JPH03130092A - 抗ヒト腫瘍壊死因子モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞及び該モノクローナル抗体を用いる測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子に対して特異性のある抗ヒ
ト腫瘍壊死因子モノクローナル抗体、これを産生ずる融
合細胞（ハイブリドーマ）及び該モノクローナル抗体を
用いる測定方法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］ヒト腫
瘍壊死因子（以下、「ヒトＴＮＦＪと呼ぶ。）は、抗腫
瘍効果、リポタンパク質リパーゼの阻害作用及び多形核
白血球の活性化などの働きを有することが知られている
。またさらに、ヒトＴＮＦは、慢性疾患の経過中に見ら
れる著しい体重の減少や疲労を起こす悪態症の原因であ
るカケクチン（悪液質物質：　ｃｔｃｈｅｃｌｉｎｌと
同じであると考えられている。このように、ヒトＴＮＦ
は慢性、感染性及び腫瘍性の病気の患者の血中に分泌さ
れることがわかっており、これらの病気の指標として使
われている。従って、血中のヒトＴＮＦを正確にかつ高
感度に検出できれば、上記の慢性、感染性及び腫瘍性の
病気の臨床診断薬として有効である。

従来、ヒトＴＮＦに対するモノクローナル抗体に関する
報告（Ｌｉａｎｇ、Ｃ，−ＩＪ、、　Ｌｉｘｎｇ、Ｓ、
−Ｍ、、１ｏｔ７、、　５ａｎｄ、人、、　　Ｄｏａｇ
ｚｓ、！、、　　ａｎｄ＾１ｌｅｔ、　Ｂ、（１９８６
）？ｏｄａｃｌｉｏｎ　　ａｎｄ　　ｃｈｘ＋ａｃｌｅ
＋１ｘａｌｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌ。

ｎａｌ　　ａｎｌｉｂｏｄｉｅｘ　　ｘＨｉｎｓｔ　＋
ｅｃｏｍｂｉｎｍｎｌ　ｈＩｌｍａｎｔｕｍｏｒｎｅｃ
ｒｏｓｉｓ　ｌ３ｃｔｏ＋／　ｃａｃｈｅｅｌｉｎ、　
ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈ７ｓ、　Ｒｅ１．Ｃｏｍｍｏ
ｎ、　　１３７８４７−８５４　；　Ｈｉ＋ａｉ、　Ｍ
Ｏｋｘｍｕ＋ａ、Ｎ、、　　Ｔｅ＋ｘｎｏ、Ｙ、、　　
Ｔｓａｉｉｍｏｔｏ、Ｍ、、　　ａｎｄＮａｋｘ！ｘｔ
ｏ、　１１．　　（１９８７１，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
　ａｎｄ　ｃｈａ＋ａｃｌｅｒｉ＋ａｌｉｏｎ　ｏｆ　
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ｇｎｌｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　
　ｈｕｍａｎｌｕｍｏ＋　ｎｅｃ＋ｏｉｉ＋　ｆａｃｔ
ｏ「、　　１．Ｉｍｍａｎｏｌ、Ｍｅｌｈ、９６５７−
６２１はあるが、ヒトＴＮＦに対し特異的で高い中和力
を持つモノクローナル抗体は報告されていない。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、ヒトＴＮＦに対して高い中和力を有する
モノクローナル抗体を得るために種々の検討を行なった
結果、精製したヒト組換えＴＮＦを抗原として動物を免
疫することにより抗体産生細胞を得、該細胞と無限増殖
性を有する細胞、例えば、骨髄腫細胞からハイブリドー
マを作製し、該ハイブリドーマによりヒトＴＮＦに対し
て高い中和力を有するモノクローナル抗体を安定に産生
させることに成功し、この発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ヒトＴＮＦと特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、特に、それｉｐ９でヒ）ＴＮＦ約　
３１０ユニツトを中和できる抗ヒトＴＮＦモノクローナ
ル抗体を提供する。

また本発明は、該モノクローナル抗体を用いるヒトＴＮ
Ｆの測定方法を提供するものである。

さらに本発明は、上記ハイブリドーマをも提供するもの
である。

［発明の詳細な説明］ 本発明のモノクローナル抗体はヒトＴＮＦに対して強い
中和力を有することを特徴とする特に、本発明モノクロ
ーナル抗体の一例である１３Ｆ７は、ｒ　ｇ　Ｇ　１の
サブクラスに属し、それ０，５層で約１５５ユニツトの
ヒトＴＮＦを中和することができる。すなわち、本発明
抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体１３Ｆ７１７＃でヒト
ＴＮＦ約３１０ユニツトを不活性化できる。

本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
は、精製ヒトＴＮＦで免疫した動物由来の抗体産生細胞
と骨髄腫細胞等を用い、ハイブリドーマを作る際の公知
の方法であるＮａ１ｕ＋ｅ　２５６巻、４９５頁（１９
７５年）に記載のケーラーとミルシュタインの方法に準
じて、当該技術分野における通常の方法によって作製す
ることができる。

すなわち、例えば免疫源としてＴ　Ｎ　Ｆ発現ベクター
を組込んだ大腸菌により産生されたヒト相撲ＴＮＦを用
いて、例えばマウス等の動物を免疫し、その牌細胞と例
えば８−アザグアニン耐性マウスミエローマ細胞とを細
胞融合させ、次に、この細胞融合によって増殖性を与え
られたクローンのみを選別し、単クローンとする。こう
して得られた単クローン化ハイプリドーマの中から上記
特性を有する本発明モノクローナル抗体を産生ずるノ＼
イブリドーマを選択することによって本発明のハイブリ
ドーマを得ることができる。更に、本発明モノクローナ
ル抗体はこのハイブリドーマを用いて従来技術によって
容易に製造することができる。

し発明の効果］ 本発明の抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体は、ヒトＴＮ
Ｆに対して特異的に高い親和性を有するので、血中のヒ
トＴＮＦの高感度な検出又は定量試薬として有効である
。また、慢性、感染性及び腫瘍性の病気の臨床診断薬と
して有効である。更に、ヒトＴＮＦは悪液質原因物質で
あると考えられているので、本発明のモノクローナル抗
体を固定化したカラム等に悪液質患者の血液を還流させ
ることによって悪液質症状を緩和することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。

［実施例］ ヒトＴＮＦ遺伝子の合成 ヒトＴＮＦ遺伝子は、ベニ力等が報告している　ｅＤＮ
Ａ配列（Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、　３１２．　　ＩＩＰ
、　　７２４−７２９１９８４）に相当するアミノ酸配
列のうちの成熟蛋白をコードする領域に、翻訳開始シグ
ナル（Ｍｅｔ）を付加した構造遺伝子について、大腸菌
でよく使用されるコドンを選択して設計した。発現用ベ
クターに、容易に挿入できるように両端に制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、ＨｉＩｌｄＤＩの認識部位を導入した。第４図
にこうして合成したヒトＴＮＦ遺伝子のアミン酸配列及
び塩基配列を示す。４Ｏ−５０ｂ、のフラグメントをＤ
ＮＡ自動合成機（人ｐｐ１ｉｅｄ　ＢｉｏＢ＋ｊｅｍ３
１１０Ｂ　ＤＮＡ　５７ｎｌｈｅ＋ｉ＋ｅｒ）を用いて
合成した。各フラグメントは、常法に従い１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により精製した。上記遺伝
子の前半部、後半部の２つのブロックに分けてＴ４ＤＮ
ＡＩｉｇ目ｅにより結合した。更に、この両ブロックど
うしを同様に結合し、４８５　ｂ、よりなるヒトＴＮＦ
遺伝子を作成した。

発現用組み換えベクターの作成 発現用ベクターとしては、ｐＫＫ２２３−３　（ファル
マシア社製）を用いた。ｐＫＫ２２３−３のＩＩｃプロ
モーター下流にあるポリリンカーのＥｅｏＲＴ、Ｈｉｎ
ｄ■領域に、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｌｉｇｘ＋ｅを用
いて上記のヒトＴＮＦ遺伝子を挿入し、大腸菌に一１２
株ＪＭ１０５またはＪＭＩ０９をカルシウム法で形質転
換し得られた形質転換株より、プラスミドＤＮＡを抽出
し、ヒトＴＮＦ遺伝子の挿入を確認した。この発現用ベ
クターを、ｐＫＫ−ＴＮＦと命名した。

組み換え体による発現 ｐＫＫ−ＴＮＦを用いて大腸菌に一１２株ＪＭＩ０５を
形質転換して得られた細胞Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＩＭＩ０
５　ｐＫＫ−丁ＮＦを、アンピシリン（２５■／ｍ１）
を含んだＬＢ培地にて対数増殖期初期まで培養し、誘導
物質としてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（
ＩＰＴＧ）を１０ｍＭとなるように加え、−晩培養した
。培養液３Ｉｌをホモジナイズし、２０．００Ｏｒｐｍ
で■時間遠心した後、上清をイオン交換カラム（ＤＥＡ
ＥセルロースＤε５２）にて０＝　０．３Ｍ　ＮｘＣＰ
勾配で溶出した。各画分を電気泳動でチエツクし、ＴＮ
Ｆ含有画分をアミコン（ブレースジャパン■社製ダイア
フローセル３０５［１）で濃縮し、セファデックスＧ−
７５＜ファルマシア社ｇＡ）でゲルが過クロマトグラフ
ィーにかけ、分子量約５万のトリマー（ＩＴ、　０００
ｘ　３）として回収し、その一部を２０ｍＭ　Ｔ＋ｉ＋
−ＨＣ［緩衝液ｐＨ６，８に溶解し、残りは再びアミコ
ンで濃縮した後凍結乾燥して保存した。

第４図に、こうして得られた合成ヒトＴＮＦ遺伝子の塩
基配列及び組換えヒＩ−ＴＮＦのアミノ酸配列を示した
。

この組換えヒトＴＮＦの生物学的活性（腫瘍壊死効果）
はマウスＬ９２９線維芽細胞（文献及び入手方法：　　
Ｆｌｉｃｋ、Ｄ、＾、　　ｌｎｄ　Ｇ１１ｆｏ＋ｄ、Ｇ
、Ｅ、、　（１９ＮＩＪ、Ｉｍｍｏｎｏｌ、Ｍｅｌｈｏ
ｄ＋、６８．　１６７−１７６）を用いた毒性試験によ
って調べた。すなわち、各ウェルにマウスＬ９２９線維
芽細胞３ＸＩＯ個を分注しＣＯ２インキユベータで３７
℃、−晩培養した後、適当濃度に希釈した該組換えヒト
ＴＮＦと　０．　Ｉ／Ｊ５ＦのアクチノマイシンＤを加
えて更に３７℃で１８時間ＣＯ２インキユベータ下で培
養した。培地を除去した後、無血清培地に溶かした０、
０３％のニュートラルレッドを　１００ハ加えてさらに
３７℃、９０分放置した後、ウェルを予め暖めておいた
ＰＢＳで２度洗い乾燥した。色素は０．０１規定の塩酸
を加えた２５％のエタノール２００Ｈで１５分間振盪溶
出させて波長４９０１における吸収で測定した。

その結果を第２図に示した。この図から、５０％細胞毒
性を有するＴＮＦ量は約Ｑ、　３５ｎｇ　（１ユニット
／ｍｌ）であった。従って、ヒトＴＮＦの比活性は約　
２．９Ｘ　ｌ１１６ユニツト／■であった。

［モノクローナル抗体の作製］ 上記のごとく精製された組換えヒトＴＮＦ　（以下、単
に「ヒトＴＮＦＪという。）を生理食塩水で適当濃度に
希釈し、フロイントの完全アジュバントと体積比１：１
で乳濁した後、２週間の間隔をあけてマウスＢＡＬＢ／
ｃに皮下注射した（５Ｇ即ヒトＴＮＦ／マウス）。最初
の免疫から２８日目に生理食塩水に溶かしたヒトＴ　Ｎ
　Ｆ　　ＩＮＩＪ９を腹腔内注射し、免疫を完了した。

最終免疫から３日後に膵臓を摘出し、８−アザグアニン
耐性マウスミエローマＳＰ２１０−Ａｇｌ１４細胞（＾
ｍｔ＋１ｅａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎから入手可）とｌＯ：１の割合で混合し
、前述のケーラーとミルシュタインの方法により細胞融
合させた。陽性のノ＼イブリドーマを常法によりフィー
ダー層としての腹腔内マクロファージの存在下で限界希
釈法によりクローン化した。

ハイプリドーマの増殖が認められたウェルについて、以
下に記載するＥＬＩＳＡ法を用いて、培養土清中の抗ヒ
トＴＮＦ抗体の存在の有無を検索した。

ＥＬＩＳＡ法は、９６ウエルプラスチツクプレート（タ
イターチック社製）を用い、先ず０．０５Ｍ重炭酸塩緩
衝液（ｐＨ９，５）　（以下、ｒＳ　ＢＢＪという。）
に１１１！ｊ　／　ｍｌの濃度に溶解したヒトＴＮＦ液
５０ＪＪｉずつを各ウェルに分注した後、−晩４℃で培
養し上清は捨てた。残渣の蛋白質結合部位は２％牛血清
アルブミン（以下、ｒＢｓＡＪという。）、２％ポリビ
ニルピロリドン（以下、「ＰＶＰ」という。）及び０．
０５％のＴｖｅｅｎ　２０を含むＳＢＢを２００パ加え
、室温で２時間反応させてブロックした。

次に、各ウェルに一次抗体としてのハイブリドーマ培養
上清２００ハを加え室温で２時間反応させた後、Ｑ、１
％のＴｖｅｅｎ　２Ｇを含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で
２度洗浄し、二次抗体として、２％ＰＶＰと０．０５％
のＴｖｅｅｎ　２Ｇを含むＳＢＨに溶かしたパーオキダ
ーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（３ｉｇｍａ）Ｉ
ＱＱ　ｇを加え室温で２時間反応させた。その後、各ウ
ニＡｖはＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、フェニレンジアミン
（９，４３■／　ｍｌ　Ｇ、　０５１Ｊクエン酸緩衝液
、ｐ１１＝５．０）を含む基質溶液５０ハと０．００２
％の過酸化水素水を加え室温で３０分反応させた後、２
Ｍの硫酸５０ハを加えて反応を止めた。各ウェルの４９
０■での吸収を測定した。

このようにして、抗ヒトＴＮＦ抗体価が認められたハイ
ブリドーマは、さらに限界希釈法でクロニングを行ない
、単クローン化し、単りローン性抗ヒトＴＮＦ抗体産生
細胞株３株、４８８．７Ｃ５，１３Ｆ７が得られた。な
お、ハイブリドーマ１３Ｆ７は、工業技術院微生物工業
技術研究所に平成元年６月２３日付で寄託され、その受
託番号は微工研菌寄第１０７９１号（ＦＥＩＩＭ　Ｐ−
１０７９１１である。

上記のようにして得た特定の細胞株からモノクローナル
抗体を大量に得るために、３週間前に免疫抑制剤プリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
）　　０．５ｍｌを注射したマウスに上記の各ハイブリ
ドーマを夫々ｌＸ１０６個ずつ腹腔内投与し、投与９日
後、腹水を回収し、細胞とフィブリノーゲンを除去し、
塩化アンモニウム沈澱法により回収精製することにより
、夫々、抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体４８ｇ、７Ｃ
５，１３１’７を得た。ヒドロキシアパタイトカラム８
丁ＡＰＳ＝　０２ＯＮＧ　（東燃株式会社製）を用いた
ＨＰＬＣによる分析では各モノクローナル抗体は約９５
％の純度であることがわかった。

抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体の免疫グロブリンのサ
ブクラスはセロチックキット（５ｅｒｏｊｅｃ社製）を
用いたオフタロニー法により決定した。

その結果、上記三種のモノクローナル抗体はいずれもＩ
　ｇＧｌに属するものであることが判明した。

［モノクローナル抗体の反応性］ 本発明モノクローナル抗体のヒトＴＮＦに対する反応性
をウェスターンブロッティング法を用いて検討した。

発現ベクター９ＫＫ−ＴＮＦを組込んだ大腸菌を、イン
ドール酢酸を加えた培地と加えない培地とで培養した。

大腸菌の蛋白質を含む抽出物は、１％の５Ｄ８１２．５
％のβ−メルカプトエタノールと１０％のグリセリンを
加えたｌ０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ）ｌ［ｉ、８
）に溶かし、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行
なった。その後、ゲルから大腸菌由来蛋白質をポリビニ
リデンシフロリドが紙（ミリボア社製、Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ−Ｐ）に移し、ＩＨ／ｍｌの各モノクローナル抗体
で処理した。パーオキシダーゼで標識した本発明モノク
ローナル抗体と反応させた後、過酸化水素で発色した。

得られた結果を第１図に示した。第１図のレーン１及び
２はモノクローナル抗体４８８についての結果、レーン
３及び４はモノクローナル抗体７Ｃ５についての結果、
レーン５及び６はモノクローナル抗体１３Ｆ　７につい
ての結果を示す。また、レーン１１３．５はインドール
酢酸の存在下で培養した大腸菌から回収した蛋白質につ
いての結果を、レーン２．４．６はインドール酢酸非存
在下で培養した大腸菌から回収した蛋白質についての結
果を示す。

各モノクローナル抗体はヒトＴＮＦとのみ反応した。ヒ
トＴＮＦとの反応の強さはモノクローナル抗体１３Ｆ７
が最も強く、以下、４Ｂｇ、７Ｃ５の順であった。モノ
クローナル抗体７Ｃ５は反応が非常に弱かった。また全
てのモノクローナル抗体について、インドール酢酸を加
えた培地で培養した大腸菌から得たヒトＴＮＦの方が、
加えなかったものよりも反応が強かった。

モノクローナル抗体１３Ｆ７のヒトＴＮＦに対する中和
力は培地中の種々濃度のモノクローナル抗体１３Ｆ７１
；：箸休ｆｌｆｆｔ：　）ＴＮＦ溶１　（ｔニー　トＴ
ＮＦｍ度４７　ｎｇ／ｍｌ）加えて混合し４℃で一晩反
応させ、その後ヒトＴＮＦの活性試験で用いたマウスの
線維芽細胞Ｌ９２９を用いた毒性試験により調べた。

その結果を第３図に示した。第３図は　ｌ／２希釈のモ
ノクロ−カル抗体についての結果を示す。モノクローナ
ル抗体１３Ｆ７は、濃度５００　ｎｇ／ｍｌでほぼ完全
に４７Ｂ／ｍｌのＴＮＦを不活性化できることがわかっ
た（５０％抑制のときのＴＮＦ濃度は第２図より僅か０
．３ｏｇであり、４７ｎｇに比べ無視できる）。

また、モノクローナル抗体１３Ｆ？、ＩＩＪ！ｇは、約
３１０ユニツトのヒトＴＮＦを中和できることがわかっ
た。

［モノクローナル抗体を用いるヒトＴＮＦの測定系］ 本発明のモノクローナル抗体１３Ｆ１を用いて、以下に
示す、ＥＬＩＳ人法を原理とする試料中ヒトＴＮＦと固
相結合ＴＮＦの競合によるヒトＴＮＦの定量法を確立し
た。

正常ヒト血清をＰＢＳで希釈し、その溶液にモノクロー
ナル抗体１３Ｆ７と種々の濃度のヒトＴＮＦを添加し、
室温で２時間反応させた。前述のＥＬＩＳＡ法に準じて
、ヒトＴＮＦを９６ウエルプラスチツクプレートにコー
ティングし、ＢＳ八でブロッキング後、該モノクローナ
ル抗体とヒｌ−Ｔ　ＮＦ混合液５０ハを各ウェルに加え
、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３度洗浄し、
二次抗体として、ビオチンをラベルしたヤギ抗マウスイ
ムノグロブリン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社）を２％ＰＶＰ、
１０５％Ｔｖｅｅｎ　２Ｇを含むＰＢＳで希釈したもの
を５ＱＩＩｉ加え室温で２時間反応させた。その後各ウ
ェルにＰＢＳ−Ｔｔ”４回洗浄後２％Ｐ　Ｖ　Ｐ　％　
Ｇ、　８５％　　Ｔｖ！ｔｎ２０を含むＰＢＳで希釈し
たパーオキシダーゼ結合アビジン５０ルを加え、室温で
３０分間反応させた。

その後ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し前述のＥＬＩＳＡ法に準
じて基質を加え発色反応を行ない、モノクローナル抗体
１３Ｆ７のみの試料の値を１００％として検量線を得た
。

第５図は、こうして得られたヒトＴＮＦ定量のための検
量線を示す図である。

［モノクローナル抗体の性質］ ４Ｂ８．１３Ｆ７．　７Ｃ５の３つのモノクローナル抗
体の抗原認識部位を検定した。それぞれの抗体を前記プ
ラスチックプレートにコーティングして、ブロッキング
した後、ＴＮＦを１％ＢＳＡを含むＰＢＳに各種濃度に
なるように添加し、その＋００　ｉｌｉを各ウェルに加
えた。２時間、室温で反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで３回
洗浄後、ビオチン化したそれぞれの抗体を添加し、２時
間、室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、パー
オキシダーゼ結合アビジンを添加して、３０分、室温で
反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、前記基質溶液
を加え発色反応を行った。その結果を第６及び７図に示
した。この結果から、１３Ｆ７と　７Ｃ５の認識する部
位は同じか、あるいは非常に近接していて、１３Ｆ７は
７Ｃ５よりも反応性が高いこと、及び４８８は、１３Ｆ
７や７Ｃ５とは違った部位を認識することがわかった。

［モノクローナル抗体を用いるもう１つのヒトＴＮＦの
測定系］ モノクローナル抗体４８８を９６ウエルマイクロプレー
トにコーティングし、ＰＢＳで０．５％に希釈したカゼ
インでブロッキング後、試料を　０．１〜０．２ｖ１％
カゼイン、１〜２％ＰＶＰ、０．ｆｌ［〜０．１％Ｔｖ
ｅｅｏ　２０　、抗マウス精子抗体１０〜２００　ｐ９
　／　ｍｌをＰＢＳに加えた緩衝液（以下ＣＰＴＧと略
する）で適当に希釈しその　１００ｍを各ウェルを加え
た。

２時間、または−晩３７℃で反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ
で３回洗浄し、ビオチン化した１３Ｆ７をＣＰＴＧで希
釈したものを加えた。２時間、室温で反応させた後ＰＢ
Ｓ−Ｔで３回洗浄し、パーオキシダーゼ結合アビジンを
添加して３０分、室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回
洗浄し、前記基質溶液を加え発色反応を行った。その検
量線を第８図に示した。−晩反応させた場合、検出限界
約１　ｐｇ／　ｍｌになり、非常に高感度な測定系がで
きた。

第９図は、上記測定方法を用いて、本発明モノクローナ
ル抗体とインターロイキン↓及びリンホトキシンとの交
差反応の有無を検討した結果である。この結果から、こ
れらの物質との交差はないことがわかる。

尚、本発明のモノクローナル抗体を用いるヒトＴＮＦの
測定系として、上記のものの他にも他の公知の原理を利
用した種々の測定系が容易に構成されることは、当業者
であれば容易に理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体とヒトＴＮＦ
とのウェスタンブロッティングのＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動の結果（粒子構造）を示す写真である
。 第２図はヒトＴＮＦの抗腫瘍効果を示す。 第３図は抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体のヒトＴＮＦ
中和活性を示す。 第４図は組換えヒトＴＮＦのアミノ酸配列及びヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の塩基配列を示す。 第５図はヒトＴＮＦ定量のための検量線を示す。 第６及び７図は本発明モノクローナル抗体の抗原特異性
の異同を表わす検量線を示す。 第８図は本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で得られた
検量線を示す。 第９図は本発明モノクローナル抗体とインターロイキン
１及びリンホトキシンとの交差反応の結果を示す。 第 ■ 図 第３図 １／クローナルｔ／ｊ、体（％９／ｍｆｆ１　）第５図 ＴＮＦ　（ｎｇ／ｍり 第６図 モノ４Ｑ−プル主１４本Ｏ摩旦会せ（４８８つ−１ンク
）ＴＮＦ　（ｐｇ／ｍｌ　） モノクローナノロルイ本の紐魯亡（１３Ｆ７つティング
） ０ ００ ０００ ＴＮＦ　（ｐｇ／ｍｌ　） 第８ 図 検量像 ＴＮＦ　（＋）９／ｍ旦）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト腫瘍壊死因子と特異的に反応する抗ヒト腫瘍
   壊死因子モノクローナル抗体。
2. （２）ＩｇＧ＿１に属する請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体。
3. （３）モノクローナル抗体１３Ｆ７である請求項２記載
   のモノクローナル抗体。
4. （４）ヒト組換え腫瘍壊死因子で免疫した動物由来の抗
   体産生細胞と８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞との
   融合細胞であって、請求項１ないし３のいずれか１項に
   記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
5. （５）ハイブリドーマ１３Ｆ７である請求項４記載のハ
   イブリドーマ。
6. （６）ヒト腫瘍壊死因子と特異的に反応し、互いに異な
   る部位を認識する二種のモノクローナル抗体を用いるこ
   とを特徴とするヒト腫瘍壊死因子のサンドイッチＥＬＩ
   ＳＡ測定方法。
7. （７）二種のモノクローナル抗体が、１３Ｆ７及び４Ｂ
   ８であることを特徴とする請求項６記載の測定方法。
8. （８）約０．１〜０．５ｗｔ％のカゼインを含む緩衝液
   を各試料及びモノクローナル抗体試薬の希釈に使用する
   ことを特徴とする請求項６又は７記載の測定方法。