JPH03162480A

JPH03162480A - 蛍光物質によるエクオリンの増感発光法

Info

Publication number: JPH03162480A
Application number: JP30143989A
Authority: JP
Inventors: Shuhei Yoshino; 修平善野; Satoshi Inoue; 敏井上
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1989-11-20
Filing date: 1989-11-20
Publication date: 1991-07-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、蛍光物質を共存させることを特徴とするエク
オリンの増感発光法に関する．［従来の技術とその問題
点］発光蛋白エクオリンは、発光オワンクラゲよりｘｍされ
たカルシウム結合蛋白質で、自然界においては蛋白質部
分のアポエクオリンと、基質部分のセレンテラジンが、
分子状酸素を介して複合体を形成している．この複合体
にカルシウムが結合することにより発光する．この発光
を利用してカルシウム濃度を測定できる．本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲよりアポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、
そのｌ次構造を明らかにした（特開昭６１−１３５，５
８８），次いで、このｃＯＮ＾を用いて大腸菌を宿主と
し、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に
成功し（特開昭６２−１７１，８９５，特開昭６３−１
０２，６９５）　，その精製法を確立した（特開平１　
−１３２．３９７）　．さらに、機能遺伝子と結合した
エクオリン遺伝子を作製し、その融合蛋白質の生産に成
功し（特開昭６４−３９，９９０、特願昭６３−３０［
１．４２４），その精製法を確立した　（特願平１−８
９．８６２），そして、これらのエクオリン及びその融
合蛋白を用いた金属検出法及び免疫測定法を開発した（
特開昭６２−２６１，９４２、特願平１　−７４，７４
２）。

本発明は、蛍光物質によるエクオリンの増感発光法に関
する報告である．ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる．すなわち、免疫測定法やＤＮＡプローブ、バ
イオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるも
のであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有
用であることが予測される．本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
蛍光物質によるエクオリンの増感発光法を開発すること
ができた．以上の説明から明らかなように、本発明の目
的はエクオリンをより超高感度な測定法に応用するため
の発光増感技術を堤供することである．［問題点を解決するための手段］本発明は、下記（１）〜（３）の構戊を有する．（１）
エクオリン及びその誘導体を用いる発光法において蛍光
物質を共存させることを特徴とする増感発光法．（２）　蛍光物質としてエオシンＹ、フルオレセイン・
ナトリウム、ブリリアントスルホフラビン、ローダミン
Ｂ若しくはローズベンガルから選ばれた一以上の物質を
用いる前記第１項に記載の増感発光法．（３）エクオリン誘導体が、変異エクオリン、半合戊エ
クオリン若しくは半合成変異エクオリンである前記Ｎ１
項に記載の増感発光法．本発明の構威と効果につき以下に詳述する．本発明は蛍
光物質の増感効果によるエクオリンの増感発光法であり
、たとえば後述の実施例に示す方法で行うことができる
．本発明の方法に関連する、ジオキセタン類とは、第１図
に示すような四員環ベルオキシド構造を有する化合物で
、セレンテラジンとは、第２図に示すような構造を有す
る化合物で、エクオリンとは、第３図に示すような構造
を有する複合体で、エクオリン誘導体とは、アボエクオ
リン部分が変異アポエクオリンにｌ！！ＥｔＡした変異
エクオリン、セレンテラジン部分がセレンテラジン銹導
体に置換した半合成エクオリンやその両方ともが置換し
た半合成変異エクオリンである．また、蛍光物質として
は、３４１表に示す物質等が挙げられる．本発明を添付図面及び表にて説明すると、第１図は、ジ
オキセタン類の構造を示したもので、（１）がジオキセ
タンの基本骨格の構造を示し、（２）〜（５）　がジオ
キセタン類発光体の一例である．第２図は、セレンテラ
ジンの構造を示す．３４３図は、エクオリンの複合体を
模式的に示したものである．第４図は、エクオリンの発光・再生のメカニズムを示す
．これによると、セレンテラジンはジオキセタンの構造
を有する中間体を経由して、分離することがわかる．第１表は蛍光物質の一例を示したものである．第　　１
　　表（種々の蛍光物質）注ＮＢＤ：　７−ニトロベンゾフラザン誘導体．ＳＢＤ：
７−スルホニルベンゾフラザン誘導体第２表（後述）は
エクオリン発光に対する蛍光物質の増感効果を示したも
のである．エクオリン若しくはエクオリン誘導体を蛍光物質と併用
する方法は、次のとおりである。

エクオリンとしては、公知方法（上述）で製造されたア
ボエクオリンを所定の条件で混合し反応させて生ずる再
生エクオリンあるいは天然エクオリンを使用する．セレ
ンテラジンを反応させる場合の好ましい反応条件は、４
℃である．得られたエクオリン及びその誘導体は、第１
表に例示されるような蛍光物質と所定の条件で混合して
、本発明に使用する発光剤とする．該発光剤に由来する
発光量の測定は公知方法に従う．上述のようにして得ら
れた本発明の増感発光法を用いることにより、より微量
な物質を超高感度に検出及び測定することが可能となっ
た．さらに、界面活性剤、包接化合物、水溶性高分子化
合物などの共存により、より高い増感効果が得られるこ
とが期待できる．また、エクオリンの発光がジオキセタ
ン中間体を経由して起こることからすると、ジオキセタ
ンやセレンテラジンの化学発光においても増感効果が予
測されるものである．［発明の効果］本発明のエクオリンの増感発光に関する方法の有用性は
、当業者に自明である．また、適当な蛍光物質と共存せ
しめることにより、エクオリンの発光の増感が可能にな
る．このような物質自体は、当業者に周知である．上記の開示により、当業者は、特許請求された本発明を
実施できる．しかし、この技術の理解を増すために、本
発明に重要なエクオリンの増感発光に使われる手順を実
施例によって明らかにする．［実施例］実施例１［エクオリン発光に対する蛍光物質の増感効果］特開昭
６３−１０２，６９５に記載の生産法により生産し、特
開平１−１３２，３９７に記載の精製法により精製し、
さらにシリカ系コスモシル１０Ｃ４　（１０ｘ　１５０
＋ａｍ）カラムにて、　０．１％トリフルオロ酢酸、水
一アセトニトリル系にて２０〜８０％のアセトニトリル
勾配をかけ、分離したアポエクオリン精製標品を以下の
実験に使用した．アポエクオリン（１０ｎｇ／μぶ）水
溶液５０μ４１　．　２００ｍＭ　Ｔｒｌｓ　ＨＣＩ（
ｐＨ７．６），１００ｍＭＥＤＴ＾バッファ−５０μｌ
１セレンテラジン（２００１ｇ／■Ａ）メタノール溶液
５μｌ，２−メルカプトエタノール５μｌ、最後に水で
５００μｌとした．　混合後、４℃にて一晩（１５〜２
０時間）インキエベートシｋ．２５μ℃ずつ別のチェー
ブに分取し、あらかじめ調製した２０〜２０００μｇ／
一ｌ蛍光物！（エオシンＹ，フルオレセイン・ナトリウ
ム、ブリリアントスルホフラビン、ローダよンＢ１ロー
ズベンガル）２５μｌと混合した後、そのｌＯμ℃につ
いて、ルミフォトメーター（　ＴＤ４０００，ラボサイ
エンス社）を用いて、３Ｇ＋＊Ｍ　ＴｒＩｓ　ＨＣＩ（
ｐ｝１７．８）．　３０ａ＋ＭＣａＣ１２水溶液１００
μぶ添加後の発光量を測定した．その結果を第２表に示
す．第２表５種全ての蛍光物質についてエクオリン発光に対する増
感効果が確認された。このことは、その他の蛍光物質に
ついての増感効果も当然に予測できる．以上のように蛍光物質の共存により、ジオキセタン類を
介した発光において増感効果が得られることがわかった
．

【図面の簡単な説明】

第１図は、ジオキセタンの化学構造を示す．第２図は、
セレンテラジンの化学構造を示す．第３図は、エクオリ
ンの構造を模式的に示したものである．第４図は、エク
オリンの発光・再生のメカニズムを示す．以　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　エクオリン及びその誘導体を用いる発光法にお
いて蛍光物質を共存させることを特徴とする増感発光法
。
（２）　蛍光物質としてエオシンＹ、フルオレセイン・
ナトリウム、ブリリアントスルホフラビン、ローダミン
Ｂ若しくはローズベンガルから選ばれた一以上の物質を
用いる特許請求の範囲第１項に記載の増感発光法。
（３）　エクオリン誘導体が、変異エクオリン、半合成
エクオリン若しくは半合成変異エクオリンである特許請
求の範囲第１項に記載の増感発光法。