JPH03141227A

JPH03141227A - 免疫強化剤

Info

Publication number: JPH03141227A
Application number: JP1276439A
Authority: JP
Inventors: Taku Kojima; 卓小島; Takashi Iwata; 岩田　高志
Original assignee: SANYO SHIYOKUSAN KK
Current assignee: SANYO SHIYOKUSAN KK
Priority date: 1989-10-24
Filing date: 1989-10-24
Publication date: 1991-06-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、アイゼニン屈導体のオリゴペプチドを有効成
分とする免疫強化剤に関する。

本発明で免疫強化剤とは、ヒトの免疫機能の低下防止な
いしは増強作用を奏し、さらには、悪性腫瘍細胞増殖抑
制作用を奏する薬剤である。いわゆるＢ　ＲＭ　（Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｒ）効果を有する薬剤である。当該薬剤は、注射、経口
貼付（外用）等によりヒトに投与され、悪性腫瘍の治療
ならびに予防に効果的なものである。また、当該薬剤は
、免疫機能も増強させるため、ウィルス感染症、細菌感
染症の治療および予防にも期待される。

〈従来の技術〉従来、悪性Ｉｌ！瘍に対する宿主（ヒト）の−船釣な免
疫機能を増強させる免疫療法がある。当該免疫療法に使
用される薬剤として、例えば、インターフェロンがある
。

〈発明が解決しようとする課題〉しかし、インターフェロンは、大量投与する必要があり
、発熱等の副作用の問題点があった。

本発明は、上記にかんがみて、インタフエロンに比して
副作用の可能性が少なく、インターフェロンと同等又は
それ以上の免疫増強作用ないし悪性腫瘍細胞増殖抑制作
用を奏する免疫強化剤を提供することを目的とする。

く課題を解決するための手段〉本発明の免疫強化剤は、アイゼニン誘導体のオリゴペプ
チドを有効成分とすることにより、上記問題点を解決す
るものである。

く手段の詳細な説明〉以下の説明で、使用される略号の一覧表を次に示す。

（１）ペプチド構造式における略号り、Ｌ・・・それぞれｄ−又はＩ−グリセリンアルデヒ
ド分子の不斉炭素原子と同じ立体配置をもつもの。

Ａｌａ・・・アラニン残基、Ａｓｐ・・・アスパラギン酸残基、Ｇｌｕ・・・グルタミン酸残基、ＩＧｌｎ・・・グルタミン残基、Ｐｙｒｏｇｌｕ・・・ピログルタミン酸残基、Ｌｅｕ・
・・ロイシン残基、Ｐｈｅ・・・フェニルアラニン残基、Ｐｒｏ・・・プロリン残基、Ｔｙｒ・・・チロシン残基、Ａｃ・・・アセチル基、Ｂｏｃ・・・ブチルオキシカルボニル基、ＯＢｚ　１・
・・ベンジル基、ＴｏｓＯＨ・・・トルエンスルホン酸塩、（２）その他
の略号ＰＢＳ・・・リン酸１１衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ・
・・Ｎ−２−ヒドロキシエチルビベラージンーＮ”−２
−エタンスルホン酸、ＤＣＣ・・・ジシクロヘキシノン
カルボジイミド、ＤＣＨＵ・・・ジシクロヘキシル尿素
、ＤＭＦ・・・ジメチルホルムアミド、ａｑ・・・水溶液。

また、アイゼニンとは、Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ　−Ｌ−Ｇ
　１　ｎ−Ｌ−Ａ　１　ａの構造を有するトリペプチド
である。アミノ酸から人工合成可能であるが通常、アラ
メ（コンブ科）のエタノール抽出液から分離される。

Ａ１本発明で使用可能なアイゼニン誘導体のオリゴペプ
チドとしては、下記のものを挙げることができる。

（１）アイゼニンのＣ末端（カルボキシル基）に疎水性
アミノ酸を脱水縮合させたオリゴペプチド■Ｌ−Ｐｙｒ
ｏｇ　　１　　ｕ−Ｌ−Ｇｌ　　ｎ−Ｌ　−Ａｌａ−Ｌ
−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇ　　１　　ｕ−Ｌ−Ｇｌ　　ｎ−Ｌ　
−Ａｌ　　ａ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ　−Ａｌａ−Ｄ
−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ　−Ａｌａ−Ｌ
−Ｔｙｒ、等。

（２）アイゼニンを構成す３個のアミノ酸残基の１個を
類似のアミノ酸残基と置換したトリペプチド。

■Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ　−Ａｌａ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ　−Ａｌａ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ　−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ａｌａ■Ａｃ−Ｌ−Ａ
　　１　　ａ−Ｌ−Ｇ　　１　　ｎ−Ｌ　−Ａｌａ ■Ｌ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−Ｌ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−Ｌ−Ａ　
　１　　ａ。

等。

（３）アイゼニンを構成する３個のアミノ酸残基の１個
を類似のアミノ酸残基と置換するとともにＣ末端に疎水
性アミノ酸を脱水縮合させたテトラペプチド。

■Ｌ−Ｐｙｒｏｇ　１　ｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ　−Ａｌａ
−Ｌ−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇ　１　ｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ　−Ｌｅｕ
−Ｌ−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｙ　ｒ　ｏ　ｇ　１　ｕ−Ｌ−Ｇ　１　ｎ−Ｌ
　−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ ■Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｄ　−Ａｌ　ａ−
Ｌ−Ｐｈｅ、等。

（４）上記（１）　　　（２）　　　（３）の誘導体か
ら訪導されるオリゴペプチド。

■Ｌ−Ｐｙｒｏｇ　１　ｕ−Ｄ−Ｇｌ　ｕ＝　（Ｌ−Ａ
　１　ａ）　２ ■Ｌ−Ｇｌ　ｎ−Ｌ−Ａｔ　ａ−Ｌ−Ｐｈｅ■Ｌ−Ｐｙ
ｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ、等。

Ｂ、上記アイゼニン誘導体の製造方法は、慣用の方法で
、市販のアミノ酸から脱水縮合させて順次、ペプチド結
合を生成させていけばよい。このペプチド結合生成の際
、一方のカルボキシル基またはアミノ基を保護して行な
い、生成後、保護基を除き、遊隙ペプチドを得る。

Ｃ１本発明のアイゼニン誘導体は、製剤技術上常識的な
任意所要の製薬用担体あるいは賦形剤等により、注射剤
、錠剤、軟膏または座薬等として適用可能である。

Ｄ、製剤化した本発明の免疫強化剤は、注射、杼口、貼
付（外用）等によりヒトに投与される。

く本発明の作用・効果〉本発明の免疫強化剤は、後述の実施例で示す如く、ヒト
末梢血単核細胞のＮＫ活性の増強し、さらには、ヒト白
血病細胞株（Ｋ−５６２）の増殖を抑制し、いわゆる、
ＢＲＭ作用を奏する。従って、特に、悪性腫瘍に対する
予防および治療に効果的な薬剤として期待される。

〈実施例〉Ａ０本発明の免疫強化剤の有効成分となるアイゼニン誘
導体の合成方法を、上記（１）■のＬ−Ｐｙｒｏｇｌｕ
−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅを合成する場合を例に採り説明する。他のアイゼニン誘
導体の場合も同様にして市販アミノ酸から合成可能であ
る。

■第１工程（Ｂｏｃ−Ｌ−Ａ　１　ａ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｂｚｌの合成）：Ｂｏａ−Ｌ−Ａｌａ　　１．８９ｇとＬ−Ｐｈｅ−ＯＢ
ｚｌ−ＴｏｓＯＨ４，２８ｇとをジクロロメタン２０Ｉ
Ｉｌｌに解かし、トリエチルアミン１．４ｍｌを加え、
０℃でＤＣＣ２，２６ｇを加え、０℃で１時間、室温で
１日攪拌後、析出するＤＣＨＵを濾去、減圧濃縮し、酢
酸エチルで３回抽出し、４％炭酸水素ナトリウムａＱ、
ｔｏ％クエン＠　ａ　ｑ　％および飽和食塩水で洗う、
硫酸ナトリウムで乾燥・減圧濃縮する。クロロホルム−
ヘキサンより結晶化、：＋、９ａｇ（収率９３％）を得
る。

■第２工程（Ｂｏａ−Ｌ−Ｇｌ　ｎ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−
Ｐｈｅ−ＯＢｚ　ｌの合成）：上記第１工程で合成した
　Ｂｏａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌ　　３．
９ｇを０℃でトリフルオロ酢酸１０ｍ１に溶かし、０℃
で１時間放置後、減圧濃縮し、Ｌ−Ａ　１　ａ−Ｌ−Ｐ
ｈｅ−ＯＢＺトドリフルオロ酢酸塩を得、これとＢｏｃ
−Ｇｉｎ２．２５ｇとをＤＭＦｌｏｍｌ、ジクロロメタ
ン１０ｍ１に溶かし、トリエチルアミン１．３ｍｌを加
え、０℃−Ｃ−ＤＣＣ２，０７ｇを加え、０℃で１時間
室温で１日攪拌後、析出するＤＣＨＵを濾去・減圧濃縮
後、酢酸エチルで３回抽出し、４％炭酸水素ナトリウム
ａｑ、１０％クエン酸ａｑ、および飽和食塩水で洗う、
硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮する。エーテルを加
え、結晶化する。４０ｇ（収率７９％）を得る。

■第３工程（Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ａ
ｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌの合成）：上記第２工程で合成したＢｏｃ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ａｌ
ａ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌ　　４．Ｏｇを０℃でトリフ
ルオロ酢酸１０１に溶かし、０℃で１時間放置後、減圧
濃縮し、Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ａ１　ａ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＢ
ｚ　１　・）リフルオロ酢酸塩を得、これとＬ−ピログ
ルタミン酸　２．２５３とをＤＭＦｌｏｍｌ、ジクロロ
メタン１０ｎ＋１に：溶かし、トリエチルアミン１．３
１を加え、０℃で　２０７ｇを加え、０℃で１時間、室
温で１日攪拌後、析出するＤＣＨＵを濾去、減圧濃縮後
、酢酸エチルで３回抽出し、４％炭酸水素ナトリウムａ
ｑ、１０％クエン酸ａｑ、および飽和食塩水で洗う。硫
酸ナトリウムで乾燥・減圧濃縮する。３．２６ｇ（収率
８０％）を得る。

■最終工程（Ｌ−Ｐｙｒｏｇ　１　ｕ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ
−Ａｌ　ａ−Ｌ−Ｐｈｅの合成）：上記第３工程で合成
したＬ−Ｐｙｒｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌ　ｎ−Ｌ−Ａｌ　ａ
−Ｌ−Ｐｈｅ　−０Ｂｚｌ　　ＩｇをＤＭＦ２０ｍｌに
溶かし、触媒として５％パラジウム炭素０．４ｇ存在下
、接触還元する。約６時間後、触媒を濾去し、濾液を減
圧濃縮エーテルを加えて結晶化させて得る。Ｌ−Ｐｙｒ
ｏｇｌｕ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＯ，７
ｇ（収率：８５％）を得た。

Ｂ０本発明の免疫強化剤の有効成分である各アイゼニン
誘導体における薬効を確認するために、（１）細胞増殖
抑制試験および（２）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活
性測定試験を行なった。（１）の結果は第１〜３表に、
（２）の結果は第４〜６表にそれぞれ示す。

各表に示す試験結果から、本発明の免疫強化剤（アイゼ
ニン誘導体）は、インターフェロンに比して、細胞増殖
抑制効果およびＮＫ細胞活性におい°Ｃも優るともとも
劣らないことが分るなお、ヒストグラムは平均値を、幅
方向に伸びるＨ形線は試験結果のバラツキを示す。

また、両試験に使用した培養液は、下記のようにして調
製した。

「イーグル（Ｅａｇｌｅ）のミニマム・エツセンシャル
・ミデイアム（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　
Ｍｅｄｉｕｍ）に２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｘ　ｔ　０
−５Ｍの２−メルカエタノール、２ｍＭのし一グルタミ
ン、さらに牛胎児血清を１０％加えたものを使用した。

また、細胞の洗浄には、牛胎児血清のみ除いたものを使
用した。」（１）細胞増殖抑制試験ニ一３Ｈ−ＴｄＲ（リボ核酸の一種であるサイミジンの水
素を三重水素で置換しＥもの）により検討した。

ノアルコン（Ｆａｌｃｏｎ）の２４穴プレートを使用し
、ウェル（１穴）当りに−５６２を５Ｘ１０’ｃｅｌｌ
ｓ　（細胞の数）を入れ、アイゼニン誘導体またはイン
ターフェロンをそれぞれ各表（第１〜３表）に示めす量
を含む培養液２ｍｌを加え、さらに１２時間毎に２ａ＋
１中１１を上記の新しい培養液とと取り替え、４８時間
培養を行なった。

４８時間培養後、各ウェルの１１′ｌｌ胞を２回洗浄し
新しい細胞液に浮遊させ、　Ｈ−ＴｄＲを１μＣｉ／ｍ
ｌの濃度になるように添加し、さらに３ｈ×３７℃の条
件で培養した。

上記で培養した細胞をＰＢＳで三回洗浄し、０゜５％ラ
ウリル硫酸ナトリウム水溶液に溶解させ、該溶解液０．
１１を、３ｍｌのベックマン・シンチレータ（Ｒｅａｄ
ｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ”）に混合し、シンチレーション・
カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｌｓ５８０１）で測定を
行なった。

細胞増殖抑制率は、次式において算出した。

性試験の結果を示すグラフ図である。

（２）ＮＫ細胞活性測定方法：ｒ　１９Ｂ７年現代化学増刊７」　（東京化学同人刊行
）第２２６〜２２７頁に記載の、［Ｓ　Ｉ　（ｒ　］遊
離法によった。

エフェクタ細胞（ヒト末梢リンパ球）に標的細胞（Ｋ−
５６２）をエフェクタ細胞／標的細胞冨２０／１の細胞
数比で混和し、各アイゼン誘導体またインターフェロン
を各表に示す濃度となる量加え、１８時間反応させた後
、遊ＩＩ　［５１（ｒ］の放射活性をガンマカウンター
にて測定した。

細胞障害活性（ＮＫ活性）は、次式において算出した。

細胞障害活性（％）　＝ｔ　ｏｏｘ特　　許出　　願人小　　島　　　卓サンヨウ食産株式会社堀　　場　　　剛

【図面の簡単な説明】

′ｒｉＳ１〜３図はそれぞれ細胞増殖抑制試験の結果を
示すグラフ図、第４〜６図はそれぞれ人末梢血単細胞のＮＫ活細胞増殖
抑制試験第図細胞増殖抑制試験第図細胞増殖抑制試験第図人末梢血Ｊ１１細胞のＮＫ活性試験第図人末梢血単細胞のＮＫ活性試験第図人末梢血単細胞のＮＫ活性試験第ズ

Claims

【特許請求の範囲】

アイゼニン誘導体のオリゴペプチドを有効成分とするこ
とを特徴とする免疫強化剤。