JPH0310683A - 先祖返りしないｒｎａウイルス - Google Patents
先祖返りしないｒｎａウイルスInfo
- Publication number
- JPH0310683A JPH0310683A JP1174353A JP17435389A JPH0310683A JP H0310683 A JPH0310683 A JP H0310683A JP 1174353 A JP1174353 A JP 1174353A JP 17435389 A JP17435389 A JP 17435389A JP H0310683 A JPH0310683 A JP H0310683A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- cdna
- rna viral
- virus
- viral
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 53
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 62
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 68
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 12
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 208000009341 RNA Virus Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 2
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 claims 2
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 claims 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 5
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 5
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 5
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000709704 Human poliovirus 2 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006658 host protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
- A61K39/13—Poliovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Physical Deposition Of Substances That Are Components Of Semiconductor Devices (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は低速度の複写及び先祖返りを有する弱体化され
たＲＮＡウィルス種に関する。更に特に本発明はその弱
体化したＲＮＡウィルス種を含んでなるワクチン及びそ
のようなワクチンの使用に関する。
たＲＮＡウィルス種に関する。更に特に本発明はその弱
体化したＲＮＡウィルス種を含んでなるワクチン及びそ
のようなワクチンの使用に関する。
種々の陽性のストランドＲＮＡウィルス又はピコルナウ
ィルスは良く知られている。典型的なピコルナウィルス
はポリオウィルス、エコウウィルス、コールドウィルス
及びリノウィルス（普通のコールドウィルス）を含む。
ィルスは良く知られている。典型的なピコルナウィルス
はポリオウィルス、エコウウィルス、コールドウィルス
及びリノウィルス（普通のコールドウィルス）を含む。
そのようなウィルスによって誘発される病気から保護す
るｔ二めに、弱体化された生活の又は死んだウィルスの
変種又は突然変異種を用いてワクチンか製造される。弱
体化されたウィルスは弱めらね、た病原性を示す。例え
ばアルバート・サビン（Ａｌｂｅｒｔ ５ａｂｉｎ）は
１９５０年代に、病気を引き起こす能力を失なった変種
が選別されるまで、ウィルスを異なる動物宿主からの組
織中に培養した細胞で通過させることによりポリオウィ
ルスの弱体化された槌を分離した［Ａ、Ｊ、サビンら、
［ナヒンの弱体化したポリオウィルス用の経ロ生ワクチ
ン種の歴史」、Ｊ、パイオル・スタート（Ｂｉｏｌ。
るｔ二めに、弱体化された生活の又は死んだウィルスの
変種又は突然変異種を用いてワクチンか製造される。弱
体化されたウィルスは弱めらね、た病原性を示す。例え
ばアルバート・サビン（Ａｌｂｅｒｔ ５ａｂｉｎ）は
１９５０年代に、病気を引き起こす能力を失なった変種
が選別されるまで、ウィルスを異なる動物宿主からの組
織中に培養した細胞で通過させることによりポリオウィ
ルスの弱体化された槌を分離した［Ａ、Ｊ、サビンら、
［ナヒンの弱体化したポリオウィルス用の経ロ生ワクチ
ン種の歴史」、Ｊ、パイオル・スタート（Ｂｉｏｌ。
５Ｌａｒｄ、）ｌＳｌ ｌ ５ （１９７３） ］ 。
ウィルスに基づくワクチンは、複写することができ且つ
抗体の生成によって適当な免疫を誘導しうるから有用で
ある。しかしながら、生ワクチンは、死んだワクチンが
血清免疫を誘発することに限られているのに対し、感染
部位に免疫を誘導するという更なる利点を有する。生ウ
ィルスワクチンは、投与か容易であり、価格が安く、そ
して迅速なワクチン地方が長期の持続する免疫を発現す
るから広く使用されている。しかし悪いことに生活ウィ
ルスは帰先する、即ち生活ウィルスの貯留物から、ワク
チンの処方中又は製造中のいずれかにおいて、病気を引
き起こすことの複写された新しい変種が現れることがあ
る。それ故にワクチンとして使用する際に先祖返りしに
くい種を生産することは興味あることである。
抗体の生成によって適当な免疫を誘導しうるから有用で
ある。しかしながら、生ワクチンは、死んだワクチンが
血清免疫を誘発することに限られているのに対し、感染
部位に免疫を誘導するという更なる利点を有する。生ウ
ィルスワクチンは、投与か容易であり、価格が安く、そ
して迅速なワクチン地方が長期の持続する免疫を発現す
るから広く使用されている。しかし悪いことに生活ウィ
ルスは帰先する、即ち生活ウィルスの貯留物から、ワク
チンの処方中又は製造中のいずれかにおいて、病気を引
き起こすことの複写された新しい変種が現れることがあ
る。それ故にワクチンとして使用する際に先祖返りしに
くい種を生産することは興味あることである。
本発明は、活性ウィルスに、先祖返りする能力の低下せ
しめられた非常に弱体化したＲＮＡウィルス種を提供す
ることによって上述した問題を解決する。本発明のＲＮ
Ａウィルスは、ウィルスの誘導する病気と身近に接触し
たものを呆護するワクチンに有用である。
しめられた非常に弱体化したＲＮＡウィルス種を提供す
ることによって上述した問題を解決する。本発明のＲＮ
Ａウィルスは、ウィルスの誘導する病気と身近に接触し
たものを呆護するワクチンに有用である。
これらの弱体化したＲＮＡウィルス種の本発明による１
つの具体例は、ウィルスの遺伝子のそれ自体への塩基対
合を増大又は減少させるＲＮＡウィルス遺伝子の改変で
ある。
つの具体例は、ウィルスの遺伝子のそれ自体への塩基対
合を増大又は減少させるＲＮＡウィルス遺伝子の改変で
ある。
本発明の方法の第２の具体例は、ウィルスＲＮＡと哺乳
動物宿主のリボソームＲＮＡとの間の塩基対合を増大又
は減少させるためにＲＮＡウィルス遺伝子を改変するこ
とである。本発明の方法は、塩基対合を減することによ
り宿主リポゾームＲＮＡとの相補性を含む領域において
或いは塩基対合を増大させることにより宿主リポゾーム
ＲＮＡ、！ｌ−の相補性を含まない領域においてウィル
スＲＮＡ塩基を改変する。本発明の方法の第３の具体例
は、非常に弱体化されたウィルス種を与えるために上述
の２つの具体例を組合せることである。
動物宿主のリボソームＲＮＡとの間の塩基対合を増大又
は減少させるためにＲＮＡウィルス遺伝子を改変するこ
とである。本発明の方法は、塩基対合を減することによ
り宿主リポゾームＲＮＡとの相補性を含む領域において
或いは塩基対合を増大させることにより宿主リポゾーム
ＲＮＡ、！ｌ−の相補性を含まない領域においてウィル
スＲＮＡ塩基を改変する。本発明の方法の第３の具体例
は、非常に弱体化されたウィルス種を与えるために上述
の２つの具体例を組合せることである。
そのような塩基対合の改変は、ＲＮＡウィルスを分離し
、そのＲＮＡを逆転写してｃ ＤＮＡコピーを得、この
ｃＤＮＡを突然変異させて、３つの具体例において上述
した効果を誘導し；ウィルスＲＮＡを産生しうる細胞を
、突然変異されたＲＮＡウィルスｃＤＮＡでトランスフ
ェクションし；そして培養して弱体化されたＲＮＡウィ
ルスを生産する工程を含んでなる。これらの改変はＲＮ
Ａウィルス種の転写又は翻訳能力を減するのに有効であ
る。
、そのＲＮＡを逆転写してｃ ＤＮＡコピーを得、この
ｃＤＮＡを突然変異させて、３つの具体例において上述
した効果を誘導し；ウィルスＲＮＡを産生しうる細胞を
、突然変異されたＲＮＡウィルスｃＤＮＡでトランスフ
ェクションし；そして培養して弱体化されたＲＮＡウィ
ルスを生産する工程を含んでなる。これらの改変はＲＮ
Ａウィルス種の転写又は翻訳能力を減するのに有効であ
る。
本発明の目的は生ワクチンに弱体化されたＲＮＡウィル
スを用いることである。このワクチンの投与は生ワクチ
ンを投与するのに通常受は入れられている方法のいずれ
かによることができる。
スを用いることである。このワクチンの投与は生ワクチ
ンを投与するのに通常受は入れられている方法のいずれ
かによることができる。
第１図は５′無情報領域の塩基３７０及び４７１間の公
表されたｃＤＮＡポリオゲノムから相補性塩基を組合せ
ることによって予想されるループ［トヨダら、Ｊ モル
・パイオル（Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、１７４．５６１
（１９８４）］ 、及び変異誘発後に得られる改変さ
れたループを記述する。
表されたｃＤＮＡポリオゲノムから相補性塩基を組合せ
ることによって予想されるループ［トヨダら、Ｊ モル
・パイオル（Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、１７４．５６１
（１９８４）］ 、及び変異誘発後に得られる改変さ
れたループを記述する。
第２図は細胞のマウス・リボソームＲＮＡと相補性を有
する７５００ｂ、ｐ、のポリオウィルス・ゲノムの系統
的記述である［マツツクルア（ＭｃＣｌｕｒｅ）及びベ
ロウルト（Ｐｅｒｒａｕｌｔ） 、ヌクレイツク・アシ
ツズ・Ｌ、ス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、）、１３．６７９７〜６８１６ （＋９８５）］。
する７５００ｂ、ｐ、のポリオウィルス・ゲノムの系統
的記述である［マツツクルア（ＭｃＣｌｕｒｅ）及びベ
ロウルト（Ｐｅｒｒａｕｌｔ） 、ヌクレイツク・アシ
ツズ・Ｌ、ス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、）、１３．６７９７〜６８１６ （＋９８５）］。
第３図は公表された２８３ラツト・リボソーム配列［ゲ
ンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ） 、ｒヌクレオチド・／−
ケンソーズ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ）ｊ、１１２４３ （１９８５）、オックスフォード
出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ）］の、ポリオｃＤＮ
Ａ配列（トヨダら、上ｌｆ！Ｓ）との相互作用を記述す
る。
ンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ） 、ｒヌクレオチド・／−
ケンソーズ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ）ｊ、１１２４３ （１９８５）、オックスフォード
出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ）］の、ポリオｃＤＮ
Ａ配列（トヨダら、上ｌｆ！Ｓ）との相互作用を記述す
る。
第４図は弱体化した種すヒン（Ｓａｂｉｎ） ３のＲＮ
Ａ配列において保存されたＤＮＡ配列領域Ａ及びＢを記
述する。
Ａ配列において保存されたＤＮＡ配列領域Ａ及びＢを記
述する。
第５図は弱体化された種すビン１のＲＮＡ配列における
２つの特定部位突然変異を記述する。
２つの特定部位突然変異を記述する。
第６図は弱体化された種すヒン２のＲＮＡ配列こおける
４つの特定部位突然変異を記述する。
４つの特定部位突然変異を記述する。
第７図は弱体化された種すビン３のＲＮＡ配列における
３つの特定部位突然変異を記述する。
３つの特定部位突然変異を記述する。
第８図は人間の２８５ ｒＲＮＡと相補性を有さない
領域における弱体化されたサビン種Ｌ ２及び３のＲＮ
Ａ配列の特定部位突然変異を記述する。
領域における弱体化されたサビン種Ｌ ２及び３のＲＮ
Ａ配列の特定部位突然変異を記述する。
本発明は非常に弱体化されたＲＮＡウィルス種の生産法
に関する。本発明で定義されるように弱体化されたＲＮ
Ａウィルス種は低下した転写又は翻訳能力を有し、この
結果ウィルスの複製が遅くなる。新しいウィルス個体群
の発生が遅くなるから、病気を引き起こすウィルス変種
を産生ずる先祖返りの可能性が少くなる。
に関する。本発明で定義されるように弱体化されたＲＮ
Ａウィルス種は低下した転写又は翻訳能力を有し、この
結果ウィルスの複製が遅くなる。新しいウィルス個体群
の発生が遅くなるから、病気を引き起こすウィルス変種
を産生ずる先祖返りの可能性が少くなる。
上述したように、本発明の最初の具体例において、ウィ
ルスＲＮＡゲノムを、それ自体に対する塩基対合を増大
又は減少させることによって変更した。改変されるウィ
ルスＲＮＡはそのゲノムのループ領域に位置する。塩基
−塩基相互作用に誘導されるこれらのループには結合し
てない及び結合した塩基残基が存在する。本発明者は下
記の方法に従い、結合してない塩基を、他の結合してな
い塩基と相補性を有する塩基で代替することを選択する
。本発明者は理論には束縛されたくはないが、塩基対合
の増加がウィルスＲＮＡの折りたたみを安定化し、これ
が順次転写又は翻訳のための巻き戻しをより困難にして
いると考えている。更に本発明物は改変された塩基対合
がウィルスＲＮＡの２次構造を変化させ、この結果それ
が転写又は翻訳中に宿主リボソームに結合するのを妨害
し或いは先祖返りを防止しているとも考えている。
ルスＲＮＡゲノムを、それ自体に対する塩基対合を増大
又は減少させることによって変更した。改変されるウィ
ルスＲＮＡはそのゲノムのループ領域に位置する。塩基
−塩基相互作用に誘導されるこれらのループには結合し
てない及び結合した塩基残基が存在する。本発明者は下
記の方法に従い、結合してない塩基を、他の結合してな
い塩基と相補性を有する塩基で代替することを選択する
。本発明者は理論には束縛されたくはないが、塩基対合
の増加がウィルスＲＮＡの折りたたみを安定化し、これ
が順次転写又は翻訳のための巻き戻しをより困難にして
いると考えている。更に本発明物は改変された塩基対合
がウィルスＲＮＡの２次構造を変化させ、この結果それ
が転写又は翻訳中に宿主リボソームに結合するのを妨害
し或いは先祖返りを防止しているとも考えている。
塩基対合の減少も２次構造を変化させ、転写又は翻訳能
力の妨害をもたらすことができる。これらの妨害は転写
又は翻訳の能力を減少させ、従ってウィルスの産生が減
少する。従って本発明の方法によって改変されたウィル
ス種は、元の又は他の未改変の種と比べて複製及び先祖
返りの速度が低下していることが特色である。病気を誘
発しうる能力のあるウィルス変種のいずれかを産生ずる
速度か低下しているから、より多くの弱体化された種が
生成する。
力の妨害をもたらすことができる。これらの妨害は転写
又は翻訳の能力を減少させ、従ってウィルスの産生が減
少する。従って本発明の方法によって改変されたウィル
ス種は、元の又は他の未改変の種と比べて複製及び先祖
返りの速度が低下していることが特色である。病気を誘
発しうる能力のあるウィルス変種のいずれかを産生ずる
速度か低下しているから、より多くの弱体化された種が
生成する。
更に本発明の第２の具体例として上述したように、ウィ
ルスＲＮＡゲノムは宿主リボソームＲＮＡと相補性を含
む領域において改変されて、非常に弱体化されたウィル
スを与える。この種の改変はウィルスＲＮ Ａ及び宿主
リボソームＲＮ Ａ間の塩基対合の増加を含む。また本
発明者は宿主リボソームＲＮＡと相補性を含まない領域
における塩基対合によっても改変する。更に上述した本
発明の両具体例はこれを組合せて、即ちＲＮＡウィルス
・ゲノムのそれ自体への塩基対合を増加又は減少させて
及び宿主リボソームＲＮ Ａと相補性を含むウィルスＲ
ＮＡの領域に相当するＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡのリボ
ソームＲＮＡへの塩基対合を増加又は減少させて行なわ
れる。本発明者はこれらの変更が翻訳の能力も妨害し、
この結果いずれが活発なウィルス変種の産生を低下させ
るものと考える。
ルスＲＮＡゲノムは宿主リボソームＲＮＡと相補性を含
む領域において改変されて、非常に弱体化されたウィル
スを与える。この種の改変はウィルスＲＮ Ａ及び宿主
リボソームＲＮ Ａ間の塩基対合の増加を含む。また本
発明者は宿主リボソームＲＮＡと相補性を含まない領域
における塩基対合によっても改変する。更に上述した本
発明の両具体例はこれを組合せて、即ちＲＮＡウィルス
・ゲノムのそれ自体への塩基対合を増加又は減少させて
及び宿主リボソームＲＮ Ａと相補性を含むウィルスＲ
ＮＡの領域に相当するＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡのリボ
ソームＲＮＡへの塩基対合を増加又は減少させて行なわ
れる。本発明者はこれらの変更が翻訳の能力も妨害し、
この結果いずれが活発なウィルス変種の産生を低下させ
るものと考える。
更に本発明は本発明の非常に弱体化したＲＮＡウィルス
を生産する方法に関する。本方法の好適な具体例におい
て、本発明者はいずれかの細胞のかすを除去するために
ウィルスを精製し、続いてラカニエロ（Ｒａｃａｎ ｉ
ｅ Ｉ ｌｏ）らの方法に従って全長のウィルス二重ス
トランドｃＤＮＡを合成［Ｖ。
を生産する方法に関する。本方法の好適な具体例におい
て、本発明者はいずれかの細胞のかすを除去するために
ウィルスを精製し、続いてラカニエロ（Ｒａｃａｎ ｉ
ｅ Ｉ ｌｏ）らの方法に従って全長のウィルス二重ス
トランドｃＤＮＡを合成［Ｖ。
Ｒ，ラカニエロら、「ポリオウィルスｃＤＮＡの分子ク
ローニング及びウィルス・ゲノムの完全ヌクレオチド配
列の決定」、ブロク・ナッル・アヵド・サイ（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｕ 、 Ｓ
、 Ａ 。
ローニング及びウィルス・ゲノムの完全ヌクレオチド配
列の決定」、ブロク・ナッル・アヵド・サイ（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｕ 、 Ｓ
、 Ａ 。
７８．４８８７ （１９８１，）］。次に本発明の第１
の具体例により、ＲＮＡウィルス・ゲノムのループ構造
中のＲＮＡ塩基に相当するＲＮＡウィルスｃＤＮＡを、
塩基対合を増大又は減少させる通常の技術を用いて突然
変異させる。また本発明の第２の具体例により、宿主リ
ボソームＲＮ Ａと相補性を含むウィルスＲＮＡの領域
に相当するＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡを突然変異させて
、ＲＮＡゲノム及びリボソームＲＮＡ間の塩基対合を増
大又は減少させる。そして本発明の第３の具体例により
、第１及び第２の具体例による両種の変異誘発を一緒に
行なう。
の具体例により、ＲＮＡウィルス・ゲノムのループ構造
中のＲＮＡ塩基に相当するＲＮＡウィルスｃＤＮＡを、
塩基対合を増大又は減少させる通常の技術を用いて突然
変異させる。また本発明の第２の具体例により、宿主リ
ボソームＲＮ Ａと相補性を含むウィルスＲＮＡの領域
に相当するＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡを突然変異させて
、ＲＮＡゲノム及びリボソームＲＮＡ間の塩基対合を増
大又は減少させる。そして本発明の第３の具体例により
、第１及び第２の具体例による両種の変異誘発を一緒に
行なう。
変異誘発後、ＲＮＡを産生しうる細胞例えばＣｖ−１、
ベロ、又はヘラ細胞を、通常の技術を用いてｃＤＮＡで
トランスフェクションする。次に生活ウィルスを公知の
方法を用いて検出し、そして公知の技術によって配列を
知り、ＲＮＡウィルス配列が突然変異したｃＤＮＡ配列
に相当するがどうかを決定する。最後に、弱体化の程度
を決定する。本発明の好適な方法は、突然変異したポリ
オｃＤＮＡ （サヒンｌ、２、又は３）及びマウスにお
ける感染に必要な配列を含むキメラｃ ＤＮＡを生産す
る［ケレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、［ポリオウィルス宿主
領域は中性化抗原部位−■における短いアミノ酸配列に
よって決定されるｊ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２４１．２１３−１５ （１９８８）］。
ベロ、又はヘラ細胞を、通常の技術を用いてｃＤＮＡで
トランスフェクションする。次に生活ウィルスを公知の
方法を用いて検出し、そして公知の技術によって配列を
知り、ＲＮＡウィルス配列が突然変異したｃＤＮＡ配列
に相当するがどうかを決定する。最後に、弱体化の程度
を決定する。本発明の好適な方法は、突然変異したポリ
オｃＤＮＡ （サヒンｌ、２、又は３）及びマウスにお
ける感染に必要な配列を含むキメラｃ ＤＮＡを生産す
る［ケレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、［ポリオウィルス宿主
領域は中性化抗原部位−■における短いアミノ酸配列に
よって決定されるｊ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２４１．２１３−１５ （１９８８）］。
このキメラ・プラスミドから作られたそのようなウィル
スを用いて、マウスの神経毒性試験を行なう。他の可能
な方法は、３５ｓ−メチオニンで標識したウィルス蛋白
の生産速度を測定する分析を用いる。
スを用いて、マウスの神経毒性試験を行なう。他の可能
な方法は、３５ｓ−メチオニンで標識したウィルス蛋白
の生産速度を測定する分析を用いる。
本発明のＲＮＡウィルス種は、生ワクチンを製造する公
知の方法を用いることによりワクチンに使用することが
できる。得られるワクチンはウィルス感染から保護され
る受容者に仔効な量の生活ウィルスを含有しよう。これ
らのワクチンの投与（」、通常認められている生ワクチ
ンの投与法のいずＨ秒）によって行ないうる。本発明を
更に良く理解するために、次の実施例を示す。この実施
例は例示だけの目的であり、本発明の範囲を限定するも
のと見なされるべきでない。
知の方法を用いることによりワクチンに使用することが
できる。得られるワクチンはウィルス感染から保護され
る受容者に仔効な量の生活ウィルスを含有しよう。これ
らのワクチンの投与（」、通常認められている生ワクチ
ンの投与法のいずＨ秒）によって行ないうる。本発明を
更に良く理解するために、次の実施例を示す。この実施
例は例示だけの目的であり、本発明の範囲を限定するも
のと見なされるべきでない。
実 施 例
１、ウィルスの精製
本発明者は、Ａ、サヒンら、「ポリオミエリチス・ウィ
ルスの変種に関する研究」、Ｊ、イクスブ・メト（Ｅｘ
ｐ、 Ｍｅｄ、）、９９．５５１ （１９５４）に記述
されている培養条件で保持された（Ｆ、Ｄ。
ルスの変種に関する研究」、Ｊ、イクスブ・メト（Ｅｘ
ｐ、 Ｍｅｄ、）、９９．５５１ （１９５４）に記述
されている培養条件で保持された（Ｆ、Ｄ。
Ａ、かも入手の）ポリオウィルスを使用した。特に本発
明者は低感染複数回で主にサルの腎臓組織に感染し、そ
してウィルスをｐｌ（７，３，３４°Ｃで培養した。い
ずれかの細胞かすを除去するために、その種を含有する
収穫した液体を低速（２０Ｑ Ｑ ｒｐｍで２０分間）
下に遠心分離した。次いでＮ ａ ＣＩ （０，１２Ｍ
）及びポリエチレングリコール８０００ （１２重量％
）を添加し、続いて４°Ｃで終夜撹拌することによって
ウィルスを沈澱させｌ二。この沈澱しｔこウィルスを１
０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって集めた
。
明者は低感染複数回で主にサルの腎臓組織に感染し、そ
してウィルスをｐｌ（７，３，３４°Ｃで培養した。い
ずれかの細胞かすを除去するために、その種を含有する
収穫した液体を低速（２０Ｑ Ｑ ｒｐｍで２０分間）
下に遠心分離した。次いでＮ ａ ＣＩ （０，１２Ｍ
）及びポリエチレングリコール８０００ （１２重量％
）を添加し、続いて４°Ｃで終夜撹拌することによって
ウィルスを沈澱させｌ二。この沈澱しｔこウィルスを１
０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって集めた
。
ウィルスのベレットを、全容ｉｔ１．２ｍＱのＴＮＥ（
ＩＯｍＭ ト リ ス − ＨＣＩ 、 ｌ
ＯＯｍＭ ＮａＣｌ。
ＩＯｍＭ ト リ ス − ＨＣＩ 、 ｌ
ＯＯｍＭ ＮａＣｌ。
１ｍＭ ＥＤＴＡ％ｐＨ８，０）に再懸濁させた後、最
終濃度が１重量％となるまでモニデット（ＭＯＮＩＤＥ
Ｔ）Ｐ−４０を添加した。次にウィルスを１５〜４５％
スクロース・グラジェント上に置き ［Ｐ。
終濃度が１重量％となるまでモニデット（ＭＯＮＩＤＥ
Ｔ）Ｐ−４０を添加した。次にウィルスを１５〜４５％
スクロース・グラジェント上に置き ［Ｐ。
Ｐ、ミノ−（Ｍｉｎｏｒ）、「３型ポリオウィルスの比
較生化学的研究」、Ｊ、ピロル（Ｖｉｒｏｌ、）、３４
．７３（１９８０）］、それを５Ｗ２８．１０−タ中で
１２，３００ｒｐｍ下に１６時間広げた。次いでグラジ
ェントの一番上から１ｍＱの両分を集めた。各試料から
２５μＱの試料を採取し、不連続の１５％ポリアクリル
アミドゲル上で展開した。ゲルを銀で染色することによ
りゲル内のカプシド蛋白質を肉眼で見えるようにするこ
とによってポリオウィルスを画分中に位置させた［Ｗ、
レイ（Ｗｒａｙ）ら、「ポリアクリルアミドゲル中の
蛋白質の銀染色」、アナリ・バイオケム（Ａｎａｌｙ、
Ｂｉｏｃｈ、）、１１８、＋９７ （１９８１）］。
較生化学的研究」、Ｊ、ピロル（Ｖｉｒｏｌ、）、３４
．７３（１９８０）］、それを５Ｗ２８．１０−タ中で
１２，３００ｒｐｍ下に１６時間広げた。次いでグラジ
ェントの一番上から１ｍＱの両分を集めた。各試料から
２５μＱの試料を採取し、不連続の１５％ポリアクリル
アミドゲル上で展開した。ゲルを銀で染色することによ
りゲル内のカプシド蛋白質を肉眼で見えるようにするこ
とによってポリオウィルスを画分中に位置させた［Ｗ、
レイ（Ｗｒａｙ）ら、「ポリアクリルアミドゲル中の
蛋白質の銀染色」、アナリ・バイオケム（Ａｎａｌｙ、
Ｂｉｏｃｈ、）、１１８、＋９７ （１９８１）］。
ポリオウィルスを含むスクロース画分を集め、ドデンル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度０．５％まで添加
した。次いでこの集めたスクロース画分から、フェノー
ル、クロロホルム及ヒイソアミルアルコール（２５：２
、＝１： ｌ ）の混合物の同容量でウィルスを１回
抽出し、そしてこのフェノールを１回逆抽出した。
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度０．５％まで添加
した。次いでこの集めたスクロース画分から、フェノー
ル、クロロホルム及ヒイソアミルアルコール（２５：２
、＝１： ｌ ）の混合物の同容量でウィルスを１回
抽出し、そしてこのフェノールを１回逆抽出した。
水性層を集め、７−５Ｍ酢酸アンモニウム０．５容量を
添加した。無水エタノール２．５容量を用い且′つ一７
０’Ｃで終夜凍結することにより、ポリオウィルスＲＮ
Ａを沈澱させた。後にこのＲＮＡのベレットを、ジエチ
ルビロカーポ不一ト（ＤＥＰ）で予め処理した注射用の
水に再懸濁させ、無水エタノール２．５容量を添加する
ことによってＲＮＡを再沈澱さセた。ＲＮＡを再びベレ
ットにし且つ水冷した７０％エタノールで２回洗浄した
後、最終のＲＮＡベレットを、ＤＥＰで処理したＷＦ＋
２０ＩＩ（ｌに再び懸濁させた。次にサンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）の方法［サンガーら、［連鎖停止禁止剤を用い
るＤＮＡの配列決定」、ブロク・ナトル・アカド・サイ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１２． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
）Ｕ Ｓ Ａ。
添加した。無水エタノール２．５容量を用い且′つ一７
０’Ｃで終夜凍結することにより、ポリオウィルスＲＮ
Ａを沈澱させた。後にこのＲＮＡのベレットを、ジエチ
ルビロカーポ不一ト（ＤＥＰ）で予め処理した注射用の
水に再懸濁させ、無水エタノール２．５容量を添加する
ことによってＲＮＡを再沈澱さセた。ＲＮＡを再びベレ
ットにし且つ水冷した７０％エタノールで２回洗浄した
後、最終のＲＮＡベレットを、ＤＥＰで処理したＷＦ＋
２０ＩＩ（ｌに再び懸濁させた。次にサンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）の方法［サンガーら、［連鎖停止禁止剤を用い
るＤＮＡの配列決定」、ブロク・ナトル・アカド・サイ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１２． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
）Ｕ Ｓ Ａ。
７４．５４６３ （１９７３）］ に従い、ＲＮ 、Ａ
での改変及びＲＮＡテンプレートと関連した２次構造に
関する問題［Ｄ、Ｃ，デボード（ＤｅＢｏｒｄｅ）ら、
「末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼに
よる通常のＲＮＡ配列規則の決定」、アナリ・バイオケ
ム、１５７．２７５（１９８６）］を用いてＲＮＡの配
列を決定した。例えば末端デオキ／ヌクレオチジル・ト
ランスフェラーゼを用いて２次構造のための人為構造を
排除した。
での改変及びＲＮＡテンプレートと関連した２次構造に
関する問題［Ｄ、Ｃ，デボード（ＤｅＢｏｒｄｅ）ら、
「末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼに
よる通常のＲＮＡ配列規則の決定」、アナリ・バイオケ
ム、１５７．２７５（１９８６）］を用いてＲＮＡの配
列を決定した。例えば末端デオキ／ヌクレオチジル・ト
ランスフェラーゼを用いて２次構造のための人為構造を
排除した。
２ 全長ポリオウィルス２重
ストランドｃＤＮＡの合成
二重ストランドｃＤＮＡの合成に対して、上記工程から
のＲＮＡをテンプレートとして用いた［ラカニエロら、
１掲１゜ポスウェル（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ） ラのオリゴ
（ｄン）、オリゴ（ｄＣ）テーリング法［Ａ。
のＲＮＡをテンプレートとして用いた［ラカニエロら、
１掲１゜ポスウェル（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ） ラのオリゴ
（ｄン）、オリゴ（ｄＣ）テーリング法［Ａ。
Ｌ、Ｍ、ボスウェル、セル（Ｃｅｌｌ）、２４．６２５
（１９８１）］ を用いて、プラスミドｐＢＲ３２２の
ＰｓＬｌｆｌＷ位中に二重ストランドｃ Ｄ Ｎ Ａを
挿入シた。コロニー・ハイブリッド形成により、ポリオ
ウィルスｃＤＮＡプローブを用いて耐テトランクリン性
クローンを挿入物に関して選別した［Ｍ、グルンスタイ
ン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、ブロク・ナトル・アカド
・サイ ＵＳＡ、７２．３９６１（１９７５）］。ヌク
レオチド配列分析及びレストリクジョン（ｒｅｓｔｒｉ
ｃｔｉｏｎ）酵素マツピング技術を用いることにより、
挿入物をウィルス・ゲノム上に配置した（Ｖ、 Ｒラカ
ニセロら、１掲）。
（１９８１）］ を用いて、プラスミドｐＢＲ３２２の
ＰｓＬｌｆｌＷ位中に二重ストランドｃ Ｄ Ｎ Ａを
挿入シた。コロニー・ハイブリッド形成により、ポリオ
ウィルスｃＤＮＡプローブを用いて耐テトランクリン性
クローンを挿入物に関して選別した［Ｍ、グルンスタイ
ン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、ブロク・ナトル・アカド
・サイ ＵＳＡ、７２．３９６１（１９７５）］。ヌク
レオチド配列分析及びレストリクジョン（ｒｅｓｔｒｉ
ｃｔｉｏｎ）酵素マツピング技術を用いることにより、
挿入物をウィルス・ゲノム上に配置した（Ｖ、 Ｒラカ
ニセロら、１掲）。
最後に部分的なポリオウィルスｃＤＮＡクローンを、そ
の通常の開裂部位において単一の全長クローン中に結合
させた［ラカニセロら、「クローン処理したポリオウィ
ルスｃＤＮＡは哺乳動物細胞中で感染性である」サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１４．９１５ （＋９８１
））。
の通常の開裂部位において単一の全長クローン中に結合
させた［ラカニセロら、「クローン処理したポリオウィ
ルスｃＤＮＡは哺乳動物細胞中で感染性である」サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１４．９１５ （＋９８１
））。
３、ポリオウィルスの変異誘発
本発明の最初の具体例に従い、結合してない塩基に（１
１当する前工程からのポリオウィルスｃＤＮＡ並びにそ
のウィルスゲノムの幹及びループ構造を突然変異させて
、ゲノムのループ或いはループ以外の線状部分に位置す
る他の結合してない塩基対合を増大させた。
１当する前工程からのポリオウィルスｃＤＮＡ並びにそ
のウィルスゲノムの幹及びループ構造を突然変異させて
、ゲノムのループ或いはループ以外の線状部分に位置す
る他の結合してない塩基対合を増大させた。
結合してない塩基対合を突然変異させ不ための手段とし
て、Ｍ１３法を用いることによりポリオウィルスｃＤＮ
Ａの部位に向いた変異誘発を利用した［Ｃ，Ａ、 ブチ
ンサン（Ｂｕｔｃｈｉｎｓｏｎ） ｎ［ら、ｒＤＮＡ配
列における特別な位置での変異誘発」、Ｊ、パイオル・
ケム（Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２５３．６５５ （
１９７８）；Ａ、ジョン（Ｒａｚ ｉｎ）ら、「化学合
成したＤＮＡを用いることによる突然変異の効果的な修
復」、ブロク・ナトル・アカド・サイＵＳＡ、、７５、
４２６８ （１９７８）］ 。
て、Ｍ１３法を用いることによりポリオウィルスｃＤＮ
Ａの部位に向いた変異誘発を利用した［Ｃ，Ａ、 ブチ
ンサン（Ｂｕｔｃｈｉｎｓｏｎ） ｎ［ら、ｒＤＮＡ配
列における特別な位置での変異誘発」、Ｊ、パイオル・
ケム（Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２５３．６５５ （
１９７８）；Ａ、ジョン（Ｒａｚ ｉｎ）ら、「化学合
成したＤＮＡを用いることによる突然変異の効果的な修
復」、ブロク・ナトル・アカド・サイＵＳＡ、、７５、
４２６８ （１９７８）］ 。
第１図は結合してない塩基を有するポリオゲノムのｃＤ
ＮＡの幹及びループ構造を示す。塩基対合を増加させる
ために、３９７−位のアデニン塩基の塩基対合を、結合
してないグアニンに結合させるためにシトシン塩基で置
き換えた。他の結合してない塩基は、塩基対合を増加さ
せるためにこの方法で置換することができた。
ＮＡの幹及びループ構造を示す。塩基対合を増加させる
ために、３９７−位のアデニン塩基の塩基対合を、結合
してないグアニンに結合させるためにシトシン塩基で置
き換えた。他の結合してない塩基は、塩基対合を増加さ
せるためにこの方法で置換することができた。
本発明の第２の具体例に従い、ラットのリボソームＲＮ
Ａと相補性を有する領域に相当するポリオウィルスｃ
ＤＮＡを、ポリオウィルスのゲノム及びラットのリボソ
ームＲＮＡ間の塩基対合を増加或いは減少させることに
よって突然変異させｌ；。
Ａと相補性を有する領域に相当するポリオウィルスｃ
ＤＮＡを、ポリオウィルスのゲノム及びラットのリボソ
ームＲＮＡ間の塩基対合を増加或いは減少させることに
よって突然変異させｌ；。
第２図に示すように、ポリオ・ゲノムの領域は細胞のマ
ウスのＲＮＡと結合することが示されている。この領域
内には、ラットのリボソームＲＮＡと相補性を有する配
列が存在する（参照第３図）。
ウスのＲＮＡと結合することが示されている。この領域
内には、ラットのリボソームＲＮＡと相補性を有する配
列が存在する（参照第３図）。
これらの配列の中の塩基残基を、ラットのリボソームＲ
ＮＡとの塩基対合を増加又は減少させるために上記方法
によって突然変異した。
ＮＡとの塩基対合を増加又は減少させるために上記方法
によって突然変異した。
次に人間の２８Ｓ ｒＲＮＡと相互作用させた後、ウ
ィルスのＲＮＡゲノム中の幹及びループ構造に相当する
配列を決定した。最初に、ポリオ配列及び公表されてい
るコクサラキー及びリノウィルス配列を含むピコルナウ
ィルス５′の翻訳されてない領域の配列を整列した。こ
の配置はりベラ（Ｒｉｖｅｒａ）ら、［エンテロウィル
ス及びリノウィルスの５′のコードのない領域の比較配
列分析」、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１６５
．４２〜５０（１９８８）］の配置と同様であった。保
存されている配列の４つの主なブロックを観察した後、
保存された配列の２つのブロック、即ち第４図に示す如
きポリオウィルスの弱体化した種３の塩基５３９〜５６
５を含む領域Ａ及び塩基４４９〜４７１を含む領域Ｂに
焦点を当てることに決めた。
ィルスのＲＮＡゲノム中の幹及びループ構造に相当する
配列を決定した。最初に、ポリオ配列及び公表されてい
るコクサラキー及びリノウィルス配列を含むピコルナウ
ィルス５′の翻訳されてない領域の配列を整列した。こ
の配置はりベラ（Ｒｉｖｅｒａ）ら、［エンテロウィル
ス及びリノウィルスの５′のコードのない領域の比較配
列分析」、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１６５
．４２〜５０（１９８８）］の配置と同様であった。保
存されている配列の４つの主なブロックを観察した後、
保存された配列の２つのブロック、即ち第４図に示す如
きポリオウィルスの弱体化した種３の塩基５３９〜５６
５を含む領域Ａ及び塩基４４９〜４７１を含む領域Ｂに
焦点を当てることに決めた。
次に第１表に示す如く領域Ａ及びＢの双方の一部分に相
補性の人間の２８３ ｒＲＮＡの５つの隣接する配列
が発見された。
補性の人間の２８３ ｒＲＮＡの５つの隣接する配列
が発見された。
第１表
保存されたポリオウィルス領域に相補性の２８Ｓ ｒ
ＲＮＡの領域 相補性配列範囲 領域 Ａ Ｂ １ ３４５４−３４７４ ３４７７−３４９６
２ ３９４０−３９６２ ３９６７−３９８３
３ １３０１−１３２０ １３２９−１３４６
４ ３１７１−３１９０ ３１９１３２１５５
４０５２−４０７４ ４０７５−４０９３２
８Ｓ ｒＲＮＡと相互作用する保存された領域Ａ及び
Ｂ間のポリオウィルス塩基の配列は本発明によれば幹及
びループＲＮＡ構造を形成する。これらのノーケンスは
本発明の第１の具体例により、突然変異で構造内の塩基
対合を増大又は減少させｊユ 。
ＲＮＡの領域 相補性配列範囲 領域 Ａ Ｂ １ ３４５４−３４７４ ３４７７−３４９６
２ ３９４０−３９６２ ３９６７−３９８３
３ １３０１−１３２０ １３２９−１３４６
４ ３１７１−３１９０ ３１９１３２１５５
４０５２−４０７４ ４０７５−４０９３２
８Ｓ ｒＲＮＡと相互作用する保存された領域Ａ及び
Ｂ間のポリオウィルス塩基の配列は本発明によれば幹及
びループＲＮＡ構造を形成する。これらのノーケンスは
本発明の第１の具体例により、突然変異で構造内の塩基
対合を増大又は減少させｊユ 。
今や第５〜７図を参照すると、サビン１，２及び３の弱
体化したウィルスのウィルス配列により形成される２８
Ｓ ｒＲＮＡとの相補性を有する保存された領域Ａ及
びＢ間のＲＮＡの幹及びループの構造が示される。本発
明の第１の具体例に従い結合してない塩基のＲＮＡ−Ｒ
ＮＡ結合を増大させ或いはすでに結合しｔ：塩基の安定
性を増大させるために、種々のＲＮＡ塩基の交換が示さ
れている。他の結合してない塩基の対合を増大又は減少
させるためにこのようにして置換することがで他に２８
３ ｒＲＮＡとの相補性を有する保存された領域Ａ及
びＢ内のポリオウィルスの塩基配列を、本発明の第２の
具体例に従って突然変異させた。これらの領域内のポリ
オウィルス塩基配列は２８Ｓ ｒＲＮＡに殆んど結合
し、これによって相補性構造を形成した。結合した塩基
の数は第２の具体例に従って減少した。他に２８３
ｒＲＮＡと相補性を有さない結合してない塩基は保存さ
れた領域Ａ及びＢ内に存在した。これらの塩基を突然変
異させて、これと２８３ ｒＲＮＡとの間の塩基対合
を増加させた。例えばウィルス・ゲノム及び２８Ｓ
ｒＲＮＡ間の塩基対合を増大させるために、ウィルス・
ゲノムの領域Ａにおける単一の塩基５４１を第８図に示
すように置換した。
体化したウィルスのウィルス配列により形成される２８
Ｓ ｒＲＮＡとの相補性を有する保存された領域Ａ及
びＢ間のＲＮＡの幹及びループの構造が示される。本発
明の第１の具体例に従い結合してない塩基のＲＮＡ−Ｒ
ＮＡ結合を増大させ或いはすでに結合しｔ：塩基の安定
性を増大させるために、種々のＲＮＡ塩基の交換が示さ
れている。他の結合してない塩基の対合を増大又は減少
させるためにこのようにして置換することがで他に２８
３ ｒＲＮＡとの相補性を有する保存された領域Ａ及
びＢ内のポリオウィルスの塩基配列を、本発明の第２の
具体例に従って突然変異させた。これらの領域内のポリ
オウィルス塩基配列は２８Ｓ ｒＲＮＡに殆んど結合
し、これによって相補性構造を形成した。結合した塩基
の数は第２の具体例に従って減少した。他に２８３
ｒＲＮＡと相補性を有さない結合してない塩基は保存さ
れた領域Ａ及びＢ内に存在した。これらの塩基を突然変
異させて、これと２８３ ｒＲＮＡとの間の塩基対合
を増加させた。例えばウィルス・ゲノム及び２８Ｓ
ｒＲＮＡ間の塩基対合を増大させるために、ウィルス・
ゲノムの領域Ａにおける単一の塩基５４１を第８図に示
すように置換した。
４、細胞の、突然変異した
ポリオウィルス・クローンでの
トランス７エクシヨン
ポリオウィルスｃＤＮＡを突然変異させた後、ＲＮＡを
産生しうる宿主細胞例えばベロ（ＶＥＲＯ）又はヘラ（
ＨｅＬａ）細胞をプラスミドｃＤＮＡとトランスフェク
ションした。トランスフェクションは、宿主細胞を電気
泳動で九理してそのｃＤＮＡの捕捉を助けること［プロ
メガ（ＰｒｏＩｌｌｅｇａ、 Ｍｅｄｉｓｏｎ。
産生しうる宿主細胞例えばベロ（ＶＥＲＯ）又はヘラ（
ＨｅＬａ）細胞をプラスミドｃＤＮＡとトランスフェク
ションした。トランスフェクションは、宿主細胞を電気
泳動で九理してそのｃＤＮＡの捕捉を助けること［プロ
メガ（ＰｒｏＩｌｌｅｇａ、 Ｍｅｄｉｓｏｎ。
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）からの装置］により改変したカル
シウム−ホスフェート技術［Ｂ、Ａ、バーカー（Ｐａｒ
ｋｅｒ）、Ｊ、バ・イロル（Ｖｉｒｏｌ、）、１↓、３
６０（１９７９）を用いて行なった。
シウム−ホスフェート技術［Ｂ、Ａ、バーカー（Ｐａｒ
ｋｅｒ）、Ｊ、バ・イロル（Ｖｉｒｏｌ、）、１↓、３
６０（１９７９）を用いて行なった。
５、生活ポリオウィルスの検出
突然変異させたポリオｃＤＮＡのトランスフエタンコン
後に、細胞病理効果（ＣＰＥ）［Ｔ、Ｈ。
後に、細胞病理効果（ＣＰＥ）［Ｔ、Ｈ。
ドン不バツカー（Ｄｏｎｎｅｂａｃｋｅｒ）、「細胞病
理的変化の段階と小児マヒウィルスの遊離との関係」、
パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２．３９９（１９
５６）］とも呼はれる細胞溶解によりポリオウィルスの
活性な産生を探すことによって検出した。ＲＮＡウィル
ス配列が突然変異させたｃＤＮＡ配列に相当するという
ことを確かめるために、ＲＮＡゲノムをサンガーらの方
法（１掲）に従って配列を決め！二 。
理的変化の段階と小児マヒウィルスの遊離との関係」、
パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２．３９９（１９
５６）］とも呼はれる細胞溶解によりポリオウィルスの
活性な産生を探すことによって検出した。ＲＮＡウィル
ス配列が突然変異させたｃＤＮＡ配列に相当するという
ことを確かめるために、ＲＮＡゲノムをサンガーらの方
法（１掲）に従って配列を決め！二 。
６ 弱体化の程度の決定
ウィルス蛋白質の産生速度を弱体化に対する分析として
使用し、現在使用されているサビン種と本発明の種を比
較した。ウィルス蛋白質を３５Ｓ−メチオニンの存在下
に標識し、蛋白質生成物を５ｂｓ−ポリアクリルアミド
電気泳動により分離し、次いでゲルの自動放射線分析及
び掃引分析により、ウィルス蛋白質の異なる量並びに宿
主蛋白質合成の禁止の程度を決定した。
使用し、現在使用されているサビン種と本発明の種を比
較した。ウィルス蛋白質を３５Ｓ−メチオニンの存在下
に標識し、蛋白質生成物を５ｂｓ−ポリアクリルアミド
電気泳動により分離し、次いでゲルの自動放射線分析及
び掃引分析により、ウィルス蛋白質の異なる量並びに宿
主蛋白質合成の禁止の程度を決定した。
他の方法はマウスの神経毒性試験において弱体化の程度
を検出した。マウスにおいて感染性を誘起しうるｃＤＮ
Ａ配列［ムレ−ら、１掲］と組合せた本発明の具体例の
いずれかに従って突然変異させたポリオｃＤＮＡを含む
キメラ・ブセスミドを生成せしめて、マウスの神経毒性
試験において弱体化の程度を検出した。増大した弱体化
又は減少した神経毒性の確認は、現存するワクチン種を
、本発明により新しく作った種とサルの神経毒性試験で
比較することにより決定した（２ＩＣ，Ｆ。
を検出した。マウスにおいて感染性を誘起しうるｃＤＮ
Ａ配列［ムレ−ら、１掲］と組合せた本発明の具体例の
いずれかに従って突然変異させたポリオｃＤＮＡを含む
キメラ・ブセスミドを生成せしめて、マウスの神経毒性
試験において弱体化の程度を検出した。増大した弱体化
又は減少した神経毒性の確認は、現存するワクチン種を
、本発明により新しく作った種とサルの神経毒性試験で
比較することにより決定した（２ＩＣ，Ｆ。
Ｒ６００〜７９９、＋２８７）。
７、生ワクチンの製造
弱体化の分析後、今や選択したウィルス粒子は現種子と
なり、これから子種子を誘導した。例えば現種子をバイ
オ反応器中においてミクロ担体上のベロ細胞に感染させ
、収穫し、そしてワクチンに用いるために精製した。
なり、これから子種子を誘導した。例えば現種子をバイ
オ反応器中においてミクロ担体上のベロ細胞に感染させ
、収穫し、そしてワクチンに用いるために精製した。
以上本発明の多くの具体例を記述してきたけれど、本発
明の基本的な構成分を変えて、本発明の方法及び組成物
を利用する他の具体例を提供しうろことは明白である。
明の基本的な構成分を変えて、本発明の方法及び組成物
を利用する他の具体例を提供しうろことは明白である。
本発明の特徴及び態様を以下に示す。
］、、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離
し す、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； Ｃ６該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡから産生されるＲ
ＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるように
ｃＤＮＡのそれ自体への塩基対合を増大させ ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃ １）
Ｎ Ａでトランスフェクションし；ｅ、該宿主細胞を培
養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、吐乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度か特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
し す、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； Ｃ６該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡから産生されるＲ
ＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるように
ｃＤＮＡのそれ自体への塩基対合を増大させ ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃ １）
Ｎ Ａでトランスフェクションし；ｅ、該宿主細胞を培
養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、吐乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度か特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
２、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
： ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡから産生されるＲ
ＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるように
ｃＤＮＡのそれ自体への塩基対合を減少させ： ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃＤＮＡで
トランスフェクションし。
： ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡから産生されるＲ
ＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるように
ｃＤＮＡのそれ自体への塩基対合を減少させ： ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃＤＮＡで
トランスフェクションし。
ｅ、該宿主細胞を培養し；及び
ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、
ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
３、ＲＮＡウィルス種がポリオウィルスである上記１又
は２の方法。
は２の方法。
４、突然変異させるＲＮＡウィルスｃＤＮＡが第４図の
塩基配列４６８〜５１６に相当する上記３の方法。
塩基配列４６８〜５１６に相当する上記３の方法。
５、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
； ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し： Ｃ３該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡから産生されるＲ
ＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるように
ｃＤＮＡの、哺乳動物宿主からのリボソームＲＮＡへの
塩基対合を増大又は減少させ。
； ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し： Ｃ３該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃ ＤＮＡから産生されるＲ
ＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるように
ｃＤＮＡの、哺乳動物宿主からのリボソームＲＮＡへの
塩基対合を増大又は減少させ。
ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃ Ｄ Ｎ
Ａでトランスフェクションし：ｅ、該宿主細胞を培養
し：及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
Ａでトランスフェクションし：ｅ、該宿主細胞を培養
し：及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
６、ＲＮＡウィルス種がポリオウィルスである上記５の
方法。
方法。
７、該突然変異が５′の翻訳されていない領域において
、塩基配列を挿入し又は除去する上記５の方法。
、塩基配列を挿入し又は除去する上記５の方法。
８ 該誘発変異か第４図における塩基配列４４９〜，１
６０．５４２〜５４５．５４７〜５５１及び５５５〜５
６５に相当する領域での塩基対合を減少させる上記６の
方法。
６０．５４２〜５４５．５４７〜５５１及び５５５〜５
６５に相当する領域での塩基対合を減少させる上記６の
方法。
９、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
： ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し： ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、但し
突然変異が、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生される
Ｒ Ｎ Ａウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させる
ようにｃ ＤＮＡのそれ自体への塩基対合を増大又は減
少させる並びにｃＤＮＡの哺乳動物宿主からのリボソー
ムＲＮＡへの塩基対合を増大及び減少させることを含ん
でなり；ｄ 細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃ
ＤＮＡでトランスフェクションし：ｅ、該宿主細胞を
培養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度か特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
： ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し： ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、但し
突然変異が、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生される
Ｒ Ｎ Ａウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させる
ようにｃ ＤＮＡのそれ自体への塩基対合を増大又は減
少させる並びにｃＤＮＡの哺乳動物宿主からのリボソー
ムＲＮＡへの塩基対合を増大及び減少させることを含ん
でなり；ｄ 細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃ
ＤＮＡでトランスフェクションし：ｅ、該宿主細胞を
培養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度か特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。
１０、ＲＮＡウィルス種がポリオウィルスである上記９
の方法。
の方法。
１１、処置した患者に関して、患者をＲＮＡウィルス感
染から保護するのに効果的なり価でＲＮＡウィルス抗原
に対する抗体の生成を誘導する、毒性への先祖返りの能
力の低いワクチン。
染から保護するのに効果的なり価でＲＮＡウィルス抗原
に対する抗体の生成を誘導する、毒性への先祖返りの能
力の低いワクチン。
１２、ＲＮＡウィルス抗原が上記ｌ、２．５又は８の方
法に従って製造されるＲＮＡウィルス種に由来する上記
１１のワクチン。
法に従って製造されるＲＮＡウィルス種に由来する上記
１１のワクチン。
１３、ＲＮＡウィルス種がポリオウィルスである上記１
２のワクチン。
２のワクチン。
第１図は５′無情報領域の塩基３７０及び４７１間の公
表されたｃＤＮＡポリオゲノムから相補性塩基を組合せ
ることによって予想されるループ及び変異誘発後に得ら
れる改変されたループを記述し； 第２図は細胞のマウス・リボソームＲＮＡと相補性を有
する７５００ｂ、ｐ、のポリオウィルス・ゲノムの系統
的記述であり； 第３図は公表された２８３ラツト・リボソーム配列の、
ポリオｃＤＮＡ配列との相互作用を記述し； 第４図は弱体化した種すビン（Ｓａｂｉｎ） ３のＲＮ
Ａ配列において保存されたＤＮＡ配列領域Ａ及びＢを記
述し； 第５図は弱体化された種すヒンｌのＲＮＡ配列における
２つの特定部位突然変異を記述し。 第６図は弱体化された種すビン２のＲＮＡ配列における
４つの特定部位突然変異を記述し；第７図は弱体化され
た種すビン３のＲＮＡ配列における３つの特定部位突然
変異を記述し；そして 第８図は人間の２８Ｓ ｒＲＮＡと相補性を有さない
領域における弱体化されたサビン種ｌ、２、及び３のＲ
ＮＡ配列の特定部位突然変異を記述する。 図面の；予言（内容に変更なし） ＦＩＧ、 Ｉａ ＦＩＧ、７ｂ Ｎ） ｉｉｐイ立 ブ乙ンＺ Ｕ ・ノＦ；づ鷲ζ♂？ミ°つ”Ｚ！ イン１丁簀θゝ 手続初了正書（方式） 平成１年１０月２４日
表されたｃＤＮＡポリオゲノムから相補性塩基を組合せ
ることによって予想されるループ及び変異誘発後に得ら
れる改変されたループを記述し； 第２図は細胞のマウス・リボソームＲＮＡと相補性を有
する７５００ｂ、ｐ、のポリオウィルス・ゲノムの系統
的記述であり； 第３図は公表された２８３ラツト・リボソーム配列の、
ポリオｃＤＮＡ配列との相互作用を記述し； 第４図は弱体化した種すビン（Ｓａｂｉｎ） ３のＲＮ
Ａ配列において保存されたＤＮＡ配列領域Ａ及びＢを記
述し； 第５図は弱体化された種すヒンｌのＲＮＡ配列における
２つの特定部位突然変異を記述し。 第６図は弱体化された種すビン２のＲＮＡ配列における
４つの特定部位突然変異を記述し；第７図は弱体化され
た種すビン３のＲＮＡ配列における３つの特定部位突然
変異を記述し；そして 第８図は人間の２８Ｓ ｒＲＮＡと相補性を有さない
領域における弱体化されたサビン種ｌ、２、及び３のＲ
ＮＡ配列の特定部位突然変異を記述する。 図面の；予言（内容に変更なし） ＦＩＧ、 Ｉａ ＦＩＧ、７ｂ Ｎ） ｉｉｐイ立 ブ乙ンＺ Ｕ ・ノＦ；づ鷲ζ♂？ミ°つ”Ｚ！ イン１丁簀θゝ 手続初了正書（方式） 平成１年１０月２４日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
； ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生されるＲＮ
Ａウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるようにｃ
ＤＮＡのそれ自体への塩基対合を増大させ； ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃＤＮＡで
トランスフェクションし； ｅ、該宿主細胞を培養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。 ２、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
： ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生されるＲＮ
Ａウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるようにｃ
ＤＮＡのそれ自体への塩基対合を減少させ； ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃＤＮＡで
トランスフェクションし； ｅ、該宿主細胞を培養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。 ３、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
； ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、該変
異誘発が該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生されるＲＮ
Ａウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるようにｃ
ＤＮＡの、哺乳動物宿主からのリボソームＲＮＡへの塩
基対合を増大又は減少させ； ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃＤＮＡで
トランスフェクションし； ｅ、該宿主細胞を培養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。 ４、ａ、ＲＮＡウィルス配列をウィルス粒子から分離し
； ｂ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを該ＲＮＡウィルス配列か
ら準備し； ｃ、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを突然変異させて、但し
突然変異が、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡから産生される
ＲＮＡウィルス種の転写及び翻訳能力を減少させるよう
にｃＤＮＡのそれ自体への塩基対合を増大又は減少させ
る並びにｃＤＮＡの哺乳動物宿主からのリボソームＲＮ
Ａへの塩基対合を増大及び減少させることを含んでなり
；ｄ、細胞を該突然変異させたＲＮＡウィルスｃＤＮＡ
でトランスフェクションし； ｅ、該宿主細胞を培養し；及び ｆ、ＲＮＡウィルス種を該細胞から抽出する、 ことを含んでなる、哺乳動物宿主において減ぜられた先
祖返り速度が特色である改変された高度に弱体化したＲ
ＮＡウィルス種の生成法。 ５、処置した患者に関して、患者をＲＮＡウィルス感染
から保護するのに効果的なり価でＲＮＡウィルス抗原に
対する抗体の生成を誘導する、毒性への先祖返りの能力
の低いワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36361189A | 1989-06-08 | 1989-06-08 | |
| US363611 | 1989-06-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0310683A true JPH0310683A (ja) | 1991-01-18 |
Family
ID=23430924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1174353A Pending JPH0310683A (ja) | 1989-06-08 | 1989-07-07 | 先祖返りしないｒｎａウイルス |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0401421B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0310683A (ja) |
| AT (1) | ATE132527T1 (ja) |
| AU (1) | AU630099B2 (ja) |
| DE (1) | DE68925356T2 (ja) |
| DK (1) | DK340489A (ja) |
| ES (1) | ES2084587T3 (ja) |
| FI (1) | FI893346A (ja) |
| GR (1) | GR3018670T3 (ja) |
| IL (1) | IL90743A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004003045A1 (de) | 2004-01-20 | 2005-08-18 | Man Roland Druckmaschinen Ag | Formatanpassung für Produktionsdaten |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8800100D0 (en) * | 1988-01-05 | 1988-02-10 | Almond J W | Attenuated viruses |
| ATE121779T1 (de) * | 1988-01-11 | 1995-05-15 | American Cyanamid Co | Nichtzurückschlagende rns-viren. |
| GB8901094D0 (en) * | 1989-01-18 | 1989-03-15 | Almond Jeffrey W | Attenuated viruses |
-
1989
- 1989-06-21 ES ES89111281T patent/ES2084587T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-21 DE DE68925356T patent/DE68925356T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-21 AT AT89111281T patent/ATE132527T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-06-21 EP EP89111281A patent/EP0401421B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-25 IL IL9074389A patent/IL90743A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-06-28 AU AU37134/89A patent/AU630099B2/en not_active Ceased
- 1989-07-07 JP JP1174353A patent/JPH0310683A/ja active Pending
- 1989-07-10 FI FI893346A patent/FI893346A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-07-10 DK DK340489A patent/DK340489A/da not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-01-16 GR GR950402391T patent/GR3018670T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK340489D0 (da) | 1989-07-10 |
| EP0401421A2 (en) | 1990-12-12 |
| DE68925356D1 (de) | 1996-02-15 |
| AU3713489A (en) | 1990-12-13 |
| AU630099B2 (en) | 1992-10-22 |
| FI893346A0 (fi) | 1989-07-10 |
| EP0401421B1 (en) | 1996-01-03 |
| GR3018670T3 (en) | 1996-04-30 |
| IL90743A0 (en) | 1990-01-18 |
| EP0401421A3 (en) | 1991-01-30 |
| DK340489A (da) | 1990-12-09 |
| DE68925356T2 (de) | 1996-09-05 |
| IL90743A (en) | 1996-01-19 |
| FI893346A (fi) | 1990-12-09 |
| ATE132527T1 (de) | 1996-01-15 |
| ES2084587T3 (es) | 1996-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2723353C1 (ru) | Термочувствительные аттенуированные штаммы вируса ящура (fmdv), способ их конструирования и применение | |
| Kuo et al. | Initiation of replication of the human hepatitis delta virus genome from cloned DNA: role of delta antigen | |
| TWI688652B (zh) | 作為對抗腸病毒感染之免疫原的病毒顆粒及其製造 | |
| CN1134174A (zh) | 改构的植物病毒作为异源肽的载体 | |
| WO2020258757A1 (zh) | 一种突变株3型鸭甲肝病毒ch-p60-117c株及构建方法 | |
| JPH09511914A (ja) | ペスチウイルス株のヌクレオチド配列、それらの配列によりコードされるポリペプチド、ならびにペスチウイルス感染の診断および予防のためのそれらの使用 | |
| EP0325768B1 (en) | Non-reverting rna viruses | |
| EP0540135B1 (en) | Attenuated measles vaccine virus strain containing specific nucleotide sequence and a method for its absolute identification | |
| US5358856A (en) | Gene expression in mammalian cells using a cap independent 5' noncoding region | |
| EP0496875B1 (en) | METHODS FOR PRODUCING RNA VIRUSES FROM cDNA | |
| US10894081B2 (en) | Recombinant bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease virus, preparation method and use thereof | |
| WO2018181298A1 (ja) | 強毒性エンテロウイルス７１の安定的生産およびその利用 | |
| McCarthy et al. | Molecular characterisation of Australian bovine enteroviruses | |
| JPH0310683A (ja) | 先祖返りしないｒｎａウイルス | |
| TWI638048B (zh) | 高成長腸病毒71型(ev71)病毒株及其疫苗 | |
| Ekström et al. | Replication of Ljungan virus in cell culture: the genomic 5′-end, infectious cDNA clones and host cell response to viral infections | |
| Kanno et al. | Viruses produced from complementary DNA of virulent and avirulent strains of swine vesicular disease viruses retain the in vivo and in vitro characteristics of the parental strain | |
| Szendroi et al. | Nucleotide sequences and mutations of the 5′-nontranslated region (5′ NTR) of natural isolates of an epidemic echovirus 11′(prime) | |
| Li et al. | Synthesis of reassortant infectious bursal disease virus in chickens injected directly with infectious clones from different virus strains | |
| AU681352B2 (en) | Virus obtainable from human neuroblastoma cells | |
| TWI225095B (en) | A strain of enterovirus 71, YN3-4a, is used to develop a vaccine | |
| CN117143204A (zh) | 肠道病毒71型vp1蛋白第75位氨基酸突变病毒株的构建及其应用 | |
| Li et al. | Residues of 862, 921 of VP3 are associated with virulence in infectious bursal disease virus | |
| Abd-Eldaim | Genetic analysis of feline calicivirus (FCV) isolates associated with a hemorrhagic-like disease | |
| Lee et al. | Murine neurovirulence studies with a chimeric poliovirus: in vivogeneration of a mutant base-paired stable attenuated poliovirus |