JPH03143387A - プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 - Google Patents
プロテアーゼ生産性の低い枯草菌Info
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- JPH03143387A JPH03143387A JP28144089A JP28144089A JPH03143387A JP H03143387 A JPH03143387 A JP H03143387A JP 28144089 A JP28144089 A JP 28144089A JP 28144089 A JP28144089 A JP 28144089A JP H03143387 A JPH03143387 A JP H03143387A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、遺伝子組換えによってペプチド等を生産する
ために、特に有用なプロテアーゼ生産性の低い枯草菌に
関する。
ために、特に有用なプロテアーゼ生産性の低い枯草菌に
関する。
[従来の技術と発明が解決しようとする課題]枯草菌(
Bacillus 5ubtilis)は、エンドト
キシンなどを生産せず、しかも病原微生物として人や動
物に寄生したり共生することがないので、大腸菌に比べ
て安全性が高い。このような枯草菌を遺伝子組換え体の
宿主菌として利用することにより、外来遺伝子産物であ
るペプチド、タンパク質等のペプチド粘合を有する有用
な生産物を菌体外へ分泌生産させることができるので、
枯草菌は、その安全性と共に、その工業的有用性が注目
されている。しかしながら、枯草菌は、プロテアーゼを
菌体外に多量に分泌生産する。従って、外来遺伝子に由
来する有用な外来分泌産物が多量に生産されたとしても
、ペプチド結合を有する外来分泌生産物は、枯草菌が培
地中に分泌する種々の菌体外プロテアーゼにより分解さ
れてしまい、高い収率で有用生産物を回収することがて
きない。
Bacillus 5ubtilis)は、エンドト
キシンなどを生産せず、しかも病原微生物として人や動
物に寄生したり共生することがないので、大腸菌に比べ
て安全性が高い。このような枯草菌を遺伝子組換え体の
宿主菌として利用することにより、外来遺伝子産物であ
るペプチド、タンパク質等のペプチド粘合を有する有用
な生産物を菌体外へ分泌生産させることができるので、
枯草菌は、その安全性と共に、その工業的有用性が注目
されている。しかしながら、枯草菌は、プロテアーゼを
菌体外に多量に分泌生産する。従って、外来遺伝子に由
来する有用な外来分泌産物が多量に生産されたとしても
、ペプチド結合を有する外来分泌生産物は、枯草菌が培
地中に分泌する種々の菌体外プロテアーゼにより分解さ
れてしまい、高い収率で有用生産物を回収することがて
きない。
この問題を解決するために、最近、宿主枯草菌のプロテ
アーゼ活性を低下させるための研究が行なわれている。
アーゼ活性を低下させるための研究が行なわれている。
プロテアーゼ生産性の低い抽j′N菌として、枯草菌の
主たる菌体外プロテアーゼであるアルカリプロテアーゼ
および中性プロテアーゼの両者を欠失したバチルス・サ
ブチリス (Bacius 5ubtills) l
04HL株[バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リザーチ・コミュニケションズ(旧ochem、
Biophys、 Res、 Commun、)。
主たる菌体外プロテアーゼであるアルカリプロテアーゼ
および中性プロテアーゼの両者を欠失したバチルス・サ
ブチリス (Bacius 5ubtills) l
04HL株[バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リザーチ・コミュニケションズ(旧ochem、
Biophys、 Res、 Commun、)。
128、601.−808.1..985]や、本出願
人が先に提案したように、バチルス・サブチリス104
Ill、株に、pap遺伝子を導入したバチルス・サ
ブチリスDY−18株(特開昭84−31284号公報
)が公知である。
人が先に提案したように、バチルス・サブチリス104
Ill、株に、pap遺伝子を導入したバチルス・サ
ブチリスDY−18株(特開昭84−31284号公報
)が公知である。
しかしながら、バチルス・サブチリス10411+、株
やDY−1,6株には、未だプロテアーゼ活性が残存し
ているので、残存するプロテアーゼ活性により、有用な
分泌産物が培地中で分解されてしまう。
やDY−1,6株には、未だプロテアーゼ活性が残存し
ているので、残存するプロテアーゼ活性により、有用な
分泌産物が培地中で分解されてしまう。
従って、本発明の目的は、安全性が高く、しかもペプチ
ド結合を有する有用な分泌産物を高収率で回収できるプ
ロテアーゼ生産性の低い枯草菌を提供することにある。
ド結合を有する有用な分泌産物を高収率で回収できるプ
ロテアーゼ生産性の低い枯草菌を提供することにある。
[発明の構成]
本発明者等は、枯草菌におけるプロテアーゼの生産が、
胞子形成期にその大半が起こることに着目して、プロテ
アーゼ低生産性枯草菌を得るべく鋭意検討した結果、枯
草菌の主たる2つのプロテアーゼであるアルカリプロテ
アーゼと中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテ
アーゼ活性が野生株の3%以下の枯草菌に、特定の遺伝
子を導入することによって、親株枯草菌よりプロテアー
ゼ活性が著しく低下した枯草菌が得られることを見い出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、枯草菌の
主たる2つのプロテアーゼであるアルカリプロテアーゼ
及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、しかもプロテア
ーゼ活性が野生株の3%以下である枯草菌に、spo
OA△f177遺伝子(Elis、 et al、 R
ecombinant DNA Technical
Bulletin、 4. l−3(1981))が導
入された、プロテアーゼ生産性の低下した枯草菌を提供
する。
胞子形成期にその大半が起こることに着目して、プロテ
アーゼ低生産性枯草菌を得るべく鋭意検討した結果、枯
草菌の主たる2つのプロテアーゼであるアルカリプロテ
アーゼと中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテ
アーゼ活性が野生株の3%以下の枯草菌に、特定の遺伝
子を導入することによって、親株枯草菌よりプロテアー
ゼ活性が著しく低下した枯草菌が得られることを見い出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、枯草菌の
主たる2つのプロテアーゼであるアルカリプロテアーゼ
及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、しかもプロテア
ーゼ活性が野生株の3%以下である枯草菌に、spo
OA△f177遺伝子(Elis、 et al、 R
ecombinant DNA Technical
Bulletin、 4. l−3(1981))が導
入された、プロテアーゼ生産性の低下した枯草菌を提供
する。
本発明において、spo OA△677遺伝子が導入さ
れる枯草菌は、枯草菌の主たる2つのプロテアーゼであ
るアルカリプロテアーゼと中性プロテアゼの生産能を失
い、かつプロテアーゼ活性か野生株の3%以下に低下し
た枯草菌であればよい。野生株や、プロテアーゼ活性か
野生株の3%を越える枯草菌に、spo OA△677
遺伝子を導入しても、プロテアーゼ活性が残存し、ペプ
チド結合を有する分泌産物の回収率が低下する。なお、
枯草菌のプロテアーゼ活性が低下しているほど、結果と
して得られるプロテアーゼ活性も低いことは容易に類推
てきる。
れる枯草菌は、枯草菌の主たる2つのプロテアーゼであ
るアルカリプロテアーゼと中性プロテアゼの生産能を失
い、かつプロテアーゼ活性か野生株の3%以下に低下し
た枯草菌であればよい。野生株や、プロテアーゼ活性か
野生株の3%を越える枯草菌に、spo OA△677
遺伝子を導入しても、プロテアーゼ活性が残存し、ペプ
チド結合を有する分泌産物の回収率が低下する。なお、
枯草菌のプロテアーゼ活性が低下しているほど、結果と
して得られるプロテアーゼ活性も低いことは容易に類推
てきる。
このような枯草菌としては、前記バチルス・サブチリス
104111、株、バチルス・サブチリスDY−16
株などが挙げられる。なお、バチルス・サブチリスDY
−16株は、バチルス・サブチリス10411L株にp
ap遺伝子を導入した菌株であり、微王研菌寄第948
8号として寄託されている。
104111、株、バチルス・サブチリスDY−16
株などが挙げられる。なお、バチルス・サブチリスDY
−16株は、バチルス・サブチリス10411L株にp
ap遺伝子を導入した菌株であり、微王研菌寄第948
8号として寄託されている。
これらの菌株は、実施例において詳述するように、野生
株バチルス・サブチリス207−25株と比較して、プ
ロテアーゼ活性が著しく小さい。すなわち、バチルス・
サブチリス104+1L株は、野生株207−25株の
約2.8%、バチルス・サブチリスDY−16株は、野
生株207−25株の約1%しかブロテアゼを生産しな
い。
株バチルス・サブチリス207−25株と比較して、プ
ロテアーゼ活性が著しく小さい。すなわち、バチルス・
サブチリス104+1L株は、野生株207−25株の
約2.8%、バチルス・サブチリスDY−16株は、野
生株207−25株の約1%しかブロテアゼを生産しな
い。
ところで、枯草菌におけるプロテアーゼの生産は、胞子
形成期にその大半が起こることが知られている。そこで
、本発明者らは、プロテアーゼ活性の低い前記枯草菌宿
主に、spo OA△677遺伝子を導入することによ
り、宿主に残存するプロテアーゼ活性が更に低下するこ
とを見い出した。
形成期にその大半が起こることが知られている。そこで
、本発明者らは、プロテアーゼ活性の低い前記枯草菌宿
主に、spo OA△677遺伝子を導入することによ
り、宿主に残存するプロテアーゼ活性が更に低下するこ
とを見い出した。
spo OA△677変異は、胞子形成の最も初期の段
階において、胞子形成を遮断する欠失変異である。すな
わち、胞子は、枯草菌が、熱、紫外線、化学薬品及び乾
燥に晒されたときにおいても、通常、自然界で生存し得
る形態であるが、上記変異遺伝子は、枯草菌における胞
子形成能を破壊する。
階において、胞子形成を遮断する欠失変異である。すな
わち、胞子は、枯草菌が、熱、紫外線、化学薬品及び乾
燥に晒されたときにおいても、通常、自然界で生存し得
る形態であるが、上記変異遺伝子は、枯草菌における胞
子形成能を破壊する。
従って、spo OAΔ677遺伝子が導入された枯草
菌は、胞子形成能を有しない。
菌は、胞子形成能を有しない。
本発明において用いられるspo OA△677遺伝了
としては特に限定されず、spo OA△677遺伝子
を有する菌株、例えば、バチルス・サブチリスATCC
35148株、ATCC39090株、ATCC39[
191株、ATCC39092株、ATCC39094
株、ATCC39o9e株なトノspo OA△677
遺伝子を用いることができ、これらの株は、アメリカン
◆タイプ・カルチャー・コレクション(Amcrtca
n Type Cu1ture Correction
)から入手できる。またバチルス・サブチリスATCC
39090株は、バチルス・サブチリスBGSCIS5
3として、バチルス・サブチリスATCC39096株
は、バチルス・サブチリスBC8CWIS58としてバ
チルス・ジェネティック・ストック・センターN)ac
llus Gcnetic 5tock Center
)からも入手できる。
としては特に限定されず、spo OA△677遺伝子
を有する菌株、例えば、バチルス・サブチリスATCC
35148株、ATCC39090株、ATCC39[
191株、ATCC39092株、ATCC39094
株、ATCC39o9e株なトノspo OA△677
遺伝子を用いることができ、これらの株は、アメリカン
◆タイプ・カルチャー・コレクション(Amcrtca
n Type Cu1ture Correction
)から入手できる。またバチルス・サブチリスATCC
39090株は、バチルス・サブチリスBGSCIS5
3として、バチルス・サブチリスATCC39096株
は、バチルス・サブチリスBC8CWIS58としてバ
チルス・ジェネティック・ストック・センターN)ac
llus Gcnetic 5tock Center
)からも入手できる。
spo OA△677遺伝子を宿主枯草菌に導入する方
法としては、慣用の方法、例えば、 (1,) spo OA△677遺伝子供与体菌の染色
体DNAをすべて宿主枯草菌に導入するコンピテントセ
ルトランスフォーメーション法、 (2) spo OA△677遺伝子供与体菌の染色体
DNA遺伝子を制限酵素により切断し、spo OA△
677遺伝子を含むDNA断片をプラスミドに組み込み
、宿主枯草菌を形質転換する方法、及び (3)上記プラスミドと同様にして、ファージ粒子に組
込んだspo OA△677遺伝子を用いて、宿主枯草
菌を形質転換する方法 などを挙げることができる。なお、上記(1,)(2)
(3)の形質転換法については、「微生物遺伝子実験法
、第3巻、p、96〜11B、共立出版」を参照できる
。
法としては、慣用の方法、例えば、 (1,) spo OA△677遺伝子供与体菌の染色
体DNAをすべて宿主枯草菌に導入するコンピテントセ
ルトランスフォーメーション法、 (2) spo OA△677遺伝子供与体菌の染色体
DNA遺伝子を制限酵素により切断し、spo OA△
677遺伝子を含むDNA断片をプラスミドに組み込み
、宿主枯草菌を形質転換する方法、及び (3)上記プラスミドと同様にして、ファージ粒子に組
込んだspo OA△677遺伝子を用いて、宿主枯草
菌を形質転換する方法 などを挙げることができる。なお、上記(1,)(2)
(3)の形質転換法については、「微生物遺伝子実験法
、第3巻、p、96〜11B、共立出版」を参照できる
。
このようにしてspo OA△677遺伝子を枯草菌宿
主に導入した形質転換株の中から、胞子形成能を欠損し
た枯草菌を選別する。
主に導入した形質転換株の中から、胞子形成能を欠損し
た枯草菌を選別する。
胞子形成能が欠損した菌株は、
(1〉胞子形成培地に形質転換株を植菌し、そのコロニ
ーがメラニン色素生産能を失ったこと、(2)温度80
℃、10分間の熱処理に耐性を示すこと、及び (3)顕微鏡検査により胞子形成を認めないことによっ
て確認できる。
ーがメラニン色素生産能を失ったこと、(2)温度80
℃、10分間の熱処理に耐性を示すこと、及び (3)顕微鏡検査により胞子形成を認めないことによっ
て確認できる。
また胞子形成能を有しない枯草菌のうち、宿主である枯
草菌よりもプロテアーゼ生産性が低下した菌を選別する
ことにより、本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯
草菌を得ることができる。
草菌よりもプロテアーゼ生産性が低下した菌を選別する
ことにより、本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯
草菌を得ることができる。
プロテアーゼ生産性の低下した菌株は、spo OA△
677遺伝子が導入され、かつ胞子形成能欠損株となっ
た枯草菌を、カゼインを含むプレートを用いて培養し、
菌体が分泌するプロテアーゼにより形成されるクリアゾ
ーン(Ilalo)が宿主に比べて小さい菌株を選別す
ることにより得られる。またプロテアーゼの生産性をさ
らに詳しく調べる方法としては、カゼイン、合成基質で
あるアゾコール、FITC−カゼインを用いる方法があ
る。この方法では、これらの基質の分解を、分光光度計
もしくは螢光光度計で測定することにより、培養上清中
のプロテアーゼ活性を調べることができるので、プロテ
アーゼ生産性の低い株を確実に選別できる。
677遺伝子が導入され、かつ胞子形成能欠損株となっ
た枯草菌を、カゼインを含むプレートを用いて培養し、
菌体が分泌するプロテアーゼにより形成されるクリアゾ
ーン(Ilalo)が宿主に比べて小さい菌株を選別す
ることにより得られる。またプロテアーゼの生産性をさ
らに詳しく調べる方法としては、カゼイン、合成基質で
あるアゾコール、FITC−カゼインを用いる方法があ
る。この方法では、これらの基質の分解を、分光光度計
もしくは螢光光度計で測定することにより、培養上清中
のプロテアーゼ活性を調べることができるので、プロテ
アーゼ生産性の低い株を確実に選別できる。
本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯草菌のうち、
特に好ましい菌株は、バチルス・サブチリス10411
L株に、spa OA△677遺伝子を導入して得られ
るバチルス・サブチリス5POII株(微工研菌寄第1
0987号)と、バチルス・サブチリスDY−16株に
、spo OAΔ677遺伝子を導入して得られるバチ
ルス・サブチリスS P L 14株(微工研菌寄第1
0988号)である。
特に好ましい菌株は、バチルス・サブチリス10411
L株に、spa OA△677遺伝子を導入して得られ
るバチルス・サブチリス5POII株(微工研菌寄第1
0987号)と、バチルス・サブチリスDY−16株に
、spo OAΔ677遺伝子を導入して得られるバチ
ルス・サブチリスS P L 14株(微工研菌寄第1
0988号)である。
本発明のプロテアーゼ生産性の低い枯草菌変異株は、胞
子形成能を有していない点を除き、一般的な枯草菌とし
ての性質を保持する。好ましい菌株についてより具体的
に説明すると、バチルス・サブチリス5PO1,1株の
親株であるバチルス・サブチリス104HL株は、遺伝
子マーカーとして、hisleu npr R2np
r E4 △apr A3を有している。
子形成能を有していない点を除き、一般的な枯草菌とし
ての性質を保持する。好ましい菌株についてより具体的
に説明すると、バチルス・サブチリス5PO1,1株の
親株であるバチルス・サブチリス104HL株は、遺伝
子マーカーとして、hisleu npr R2np
r E4 △apr A3を有している。
これに対して、その変異株であるバチルス・サブチリス
5PO1,]株は、遺伝子マーカーhis npr
R2ている。
5PO1,]株は、遺伝子マーカーhis npr
R2ている。
またバチルス・サブチリス5PL14株の親株であるバ
チルス・サブチリスDY−16株は、遺伝子70 カーとしてhis npr 2 npr 4 △apr その変異株であるバチルス・サブチリスSP1.1.4
株れている。
チルス・サブチリスDY−16株は、遺伝子70 カーとしてhis npr 2 npr 4 △apr その変異株であるバチルス・サブチリスSP1.1.4
株れている。
上記遺伝子マーカーからも明らかなように、本発明の枯
草菌は、通常、少なくともヒスチジン要求性を有してい
るので、遺伝子組換え実験などの宿主として有用である
。
草菌は、通常、少なくともヒスチジン要求性を有してい
るので、遺伝子組換え実験などの宿主として有用である
。
なお、spo O^△677遺伝子を含む菌株、例えば
、spo OA△677遺伝子の供与体であるバチルス
・サブチリスATCC39096株は、遺伝形質として
thy Atthy Bl pyr DI aro l
01in 2 aIIly 3 sp。
、spo OA△677遺伝子の供与体であるバチルス
・サブチリスATCC39096株は、遺伝形質として
thy Atthy Bl pyr DI aro l
01in 2 aIIly 3 sp。
OA△677を有している。
本明細書に記載の遺伝子マーカーの記号の意義は、次の
通りである。
通りである。
Ieu :ロイシン要求性変異
his :ヒスチジン要求性変異
1
nprR2:中性プロテアーゼ制御遺伝子変異nprE
4:中性プロテアーゼ遺伝子欠損変異Δaprへ8:ア
ルカリプロテアーセ遺伝子欠失変異 eye−r:サイクロセリン耐性変異 pap−8:α−アミラーゼとプロテアーゼの生産性に
影響を与える遺伝変異 spo OA△677 胞子形成の最も初期の段階に
おける遮断を起こさせる欠失変異 1in2:リンコマイシン耐性変光 thy Al 、thy旧:チミン及びチミジンに対す
る要求性を付!jする突然変異で、トリメトプリム耐性
を付Ij−する pyr DI :ピリミジンに対する要求性を付ちする
突然変異 arolO:芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、
チロシン、トリプトファンに対す る要求性を付与する突然変光 [発明の効果] 以上のように、本発明の一プロテアーゼ生産性の2 低い枯草菌は、プロテアーゼ活性が小さな枯草菌にsp
o OA△677遺伝子が導入されているので、安全性
が高く、ペプチド結合を有する有用な分泌産物を高収率
で回収できる。
4:中性プロテアーゼ遺伝子欠損変異Δaprへ8:ア
ルカリプロテアーセ遺伝子欠失変異 eye−r:サイクロセリン耐性変異 pap−8:α−アミラーゼとプロテアーゼの生産性に
影響を与える遺伝変異 spo OA△677 胞子形成の最も初期の段階に
おける遮断を起こさせる欠失変異 1in2:リンコマイシン耐性変光 thy Al 、thy旧:チミン及びチミジンに対す
る要求性を付!jする突然変異で、トリメトプリム耐性
を付Ij−する pyr DI :ピリミジンに対する要求性を付ちする
突然変異 arolO:芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、
チロシン、トリプトファンに対す る要求性を付与する突然変光 [発明の効果] 以上のように、本発明の一プロテアーゼ生産性の2 低い枯草菌は、プロテアーゼ活性が小さな枯草菌にsp
o OA△677遺伝子が導入されているので、安全性
が高く、ペプチド結合を有する有用な分泌産物を高収率
で回収できる。
従って、本発明の枯草菌は、遺伝子組換扶術を利用して
、ペプチド等を生産するときの宿主として有用である。
、ペプチド等を生産するときの宿主として有用である。
[実施例]
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
。なお、本発明はこれらの実施例に駆足されるものでは
ない。
。なお、本発明はこれらの実施例に駆足されるものでは
ない。
実施例1
spa OAΔ677遺伝子及びリンコマイシン耐性遺
伝子(以下、Lin’と表す)を有する枯草菌であるバ
チルス・サブチリスATCC39096株を、表1に示
すLB培地を用いて、温度37°Cで対数増殖期まで振
盪培養した。
伝子(以下、Lin’と表す)を有する枯草菌であるバ
チルス・サブチリスATCC39096株を、表1に示
すLB培地を用いて、温度37°Cで対数増殖期まで振
盪培養した。
(以下、余白)
] 3
表1
1.0重量% トリプトン
0.5重量% 酵母エキス
0.5重量% NaCノ
pH7,5
培養液50m1中に含まれる菌体を集め、斎藤・三浦の
方法(11,5aito、 K、旧ura、 l3io
chf、 Biophis、 Acta、 72.61
9 (1963))により染色体DNAを抽出精製した
。
方法(11,5aito、 K、旧ura、 l3io
chf、 Biophis、 Acta、 72.61
9 (1963))により染色体DNAを抽出精製した
。
得られた染色体DNAを用いて、コンピテントセルトラ
ンスフォーメーション法により、バチルス・サブチリス
l O411L株を形質転換した。
ンスフォーメーション法により、バチルス・サブチリス
l O411L株を形質転換した。
ヒスチジンを50 mg / J含む最小寒天培地に形
質転換した枯草菌をまき、温度37℃で48時間培養し
た。以下の指標1〜3に合致する菌株を、胞子形成能欠
損株として選別した。
質転換した枯草菌をまき、温度37℃で48時間培養し
た。以下の指標1〜3に合致する菌株を、胞子形成能欠
損株として選別した。
]、胞子形形成地に形質転換株を植菌しそのコロニーが
メラニン色素生産能を失ったこと、2、温度80 ’C
で10分間の熱処理に耐性を示すこと、及び 4 3、顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。
メラニン色素生産能を失ったこと、2、温度80 ’C
で10分間の熱処理に耐性を示すこと、及び 4 3、顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。
得られた胞子形成能欠損株173株のうちプロテアーゼ
活性が最も低い株を選出すると共に、プロテアーゼ活性
を、以下の方法で測定した。
活性が最も低い株を選出すると共に、プロテアーゼ活性
を、以下の方法で測定した。
すなわち、1重量%のカゼインを含むLB寒天平板培地
に、胞子形成能を欠損した形質転換株と、親株であるバ
チルス・サブチリス10411 L株とを別々に植菌し
、温度37℃で24時間培養した。菌体が分泌するプロ
テアーゼによりカゼインが分解されるので、カゼインの
分解により形成される菌体の回りのハローの大きさを指
標として、親株であるバチルス・サブチリス1041i
L株よりもプロテアーゼ生産能が低下した菌株を24株
分離した。
に、胞子形成能を欠損した形質転換株と、親株であるバ
チルス・サブチリス10411 L株とを別々に植菌し
、温度37℃で24時間培養した。菌体が分泌するプロ
テアーゼによりカゼインが分解されるので、カゼインの
分解により形成される菌体の回りのハローの大きさを指
標として、親株であるバチルス・サブチリス1041i
L株よりもプロテアーゼ生産能が低下した菌株を24株
分離した。
さらに、これらの菌株を、LB培地で液体培養し、その
培養上清に存在するプロテアーゼの活性を、アゾコール
(シグマ社製)を基質として測定した。すなわち、バチ
ルス・サブチリス+ 04 II L株と、プロテアー
ゼ活性が低下した形質転換株24株とを、それぞれ、L
B培地1.0 mlを用いて一晩培養した後、培養液1
mlを遠心分離し、その上清5 をプロテアーゼ酵素液とした。
培養上清に存在するプロテアーゼの活性を、アゾコール
(シグマ社製)を基質として測定した。すなわち、バチ
ルス・サブチリス+ 04 II L株と、プロテアー
ゼ活性が低下した形質転換株24株とを、それぞれ、L
B培地1.0 mlを用いて一晩培養した後、培養液1
mlを遠心分離し、その上清5 をプロテアーゼ酵素液とした。
また基質溶液として、0.48gのアゾコールを、50
m M トリス−塩酸(pH7,5)と1mM塩化カ
ルシウムとからなる混合液20m1に懸濁し、その75
0μノを酵素液50μノと混合し、温度37℃で30分
間インキュベートした。反応溶液に、反応停止l夜とし
て0.5M+−リクロロ酢酸800μJを加えた後、遠
心分離し、その上清の吸光度を波長520 nmで測定
した。
m M トリス−塩酸(pH7,5)と1mM塩化カ
ルシウムとからなる混合液20m1に懸濁し、その75
0μノを酵素液50μノと混合し、温度37℃で30分
間インキュベートした。反応溶液に、反応停止l夜とし
て0.5M+−リクロロ酢酸800μJを加えた後、遠
心分離し、その上清の吸光度を波長520 nmで測定
した。
なお、プロテアーゼ活性(PU)は、科研製薬■製、ア
クチナーゼEの活性に換算して算出した。
クチナーゼEの活性に換算して算出した。
その際、アクチナーゼEがカゼインを基質として温度3
7℃、pH7,5において、1分間に1μIIIolの
チロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチドを遊
離する活性を1ユニツトとした。すなわち、上清のプロ
テアーゼ酵素液に代えて、上記アクチナーゼEを用い、
上記と同様の反応を行ない、上清の吸光度を測定して検
量線を作成し、この検量線に基づいて、プロテアーゼ活
性を算出した。
7℃、pH7,5において、1分間に1μIIIolの
チロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチドを遊
離する活性を1ユニツトとした。すなわち、上清のプロ
テアーゼ酵素液に代えて、上記アクチナーゼEを用い、
上記と同様の反応を行ない、上清の吸光度を測定して検
量線を作成し、この検量線に基づいて、プロテアーゼ活
性を算出した。
] 6
そして、親株バチルス・サブチリスl0411L株より
も、プロテアーゼ活性か極端に低下した4株を得、これ
らの菌株を、それぞれ、バチルス・サブチリスspo
6株、spo 7株、spo 9株、5po1.1株と
した。
も、プロテアーゼ活性か極端に低下した4株を得、これ
らの菌株を、それぞれ、バチルス・サブチリスspo
6株、spo 7株、spo 9株、5po1.1株と
した。
これら4株のプロテアーゼ活性を、さらに詳しく測定し
た。すなわち、バチルス・サブチリス104 HL株及
びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株4株を、10
m1のLB培地で18時間培養した後、50m1のMe
dium A培地(Journal Or13acte
riology、 165.796−804.1986
)に菌体を移し、24時間及び48時間培養した後、
培養」二清中のプロテアーゼ活性を上記と同様にして測
定した。
た。すなわち、バチルス・サブチリス104 HL株及
びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株4株を、10
m1のLB培地で18時間培養した後、50m1のMe
dium A培地(Journal Or13acte
riology、 165.796−804.1986
)に菌体を移し、24時間及び48時間培養した後、
培養」二清中のプロテアーゼ活性を上記と同様にして測
定した。
その結果を表2に示す。
(以下、余白)
表
(表中、OD 600は、波長600■における培養液
」二清の吸光度を示す。また割合は、親株バチルス・サ
ブチリス104 HL株のプロテアーゼ活性を1−00
としたときの相対値を示す。以下、同じ。)表2より、
得られた胞子形成能欠損株のうち、5PO7及びSPO
口株は、親株に比べてプロテアーゼ活性が極めて低いこ
とが確認された。特に5POII株は、プロテアーゼ活
性が、親株である104111、株の約1%に低下して
いることから、ペプチド等の分泌生産のための宿主とし
てきわめて有用である。
」二清の吸光度を示す。また割合は、親株バチルス・サ
ブチリス104 HL株のプロテアーゼ活性を1−00
としたときの相対値を示す。以下、同じ。)表2より、
得られた胞子形成能欠損株のうち、5PO7及びSPO
口株は、親株に比べてプロテアーゼ活性が極めて低いこ
とが確認された。特に5POII株は、プロテアーゼ活
性が、親株である104111、株の約1%に低下して
いることから、ペプチド等の分泌生産のための宿主とし
てきわめて有用である。
また5POII株は、前記の遺伝子マーカーを有してい
る。またいずれの株もヒスチジンに対する要求 8 性を有している。従って、バチルス・サブチリスspo
6株、spo 9株、特にspo 7株、中でもバチ
ルス・サブチリス5POII株は、ペプチドを効率よく
生産できる宿主として、安全かつ有用である。
る。またいずれの株もヒスチジンに対する要求 8 性を有している。従って、バチルス・サブチリスspo
6株、spo 9株、特にspo 7株、中でもバチ
ルス・サブチリス5POII株は、ペプチドを効率よく
生産できる宿主として、安全かつ有用である。
実施例2
バチルス・サブチリスATCC3909ff株の染色体
DNAを用いて、コンピテントセル形質転換法により、
バチルス・サブチリスDY−16株を形質転換した。次
に、得られた形質転換株を、5μg / mlのリンコ
マイシンを含むLB寒天平板培地を用いて培養し、Li
nrの導入された株を選択した。
DNAを用いて、コンピテントセル形質転換法により、
バチルス・サブチリスDY−16株を形質転換した。次
に、得られた形質転換株を、5μg / mlのリンコ
マイシンを含むLB寒天平板培地を用いて培養し、Li
nrの導入された株を選択した。
その結果、約800株のリンコマイシン耐性形質転換株
を得た。また実施例1と同様にして、これらのリンコマ
イシン耐性形質転換株から胞子形成能欠損株を51株分
離した。
を得た。また実施例1と同様にして、これらのリンコマ
イシン耐性形質転換株から胞子形成能欠損株を51株分
離した。
得られた胞子形成能欠損株のうちプロテアーゼ活性が最
も小さい株を、実施例1と同様にして、選出し、プロテ
アーゼ活性を測定した。
も小さい株を、実施例1と同様にして、選出し、プロテ
アーゼ活性を測定した。
すなわち、1重量%のカゼインを含むLB寒天平板培地
に、胞子形成能欠損形質転換株と、親株−9 であるバチルス・サブチリスDY−111株とを別々に
植菌し、温度37°Cで24時間培養し、実施例1と同
様に、菌体の回りのハローの大きさを指標として、バチ
ルス・サブチリスDY−IEi株よりもプロテアーゼ生
産能が低下した菌株を400株分離た。
に、胞子形成能欠損形質転換株と、親株−9 であるバチルス・サブチリスDY−111株とを別々に
植菌し、温度37°Cで24時間培養し、実施例1と同
様に、菌体の回りのハローの大きさを指標として、バチ
ルス・サブチリスDY−IEi株よりもプロテアーゼ生
産能が低下した菌株を400株分離た。
これらの株をLB培地で液体培養し、その培養」1清に
6花するプロテアーゼの活性を、FITC−カゼイン(
シグマ社製)を基質として測定した。
6花するプロテアーゼの活性を、FITC−カゼイン(
シグマ社製)を基質として測定した。
すなわち、バチルス・サブチリスDY−16株及びプロ
テアーゼ活性が低下した形質転換株40株を、それぞれ
、LB培地10m1を用いて一晩培養し7、その培養液
1. mlを遠心分離し、その上清をプロテアーゼ酵素
液とした。
テアーゼ活性が低下した形質転換株40株を、それぞれ
、LB培地10m1を用いて一晩培養し7、その培養液
1. mlを遠心分離し、その上清をプロテアーゼ酵素
液とした。
酵素液50μノと0.2μgのFITC−カゼインとを
、10 m M )リス−塩酸(pH7,5)及び2m
M塩化カルシウムからなる200μノの緩衝液中で、温
度37℃で2時間反応した。反応液に、200μノの7
.5重量%トリクロロ酢酸を加え遠心分離した後、その
上清100μノに、500mMのトリス−塩酸(pH8
,5)9000 μノを加え、螢光光度計でプロテアーゼ活性を測定した
。
、10 m M )リス−塩酸(pH7,5)及び2m
M塩化カルシウムからなる200μノの緩衝液中で、温
度37℃で2時間反応した。反応液に、200μノの7
.5重量%トリクロロ酢酸を加え遠心分離した後、その
上清100μノに、500mMのトリス−塩酸(pH8
,5)9000 μノを加え、螢光光度計でプロテアーゼ活性を測定した
。
なお、プロテアーゼ活性(PUD)は、カゼインを用い
、温度37℃、pH7,5において、1分間に1μmo
lのチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチド
を遊離する酵素量をI P U Dとして、算出した。
、温度37℃、pH7,5において、1分間に1μmo
lのチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチド
を遊離する酵素量をI P U Dとして、算出した。
その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブチリ
スDY−16株に比べて、極端に低下した4株を得、こ
れらの菌株を、それぞれ、バチルス・ザブf 1,1
ス5PL9株、5PI−,11株、S P L 14株
、SPI、39株とした。
スDY−16株に比べて、極端に低下した4株を得、こ
れらの菌株を、それぞれ、バチルス・ザブf 1,1
ス5PL9株、5PI−,11株、S P L 14株
、SPI、39株とした。
そして、実施例1と同様にして、バチルス・サブチリス
DY−Lit株及びこれらのプロテアーゼ活性が低下し
た形質転換株を10m1のLB培地で18時間培養した
後、50m1のMedium A培地に菌体を移し、培
養24時間及び48時間培養した後、培養上清中のプロ
テアーゼの活性を上記と同様にして測定した。その結果
を表3に示す。
DY−Lit株及びこれらのプロテアーゼ活性が低下し
た形質転換株を10m1のLB培地で18時間培養した
後、50m1のMedium A培地に菌体を移し、培
養24時間及び48時間培養した後、培養上清中のプロ
テアーゼの活性を上記と同様にして測定した。その結果
を表3に示す。
1
表
表3より、形質転換株4株は、親株よりもプロテアーゼ
活性が1/20以下と低いことが確認された。特にS
P L 14株は、プロテアーゼ活性が、親株であるD
Y−16株の3%程度に抑制されていることが確認され
た。このS P L 4株は、前記の遺伝子マーカーを
有している。またこれらの菌株は、いずれも、ヒスチジ
ンとロイシンに対する要求性を有しており、遺伝子組換
え実験において宿主に要求される複数の栄養要求性を確
認した。従って、バチルス・サブチリスS P L 9
株、5PL1.1株、5PL39株、特に5PL14株
はペプチドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ
有用である。
活性が1/20以下と低いことが確認された。特にS
P L 14株は、プロテアーゼ活性が、親株であるD
Y−16株の3%程度に抑制されていることが確認され
た。このS P L 4株は、前記の遺伝子マーカーを
有している。またこれらの菌株は、いずれも、ヒスチジ
ンとロイシンに対する要求性を有しており、遺伝子組換
え実験において宿主に要求される複数の栄養要求性を確
認した。従って、バチルス・サブチリスS P L 9
株、5PL1.1株、5PL39株、特に5PL14株
はペプチドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ
有用である。
2
なお、実施例1及び実施例2において形質転換に供した
バチルス・サブチリス1041+、株及びバチルス・サ
ブチリスDY−16株のプロテアーゼ活性を、プロテア
ーゼの野生株であるバチルス・サブチリス20フー25
株と比較したところ、表4に示す結果が得られた。なお
、プロテアーゼ活性は、実施例]と同様にして、菌株を
24時間培養し、測定した。
バチルス・サブチリス1041+、株及びバチルス・サ
ブチリスDY−16株のプロテアーゼ活性を、プロテア
ーゼの野生株であるバチルス・サブチリス20フー25
株と比較したところ、表4に示す結果が得られた。なお
、プロテアーゼ活性は、実施例]と同様にして、菌株を
24時間培養し、測定した。
表4
表4より、バチルス・サブチリスI 04 II 1.
株は、野生株207−25株の2.8%、バチルス・サ
ブチリスDY−16株は野生株207−25株の約1%
しかプロテアーゼを生産しない。
株は、野生株207−25株の2.8%、バチルス・サ
ブチリスDY−16株は野生株207−25株の約1%
しかプロテアーゼを生産しない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産
能を欠き、かつプロテアーゼ活性が野生株の3%以下で
ある枯草菌に、¥spo¥OAΔ677変異遺伝子が導
入されているプロテアーゼ生産性の低い枯草菌。 2、プロテアーゼ生産性の低い枯草菌が、バチルス・サ
ブチリス104HL株に、¥spo¥OAΔ677変異
遺伝子が導入されているバチルス・サブチリスSPO1
1株(微工研菌寄第10987号)である請求項1記載
の枯草菌。 3、プロテアーゼ生産性の低い枯草菌が、バチルス・サ
ブチリスDY−16株(微工研菌寄第9488号)に、
¥spo¥OAΔ677変異遺伝子が導入されているバ
チルス、サブチリスSPL14株(微工研菌寄第109
88号)である請求項1記載の枯草菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28144089A JPH03143387A (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28144089A JPH03143387A (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03143387A true JPH03143387A (ja) | 1991-06-18 |
JPH0523742B2 JPH0523742B2 (ja) | 1993-04-05 |
Family
ID=17639206
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP28144089A Granted JPH03143387A (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03143387A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003072783A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique |
JP2013252069A (ja) * | 2012-06-05 | 2013-12-19 | Ikeda Shokken Kk | 発酵調味料の製造方法 |
-
1989
- 1989-10-27 JP JP28144089A patent/JPH03143387A/ja active Granted
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003072783A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique |
US7329514B2 (en) | 2002-02-28 | 2008-02-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing n-acetylneuraminic acid |
JP2013252069A (ja) * | 2012-06-05 | 2013-12-19 | Ikeda Shokken Kk | 発酵調味料の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0523742B2 (ja) | 1993-04-05 |
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