JPH03178979A - 細胞毒性高分子 - Google Patents

細胞毒性高分子

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JPH03178979A
JPH03178979A JP1306369A JP30636989A JPH03178979A JP H03178979 A JPH03178979 A JP H03178979A JP 1306369 A JP1306369 A JP 1306369A JP 30636989 A JP30636989 A JP 30636989A JP H03178979 A JPH03178979 A JP H03178979A
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substantially pure
lysocrinamide
cells
compound according
bistraten
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Application number
JP1306369A
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English (en)
Inventor
Clifford J Hawkins
クリフォード　ジェイ．ホーキンズ
Diane J Watters
ダイアナ　ジェイ．ウォターズ
Martin F Lavin
マーチン　エフ．ラヴィン
David L Parry
デイヴィド　エル．パリィ
Elizabeth J Mccaffrey
エリザベス　ジェイ，マクカフレイ
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University of Queensland UQ
Original Assignee
University of Queensland UQ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は細胞ｉＷ性缶高分子単離、同定及び調製に、そ
して該高分子を使用する療法に関する。特に、本発明は
癌や関連疾病の治療に行動である新規な環式ペプチド類
及び巨大環式エーテル類に関する。
［従来技術］ 化学療法は広く認められている癌の治療法であるが、多
くの形態の癌は依然として薬物治療が難しい。新規な薬
剤を求める過程で、峠生・海生前を椎動物は免疫保護胸
腺系をもたないので、これら動物は免疫保護のために複
雑な化学的機構を発達させなければならなかったか、こ
のため、このような化学的保譚剤はヒトの各秤の医療問
題の改善にイｆ効であることが認識されるようになった
。
！１１丈、尼近の研究によれば、海生生物は抗胛瘍活性
を示す有機化合物の有用な供給源であることが確認され
ている。
［発明の開示］ 本発明者等は、この度、相５な細胞毒性を示す海生生物
リソクリヌム・パテラ（１，ｉｓｓｏｃｌｉｎｕｍ　ｐ
ａｌａｌｌａ）及びリソクリヌｌ＼−ビス１−ラツム（
１，１ｓｓｏｃｌｉｒ＋ｕｍ　ｂｉｓｔｒａｌ、ｕｍ）
から多数のド犬環式化合物を単離・同定した。これら環
式化合物は、そのインビトロ及びインビボ活性からみて
、癌や関連疾病の治療に使用できるものである。
すなわち、本発明の第１　ｒｇ様によれば、それぞれ個
別に単離できる、以ド、トリスオキサソリン（ｔｒｉｓ
ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ノくチルアミド（ｐａｔｃｌｌ
ａｍｉｄａ）　Ｄ　、　　リソクリンアミド（Ｉｉｓｓ
ｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ：＋４、リソクリンアミド５、リ
ソクリンアミド７、リソクリンアミド８、ピストラドア
ミド Ａ、ビス１−ラテン（ｂｉｓｔｒａｔｃｎｃ）Ａ及びヒ
゛ストラテンＢ−いずれの構造も第１図に示しであるー
と呼ぶ一連の化合物が提供される。
トリスオキサゾリン、ピストラドアミドＡ１　ビス！・
ラドアミドｎ１　ビストラテンＡ及びビス１−ラテンＩ
３はすべて無管類ホヤリソクリヌム．ビストラツム（１
，ｉｓｓｏｃｌｉｎｕｍ　ｂｉｓｔｒａｔｕｍ）からｔ
ｌｉ離し、そしてノ〈チルアミドＤ１　リソクリンアミ
ド４、リソクリンアミド５、リソクリンアミド７及びリ
ソクリンアミド８はすべて無管類すソクリヌム・ノくテ
ラ（１，ｉｓｓｏｌｉｎｕｍν±ｃ−ｊ　Ｉ　ａ　）か
らｌｉ１離したものである。
本発明の第２態様によれば、 １　）　ｉｆ？浄処理したホヤをアルコール／炭化水素
溶ｌｆｋて均質化処理し、 ２）均質化処理物を給湯し、 ３）泊過物を水溶ｔｉ＆で抽出ｌ，、 ／ｌ）水性層をを機溶剤で抽出し、 ５）有機抽出物を乾燥・蒸発して除去し、６）残留物を
クラマ）・グラフィー処理し、そして ７）個々の化合物を単離することからなる−に記系列の
化合物の単離方法が提供される。
好適には、（１）ホヤをアルコール／芳香族炭化水素溶
液、より好ましくはメタノール／トルエン溶液で均質化
処理し、（２）濾過物を哨酸ナトリウム溶液抽出し、モ
して（３）水性層をクロロホルム抽出する。
本発明の化合物をインビトロ及びインビホ抗胛瘍性につ
いてスクリーン試験したところ、結果は陽性であった。
従って、該化合物は癌や関連疾病の抑制に使用できる。
予備的な研究が示唆するところによれば、細胞毒性の決
定因子は、これら化合物各々の構造上の全体的な立体配
座である。従って、Ｉ−記系列の化合物の誘導体も抗胛
瘍シ１′を呈するｊＩＪ能ｆ牛がある。
このため、本発明の第３態様によれば、それぞれ」二記
系列の化合物の環式骨格と同様な骨格を示すが、光なる
ノ１（によってｊ！’５換された化合物が提供される。
これら誘導体は従来公知の標準的な方法によって１凋製
することができる。
なおこの点に関して、Ｌ記の各神化合物及びその誘導体
はキラルであり、従って、本発明は個々の立体異性体だ
けでなく、エナンチオマー及び／又はジアステレオマー
を含むかとうかに関係無く、これらの混合物にも関する
。
勿論、本発明化合物のラセミ化も可能であり、従って、
本発明は個々の立体光外体すべてだけでなく、エナンチ
オマーの光学的に不活性な混合物や一つのエナンチオマ
ーが他のエナンチオマーに対して過剰に存在する光学的
に活性な混合物を始めとする該立体異性体の混合物すべ
てを包含し、なおかつジアステレオマーの混合物も包含
するものである。
第３態様による、本発明化合物か抗肺瘍性を呈すること
から、適宜投与に好適な賦形薬又は希釈薬を共に、に記
の化合物一種かそれ以上、あるいはこれらの非毒性塩を
含む薬剤組成物が提供される。
この明細書の全体を通じて使用する非毒外塩とは、行動
な投Ｉｊ、量で投与した時に、望ましくない副作用をも
たらさない塩を指す。非ｉｉｔ性酸付加塩の例には、塩
酸塩、硫酸塩、哨酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩
や蓚酸塩がある。
さらに、本発明の第４態様によれば、前記化合物の有効
型を投与することからなる治療法が提供される。
なお、“イｆ効量パとは、癌や同様な疾病の抑制を可能
にするのに１−分な量を意味するものである。なお、投
与型は、治療すべき疾病、患者の反応や使用する特定化
合物に従つて広い範四内で変ることができる。
初期の研究で確認したところによると、上記化合物の一
部は醇素蛋白質キナーゼ（１）　ＫＣ）を活＋１：化で
きる。
従って、本発明の第４態様によれば、Ｐ　ＣＫ等の細胞
蛋白質の転形子として一種かそれ以」二の上記化合物を
使用して、細胞の成Ｊ壬及び分化を検出・監視する方法
が提供される。
「実施態様の詳細な説明］ 本発明化合物及び本発明方法のＪｕ１体的な細部を以下
の実施例により説明する。以下の実施例において、温度
の単位はすべて°Ｃであり、述語の意味は従来通りであ
る。粗生成物はここに記載する手段によって、あるいは
その他の公知手段によって精製できる。
化合物の同定・細胞毒性 本発明の各化合物の構造同定は二次元ＮＭＲ法によって
行い、各化合物のヒト線維芽細胞及び肺癌細胞系統につ
いての細胞毒性を試験した。
ＮＭＲ分光分析 ＪＥＯＬ　　ＧＸ４０ＯＮＭＲ分光計においてＣ−５デ
ユアル１■、１３Ｃプローブを使用して、スペクトルを
求めた。重水素化クロロホルム（Ｍｅｒｃｋ）に化合物
を溶解し、テトラメチルシラン（”Ｉ’　Ｍ　Ｓ　）に
対する化学シフトを誘導した。
Ｃ０３Ｙ／１５実験ては、以下のパラメータを使用した
。即ち、ピストラドアミドＡ１スペクトル幅３０７６．
９１１ｚ、データマトリックス５１２Ｘ１０２４、スキ
ャン数３２、リサイクル時間３秒、モしてν１ドメイン
におけるゼロ・フィリング　ピストラドアミドＢ１スペ
クトル幅３４５０．　７１１ｚ、データマトリックス５
　］　２Ｘ２０４８、スキャン数３２、リサイクル時間
３．２３秒、モしてｈドメインにおけるゼロ・フィリン
グ。サイン・ベルアポダイゼーション関数を使用した。
ヘテロ核関連実験では、次のパラメータを使用した。ピ
ストラドアミドＡ１データマトリッリス１２８Ｘ／ｌ０
９６、スキャン数５９２、リサイクル時間１．６秒５．
ビストラ１−アミドＩ３、データマトリックス＋２８Ｘ
／１０９Ｇ、スキャン数２０００、リサイクルＩＬ’７
１ｆｉＪ１．９秒：ビストラテン丁３、デーツマ１−リ
ソクス＋２８Ｘ／１０９６、スキャン数３２０、リサイ
クル時間１．６秒。Ｊ−１３８１−１ｚについて、−・
定遅れム１及びム２（それぞれＩ／２Ｊ及びｌ／−Ｊ）
設定した。変換前に、両次元をセロ・フィリングＩ７、
サイン・ベル関数で乗じた。ビストラテンへにお（プる
ロング・レンジＩ　ｔｌ　　Ｉ　２　Ｃシフト相関関係
では、２つの実験植を使用し、Ｊ　＝　Ｉ　Ｏｆｉｚ及
びＪ−１６，６１１７について、ム１及びム２（それぞ
れＩ／２Ｊ及びＩ／″Ｊ）を設定した。
質ｆｉｆ分光分析 Ｋｒａｔｏｓ　　ＭＳ２５　　ＲＦＡ実験装置を使用し
た。ＦＡＢ−ＭＳについては、Ｉ。
ｎｔｅｃｈ”ｔドル・フィールドＦ　Ａ　Ｂ源をアルゴ
ンガスと共に使用した。サンプルをメタノールに１　ｍ
ｇ／　ｍｃｔの濃度で溶解し、グリセロールで８倍に弄
釈して、ＦＡＢ分析を行った。高解像電子衝突質量スペ
クトル（ＨＲＥＪＭＳ）　ヲ７０　ｋ　ｃ　Ｖ及び３０
００（１）解像力で５己録した。
試験−動麹の人手 オーストラリア、クィンーズラント州、グレート・バリ
ア・リーフのヘロン・アイランから付着物を除き、２　
Ｘ　２　ｃｍの標本片に切断し、入手後４時間以内で一
２０°Ｃで凍結した。
比合−物−兜坤−（■ ＩＱの３゛１メタノール、！・ルエン溶液を用いて、抽
出用ガイズの代表的なサンプル、凍結ホヤ２５０ｇ　（
湿式型ｆｉｔ）をワーリングブレンターで均質化処理し
た。得られたホモケ不一トを濾過し、濾過物を１Ｍ硝酸
ナトリウム溶液（８００ｍ０抽出した。水性層をりロロ
ホルム（６Ｘ１００ｍ０抽出し、無水硫酸すＩ・リウｌ
＼でクロロホルムを乾燥した。乾固するまでクロロホル
ムを蒸発して、褐色を洲ひたオイルを得た。
酸加水分解及びキラル・カスクロマトグラフィー ６ＭのＨＣＱ　（］　ｍｆｆ）及びメルカプタン（１０
０ｉｔ＆）　ｒＪｌ、ｌ’Ｌ空下１１０℃テ２４１１．
’７１７１　ヘフヂＩ−（０，３μｍｏ　ｌ）を加水分
解した。加水分解中システィンの酸化を防Ｉ卜するため
にメルカプタンを加えた。乾固するまで蒸発した後、ア
ミノ酸をそのＮ−ペンタフルオロプロピオニルイソプロ
ビルエステルに転化し、Ｃｈ　ｉ　ｒａ　ｓ　ｉ　Ｉ　
　−Ｖａ　Ｉ　　ＧＣカラムに加え、■）及びＩ、異性
体を分離した。
Ａ）　　Ｉ・リスオキサゾリン Ａ、　　ｉ　　単離及び特性化 上記に記載した一般的な手順に従って、凍結Ｌ　　ｂｉ
ｓｔｒａｔｕｍを処理して、濃い緑茶色のオイルを得た
。
２ 調製的逆層Ｃ−１８カラム（ワットマン０Ｉ）Ｓ−３）
を用いて、このオイルをクロマトグラフィー処理すると
、２１０　ｎ　ｍに吸収を示す純粋なトリスオキ刃ゾリ
ンか得られた。
１（及び”ＣＮＭＲスペクトル及びＦ　Ａ　Ｂ質量分光
分析「（Ｍ＋＋（）　”＝　５４７］を行ったところ、
このものは対象環式へキサベプチ１ζて、その構造は第
１１’ｌに示す通りである。
Ａ、ｉｉ　　細胞毒性 ２種類の細胞系統−ＳＶ４　Ｑ転換線維非細胞（ＭＲＣ
５ＣＶｌ）及び膀胱のトランジション癌細胞−を使用し
て、インビトロ細胞毒性を調べた。異なる濃度のトリス
オキサゾリンを用いて、細胞を１時間インキュベーショ
ンし、５日後に、細胞生存率のひとつのＪ〈度として、
「メチル−３１］］のＤＮＡへの紹込みを求めた。結果
は第２図に示す。ＩＣ７゜（Ｉｉ′ｆ（成長を５０％抑
制するのに必要な濃度）は０　、　５　ｔｒｇ／　ｍ（
ｌとして求めた。また、細胞生存率は異なるトリスオキ
サゾリン濃度で美大コロニー形１戊を測定することによ
って求めた。これら実験から、Ｉ　Ｃ、、。イ１−＋’
ｊは］、２ｔｚ！？／　ｍｌで、これはチミジン組込み
から得られたイ＋ｌｌｉによく一致していた。
Ａ、　　ｉ　ｉ　ｉ　　１．Ｉ）、。測定２００　ｍｇ
／　ｋｇの濃度でＱｕａｃｋｃｎｂｕｓｂマウスにおｉ
ツるインビボ細胞ｊｌｉ性を求めた。この１１乏大濃度
でも、マウスは死亡しなかった。
Ａ、ｉｖ　　インビボ抗姉−里挫 ある一つのトリスオキサゾリン治療におけるインビボ抗
肺瘍性を評価するために使用した検定法は、全国症協会
（ＮＣＩ）のカイトラインで薦められているＢａ１ｂ／
Ｃマウスの１）−３３８検定法てあった。
マウス（２２〜４４５Ｉ）の体重を測定し、ランタムに
３群に分類した。すなわち、Ａ　対照群（薬物治療なし
） Ｂ　：　陽性対照群（５−フルオロウラシル治療） Ｃ・試験群（トリスオキサプリン治療）５ 各マウスに１×１０°Ｐ３８８細胞をリン酸緩衝生裡的
食塩水としてｉｐ投与した。２４時間後、５−フロオロ
ウラシル（１回の投’；ｆｆｔ　２００　ｍｇ／　ｋｇ
）及びトリスオ牛づプリン（５ｍｇ／ｋｇ＞のいずれか
てマウスを治療した。トリスオキサゾリン治療を２日置
きに繰り返したが、注射前に、マウスの体重を測定した
。これを２５０目まで繰返した。記録したパラメータは
平均体重増加及び平均生存時間であった。Ｔ／Ｃインデ
ックスの算出法は次の通りであった。
Ｔ／Ｃ（％）−」を均生７７１１ξ１ｉｒＪ　（治療群
）÷平均生存時間（対照群）× ０Ｏ −Ｉ−、記３７！Ｔの平均体重増加は次の通りであった
。
対照？！Ｔ　（薬物なし）　　　　　　３．２５ｇフル
オロウラシル治療Ｗ　　　０．５ｇ試験７！Ｔ　（１−
リスオキサゾリン）　７５ｇ 対照群の平均生存時間は９＋５１１てあつた。
級里ニ トリスオキサゾリンのＴ／Ｃは１３／９．５Ｘ１００＝
１３７％で、５〜フルオロウラシルのＴ／Ｃは２５／９
．５Ｘ］００＝２６３％であった。
ＮＣＩガイドラインでは、１’／Ｃインデツクスは１２
５で有意味とされている。
明細書の浄書（内容に変更なし） ７及び８ ７　Ｋｙのエル・バテラが、前述した自然抽出にょシ約
１０２を通常の抽出方法に基づいて生成された。この自
然抽出物はメタノール：水（７７：２３）の混合液に溶
解され、用意されたホヮットマン・パーティシル０Ｄｓ
−３９ｍＸ５００ｍのＨＰＬＣコ７ムに適用された。７
７〜１００％のメタノールで１２０分間以上にわたる溶
出が一つの凹面による傾斜溶離法によって行なわれた。
そして、溶出液の吸収態様が一つのウォータ９９０ボト
ダイオード列探知器によシ追尾された。変化するビータ
に対応した小片が集積され、蒸発にょシ乾燥させ、そし
て更に浄化が進められ、平静条件下で同一コラムに関す
るクロマトグラフィか、又はセファデックスＬＩ（−２
０に関するクロマトグラフィの−ずれかにメタノール：
水（８０：２０　）の混合液を使用する。
この純粋化合物の構造は、Ｈｌ（ＥＩＭＳの一つの組み
合わせに、ｒ、つて決定され、酸性の加水分解はキラル
ガスクロマトグラフイ、及び二次元ＮＭＲ技術に従って
打われる。
パテルアミドＤ　（Ｃ３８Ｈ４０Ｎ８０６８２　）は、
６位置で特定のインロイシンに置換されたロイシンを除
く周知のパテルアミドＢに構造が非常に似ている。
）（ＲＢＴ、質量分光器は分子量７７６．５１５８（ｃ
ａｌｃ’ｄ７７、ｌｓ、３１２８）を付与する。陽イオ
ンＦＡＢ−ＭＳは（Ｍ＋１（）　７７７を付与する。そ
の構造は１）（及び１３ＣＮＭＲ分光器、２１）ＣＯ８
Ｙ　　４５及びＩ　Ｈ−１３Ｃシフト関連試験による詳
細な分析により明確にされる。
リンクリンアミド４．５．７及び８ これら４つのペプチドは全てア□ノ酸の同一順序を有し
、それらの立体利学又はチアゾール数及びチアゾール環
数とは異なる周期的なヘプメベブチドである。
ＨＲＥＩＭＳによる正確な質量測定は、分子イオン質量
７４１．２８５０　リソクリンアミド４　（Ｃ３８Ｈ４
１Ｎ７０５Ｓ２）（Ｃａｌｃ’ｄ　７４１．２７６７　
）　、及びリンクリンアミド５（Ｃ３ｇＨ４１Ｎ７０５
８２）　（Ｃａ１ｃ’ｄ　７３９．２６１０　）を付与
する。陽性イオンＦＡＢ−ＭＳは（Ｍ＋Ｈ）　７４２．
７４０を付与する。その構造はＩＨ１１３Ｃ及び２Ｄ　
ＣＯＣ０８Ｙ４５Ｎスペクトラ、そしてＣ０ＬＯＬ試験
による分析から同一のものと考えられる。
リンクリンアミド８　（Ｃ３８Ｈ４１Ｈ７０５８２）の
Ｈ凡ＢＩＭＳはリソクリンアミド７　（ＣａｓＨ４＋Ｎ
７０ｓＳ２）のために、分子イオン質ｉｔ　７４１．２
７８５　（Ｃａ１ｃ’ｄ７４１．２７６７　）、及び７
４３．２９３５　（Ｃａｌｃ’ｄ　７４３．２９２７）
を付与する。ペンタフルオロプロピノール　イソプロビ
ール　エスタのキラルガスクロマトグラフィ、及びＩｎ
−Ｉｎ対に結合されたＣ　ＯＪ、ＯＣ試験における長い
範囲のＩＨ１３Ｃ対の分析は、それぞれの構造を決定す
べく可能にした２Ｄ　ＣＯ８’Ｙ　４５　試験により探
索した。
リンクリンアミド８の場合、そのバリンの残シはリソク
リンアミド４に発生する同じ順序である６１の位置であ
る。従って、リンクリンアミド４と８との唯一の違いは
、アミノ酸の１つ又は２つによる立体科学に帰属されね
ばならない。筐た、Ｄの形状は−６リンクリンアミド８
のものといえる。また、リンクリンアミド７．８はそれ
ぞれ乾燥された状態にあって０４％及び０５％が構成さ
れる。
２つの細胞線は、ＭＲＣ５ＣＶ　１　（８Ｖ　４０−変
化した人間芽細胞）調整、及び腫瘍線としてのＴ２４（
袋状組織の過渡期癌細胞）に使用される。細胞はＣＯ２
５％の湿度大気中で子牛胎児の血清１０％を含むＲＰＭ
ｌ−１６４０媒体（カモンウエルス血清研究所）に保持
された。昔た、細胞は有害細胞テストに先立つ２４時間
前に５×１０セル／１６澗の好適密度に曝露された。細
胞用疑似膜が異なる密度の化合物を１時間曝露させたの
ち、培養期間５〜７日を経過後にマイクロスコープ装置
により形成された。この段階で見られた有害細胞の化合
物は、ＤＮＡ中の〔メチル−３）１）チミジンとの併合
に釦いてそれらの影響を試験することにより更に詳しく
研究できる。また、有害細胞が異なる密度で１時間曝露
され、５日経過後、〔メチル−Ｈ〕チミジン（１０μｃ
ｉ　／ｍＬ　、　　４０　Ｃｉ　／ｍｍｏ　ＩＸＡｍｅ
ｒｓｈａｒｎ　）と共に４時間で膜化し、その後これら
を１０％のトリクロロアセチク酸（ＴＣＡ　）で冷却し
て抽出した。このＴＣＡ−不溶性物質はグラスファイバ
製のフィルタ上に収集され、液体シンチレーション計数
器による計数に先んじて１００％のエタノールによる５
％のＴＣＡで冷却して洗浄した。これらの試験は各ポイ
ントごとに正副の試金を伴って３回行われた。第６図は
、発明者によるＴ−試験の結果を示し、各試験に釦ける
差異を統計的に意味づけている。
リソクリンアミド７．８ こノ１ら２つの化合物の有害細胞は、袋状組織の過渡期
癌細胞（ｉ’−２４）、ＳＶ４０芽細胞（ＭＲＣｓＣＶ
ｌ）及び正常な血液リンパ球に用いられるビイトロ中で
検出される。細胞の育戒能献金は、ＭＴＴ（３−（４，
５−ジメチルチアゾ−ロー２２１）−’−２、牛体ミト
コンドリアによって青色染色となった５−ジフェニール
テトラシリコーム臭化物の転換に信頼のある色度測定献
金を使用して実施された。この分析測定は〔メチル−３
Ｈ）チミジン共同献金の結果と同様であることを見い出
すことができる。
５Ｖ４ｏ芽細胞（Ｍ）もＣ３ＣＶ１）及び袋状組織の過
渡期癌細胞（Ｔ２４　）は、００２５　％の湿度大気中
で子牛脂児の血清１０％を含むＲＰＭｌ−１６４０媒体
（カモンウエルス血清研究所）に保持された。人のリン
パ球は生産者に評価のあるＦｉｃｏｌｌ　Ｐａｇｕｅ（
薬剤−ＬＫＢ）を用いて血液全量から単離された。
ポトハマグリチニン（ＰＨＡ、（ＧＩＢＣＯ））が１μ
Ｌ／ｍＬで付与された。リンパ球は密度１×１０５／ｍ
Ｌで好適なマイクロチモレ皿９乙に張られた。７２時間
ＰＨＡを刺激した後、リソクリンアミドが０１μｇ／ｍ
Ｌ〜１００μｇ／ｍＬの範囲で伺与され、２４時間後、
残存しプこ有害細胞が献金分析された。
有害細胞のデータどして、ＭＲＣ５ＣＶ　１及びＴ２４
の細胞が密度１×１０５／ｍＬで好適なマイクロチモレ
皿９乙に張られた。−晩培養した後、その培養細胞がリ
ソクリンアミドの異なる密度の下に１時間曝露された。
４８時間培養後、ＭＴＴ（ｓη／ｍＬ）の１０μＬが適
量でかつ３７℃で４時間の培養物の付与された。従って
、ｏ、ｏｓＭ　Ｈ，ＣＬの適量の１００μＬがイソプロ
パツール中に投与された。採取物は青色生成物の全てが
溶解する１で混合され、光学濃度５４０ｎｍはＴｉ　ｔ
ｅｒｔｅｋ多走査Ｍｅ装置を６９０ｎｍの波長を用いて
決定される。異なった３つの細胞が第６図、第７図及び
第８図に示すように残存曲線を描く。リソクリンアミド
アは１時間の曝露で００４μｇ／ｍＬのＩＣ値を示すこ
とから最も有害な細胞であることが明らかになった。
褐色の原油（０，２２′？）が前述の生成化合物を通常
の抽出に従ってエル・パイストレータム（２５０７）か
ら単離された。この原油はメタノール：水（７７：２６
）の混合物中に溶解され、用意されたホワットマン・バ
ーデイシル０ＤＳ−３９ｍｍＸ５００鴫で変換層１−Ｉ
　Ｐ　Ｌ　Ｃコラムに供給された。７７〜１００％のメ
タノールで１２０分間以上にわたる溶出が一つの凹面に
よる傾斜溶離法によって行なわれた。
生成された小片が集積され、蒸発により乾燥させ、そし
て更に溶解力のあるメタノール：水（７７：２３）の混
合液、内界、パイストラドアミドＢ１バイストラドアミ
ドＡ１バイストラテンＡ及びＢを用い、セファデックス
ＬＨ−２０に関するクロマトグラフィによって更に浄化
が進められた。パイストラドアミドＡ及びＢは乾燥によ
り抽出された（濡れ重量５η／助に同等の）組成３％に
ほぼ等しい量のものが得られた。バイストラテンＡ及び
Ｂの収率は乾燥した抽出物１０％及び２．８％であった
。化合物の構造はＩＨ及び１３ＣＮＭＲ分光器、２Ｄ　
Ｃ０８Ｙ　４５及びＩｎ　　１３ｃ　　シフト関連試験
による詳細な分析からは明確にされなかった。
人の細胞線に対し６つ化合物の有害細胞は、Ｍ凡Ｃ５Ｃ
■１の人間芽細胞及び腫瘍線としてのＴ２４の袋状組織
による過渡期癌細胞が明らかとなった。
この細胞はＣＯ２５％の湿度大気中で子牛脂児の血清１
０％を含むＲＰＭＩ−１６４０媒体（カモンウェルス血
清研究所）に保持された。また、細胞は〔メチル−Ｈ）
チミジン（１０μｃｉ　／ｍＬ、　４０　Ｃｉ　／ｍｍ
ｏｌ、Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ　）により膜化される２
４時１’ｆ４Ｊ　’ＭＵに５　Ｘ　１０３セル／１６咽
の好適密度で張られた。それから、１０％のトリクロロ
アセチク酸（ＴＣＡ　）で冷却して抽出した。このＴＣ
Ａ−不溶性物質はグラスファイバ製のフィルタ上に収集
され、液体シンナレーション計数器による計数に先んじ
て１００％のエタノールによる５％のＴＣＡで冷却して
洗浄した（第４図）。パイストラドアミドＡは約６０μ
ｇ　／　ｍＬのＩＣ５ｏ値をイｊ“し、パイストラドア
ミドおは約１００μｇ／ｍＬよりも大きいＩＣ５ｏ値を
翁する。
これら双方の有毒性はパテルアミドＤのそれに似ている
。バイストラドア□ドＡにおける一つのチアゾリンを、
バイストラドアミドＢ内のチアゾールへ転換することは
毒性の少ない化合物に組成する結果となる。
バイストラテンＡ及びＢ これら２つの化合物の有害細胞は、前述したパイストラ
ドアミドＡ−及びＢと同様な手順を踏１えることにより
決定される。また、ノくイストラテンは現在１でにホヤ
類、特に、ＩＣ５゜値が０．０７μｇ／ｍＬのバイスト
ラテンＡで発見された最も有害化合物に含゛まれる。甘
た、この発明で優先された化合物の有害細胞の成分は、
表１に示された周知の化合物であるアシデイアシクルア
ミド及びウリデイアシクルアミドの有害成分と同様であ
る。
（以下、この頁余白） 表 上表は袋状組繊細胞： Ｔ２４を 時間曝露した 結果を示す。
バイストラテンス（ｂｉｓｔｒｔｅｎｅｓ　）の作用の
機構も試験した。
理論によって拘束されることは希望しないが、上記の化
合物はナノモル濃度で１−１．Ｌ−６０内の膜化の性質
、人間の白血病細胞及び単環／大食球通路を示す。これ
らはカルシウムイオン電気導入性を有しないが、マイク
ロモル濃度で酵素タンパクキナーゼを活性化する。
詳述すれば、次のＰＫＣアサイズ（ａｓｓａｙｓ　）に
使用されるパイストラテンス（ｂｉｓｔｒｔｅｎｅｓ　
）　Ｂの濃度は逆位相及び正常相薄層のクロマトグラフ
ィーによって証明される。ＴＰＡＸＭＴＴ　（３、（４
，５−シメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフ
ェニルテトラゾリウム臭化物、ホスファチジルセリン、
オレイン酸、ヒストンＨ１及び１，２−ジオレインはＳ
ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、の市販品Ｃｒ−３
２Ｐ　）ＡＴＰをＢｒｅｓａｔｅｃから入手した。
ＯＫＭ−１（大食球−顆粒球細胞表面グリュタンバク）
に対する抗体が０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓで
得られる。Ｌｅｕ−Ｍ３　（ＣＤｗ　１４　）に対する
紅藻素をラベルし／こ抗体、顆粒体マーカー　Ｌｅｕ−
１１ａ（ＣＤＬ６　）、Ｌｅ　ｕ　−７（ＨＮＫ−１）
及びＨＬＡ　−Ｄ　ＲをＢａｃｔＯ＋ｎＤｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ社から入手した。
ＩＩＩ、−６０細胞を１０％子牛脂児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地で培養した。Ｈ，Ｌ−６０細胞に対する
パイストラテンス（ｂｉｓｔｒｔｅｎｅｓ　）の細胞毒
素は生きた糸粒体によってＭＴＴの青色ホルマザン生Ｊ
或物への変換に基つく比色アサイ（ａｓｓａｙ）を使用
して測定しプζ。
前着性は、培養物を緩やかに振り混せ、非癒着性細胞を
通気した後の視察試験によって評価した。
細胞遠心植木標本をビストラテン（ｂ＋５ｔｒａｔｅｎ
ｓ　）Ａによる処理後、４８時間で非特異性エステラー
ゼＣＮ５Ｅ）に対して評価した。食作用は膜化Ｉ４　Ｌ
６０　ｙ、（ｏ、　ａμポリスチロール−ラテックス　
ビード（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）
で培養した。
ビストラナン処理培養物の上澄液は、第１抗体としてウ
サギ抗体工Ｌ−１及び第２抗体として活性部位に向いた
抗■Ｌ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用するＥ
ＬＩＳＡ試金によ献金インターロイキン１（ＩＬ−１）
の存在下で評価した。表面抗原ＨＬ　Ａ−Ｄ　ＲｌＯＫ
Ｍ−１、Ｌｅ　ｕ−Ｍ３．　Ｌｅ　ｕ−７及びＬｅｕ−
１１ａは適当な螢光的にラベルしたｍＡｂ　ｓを使用す
る螢光活性細胞分類法によって測定し、第２抗体として
ＯＫＭ−１螢光的にラベルした山羊のアンチマウスＩｇ
Ｇを使用する。
ＰＫＣは、Ｄ　ＥＡ−Ｅ−セルロース、フェニル−セフ
ァロース、ドレニン−セファロース及ヒオキシラバタイ
ト上の連続的クロマトグラフィーによって牛の牌臓（ｉ
ｏｏｏｙ）から単離した。電気泳動的に純粋なタイプＩ
ｔ　ＰＫＣの４３■及びタイプ■ＰＫＣ２，０ηが最終
生成物であった。酵素活性度のａｓｓａｙ評価は基質ど
してリシン含有ヒストンを使用し、（−”ＰＪＡＴＰ　
（５０μＭ、　４　Ｘ　１　ｏ　ｄｐｍ／試金か献金リ
ン酸塩（３２ｐ）をヒストン（１■／ｍＬ　）　Ｋ配合
する速度を測定することによって実施された。
全献金は１ｏｍＭのＭｇＣｌ２及び５　ｍＭのジチオト
ロイトールヲ含ンでいた。カルシウムイオン、フォスフ
ェティジルセリン、オレイン酸、ジオレイン、ＴＰＡ及
び献金内に含１れるビストラテンの濃度は第２表に示さ
れる。
（以下、 この頁余白 ） ト ペ 糟 赫 謳 謳 フォスフェティジルセリンを超音波処理小胞生成物とし
て添加した。他の化合物はエタノール又はメタノールの
溶液として添加した。常に２％（■／Ｖ）以下の有機溶
媒濃度は酵素活性度に影響がないことが判明した。
ＨＬ−６０、人間の前骨髄球の白血病細胞をビストラテ
ンＡ及びＢで処理すると、高濃度で細胞毒性が観察され
るが、低濃度ではこれらの細胞に激しい形態変化が観察
され、これは細胞の膜化を示すものである。■Ｌ−６０
細胞の成育性に対するビストラテンＡ及びＢの増加濃度
の影響を第９図に示す。これらの細胞に対する■Ｃ５ｏ
値は４２４ｎＭであった。これ以下の濃度で／′ｉ１１
１−１Ｌ−６０胞は膜化が起こる。ビストラチンＡ　（
１１００ｎ、　）に対する２時間の連続的曝露後、ＨＬ
−６０細胞は培養板に付着し、スピンドル形状の形態と
偽足の形態となった。この細胞は互いに分離状態を継続
するが、時間の経過と共に細胞が大きくなった。ＴＰＡ
処理細胞は更に強力に何着し、又大きい凝集塊を示しブ
こ。ビストラテン処理のＨＬ−６０細胞の形態は単種細
胞／大食細胞経路に沿う膜化の過程で代表的なものであ
る。種々の細胞表面と他の膜化マーカー（第３表）を使
用する詳細を研究した。
表 ろ マーカ ＨＬ−６０の種類 Ｏｎｅ 誘発因子 ビストラチンＡ　　　　ＴＰＡ 伺着力 通常エストラーゼ 食菌 ＩＬ−生成 ＯＫＭ−１抗原薬 陽性百分率 ００１ ９２ ＤＲ−抗原薬 Ｌｅｕ−Ｍ、５ （ＣＤ１ｊ） Ｌｅｕ−７ （ＨＮＫ−１） Ｌｅｕ−１１ａ ０ ０２ Ｄ Ｄ 表中、全数値は４８時間経過後を示し、Ｌｅｕ−Ｍ５の
みは９６時間経過の数値である。
最大値の半分を生成するに要求される濃度（ＴＰＡ）は
ＯＫＭ−１及びＬｅｕ−Ｍ、ｓのそれぞれ５０　ｎＭよ
りも低値でめった。
（以下、この頁余白） これらの細胞は幾つかの形態特徴、例えばプラスチック
の対する付着性及びＯＫＭ−１とＬｅｕ−Ｍｓ抗原の表
徴の特徴を示すが、これらは）ｉＬＡ−ＤＲ表徴及び非
％異性エステラーゼ活性を欠いているから、活性化され
ることなく、食細胞で■Ｌ−１を生成することはない。
牛のｗｌ、臓から得られたタイプ■のＰＫＣの活性度に
対するビストラテンＢの影響を試験した。同じ酵素製品
に対するジオレインとＴＰＡの影響を研究するための並
行試験を行い、この結合成果を第２表に示す。ビス）・
ラテンＢは３５６μＭ以下の濃度では酵素を活性化せず
、ＴＰＡ（ＩＳｎＭ）は３５μＭのビストラテンＢの存
在下では活性を増加することはない。カルシウドイオン
の改善の濃度（１０μＭ）とクオステジルセリンの改善
の濃度（１０μｇ／ｍＬ　）では、ＴＰＡとビストラテ
ンＢの両者は酵素活性を増加する。オレイン酸のみが存
在（２５μＭ）する場合は（フォスフブチジルセリンの
代替物として）、酵素は殆ど完全に不活性になる。２５
μＭのオレイン酸及び１０μＭのジオレインの存在下で
は、この活性は、実験誤差の範囲内で同じ価１で増加さ
れ、この価は最適濃度のフォスフブチジルセリンとジオ
レインの存在下で測定したものである。この研究は、Ｔ
ＰＡとビストラテンＢはオレイン酸の存在で酵素の活性
を同様に増加することを示した。２５μＭのオレイン酸
ではＴＰＡとビストラテンＢも最大の活性増加を生じな
い。しかし、脂肪酸の高濃度（３００−６００μＭ）テ
は酵素ｎ　１６　ｎＭＴＰＡ又は３５μＭのビストラテ
ンＢの存在で完全に活性化され、６００μＭの脂肪酸の
みの存在で活性は３０倍に増加される。
〔 入も き 畳 〕
Ｓ−、　／／１ ゛へ 入目４０誠 （盪４１１帆） 〔 ＾、 転 コ ニ 〕 も’／／ ′へ べ聴４Ｄ叡 （、鴨４ｑ訳） 手 続 補 正 男 （自発） １゜ 事件の表示 平Ｊ戊　１年　特ＩＩ願 第 ０６３６９ ２、発Ｉす］の名称 細胞ｉｊｊ性高分子 ３゜ 補正をする者 市（ｌＩとの関係　　　特許出願人 名称　ユニヴアーシティ　オフ クイーンズランド ４、代　理　人 願１ν）及び委什状ｉｌｌ□びに図面 ６゜ 補正の内容 別紙の通り 丁 続 補 正 １ （方式） ％式％ 発明の名称 細胞毒用高分子 補正をする老 事件との関係　　　秘計出願人 名称　ユニヴアーシティ　オフ クイーンズラント 代 ■甲　　　　人 補正の対象 補 疋 の 内 容
【図面の簡単な説明】
第１　Ａ、〜Ｃ図は、対称環式へキサペプチドの構造を
示す図であり、 第２図は、異なる濃度のトリスオキサゾリンを用いて、
細胞を１時間インキーベーションシ、５日後に、細胞生
存率のひとつ尺度として、〔メチル−ｓ　Ｈ）のＤＮＡ
への組込みを求めた結果を示す図であり、 第３〜５図は、第２図と同様な図で、８ｔｕｄｅｎｔの
Ｔ−試験により求めた、平均値の統計的有意差を示す図
であり、 そして 第６〜９図は、 細胞育成能と濃度との関係を示 す図である。

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）実質的に純粋なリソクリンアミド７。
  2. （２）実質的に純粋なビストラテンＡ。
  3. （３）実質的に純粋なビストラテンＢ。
  4. （４）実質的に純粋なトリスオキサゾリン。
  5. （５）実質的に純粋なリソクリンアミド８。
  6. （６）実質的に純粋なリソクリンアミド４。
  7. （７）実質的に純粋なリソクリンアミド５。
  8. （８）実質的に純粋なパテルアミドＤ。
  9. （９）実質的に純粋なビストラテンＡ。
  10. （１０）実質的に純粋なビストラテンＢ。
  11. （１１）少なくとも一つの基が別な基によって置換され
    ている請求項第１〜１０項のいずれか１項に記載の化合
    物。
  12. （１２）請求項第１〜１０項のいずれか１項に記載の化
    合物を単離する方法において、 １）清浄処理したホヤをアルコール／炭化水素溶液で均
    質化処理し、 ２）均質化処理物を濾過し、 ３）濾過物を水溶液で抽出し、 ４）水性層を有機溶剤で抽出し、 ５）有機抽出物を乾燥・蒸発して除去し、 ６）残留物をクラマトグラフィー処理し、 そして ７）個々の化合物を単離することからなる単離方法。
  13. （１３）ホヤがリソクリヌム・パテラ（￥Ｌｉｓｓｏｃ
    ｌｉｎｕｍ￥　￥ｐａｔｅｌｌａ￥）又はリソクリヌム
    ・ビストラツム（￥Ｌｉｓｓｏｃｌｉｎｕｍ￥　￥ｂｉ
    ｓｔｒａｔｕｍ￥）である請求項第１２項記載の方法。
  14. （１４）賦形薬又は希釈薬と共に請求項第１〜１１項の
    いずれか１項記載の化合物の少なくとも一種か、あるい
    はその非毒性塩を含む薬剤組成物。
  15. （１５）請求項第１〜１１項のいずれか１項記載の化合
    物又は請求項第１４項記載の薬剤組成物の有効量を投与
    することからなる治療方法。
  16. （１６）治療対象が癌又は関連疾病である請求項第１５
    項記載の方法。
  17. （１７）細胞蛋白質の転形子として請求項第１〜１１項
    のいずれか１項記載の化合物を使用して、細胞成長及び
    分化を検出・監視する方法。
  18. （１８）細胞蛋白質がＰＫＣである請求項第１７項記載
    の方法。
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