JPH03143387A - プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、遺伝子組換えによってペプチド等を生産する
ために、特に有用なプロテアーゼ生産性の低い枯草菌に
関する。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］枯草菌（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）は、エンドト
キシンなどを生産せず、しかも病原微生物として人や動
物に寄生したり共生することがないので、大腸菌に比べ
て安全性が高い。このような枯草菌を遺伝子組換え体の
宿主菌として利用することにより、外来遺伝子産物であ
るペプチド、タンパク質等のペプチド粘合を有する有用
な生産物を菌体外へ分泌生産させることができるので、
枯草菌は、その安全性と共に、その工業的有用性が注目
されている。しかしながら、枯草菌は、プロテアーゼを
菌体外に多量に分泌生産する。従って、外来遺伝子に由
来する有用な外来分泌産物が多量に生産されたとしても
、ペプチド結合を有する外来分泌生産物は、枯草菌が培
地中に分泌する種々の菌体外プロテアーゼにより分解さ
れてしまい、高い収率で有用生産物を回収することがて
きない。

この問題を解決するために、最近、宿主枯草菌のプロテ
アーゼ活性を低下させるための研究が行なわれている。

プロテアーゼ生産性の低い抽ｊ′Ｎ菌として、枯草菌の
主たる菌体外プロテアーゼであるアルカリプロテアーゼ
および中性プロテアーゼの両者を欠失したバチルス・サ
ブチリス　（Ｂａｃｉｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｌｓ）　ｌ
０４ＨＬ株［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リザーチ・コミュニケションズ（旧ｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）。

１２８、６０１．−８０８．１．．９８５］や、本出願
人が先に提案したように、バチルス・サブチリス１０４
　Ｉｌｌ、株に、ｐａｐ遺伝子を導入したバチルス・サ
ブチリスＤＹ−１８株（特開昭８４−３１２８４号公報
）が公知である。

しかしながら、バチルス・サブチリス１０４１１＋、株
やＤＹ−１，６株には、未だプロテアーゼ活性が残存し
ているので、残存するプロテアーゼ活性により、有用な
分泌産物が培地中で分解されてしまう。

従って、本発明の目的は、安全性が高く、しかもペプチ
ド結合を有する有用な分泌産物を高収率で回収できるプ
ロテアーゼ生産性の低い枯草菌を提供することにある。

［発明の構成］ 本発明者等は、枯草菌におけるプロテアーゼの生産が、
胞子形成期にその大半が起こることに着目して、プロテ
アーゼ低生産性枯草菌を得るべく鋭意検討した結果、枯
草菌の主たる２つのプロテアーゼであるアルカリプロテ
アーゼと中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテ
アーゼ活性が野生株の３％以下の枯草菌に、特定の遺伝
子を導入することによって、親株枯草菌よりプロテアー
ゼ活性が著しく低下した枯草菌が得られることを見い出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、枯草菌の
主たる２つのプロテアーゼであるアルカリプロテアーゼ
及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、しかもプロテア
ーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、ｓｐｏ　
ＯＡ△ｆ１７７遺伝子（Ｅｌｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、　４．　ｌ−３（１９８１））が導
入された、プロテアーゼ生産性の低下した枯草菌を提供
する。

本発明において、ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子が導入さ
れる枯草菌は、枯草菌の主たる２つのプロテアーゼであ
るアルカリプロテアーゼと中性プロテアゼの生産能を失
い、かつプロテアーゼ活性か野生株の３％以下に低下し
た枯草菌であればよい。野生株や、プロテアーゼ活性か
野生株の３％を越える枯草菌に、ｓｐｏ　ＯＡ△６７７
遺伝子を導入しても、プロテアーゼ活性が残存し、ペプ
チド結合を有する分泌産物の回収率が低下する。なお、
枯草菌のプロテアーゼ活性が低下しているほど、結果と
して得られるプロテアーゼ活性も低いことは容易に類推
てきる。

このような枯草菌としては、前記バチルス・サブチリス
　１０４１１１、株、バチルス・サブチリスＤＹ−１６
株などが挙げられる。なお、バチルス・サブチリスＤＹ
−１６株は、バチルス・サブチリス１０４１１Ｌ株にｐ
ａｐ遺伝子を導入した菌株であり、微王研菌寄第９４８
８号として寄託されている。

これらの菌株は、実施例において詳述するように、野生
株バチルス・サブチリス２０７−２５株と比較して、プ
ロテアーゼ活性が著しく小さい。すなわち、バチルス・
サブチリス１０４＋１Ｌ株は、野生株２０７−２５株の
約２．８％、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株は、野
生株２０７−２５株の約１％しかブロテアゼを生産しな
い。

ところで、枯草菌におけるプロテアーゼの生産は、胞子
形成期にその大半が起こることが知られている。そこで
、本発明者らは、プロテアーゼ活性の低い前記枯草菌宿
主に、ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子を導入することによ
り、宿主に残存するプロテアーゼ活性が更に低下するこ
とを見い出した。

ｓｐｏ　ＯＡ△６７７変異は、胞子形成の最も初期の段
階において、胞子形成を遮断する欠失変異である。すな
わち、胞子は、枯草菌が、熱、紫外線、化学薬品及び乾
燥に晒されたときにおいても、通常、自然界で生存し得
る形態であるが、上記変異遺伝子は、枯草菌における胞
子形成能を破壊する。

従って、ｓｐｏ　ＯＡΔ６７７遺伝子が導入された枯草
菌は、胞子形成能を有しない。

本発明において用いられるｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝了
としては特に限定されず、ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子
を有する菌株、例えば、バチルス・サブチリスＡＴＣＣ
３５１４８株、ＡＴＣＣ３９０９０株、ＡＴＣＣ３９［
１９１株、ＡＴＣＣ３９０９２株、ＡＴＣＣ３９０９４
株、ＡＴＣＣ３９ｏ９ｅ株なトノｓｐｏ　ＯＡ△６７７
遺伝子を用いることができ、これらの株は、アメリカン
◆タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｃｒｔｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ
）から入手できる。またバチルス・サブチリスＡＴＣＣ
３９０９０株は、バチルス・サブチリスＢＧＳＣＩＳ５
３として、バチルス・サブチリスＡＴＣＣ３９０９６株
は、バチルス・サブチリスＢＣ８ＣＷＩＳ５８としてバ
チルス・ジェネティック・ストック・センターＮ）ａｃ
ｌｌｕｓ　Ｇｃｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ
）からも入手できる。

ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子を宿主枯草菌に導入する方
法としては、慣用の方法、例えば、 （１，）　ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子供与体菌の染色
体ＤＮＡをすべて宿主枯草菌に導入するコンピテントセ
ルトランスフォーメーション法、 （２）　ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子供与体菌の染色体
ＤＮＡ遺伝子を制限酵素により切断し、ｓｐｏ　ＯＡ△
６７７遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドに組み込み
、宿主枯草菌を形質転換する方法、及び （３）上記プラスミドと同様にして、ファージ粒子に組
込んだｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子を用いて、宿主枯草
菌を形質転換する方法 などを挙げることができる。なお、上記（１，）（２）
（３）の形質転換法については、「微生物遺伝子実験法
、第３巻、ｐ、９６〜１１Ｂ、共立出版」を参照できる
。

このようにしてｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子を枯草菌宿
主に導入した形質転換株の中から、胞子形成能を欠損し
た枯草菌を選別する。

胞子形成能が欠損した菌株は、 （１〉胞子形成培地に形質転換株を植菌し、そのコロニ
ーがメラニン色素生産能を失ったこと、（２）温度８０
℃、１０分間の熱処理に耐性を示すこと、及び （３）顕微鏡検査により胞子形成を認めないことによっ
て確認できる。

また胞子形成能を有しない枯草菌のうち、宿主である枯
草菌よりもプロテアーゼ生産性が低下した菌を選別する
ことにより、本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯
草菌を得ることができる。

プロテアーゼ生産性の低下した菌株は、ｓｐｏ　ＯＡ△
６７７遺伝子が導入され、かつ胞子形成能欠損株となっ
た枯草菌を、カゼインを含むプレートを用いて培養し、
菌体が分泌するプロテアーゼにより形成されるクリアゾ
ーン（Ｉｌａｌｏ）が宿主に比べて小さい菌株を選別す
ることにより得られる。またプロテアーゼの生産性をさ
らに詳しく調べる方法としては、カゼイン、合成基質で
あるアゾコール、ＦＩＴＣ−カゼインを用いる方法があ
る。この方法では、これらの基質の分解を、分光光度計
もしくは螢光光度計で測定することにより、培養上清中
のプロテアーゼ活性を調べることができるので、プロテ
アーゼ生産性の低い株を確実に選別できる。

本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯草菌のうち、
特に好ましい菌株は、バチルス・サブチリス１０４１１
Ｌ株に、ｓｐａ　ＯＡ△６７７遺伝子を導入して得られ
るバチルス・サブチリス５ＰＯＩＩ株（微工研菌寄第１
０９８７号）と、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株に
、ｓｐｏ　ＯＡΔ６７７遺伝子を導入して得られるバチ
ルス・サブチリスＳ　Ｐ　Ｌ　１４株（微工研菌寄第１
０９８８号）である。

本発明のプロテアーゼ生産性の低い枯草菌変異株は、胞
子形成能を有していない点を除き、一般的な枯草菌とし
ての性質を保持する。好ましい菌株についてより具体的
に説明すると、バチルス・サブチリス５ＰＯ１，１株の
親株であるバチルス・サブチリス１０４ＨＬ株は、遺伝
子マーカーとして、ｈｉｓｌｅｕ　　ｎｐｒ　Ｒ２ｎｐ
ｒ　Ｅ４　　△ａｐｒ　Ａ３を有している。

これに対して、その変異株であるバチルス・サブチリス
５ＰＯ１，］株は、遺伝子マーカーｈｉｓ　　ｎｐｒ　
Ｒ２ている。

またバチルス・サブチリス５ＰＬ１４株の親株であるバ
チルス・サブチリスＤＹ−１６株は、遺伝子７０ カーとしてｈｉｓ ｎｐｒ ２ ｎｐｒ ４ △ａｐｒ その変異株であるバチルス・サブチリスＳＰ１．１．４
株れている。

上記遺伝子マーカーからも明らかなように、本発明の枯
草菌は、通常、少なくともヒスチジン要求性を有してい
るので、遺伝子組換え実験などの宿主として有用である
。

なお、ｓｐｏ　Ｏ＾△６７７遺伝子を含む菌株、例えば
、ｓｐｏ　ＯＡ△６７７遺伝子の供与体であるバチルス
・サブチリスＡＴＣＣ３９０９６株は、遺伝形質として
ｔｈｙ　Ａｔｔｈｙ　Ｂｌ　ｐｙｒ　ＤＩ　ａｒｏ　ｌ
０１ｉｎ　２　ａＩＩｌｙ　３　ｓｐ。

ＯＡ△６７７を有している。

本明細書に記載の遺伝子マーカーの記号の意義は、次の
通りである。

Ｉｅｕ　：ロイシン要求性変異 ｈｉｓ　：ヒスチジン要求性変異 １ ｎｐｒＲ２：中性プロテアーゼ制御遺伝子変異ｎｐｒＥ
４：中性プロテアーゼ遺伝子欠損変異Δａｐｒへ８：ア
ルカリプロテアーセ遺伝子欠失変異 ｅｙｅ−ｒ：サイクロセリン耐性変異 ｐａｐ−８：α−アミラーゼとプロテアーゼの生産性に
影響を与える遺伝変異 ｓｐｏ　ＯＡ△６７７　　胞子形成の最も初期の段階に
おける遮断を起こさせる欠失変異 １ｉｎ２：リンコマイシン耐性変光 ｔｈｙ　Ａｌ　、ｔｈｙ旧：チミン及びチミジンに対す
る要求性を付！ｊする突然変異で、トリメトプリム耐性
を付Ｉｊ−する ｐｙｒ　ＤＩ　：ピリミジンに対する要求性を付ちする
突然変異 ａｒｏｌＯ：芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、
チロシン、トリプトファンに対す る要求性を付与する突然変光 ［発明の効果］ 以上のように、本発明の一プロテアーゼ生産性の２ 低い枯草菌は、プロテアーゼ活性が小さな枯草菌にｓｐ
ｏ　ＯＡ△６７７遺伝子が導入されているので、安全性
が高く、ペプチド結合を有する有用な分泌産物を高収率
で回収できる。

従って、本発明の枯草菌は、遺伝子組換扶術を利用して
、ペプチド等を生産するときの宿主として有用である。

［実施例］ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
。なお、本発明はこれらの実施例に駆足されるものでは
ない。

実施例１ ｓｐａ　ＯＡΔ６７７遺伝子及びリンコマイシン耐性遺
伝子（以下、Ｌｉｎ’と表す）を有する枯草菌であるバ
チルス・サブチリスＡＴＣＣ３９０９６株を、表１に示
すＬＢ培地を用いて、温度３７°Ｃで対数増殖期まで振
盪培養した。

（以下、余白） ］　３ 表１ １．０重量％　　　　　トリプトン ０．５重量％　　　　酵母エキス ０．５重量％　　　　ＮａＣノ ｐＨ７，５ 培養液５０ｍ１中に含まれる菌体を集め、斎藤・三浦の
方法（１１，５ａｉｔｏ、　Ｋ、旧ｕｒａ、　ｌ３ｉｏ
ｃｈｆ、　Ｂｉｏｐｈｉｓ、　Ａｃｔａ、　７２．６１
９　（１９６３））により染色体ＤＮＡを抽出精製した
。

得られた染色体ＤＮＡを用いて、コンピテントセルトラ
ンスフォーメーション法により、バチルス・サブチリス
ｌ　Ｏ４１１Ｌ株を形質転換した。

ヒスチジンを５０　ｍｇ　／　Ｊ含む最小寒天培地に形
質転換した枯草菌をまき、温度３７℃で４８時間培養し
た。以下の指標１〜３に合致する菌株を、胞子形成能欠
損株として選別した。

］、胞子形形成地に形質転換株を植菌しそのコロニーが
メラニン色素生産能を失ったこと、２、温度８０　’Ｃ
で１０分間の熱処理に耐性を示すこと、及び 　４ ３、顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。

得られた胞子形成能欠損株１７３株のうちプロテアーゼ
活性が最も低い株を選出すると共に、プロテアーゼ活性
を、以下の方法で測定した。

すなわち、１重量％のカゼインを含むＬＢ寒天平板培地
に、胞子形成能を欠損した形質転換株と、親株であるバ
チルス・サブチリス１０４１１　Ｌ株とを別々に植菌し
、温度３７℃で２４時間培養した。菌体が分泌するプロ
テアーゼによりカゼインが分解されるので、カゼインの
分解により形成される菌体の回りのハローの大きさを指
標として、親株であるバチルス・サブチリス１０４１ｉ
Ｌ株よりもプロテアーゼ生産能が低下した菌株を２４株
分離した。

さらに、これらの菌株を、ＬＢ培地で液体培養し、その
培養上清に存在するプロテアーゼの活性を、アゾコール
（シグマ社製）を基質として測定した。すなわち、バチ
ルス・サブチリス＋　０４　ＩＩ　Ｌ株と、プロテアー
ゼ活性が低下した形質転換株２４株とを、それぞれ、Ｌ
Ｂ培地１．０　ｍｌを用いて一晩培養した後、培養液１
　ｍｌを遠心分離し、その上清５ をプロテアーゼ酵素液とした。

また基質溶液として、０．４８ｇのアゾコールを、５０
　ｍ　Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７，５）と１ｍＭ塩化カ
ルシウムとからなる混合液２０ｍ１に懸濁し、その７５
０μノを酵素液５０μノと混合し、温度３７℃で３０分
間インキュベートした。反応溶液に、反応停止ｌ夜とし
て０．５Ｍ＋−リクロロ酢酸８００μＪを加えた後、遠
心分離し、その上清の吸光度を波長５２０　ｎｍで測定
した。

なお、プロテアーゼ活性（ＰＵ）は、科研製薬■製、ア
クチナーゼＥの活性に換算して算出した。

その際、アクチナーゼＥがカゼインを基質として温度３
７℃、ｐＨ７，５において、１分間に１μＩＩＩｏｌの
チロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチドを遊
離する活性を１ユニツトとした。すなわち、上清のプロ
テアーゼ酵素液に代えて、上記アクチナーゼＥを用い、
上記と同様の反応を行ない、上清の吸光度を測定して検
量線を作成し、この検量線に基づいて、プロテアーゼ活
性を算出した。

］　６ そして、親株バチルス・サブチリスｌ０４１１Ｌ株より
も、プロテアーゼ活性か極端に低下した４株を得、これ
らの菌株を、それぞれ、バチルス・サブチリスｓｐｏ　
６株、ｓｐｏ　７株、ｓｐｏ　９株、５ｐｏ１．１株と
した。

これら４株のプロテアーゼ活性を、さらに詳しく測定し
た。すなわち、バチルス・サブチリス１０４　ＨＬ株及
びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株４株を、１０
ｍ１のＬＢ培地で１８時間培養した後、５０ｍ１のＭｅ
ｄｉｕｍ　Ａ培地（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｒ１３ａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ、　１６５．７９６−８０４．１９８６
　）に菌体を移し、２４時間及び４８時間培養した後、
培養」二清中のプロテアーゼ活性を上記と同様にして測
定した。

その結果を表２に示す。

（以下、余白） 表 （表中、ＯＤ　６００は、波長６００■における培養液
」二清の吸光度を示す。また割合は、親株バチルス・サ
ブチリス１０４　ＨＬ株のプロテアーゼ活性を１−００
としたときの相対値を示す。以下、同じ。）表２より、
得られた胞子形成能欠損株のうち、５ＰＯ７及びＳＰＯ
口株は、親株に比べてプロテアーゼ活性が極めて低いこ
とが確認された。特に５ＰＯＩＩ株は、プロテアーゼ活
性が、親株である１０４１１１、株の約１％に低下して
いることから、ペプチド等の分泌生産のための宿主とし
てきわめて有用である。

また５ＰＯＩＩ株は、前記の遺伝子マーカーを有してい
る。またいずれの株もヒスチジンに対する要求　８ 性を有している。従って、バチルス・サブチリスｓｐｏ
　６株、ｓｐｏ　９株、特にｓｐｏ　７株、中でもバチ
ルス・サブチリス５ＰＯＩＩ株は、ペプチドを効率よく
生産できる宿主として、安全かつ有用である。

実施例２ バチルス・サブチリスＡＴＣＣ３９０９ｆｆ株の染色体
ＤＮＡを用いて、コンピテントセル形質転換法により、
バチルス・サブチリスＤＹ−１６株を形質転換した。次
に、得られた形質転換株を、５μｇ　／　ｍｌのリンコ
マイシンを含むＬＢ寒天平板培地を用いて培養し、Ｌｉ
ｎｒの導入された株を選択した。

その結果、約８００株のリンコマイシン耐性形質転換株
を得た。また実施例１と同様にして、これらのリンコマ
イシン耐性形質転換株から胞子形成能欠損株を５１株分
離した。

得られた胞子形成能欠損株のうちプロテアーゼ活性が最
も小さい株を、実施例１と同様にして、選出し、プロテ
アーゼ活性を測定した。

すなわち、１重量％のカゼインを含むＬＢ寒天平板培地
に、胞子形成能欠損形質転換株と、親株−９ であるバチルス・サブチリスＤＹ−１１１株とを別々に
植菌し、温度３７°Ｃで２４時間培養し、実施例１と同
様に、菌体の回りのハローの大きさを指標として、バチ
ルス・サブチリスＤＹ−ＩＥｉ株よりもプロテアーゼ生
産能が低下した菌株を４００株分離た。

これらの株をＬＢ培地で液体培養し、その培養」１清に
６花するプロテアーゼの活性を、ＦＩＴＣ−カゼイン（
シグマ社製）を基質として測定した。

すなわち、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株及びプロ
テアーゼ活性が低下した形質転換株４０株を、それぞれ
、ＬＢ培地１０ｍ１を用いて一晩培養し７、その培養液
１．　ｍｌを遠心分離し、その上清をプロテアーゼ酵素
液とした。

酵素液５０μノと０．２μｇのＦＩＴＣ−カゼインとを
、１０　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）及び２ｍ
Ｍ塩化カルシウムからなる２００μノの緩衝液中で、温
度３７℃で２時間反応した。反応液に、２００μノの７
．５重量％トリクロロ酢酸を加え遠心分離した後、その
上清１００μノに、５００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８
，５）９０００ μノを加え、螢光光度計でプロテアーゼ活性を測定した
。

なお、プロテアーゼ活性（ＰＵＤ）は、カゼインを用い
、温度３７℃、ｐＨ７，５において、１分間に１μｍｏ
ｌのチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチド
を遊離する酵素量をＩ　Ｐ　Ｕ　Ｄとして、算出した。

その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブチリ
スＤＹ−１６株に比べて、極端に低下した４株を得、こ
れらの菌株を、それぞれ、バチルス・ザブｆ　１，１　
ス５ＰＬ９株、５ＰＩ−，１１株、Ｓ　Ｐ　Ｌ　１４株
、ＳＰＩ、３９株とした。

そして、実施例１と同様にして、バチルス・サブチリス
ＤＹ−Ｌｉｔ株及びこれらのプロテアーゼ活性が低下し
た形質転換株を１０ｍ１のＬＢ培地で１８時間培養した
後、５０ｍ１のＭｅｄｉｕｍ　Ａ培地に菌体を移し、培
養２４時間及び４８時間培養した後、培養上清中のプロ
テアーゼの活性を上記と同様にして測定した。その結果
を表３に示す。

１ 表 表３より、形質転換株４株は、親株よりもプロテアーゼ
活性が１／２０以下と低いことが確認された。特にＳ　
Ｐ　Ｌ　１４株は、プロテアーゼ活性が、親株であるＤ
Ｙ−１６株の３％程度に抑制されていることが確認され
た。このＳ　Ｐ　Ｌ　４株は、前記の遺伝子マーカーを
有している。またこれらの菌株は、いずれも、ヒスチジ
ンとロイシンに対する要求性を有しており、遺伝子組換
え実験において宿主に要求される複数の栄養要求性を確
認した。従って、バチルス・サブチリスＳ　Ｐ　Ｌ　９
株、５ＰＬ１．１株、５ＰＬ３９株、特に５ＰＬ１４株
はペプチドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ
有用である。

２ なお、実施例１及び実施例２において形質転換に供した
バチルス・サブチリス１０４１＋、株及びバチルス・サ
ブチリスＤＹ−１６株のプロテアーゼ活性を、プロテア
ーゼの野生株であるバチルス・サブチリス２０フー２５
株と比較したところ、表４に示す結果が得られた。なお
、プロテアーゼ活性は、実施例］と同様にして、菌株を
２４時間培養し、測定した。

表４ 表４より、バチルス・サブチリスＩ　０４　ＩＩ　１．
株は、野生株２０７−２５株の２．８％、バチルス・サ
ブチリスＤＹ−１６株は野生株２０７−２５株の約１％
しかプロテアーゼを生産しない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産
   能を欠き、かつプロテアーゼ活性が野生株の３％以下で
   ある枯草菌に、￥ｓｐｏ￥ＯＡΔ６７７変異遺伝子が導
   入されているプロテアーゼ生産性の低い枯草菌。 ２、プロテアーゼ生産性の低い枯草菌が、バチルス・サ
   ブチリス１０４ＨＬ株に、￥ｓｐｏ￥ＯＡΔ６７７変異
   遺伝子が導入されているバチルス・サブチリスＳＰＯ１
   １株（微工研菌寄第１０９８７号）である請求項１記載
   の枯草菌。 ３、プロテアーゼ生産性の低い枯草菌が、バチルス・サ
   ブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８号）に、
   ￥ｓｐｏ￥ＯＡΔ６７７変異遺伝子が導入されているバ
   チルス、サブチリスＳＰＬ１４株（微工研菌寄第１０９
   ８８号）である請求項１記載の枯草菌。