JPH03133383A - ＴＧＦ―α発現ベクター、ＴＧＦ―α融合蛋白、形質転換微生物及びＴＧＦ―αの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＴＧＩ’−α発現ベクター、ＴＧＦ−α融合
蛋白、前記ベクターを大腸菌に組み込んだ形質転換微生
物及びこの微生物を用いてＴＧＦ−αを大量に生産する
方法に関する。

〔従来の技術〕

ＴＧＦ−α〔トランスフォーミンググロースファクター
タイプａ　（ｔｒａｎｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　
ｆａｃｔｏｒ　ｔｙｐｅα）〕（細胞生長因子）は、最
初サルコーマヴイルスにより形質転換されたラン）細胞
の培養上澄中に存在することが報告された〔トダロ（Ｊ
、Ｔｏｄａｒｏ）ら、ネイチュアー誌（Ｎａ　ｔｕｒｅ
）　、　２６４　、２６〜３１　（１９７６）　）　。

ＴＧＦ−αは、上皮細胞生長因子（ＥＧＦ）　と生物活
性において密接な関連を有し、ＥＧＰリセプクーに対し
てＥＧＦと競合して結合することが知られており、また
ＤＮＡ合成促進、軟寒天中でのコロニー形成促進、新生
仔マウスの眼瞼開裂の促進等ＥＧＦと共通の生物活性を
有する。しかし、一方、ＴＧＦ−αは、ＥＧＦよりも強
い骨吸収活性、脈管形成活性等を示し、今後、ＥＧＰと
ともに医薬としての利用が期待されている。

また、ＴＧＦ−αの構造については、最初、サルコーマ
ヴイルスにより形質転換されたラン＋−ｍ維芽細胞の培
養上澄からラン）　ＴＧＦ−αが精製単離され、その−
次構造が決定された。次いでヒト遺伝子ライブラリーか
らヒ）−ＴＧＦ−αの前駆体の遺伝子が単離され、ヒ）
　ＴＧＦ−αは、下記式で表わされる５０個のアミノ酸
よりなるポリペプチドであることが明らかとなった。な
お、ヒトＴＧＦ−αとラントＴＧＦαとではそれぞれ５
０個のアミノ酸のうち、次の４残基が異るのみである。

また、ヒトＴＧＦ−αには、いくつかのタイプがあるこ
とが知られている。

４１位　　　　Ａｌａ Ｖａｌ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅｌｌｉｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｃ１ｎ−Ｐｈｅ−ＣｙｓＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｇｌｎ−Ｃ１ｕＣｙｓ−ｔｌｉｓ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ旧５−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕνａｌ Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒ。

Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ−５ｅｒ Ｃｙｓ−Ａｒｇ− Ｃｙｓ−Ｖａｌ− Ｃｙｓ−Ｇｌｕ− ＴＧＦ−αを今後医薬として治療あるいは診断に用いる
ためには、生物活性をもった、充分な量のＴＧＦ−αを
得ることが必要であるが、サルコーマヴィルスにより形
質転換されたラット細胞上澄等から大量にＴＧＦ−αを
集めることは、きわめて労力を要し、効率的ではない。

また、ＴＧＦ−αを遺伝子工学的手法で産生じようとす
る試みも種々提案されているが（例えば、特開昭６１−
６３６９９号公報、特開昭６３−３１３５８６号公報等
）、これらの方法においても未だ充分に満足できる方法
は提案されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであ
って、ＴＧＦ−αを融合蛋白の形として、これを効率よ
く大量に生産できる発現ベクターを提供するとともに大
量にしかも安価にＴＧＦ−αを生産する方法を提供しよ
うとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、 （１）　ｔａｃブロモ−クーのフラグメント、プラスミ
ドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、
さらに好ましくはｎａｃｌのフラグメント、ブクーアデ
ニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部を
コードする塩基配列からなるＤＮＡ及びＴＧＦ−αもし
くはその類縁体のアミノ酸配列をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡを含み、かつ前記側ＤＮＡが結合されてい
て、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部
もしくは全部とＴＧＦ−αとの融合蛋白を発現するよう
にされているＴＧＦ−α発現ヘクター （２）ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一
部もしくは全部とＴＧＦ−αとが結合してなるＴＧＦ−
α融合蛋白、 （３）前記（１）の発現ベクターを大腸菌に形質導入し
たことからなる形質転換微生物、 （４）前記（３）の形質転換微生物を培養し、丁ＧＦ−
α融合蛋白を発現させ、これを採取した後、切断してＴ
ＧＦ−αを回収することからなるＴＧＦ−αの製造法、 に関する。

上記ＴＧＦ−αとしては、前述のようにヒトＴＧＦ−α
、ラン１−ＴＧＦ−α等、またヒトＴＧＦ−αには、さ
らにいくつかのタイプが知られ、また、このＴＧＦ〜α
のアミノ酸の一部を他のアミノ酸に置き換えたり、アミ
ノ酸の一部を削減して同様の機能を有する、いわゆる類
縁体も知られている　（前出の文献類及び特開昭６３−
３１６７９８号公報参照）。本発明においては、これら
の類縁体においても適用でき、本発明のＴＧＦ−αには
、これらのＭ縁体が包含されるものである。

本発明のＴＧＦ−αの遺伝子は、ＴＧＦ−αを構成する
アミノ酸数が６０程度と小さいので、ＤＮＡ合成機を用
いて比較的簡単に調製できる。勿論、ｃＤＮＡライブラ
リーからｃＤＮＡをスクリーニングすることによって得
ることもできる。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の
高いコドンを用いることが好ましく、特に第１図に示し
たように制限酵素旧ｎｄｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り出
したＤＮＡ断片と接合できるような塩基配列の遺伝子を
用いることが望ましい。

本発明では、この遺伝子をプラスミド中に挿入し、大腸
菌に組込み、大腸菌中で増殖させた後、このプラスミド
を取り出し、制限酵素でこの遺伝子を切出して使用する
とよい。

このようなプラスミドとしては、ＴＧＦ−αの遺伝子を
増幅できるものであればどのようなものでも使用できる
が、次のように調製したプラスミドｐＥＸ１４を使用す
ることが好ましい。

市販のプラスミドｐＢＲ３２２（例えば、ファルマシア
社（Ｐｈａｒｍａｓ　１ａＡＢ）製、カタログＮｏ、２
７−４９０２参照〕をＥｃｏＲＩとＰｖｕ　ＩＩとの部
位の間で切断し、アンピシリン耐性遺伝子（ＡＰｒ）と
複製起点（Ｏｒｉ）とを含むフラグメントにトリプトフ
ァンプロモータとトリプトファンＬＨの蛋白をコードす
る構造遺伝子〔ヤノフスキ−（Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ）
他、ニュークリンク、アシッド、リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９、　ｐ６６４
７−６６５９）の一部及びクローニングサイトからなる
、第２図に示した塩基配列のＤＮＡと接合することによ
り、プラスミドｐＥχ１４が得られる。

このプラスミドを制限酵素、好ましくはＥｃｏＲ［及び
旧ｎｄｌｌｌで切断し、この間にＴＧＦ−αの遺伝子を
挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで接合して、大腸菌に組込
み、増殖させる。そして、大腸菌からプラスミドを取り
出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩＩで切断し、
この断片を使用するとよい。

一方、本発明にいう　ｔａｃプロモーターのフラグメン
トは、第３図に示した塩基配列を有するもので、ＤＮＡ
合成機等により容易に合成することができる。従って、
これらのプロモーターを合成し、これをプラスミドｐＵ
Ｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント等と組合
せても良いか、市販のプラスミドの切り出しや接合等を
組合せることにより比較的容易に調製できる。例えば、
市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア製
）を制限酵素Ｐｖｕ　１及びＮｒｕ　Ｉで切断したｔａ
ｃプロモーターフラグメントを含むサイト部と市販のプ
ラスミドｐＵＣ１Ｂを制限酵素Ｐｖｕ　ｆ及びＮｒｕ　
Ｉで切断した複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントを含
むサイト部とをＴ４　ＤＮＡリガーゼで接合してプラス
ミドｐＭＫ２を得、これにブタ−アデニレートキナーゼ
の一部もしくは全部のｃＤＮＡを組み込んで構築すると
、　ｔａｃブロモ−クーのフラグメント、プラスミドｐ
ＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ
−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは
全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベクタ
ーが得られる。このベクターのうち、第４回に示した塩
基配列からなるブクーアデニレートキナーゼのＤＮＡを
組み込んだものは、本発明者等によりブタアデニレート
キナーゼ発現ベクターｐＭＫＡに３として、既に提案さ
れている（特開昭６４−５１０８８号公報参照）。この
発現ベクターを利用すると、比較的簡便に、本発明のＴ
ＧＦ−α発現ベクターを構築することができる。

本発明では、上述のようなｔａｃプロモーターのフラグ
メント、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）
のフラグメント、ブクーアデニレートキナ−ゼのアミノ
酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配列からな
るＤＮＡを含むベクターを利用すると良いが、これら以
外に、用いたプラスミド由来の他の遺伝子を含んでいて
も何ら支障はないが、例えば、ｒｒｎＢターミネータ−
、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグメント等を含んで
いると、高発現を行うことができ、またスクリーニング
が簡便となり、特に好ましい。

次に、このＬａｃブロモ−クーのフラグメント、プラス
ミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント
、ブクーアデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部も
しくは全部をコードする塩基配列からなる［ｌＮＡを含
むベクターに、前述のＴＧＦ−αの遺伝子を組み込む。

この組込においては、種々の制限酵素を用いて開裂する
ことにより行うことができるが、ベクターとして前述の
プラスミドｐＭＫＡＫ３を用いる場合は、制限酵素Ｐｖ
ｕ　Ｕを用いて開裂し、ＴＧＦ−αの遺伝子を結合する
と良い。この制限酵素によると）゛ターアデニレートキ
ナーゼの６５番目と６６番目のアミノ酸 ｖｕ　Ｕ 開裂する。これをアルカリホスファターゼ処理して５′
−リン酸基を除去する。

一方、前記したようにして切出したＴＧＦ−α遺伝子断
片を、次のように クレノー酵素で処理してプラントエンドとした後、前記
ブクーアデニレートキナーゼ切断部位に挿入し接合する
。

このようにすると、ＴＧＦ−αのアミノ酸をコートする
ＤＮＡに終止コドンが含まれているのでブタアデニレー
トキナーゼの６６番目以降のアミノ酸は融合蛋白として
発現しなくなる。本発明では、このようにして得られる
プラスミドル門ＡＫＴＧＦαを発現ベクターとして使用
すると特に好ましい。

さらに、本発明では、発現ベクターを誘導型にして高密
度培養に適したプラスミドを構築するようにすることが
好ましい。

このような誘導型のベクターは、次のようにして調製す
る。

すなわち、融合蛋白遺伝子をイソプロビルチオガラク）
・シト（ＴＰＴＧ）で誘導可能にするプラスミドｐＭＫ
ＩＱを調製し、これのｔａｃプロモーターのフラグメン
ト、複製開始点（Ｏｒｉ＞のフラグメント及びｆｆ１ａ
ｑ＋プロモーターに変異を起した遺伝子であるｆｆａｑ
ｌｑのフラグメントを利用すると良い。この１　ａｑｌ
ｑを挿入することによりリプレッサー蛋白を多量に生産
させ、ｔａｃプコモークーの発現をおさえ、菌体が増殖
している間はＴＧｌ？−αは生産されないが、菌体が増
殖した後に、ＩＰＴＧを添加することによりＴＧＦ−α
が大量に生産されるようになる。

このプラスミドｐＭＫ　Ｉ［ｌは、市販のプラスミドｐ
ＴＴ［１１８と本発明者らによって構築された公知のプ
ラスミドｐＭＫ２とを用いると簡便に調製される。

プラスミドｐＴＴＱ］８は市販されており、人手はきわ
めて容易であり、その制御酵素開裂地図は既知（例えば
、アマージャム社、コードＮＡＩＬ　ＲＰＮ、　１２６
１参照）である。

このプラスミドρＴＴＱ１８の１ａｑｌｑを用いるので
、このフラグメントを含む断片を制限酵素で切断する。

制限酵素としてはｆｆ１ａｑｌｑフラグメントを含みプ
ラスミドｐＭに２に接合できるように切断できるもので
あればどのようなものでも使用できるが、通常は制限酵
素Ｓｃａ　Ｉ及びｔｌｉｎｄＩＩＩを用いて切断する。

この制限酵素を用いると！！、ａｑｌｑとともにｒｒｎ
Ｂターミネータ−のフラグメントをも含む断片を得るこ
とができる。

一方、プラスミドル門に２は、特開昭６４−５１．０８
８号公報にその調製法及び制限酵素による切断部位等が
詳細に述べられている。本発明ではこのプラスミドのｔ
ａｃプロモーター、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
トを利用するので、これらのフラグメントを含む断片を
制限酵素で切断する。制限酵素としてはこれらのフラグ
メントを含みプラスミドｐＴＴ０１８の切り出した断片
と接合できるように切断できるものであればどのような
ものでも使用できるが、通常はプラスミドｐＴＴ旧８を
切り出した制限酵素と同様のＳｃａ　ｌ及び旧ｎｄＩ［
ｌを用いることが接合のしやすさの面から望ましい。こ
のようにして得られた両断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼで
接合してプラスミドｐＭＫＩ［ｌを得る。このプラスミ
ドにはｐＭＫ２由来のアンピシリン耐性遺伝子のフラグ
メントが含まれている。

このプラスミドを大腸菌に導入して培養し、これをアン
ピシリン耐性によってスクリーニングしてこれらのフラ
グメントを含んだベクターを調製し、このプラスミドの
塩基配列をサンガー法等を用いて確認する。

次に、このようにして得られたプラスミドｐＭＫＩ［ｌ
にＴＧＦ−α融合蛋白を発現させる遺伝子ＤＮＡを組み
込む。従って、プラスミドＰＭＫＩＱを制限酵素を用い
て開裂する。

制限酵素としてはプラスミドｐｏｒｑの開裂サイトとＴ
ＧＦ−α融合蛋白のアミノ酸配列をコードする塩基配列
からなるＤＮＡとを接合できるように切断できるもので
あれば、いずれでもよいが、通常は制限酵素としてＥｃ
ｏＲＩを用いて開裂を行う。一方、ＴＧＦ−αの遺伝子
はブクーアデニレートキナーゼの遺伝子と接合されてい
るものが用いられる。特に好ましいのは前記のプラスミ
ドｐＭＡＲＴＧＦα中に組込んだ、ブクーアデニレート
キナーゼの６５番目のアミノ酸をコードするＯＮへと６
６番目のアミノ酸コードするＤＮＡとの間にＴＧＦ−α
の遺伝子ＤＮＡが組込まれているものが望ましい。この
場合、プラスミドｐＭＡＫＴＧＦαを制限酵素で切断し
てＴＧＦ−αの遺伝子とブタ−アデニレートキナーゼの
遺伝子とが融合した遺伝子ＤＮＡを取り出し、これをＴ
４　ＤＮＡリガーゼで処理してブタ−アデニレートキナ
ーゼの遺伝子とＴＧＦ−αの遺伝子とが２個タンデムに
連結した遺伝子ＤＮＡを作成し、これを使用することが
望ましい。制限酵素としては、ＥｃｏＲｌを用いること
が望ましい。このようにして得られる遺伝子ＤＮＡを、
前記したプラスミドρＭＫＩＱを制限酵素ＥｃｏＲ１を
用いて開裂したものの間に挿入して接合を行う。

このようにしてプラスミドＰＩＱＡＸＴＧＦα２を得、
これをＴＧＦ−αの融合蛋白の発現ベクターとして使用
する。

本発明におけるこれらの発現ベクターｐＭＡＫＴＧＦα
、ｐｌＱＡＫＴＧＦα２は、これを大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ
　Ｊ旧０９株に導入し、アンピンリン耐性及びコピー数
の増加を調べてスクリーニングし、正しい方向にクロー
ンされたプラスミドをｐ？ＩＡＫＴＧＦα、　ｐｌＱＡ
ＫＴＧＦα２として使用する。

これらのプラスミドを大腸菌に導入し、この形質転換菌
を所定の培地で培養することにより、ＴＧＦ−α融合蛋
白を発現させ、次いで菌体を破壊し、遠心分離、カラム
クロマトグラフィー等の手段によりＴＧＦ−α融合蛋白
を単離精製する。

このＴＧＦ−α融合蛋白を、ブロムシアナミド等で処理
して、フォールディングを行ないＴＧＦ−αを取得する
。

本発明は、ヒトＴＧＦ−αばかりではなくマウスＴＧＦ
−α等の生産にも応用することができる。

本発明ではＴＧＦ−αをＴＧＦ−αとブクーアデニレー
トキナーゼとの融合蛋白の形で発現させるので、大量に
効率よく発現させることができる。

〔実施例〕

（実施例１） （１）　　ヒトＴＧＦ−αの遺伝子の調製第１図に示し
たヒトＴＧＦ−αの塩基配列のＤＮＡを小片に分けて合
成機〔アプライドハイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、モデル３８〇八］を使用
して、合成し、アニーリングして、ヒトＴＧＦ−αの構
造遺伝子を得た。

次に、市販のプラスミドｐ［ｌＩ’１３２２をＥｃｏＲ
ＩとＰｖｕｌｌとの部位の間で切断し、アンピシリン耐
性遺伝子（ＡＰｒ）と複製起点（Ｏｒｉ）　とを含むフ
ラグメントにトリプトファンプロモーターとトリプトフ
ァンＬＥの蛋白をコードする構造遺伝子の一部及びクロ
ーニングサイドからなる、第２図に示した塩基配列のＤ
ＮＡと接合してプラスミドｐＥＸ１４を得た。

このプラスミドρＥ×１４の旧ｎｄＩｎとＥｃｏＲＩと
の部位間を切断して取り除き、前記で合成したヒトＴＧ
Ｆα遺伝子をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、
このベクターをＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株に導入し、
当該株の形質転換を行い、この形質転換を増幅した後、
プラスミドｐＴＺＴを単離し、これからヒトＴＧＦ−α
遺伝子を制限酵素層ｎｄｍとＥｃｏＲ］で切り出した。

この遺伝子が第１図に示すＤＮＡ配列を有することはサ
ンガー法で確認した（第５図参照）。

（２）発現ベクターの調製 第６図に示すように本発明者等によってブタアデニレー
トキナーゼ発現のために構築された公知のプラスミドｐ
−ＫＡＫ３　（特開昭６４−５１０８８号公報参照）を
制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩによってブタ−アデニレートキナ
ーゼのアミノ酸配列の６５番目と６６番目の間（Ｇ　１
！　ｎとＬｅｕとの間）を開裂し、アルカリホスファタ
ーゼ処理を行って５′−リン酸基を除去した。

このプラスミド断片には、　ｔａｃプロモーター、複製
開始点（Ｏｒｉ）　、アンピシリン耐性遺伝子等のフラ
グメントを含んでいる。

一方、上記（１）によってえられた制限酵素ＥｃｏＲ１
及び旧ｎｄｌｌｌで切り出したＴＧＦ−α遺伝子を含む
フラグメントを、クレノー酵素で処理してプラントエン
ドにした後、このフラグメントを上記プラスミドｐＭＫ
ＡＫ３の開裂部位の間に結合した。これを、大腸菌Ｅ、
ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株に導入し、アンピシリン耐性及
びコピー数の増加を調べることによりスクリーニングし
た。この正しい方向ニクローン化されたプラスミドをｐ
ＭＡＫＴＧＦ　αとした。

（３）　　ヒトＴＧＦ−αの発現 上記プラスミドｐＭＡＫＴＧＦαにより形質転換された
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を５０　ｕ　ｇ／ｄ
のアンピシリンを含むＬＢ培地〔バタトトリブトン（Ｂ
ａｃＬｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ＃２、バクトイ−
ストエキストラクト（Ｂａｃｔ。

ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）５　ｇ　／　Ｒ１Ｎａｃ
　Ｉ！　１０　ｇ　／　ｊ２　ＳｐＨ７，５）　　２０
０ｄで培養した。−晩培養後、遠心分離して菌体を集め
、菌体を破壊し、これからブタ−アデニレートキナーゼ
のＮ末端から６５番目のペプチドとヒ）　ＴＧＦ−α蛋
白との融合した融合蛋白を得た。この融合蛋白の発現を
、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。この結果、この
融合蛋白は、全菌体蛋白の約３０％の発現を示し、融合
蛋白を大量に発現させることができた。このようにして
得られた融合蛋白をブロムシアナミドで処理して、ＴＧ
Ｆ−αとブクーアデニレートキナーゼの一部を切り離し
た。

次に、これをトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）　Ｏ，
ＬＭ、硫酸アンモニウム０．１？Ｉ、及びＴｒｉｔｏｎ
　ＸＸ１００（Ｒｏｈ　＆１１ａａｓ　Ｃｏ、の商品名
）５．０ｍＭ及び０．１ｍＭからなるバッファー液に熔
解し、これに還元型グルクチオン及び酸化型グルタチオ
ンをそれぞれ０．５ｍＭ添加し、室温で１６時間リフォ
ールディングを行い、８番目と２１番目、１６番目と３
２番目及び３４番目と４３番目のシスティンをジスルフ
ィド結合化した。

次いで、これを１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐｔ１
８．０）ニ対して、（！　）Ｌｔ　Ｃ１ｌ　−７！、チ
ューブ（ｃｕｔ　ＭＷ　１０００）を用いて透析を行っ
た後、凍結乾燥し、塩化ナトリウム１３８　ｍＭ、塩化
カリウム１．２　ｍＭ、硫酸マグネシウム１．２　ｍＭ
、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピベラジン−エ
タンースルホネイト（ＨＥＰＥＳ）　５０ｍＭからなる
ｐｌ＋７．７の緩衝液に熔解し、高速液体クロマトグラ
フィーを用いて、精製を行った。

これにより得られた１ＧＦ−αの生産量は培地１１あた
り３０■であった。

尚、このプラスミドｐＭＡＫＴＧＦαが挿入された菌株
はＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　ｐＭＡＫＴＧＰαＣ微工
研条寄第２６１１号（ＦＥＲＭ　ＲＰ−２６１１）　〕
として微１研に寄託されている。

実施例２ （１）　　ヒ）　ＴＧＦ−α遺伝子が２個連結した遺伝
子の調製 第７ズに示すように実施例１で得られたプラスミドｐＭ
ＡＫＴＧＦαを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ブタアデ
ニレートキナーゼのＮ末端がら６５番目までのペプチド
どヒトＴＧＦ−α蛋白との融合した融合蛋白のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡを得た。このＤＮＡを２個Ｔ４
　ＤＮ＾リガーゼで連結した。

（２）発現ベクターの調製 第８図に示すように、市販のプラスミドｐＴＴＱ１Ｂを
制限酵素Ｓｃａ　ｌ及び旧ｎｄＩ［Ｉで切り出し、ｒｒ
ｎＢターミネータ−のフラグメントとｆｆ１ａｃｌＱの
フラグメントとを含む断片を得た。

一方、本発明者等によって構築された公知のプラスミド
ｐＭＫ２　（特開昭６４−５１０８８号公報参照）を制
限酵素Ｓｃａ　ｌ及び旧ｎｄＩ［で切断し、この間に上
記断片を入れＴ４　ＤＮＡリガーゼで接合した。

この）゛ラスミドル門に２は、ｔａｃプロモーターのフ
ラグメント、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ア
ンピシリン耐性遺伝子のフラグメントを含んででいる。

このプラスミドを大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株に
導入して培養し、これをアンピシリン耐性によってスク
リーニングしてこれらのフラグメントを含んだベクター
を調製した。この調製したプラスミドの塩基配列は、サ
ンガー法で確認した。このプラスミドをｐＭＫＩＱとし
た。

次に、上記プラスミドｐＭＫ　１口を取り出し、第７図
に示すように制限酵素ＥｃｏＲＩで開裂した後、アルカ
リホスファターゼ処理によって５′−リン酸基を除去し
た。

一方上記（１）によって得られた２個の融合蛋白のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを開裂サイト間に入れ、Ｔ
４　ＤＮＡリガーゼで結合した。これを大腸菌Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　ＪＭ１０９株に導入し、アンピシリン耐性及びコ
ピー数の増加を調べることによってスクリーニングした
。この正しい方向にクローン化されたプラスミドをｐｒ
ＱＡＫＴＧＦα２とした。

（３）　　ヒトＴＧＦ−α融合蛋白の発現上記のプラス
ミドρＩＱＡＫＴＧＦα２により形質転換された大腸菌
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を５０ａｇ／ｍｉｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地〔バタトトリブトン（８ａｃｔ
。

ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　１０　ｇ　／　ｊ２、バクトイ−
ストエキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔ
ｒａｃｔ）５ｇ／ｆ、、ＮａＣｌ２　１０ｇ／Ｉ’。

ｐＨ７，５）に接種し、菌体が増殖した後、ＩＰＴＧを
添加し一晩培養し、遠心分離して菌体を集め、菌体を破
壊した。これからブタ−アデニレートキナーゼのＮ末端
から６５番目までのアミノ酸配列を有するペプチドとヒ
トＴＧＦ−α蛋白との融合した融合蛋白を得た。この融
合蛋白の発現を５Ｏ５−ＰＡＧＥによって確認した。こ
の結果、この融合蛋白は、全菌体蛋白の約２０％の発現
を示し、融合蛋白を大量に発現させることができた。　
　このようにして得られた融合蛋白をブロムシアナミド
で処理してヒトＴＧＦαを得た。これは。培地１２当り
５０■の生産量であった。

このプラスミドル１口＾ＫＴＧＦα２が挿入された菌株
は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株　ｐｌＱＡＫＴＧＦ　
ｃｘ　ｚ　　（微工研条寄第２６１２号（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２６１２）、〕として微１研に寄託されている。

〔発明の効果〕

本発明は、ＴＧＦ−αを−ブターアデニレートキナーゼ
との融合蛋白として遺伝子工学的手法により発現させた
ので融合蛋白を大量に発現させることができ、ＴＧＦ−
αを工業的有利に製造することができる。

また、１ａｃＩのフラグメントを導入し、誘導型発現ベ
クターとすることにより、ＩＰＴＧで誘導を行うことが
でき、菌体を高密度に生育させることによってＴＧＦ−
αを一層大量に発現させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で合成したヒトＴＧＦ−αの遺伝子の
塩基配列を示すＤＮＡ及び制限酵素切断部位を、第２図
はプラスミドｐＥＸ１４に導入したＤＮＡを、第３図は
ｔａｃプロモーターの塩基配列をそれぞれ示す。第４図
は、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなるＤＮＡ及びその制限酵素切断部
位を示す。 第５図は、プラスミドｐＴＺＴの、第６図はプラスミｌ
’　ｐＭＡＫＴＧＦ　ｃｘ　ノ、第７図はプラスミドｐ
ｌＱＡＫＴＧＦ　ｃｘ　。 の、また第８図はグラスミ１９ＭＫ１口の調製法の概略
をそれぞれ示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラスミド
   ｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブ
   タ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしく
   は全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及びＴＧＦ
   −αのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮ
   Ａを含み、かつ前記両ＤＮＡが結合されていて、ブタ−
   アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全
   部とＴＧＦ−αとの融合蛋白を発現するようにされてい
   ることを特徴とするＴＧＦ−α発現ベクター。
2. （２）ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラスミド
   ｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント及び
   ｌａｃＩのフラグメントと、ブタ−アデニレートキナー
   ゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基
   配列からなるＤＮＡと、ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列からなるＤＮＡとを含み、かつ前記両
   ＤＮＡが結合されていて、ブタ−アデニレートキナーゼ
   のアミノ酸配列の一部もしくは全部とＴＧＦ−αとの融
   合蛋白を発現するようにされていることを特徴とするＴ
   ＧＦ−α発現ベクター。
3. （３）ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一
   部もしくは全部とＴＧＦ−αとが結合してなるＴＧＦ−
   α融合蛋白。
4. （４）請求項（１）または（２）の発現ベクターを大腸
   菌に形質導入したことからなる形質転換微生物。
5. （５）請求項（４）の形質転換微生物を培養し、ＴＧＦ
   −α融合蛋白を発現させ、これを採取した後、切断して
   ＴＧＦ−αを回収することを特徴とするＴＧＦ−αの製
   造法。