りである：使用される試薬は、サンプル緩衝
液：　　１００ｄのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのアジ
化ナトリウム及び０、２％のＢＳＡ；アッセイ緩衝液（
ｐＨ７，０）　　：　１０１のエチレングリコール四酢
酸、２ｍＭの酢酸マグネシウム、２０ｍＭのアジ化ナト
リウム、１５０ａＭのリン酸ナトリウム、　１００ｍＭ
のリン酸カリウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０．０．
０５ｍＭのジチオトレイトールであった。

免疫純度を、抗−Ｔ４抗体ＴｇＧ　５ｏｒｂｈｅａｄｓ
による酵素供与体接合体の沈殿により決定した。ＥＤを
、ロッカー振盪機により室温で１５分間、第一抗体と共
にインキュベートした。第二抗体を添加し、そしてイン
キュベーションを１５分間続けた。その懸濁液を遠心分
離し、そしてその上清液のアリコートをアッセイのため
に保存した。上記サイクルを、合計５サイクル、残る上
清液に対してくり返した。ＥＤの対照サンプルは、第一
抗体を有さない。インキュベーションの間のＥＤＩ度は
２０ｎＭである。アッセイ濃度は、ＥＡで５００ｎＭ　
；　Ｅ　Ｄで４ｎＭ；及び０ＮＰＧで１　ｍｇ／ｄであ
る。免疫純度は、第一抗体により沈殿可能なＥＤ活性の
％として表わされる。

動的比活性は、１０分間、過剰のＥＡと共にＥＡを予備
インキュベーションすることによるＣ０ＢＡＳＢＩＯア
ツセイを用いて決定される。システム濃度は、ＥＤで０
．１〜０．５　ｎＭ、　ＥＡ２２で、５００ｎＭ及びＣ
ＰＲＧで１．１１ｍＭである。上記範囲における６種の
濃度のＥＤを、３７°Ｃで２回アッセイした。単位／ア
ッセイ対ｎｇタンパク質／アッセイのデータをプロット
し、そして比活性（μ／■）を最小自乗ソイティング法
により計算する。１単位は、１μモルのＣＰＲＧ／分と
して定義される。

免疫化学試験をＥｎｃｏｒｅに基づいて行なった。２種
の試薬法を使用し、その第一試薬はアッセイ緩衝液、Ｅ
Ａ２２及び０ＮＰＧを含み、そして第二試薬はＥＤ、抗
−Ｔ４又は抗−ジゴキシン抗体を含み、そしてそれらの
濃度は、ＥＡで５６０ｍＭ　；　Ｅ　Ｄで２、４　ｎＭ
　；　０ＮＰＧで０．５８ｎｇ／−であった。使用され
るリガントの濃度は、表に示されている。ＥＤ及び抗体
を、ローター上で３７゛Ｃで１５分間、予備インキュベ
ートした。すべての濃度の抗体を２度アッセイした。ア
ッセイにおける合計タンパク質の変化は正されなかった
。

Ｋａを次のようにして決定した：実験的なＥＤ接合体の
ための抗体の親和性定数を決定するために、固定された
抗体に対するＥＤ滴定を行なう。

接合されたＥＤに接合する抗体を、クロモゲン基質の転
換率の低下により示されるように活性酵素の形成の阻害
によりモニターする。得られたデータは、５ｃａｔｃｈ
ａｒｄ型式（結合／遊離ｖｓ、　（接合〕）でプロット
される。得られる直線の傾斜はＬ１モルで　〜に＾に等
しい。

次の表は、その結果を示す。

フオレートについてのイムノアッセイ ＥＤ１４−フオレート接合体の調製 葉酸（５，０■）、ジシクロへキシルカルボジイミド（
２，０■）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１，０
ｍｇ）を、熱しながらＤＭＦ（０，５ｍｆ）に溶解し、
そして３時間撹拌した。すべての葉酸は溶解しなかった
。その溶液をマイクロフユージし、そしてその上清液（
２００ｍ　）を、０．２Ｍのボレート、ｐｉ４８．５　
（７５０Ｉｌｌ）及びジメチルホルムアくド（２５０＃
　）中、ＥＤ１４（２０２ｘ）の溶液に添加した。その
混合物を軽く１時間撹拌し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管
中でマイクロフユージした。その上清液をＧ−２５カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に負荷し、モしてＰＭＪ−
１により溶出した。（ＩｆのＰＭＪ−１を次のようにし
て調製した：　ＫＨ２ＰＯ４（２，５ｇ）、　ＫＨ２Ｐ
Ｏ４（２３，０ｇ）、　Ｎａ１ｌｚＰＯｎ（１２，５ｇ
　）　、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（０，
６７ｇ　）　、酢酸マグネシウム四水和物（１，２９ｇ
　）　、アジ化ナトリウム（１，３ｇ）及びエチレング
リコール（２４，５，ｄ）を、十分な水に溶解し、合計
体積を１．Ｏｌにする。）相補性画分を集め、そしてＨ
ＰＬＣ上に注入した（ＲＰ分析用フェニル　ＰＢｏｎｄ
ａｐａｋカラム、１％線状グラジェント、緩衝液Ａ：氷
水中０．１％ＴＦＡ　ｉ緩衝液Ｂ：水中、０．１％ＴＦ
Ａ、８０％Ｃ）１３ＣＮ）。接合体は３４．１分で溶出
され、続いて未反応ＥＤ１４が３４．５分で溶出された
。

初めの画分を集め、混合し、そして４°Ｃで貯蔵した。

葉酸アッセイのための方法 次の緩衝システム及び試薬を用い、そして下記に示され
るように略語化されるであろう：１、　サンプル緩衝液
；　　１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのアジ
化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡ。

２、　アッセイ緩衝液（ｐＨ７，０）　；　１０ｍＭの
エチレングリコール四酢酸、２ｄの酢酸マグネシウム、
２０ｍＭのアジ化ナトリウム、　１５０ｍＭのリン酸ナ
トリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム、０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ２０．０．０５ｍＭのジチオトレイトール、ｐ
ｌ＋７．０に調節される。

３、ＥＡ；酵素受容体 ４、ＥＤ；酵素供与体 ５、　　ＦＢＰ　５ｃｒｉｐｐｓ　Ｈ５ｃｒｉｐｐｓ　
２．２５ｍｇ／ＩＲ１原液からのフオレート結合タンパ
ク質 ６、　　ＣＰＲＧ　；クロロフェノールレットβ−Ｄ−
ガラクトピラノシド ７、　０ＮＰＧ　；　２−ニトロフェノールβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド ＥＤ１４−フオレート接合体を、活性酵素へのＥＡの相
補性について評価した。２種のＥＤ１４−フオレート画
分、＃３４及ヒ＃３５ヲ、種々のＥＡｆｉ度でｉ定した
。次の試薬を使用した；アッセイ緩衝液（ｐＨ７，０）
中、６．　ＯＸＩＯ−ｂＭ　、　１．２　Ｘｌ０−’Ｍ
　。

２、　ＯＸｌ０−５Ｍ　、　３．　ＯＸＩＯ−５Ｍ（７
）濃度で（７）ＥＡ、アッセイ／ＣＰＲＧ緩衝液（ｐＨ
７，０）中、７．５　Ｘｌ０−’Ｍの濃度でのＥＤ１４
−フオレート（画分＃３４及び＃３５）及びサンプル緩
衝液。次の方法をＥｎｃｏｒｅ分析機に対して使用した
；ＥＡ試薬４１．６Ｉｌ！をＥｎｃｏｒｅローターの上
部のウェル中においてサンプル緩衝液４１．６ｄと共に
混合し、そしてＥＤ１４−フオレート１６６．７メをそ
の低部のウェル中に負荷した。割合を、３分でのＯＤｓ
＋＋。から、２分でのＯＤｓ＊ｏを引き算により計算し
た。その結果は第１４表に示される。ＥＡ濃度が上昇す
るにつれて、システムの酵素活性もまた上昇する。

ＥＡに対するＥＡ１４−フオレートの相補性を阻害する
ＦＢＰの能力を評価した。ＥＤ１４−フオレートの画分
＃３４を、種々の濃度のＦＢＰに対して滴定した。次の
試薬を使用した：アッセイ緩衝液（ｐＨ７，０）におけ
る１、　５　Ｘｌ０−ｂの濃度でのＥＡ、アッセイ／Ｃ
ＰＲＧ緩衝液（ｐＨ７，０）における７、７Ｘ１０−９
Ｍの濃度でのＥＤ１４−フオレート、サンプル緩衝液に
おける１　：１ｏ、　　１　：２０．　１　：４０．　
１　：６０．　１　：８０、　１　：１２０．１　：１
６ｏ、　１　：２００．１　：２４０．１　：３００゜
１　：　４００．１　：　６００．１　：　８００の希
釈度でのＦＢＰ。

次の方法を、Ｂａｋｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製の
Ｅｎｃｏｒｅ分析機に対して使用した；ＥＡ試薬４１．
６ｍをＥｎｃｏｒｅローターの上部のウェル中において
サンプル緩衝液４１．６バと共に混合し、そしてＥＤ１
４−フォート１６２メを希釈されたＦＢＰ５ｍと共に混
合し、そして室温で２５分間インキュベートし、そして
次にＥｎｃｏｒｅローターの低部のウェル中に負荷した
。割合を、１１分でのＯＤ３．。から９分での０Ｄｓｉ
ｏを引き算することによって計算した。その結果は第１
５表に示される。

フオレート用量反応を、次のようにして誘導した。次の
試薬を調製した：アッセイ緩衝液（ｐＨ７，０）におけ
る３７５０ｎＨの濃度でのＥＡ、アッセイ１０ＮＰＧ緩
衝液（ｐＨ７，０）における２６　・６６ｏＭの濃度で
のＨＤ１４−フオレート（画分＃３４）　、サンプル緩
衝液における１：１０００の希釈度でのＦＢＰ及びサン
プル緩衝液における０　、　２．５　、５．０．１０．
０、及び２０．０’ｎｇ／−での葉酸対照。次の方法を
、Ｅｎｃｏｒｅ分析機（Ｂａｋｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ）に使用した；葉酸対照２５ｄ及びＦＢＰ　２５
ｄを混合し、そして室温で３０分間インキュベートし、
次にそのサンプル−ＦＢＰ混合物を２６．６６ｏＭのＥ
Ｄ１４−フオレート１５０ＩＪ１に添加し、そして室温
で３０分間インキュベートし、そしてその混合物２００
　ｄをＥｎｃｏｒｅローターの低部ウェル中に負荷し、
その３７５０ｎＭのＥＡ溶液５０１！ＩをＥｎｃｏｒｅ
ローターの上部ウェル中に負荷した。割合を、９分での
ＯＤ４□。から５分でのＯＤ４□。を引き算することに
よって計算した。

旦しζ畦　　５’　　−９’ ０３３６．５ ２．５　　　　　３６２ ５．０　　　　　３８８．５ １０．０　　　　　４４３．５ ２０．０　　　　　５６２ 結果は、ｒ　＝０．９９９、 を有する直線である。

旦＝ヨ朱 ２５．５ ２ ０７ ５５ ｍ　＝１１．３２ あ」劃１ ７．０ １３．４ ２４．１ ４０．０ 及びｙ　＝３３３．６ ：ｌＯ ：２０ ：４０ ：６０ ：８０ ：１２０ ：１６０ ：２００ ：２４０ ：３００ ：４００ ：６００ ：８００ ：　５００ ：　１０００ ：　２に ：　３に ：　４　Ｋ ：　６に ：　８に ：１０に ；１２に ＝１５に ：２ＯＫ ＝３０に ：４０に ７４ ７８ ９５ ９８ ３０６．５ ３３０．５ ５８ ３６２．５ ０３ ２９ ４９９．５ ５９５．５ ６３７．５ ６７．５ ６７．０ ６４．７ ６４．７ ６３．７ ６０．８ ５７．６ ５７．０ ５２．２ ４９．１ ４１．８ ２９．４ ２４．４ 本発明の方法は、種々の手段で使用される高感度で且つ
正確なアッセイを提供することは、上記結果から明らか
である。さらに、貯蔵安定性がひじように高められる。

なぜならば、フラグメントは水性媒体中でひじょうに安
定しており、そしてその水性媒体における混合で容易に
活性化されるからである。個々のフラグメントは、種々
のりガントのために広い動的な範囲をもたらす活性接合
体を供給するために、広範囲の種類の対象のりガントと
容易に接合される。

本明細書に引用されたすべての出版物及び特許出願は、
引用により本明細書に組込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンプルにおける分析物（リガンド及び受容体から
   成る特定の結合対のメンバーである）の量を決定するた
   めの酵素アッセイ方法であって：（ａ）（１）サンプル
   ；（２）突然変異化されたβ−ガラクトシダーゼのＮ−
   近位フラグメント（ここで２〜３個のアミノ酸がシステ
   イン又はリシンにより置換され、前記分析物と免疫学的
   に交差反応する又は受容体分析物に相補性のリガンドと
   の接合のための部位が供給される）；（３）分析物結合
   タンパク質（前記分析物が受容体以外のものである場合
   ）；及び（４）β−ガラクトシダーゼのＣ−近位フラグ
   メントから実質的に成る酵素受容体ポリペプチド（ここ
   で、前記酵素供与体及び前記酵素受容体がβ−ガラクト
   シダーゼ活性を有する活性酵素複合体を形成し、そして
   この活性は、受容体が前記接合体に結合される場合に区
   別され得る）を、媒体中で混合することによって反応混
   合物を形成し； （ｂ）前記反応混合物における基質の転換速度を測定し
   ；そして （ｃ）既知量の分析物を用いて得られた基質の転換速度
   と前記基質の転換速度とを比較することによってサンプ
   ル中の分析物の量を決定する段階を含んで成る方法。 ２、前記酵素供与体が、リガンドへの接合のためにシス
   テインに突然変異される請求項１記載の方法。 ３、前記酵素供与体が、リガンドへの接合のためにリシ
   ンに突然変異される請求項１記載の方法。 ４、前記突然変異の１つが、アミノ酸４６で存在する請
   求項１記載の方法。 ５、前記突然変異の１つが、アミノ酸１〜５の領域に存
   在する請求項１記載の方法。 ６、前記突然変異がアミノ酸４８〜６１以外で存在する
   請求項１記載の方法。 ７、前記分析物がハプテンである請求項１記載の方法。 ８、前記分析物が抗原である請求項１記載の方法。 ９、前記反応混合物が、（５）前記受容体を結合する抗
   体をさらに含んで成る請求項１記載の方法。 １０、下記配列： 【遺伝子配列があります】 〔ここで、文字の下部の数字は野生型のβ−ガラクトシ
   ダーゼ番号を示し、そして星印は、星印により示される
   ２〜３個のアミノ酸がシステイン又はリシンにより置換
   されている部位を示す〕で表わされる少なくとも４０個
   のアミノ酸を有するタンパク質組成物。 １１、前記置換が位置１〜５又は４６で存在する請求項
   １０記載のタンパク質組成物。 １２、アミノ酸５〜１０の領域において少なくとも１つ
   のアミノ酸の欠失を有する請求項１０記載のタンパク質
   組成物。 １３、前記配列Ｒ−Ｓ−Ｌ−Ｎが、配列Ａ−Ｅ−Ｐ−Ｅ
   −Ｗにより置換される請求項１０記載のタンパク質組成
   物。 １４、前記タンパク質組成物がリガンドに共有結合され
   る請求項１０記載のタンパク質組成物。 １５、前記リガンドが、ジゴキシン、チロキシン、乱用
   薬物、治療薬物、ステロイド又は免疫学的に交差性のそ
   れらの化合物である請求項１４記載のタンパク質組成物
   。 １６、組換えＤＮＡベクターであって、微生物宿主にお
   いて機能的な複製システム及び前記宿主において機能的
   な転写及び翻訳開始及び終結調節領域並びに請求項１０
   記載のタンパク組成物をコードする読み取り枠を含んで
   成るベクター。 １７、請求項１６記載のベクターを含んで成る細菌。 １８、前記細菌がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である請求
   項１７記載の細菌。 １９、請求項１記載のアッセイに使用するためのキット
   であって、酵素供与体、酵素受容体（ここで前記酵素供
   与体及び酵素受容体が活性β−ガラクトシダーゼを有す
   る複合体を形成する）、前記リガンドのための受容体（
   前記分析物がリガンドである場合）及び場合によっては
   β−ガラクトシダーゼ基質を含んで成るキット。