JPH0286798A - バイオセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はバイオセンサに関し、特に酵素を用い［従来の
技術］ 第６図を参照して、従来の酵素を用いたバイオセンサを
説明する。

一端を閉じた透明な石英カラスパイプ５７の先端部５８
の内側にシリコンのＰＩＮホトダイオドのような光セン
サ５１を納め、その受光面と対向するようにガラスパイ
プ５７の先端部５８の外面に酵素５２を吸着法で埋め込
んで製膜したセルローストリアセテートＷ１５３か密着
して張り付けられてバイオセンサ５０を構成している。

このように固定化される酵素５２としては、触媒として
働くパーオキシダーゼ（ＰＯＤ＞または触媒酵素ＰＯＤ
とある種の生体成分酵素との組め合わせ笠かある。

光センサ５１の出力は電流計５５、記録計５４に接続さ
れて、測定結果を読み収り、記録できるようにされてい
る。

測定すべきサンプルは、化学発光物質ルミノールを含有
させたサンプル溶液６１として試料室６２に納められて
いる。測定対象は、過酸化水素ないしはある種の生体成
分である。

第７図を参照して、測定動作を説明する。測定対象か過
酸化水素である場合を説明する。まず第６図に示すよう
に、試料室６２にサンプル溶液６１を納め、そこにバイ
オセンサ５０を浸す。サンプル溶液６１がセルロースト
リアセテート１１ｇ５３中に浸透して、第７図に示すよ
うに触媒酵素ＰＯＤの存在下で、過酸化水素とルミノー
ルか以下のように反応する。

ルミノールナト■２０□ →アミノフタレート十Ｎ　２　＋　Ｈ２０＋　ｈνこの
化学発光ｈνが光センサ５１を照射し、電流計５５で検
出される０発光は青色である。このようにして過酸化水
素の定量分析を含む検出が行える６ つき°に検出対象がある種の生体成分（グリコースを例
とする）である場合を説明する。

グリコースと化学発光物質ルミノールとを含むサンプル
溶液６１を準備する。セルローストリアセテート膜５３
中の酵素５２は触媒酵素ＰＯＤとクリコースオキシター
ゼＣＯＤとの組合せを含むものとする。サンプル溶液６
１かセルローストリアセテ−Ｈｌ１ｊ５３中に入って酵
素５２と接触する。

すると、サンプル溶液６１中のグリコースが膜中の生体
酵素であるグリコースオキシダーセと反応して過酸化水
素Ｈ２Ｏ２を発する。この発生したＨ２０□か触媒酵素
ＰＯＤの存在下でルミノールと反応し、ルミノール化学
発光反応によって青色光を発する。この青色光を光セン
サ５１で受光して光電流に変換し、電流計５５で検出し
て、記録計５４に記録する。このようにして生体成分（
本例の場合はグリコース）が定量分析を含めて検出され
る。

このように、従来のバイオセンサによって過酸化水素な
いしある種の生体成分を検出することができる。

しかしながら、このような従来のバイオセンサは以下の
如き課題を有している。

（１）成膜法が吸着法のため酵素固定化能が低く酵素か
離脱しやすい。

（２）固定化できる酵素の量か限られる。

（３）測定物質の濃度範囲が狭い。

（４）センサとしての反応速度が遅い、これは吸着法で
あり、セルローストリアセテートの構造のため発光サイ
トが多く一度に発光しないためと考えられる。

（５）酵素固定化膜の形状が限られている。

ここで固定化能とは、酵素を離脱しないようにしっかり
固定化する能力をさす。

定化能か高い状態で、酵素を固定化したバイオセンサを
提供することである。

本発明の他の目的は、光透過度の高い材料に触媒酵素パ
ーオキシダーゼを酵素固定化能が高い状態で、固定化し
たバイオセンサを提供することである。

本発明の池の目的は、光透過度の高い材料に触媒酵素パ
ーオキシダーゼと過酸化水素発生機能を有する生体成分
酵素との複合酵素を酵素固定化能が高い状態で、固定化
したバイオセンサを提供することである。

［発明が解決しようとする課題］ 従来例のバイオセンサにおいては、セルローストリアセ
テート膜に吸着法により酵素を固定化していたため、酵
素固定化能が低く、かつ酵素を十分多量に固定化して使
用できなかった。固定化できる酵素の量か少ないため測
定物質の検出濃度範囲を広くできなかった。

本発明の目的は、光透過度の高い材料に酵素固［課題を
解決するための手段コ 酵素を絹フィブロイン膜の内部に膜の厚さ方向に関して
非対称的に、例えば、１表面層のみ、包括法によって固
定化し、光センサを絹フィブロイン膜と光学的に結合す
る。

また、酵素として触媒酵素パーオキシダーゼを用いる。

また、酵素として触媒酵素パーオキシダーゼと過酸化水
素発生機能を有する生体成分酵素との複合酵素を用いる
。

［作用］ 絹フィブロインは包括法によって酵素を固定化でき、酵
素の固定化能が優れていることが判った。

複数枚の絹フィブロイン膜を一体化することもできる。

また、絹フィブロインは可視光に対する透過率が非常に
高い。

従って、絹フィブロイン膜に酵素を薄膜状に固定化する
と、優れた特性のバイオセンサを提供できる。

［実施例］ 以下図面を参照して実施例を説明する。

第１図はバイオセンサを利用した測定システムを示す概
略図、第２図はその要部を拡大して示す概略断面図であ
る６片端を透明石英の底板８で閉じた石英管７を用意し
、その内側に受光面を底板８と結合させて光センサ１を
配置する。光センサ１は、例えば、光起電力型のシリコ
ンホトダイオードである。

透明石英の底板８の反対ｆｉｌｌ！Ｉ（外面）には酵素
固定化絹フィブロインＷＡ３を光センサ１と対向して密
着させて張り付け、バイオセンサ１０を形成している。

酵素固定化絹フィブロイン膜３は、絹フィブロイン膜部
分３ｂと酵素を高濃度に包括法で固定化した酵素同定化
絹フィブロイン膜部分３ａとを一体化したものである。

第３図（Ａ＞に示すように、絹フィブロイン膜部分３ｂ
を透明石英の底板８に接しさせて、酵素固定化絹フィブ
ロイン膜部分３ａを外側にする場合と、第３図（Ｂ）に
示すよつに酵素固定化絹フィブロイン膜部分３ａを底板
８に接しさせて、絹フィブロイン膜部分３ｂを外側にす
る場合とかある。絹フィブロイン膜は薄く成形でき、操
作性に優れている。

このような酵素固定化絹フィブロイン膜３は、絹フィブ
ロイン膜部分３ｂと、酵素を固定化しな酵素固定化絹フ
ィブロイン膜部分３ａとを別に準備して一体化すること
によっても、−度に濃度勾配のある膜を成膜することに
よっても作ることかできる。前者の場合、担体である絹
フィブロインと機能物質である酵素とを混合して、均一
な分布状態の混合物を作り、これを成膜して酵素固定化
絹フィブロイン膜部分３ａを作り、別の絹フィブロイン
膜と一体化すればよい。種々の濃度の膜を作って適当に
積層してもよい、後者の場合、担体である絹フィブロイ
ンと機能物質である酵素とを所望の分布を実現するよう
に厚さ方向に分布させ、成膜すればよい。

酵素としては、過酸化水素検出の場合はパーオキシダー
ゼ（ＰＯＤ）等を、ある種の生体成分を検出する場合は
その生体成分と反応して過酸化水素を発生させる過酸化
水素発生機能を有する生体成分酵素と触媒酵素パーオキ
シダーゼとの複合酵素を用いることができる。このよう
な生体成分酵素としてはグリコースに働くグリコースオ
キシダーセ、尿酸に働くウリアーゼ、ビリビン酸に働く
ピリビン酸オキシターゼ、コレステロールに働くコレス
テロールオキシダーセ等がある。

包括法で固定化した酵素は感度は高くないが、高濃度領
域まで感度をもち、高濃度領域で感度か飽和してしまう
従来技術の課題を解決できる。固定化酵素量か多いこと
が影響していると考えられる。

また、絹フィブロインに固定化した酵素は、その活性を
うしなう失活温度が高い、このため特性の温度に対する
安定性が高い。

第３図（Ａ）に示すように、高濃度に酵素を固定化した
部分３ａを外側にすると、サンプル溶液か直接高濃度酵
素固定化部分３ａに接するので反応速度か速い、絹フィ
ブロイン膜３ｂは可視光透過度が通常９５％以上あるの
で、高濃度酵素固定化部分３ａと光センサ１との間に絹
フィブロインＭ３ｂが存在することによる発光光量の損
失は極めて少ない。

第３図（Ｂ）に示すように高濃度酵素固定化部分３ａを
透明石英の底板８に密着させ、絹フィブロイン膜３ｂを
外側にすると、高濃度酵素固定化部分３ａは絹フィブロ
イン膜３ｂで保護される。

高濃度酵素固定化部分３ａで発光した光は石英底板８の
みを介して光センサ１に光結合されるので光結合の程度
が高くなる。

なり、特に石英の底板８のような底板を設けずに光セン
サ１の受光面を利用して石英管７の底部端を封止しても
よい。その場合は、光センサ１の受光面に直接酵素固定
化絹フィブロイン膜３を装着する。

光センサ１からの出力リード線６は電流計５、記録計４
に接続されている。

測定試料１１は、化学発生物質ルミナールを添加した溶
液であり、溶液導入口１３、溶液排出口１４を備えた試
料室１２に収納されている。ポンプ１５か測定試料１１
をフローさせている。フローにより連続測定が可能にさ
れ、バイオセンサ１０の反応速度か速いことにより、高
速測定が可能にされている。

測定対象は試料１１中の過酸化水素Ｈ２Ｏ２、又はグリ
コース、尿酸、ピルビン酸、血液等の生体成分である。

このバイオセンサが過酸化水素（Ｈ２０２）の検出セン
サである場合、高濃度酵素固定化部分３ａは、触媒酵素
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含んで形成される。まず
試料の溶液の化学発光物質ルミナールと過酸化水素が酵
素固定化絹フィブロイン膜の表面の高密度固定化酵素Ｐ
ＯＤの触媒作用によって化学発光をし、青色（六〇＝４
２５ｎｍ）の光を発光する。これを直ちに光センサ１の
シリコンホトダイオードで受光して光電流に変換し、こ
れを電流計５で検出し、記録計４で記録して過酸化水素
の検出をする。

ルミノール反応は、 ルミノール＋Ｈ２Ｏ２ →アミノフタレート十Ｎ　２　＋　８２０　＋ｈνであ
る。

このバイオセンサが種々の生体成分の検出センサである
場合は、酵素はある種の生体成分酵素（例えばグリコー
スオキシダーセ）と触媒酵素パーオキシダーゼとの複合
酵素である。

まずある種の生体成分（例えばグリコース）とその生体
成分酵素（例えばグリコースオキシターゼ）とか反応し
て過酸化水素を発生する。試料溶液中の化学発生物質ル
ミノールが先に述べた膜中の触媒酵素ＰＯＤの触媒作用
でこの過酸化水素と化学発光反応（ルミノール反応）を
起こし、青色（λＤ＝４２５ｎ１１）の光を発光する。

これを光センサ１のシリコンホトダイオードで受光して
、光電流に変換してこれを記録し、ある種の生体成分（
例えはグリコース）の検出並びに定量を行う。

絹フィブロインは、包括法で酵素を固定化でき、以下の
ような特性を持つ。

（１）絹フィブロインは、酵素の固定化能が従来品に比
し優れ、酵素が龍脱しにくい。

（２）酵素の固定化量を多くすることができる。

（３）検出濃度範囲を広くすることができる。

（４）絹フィブロインの膜は生体親和性に優れ、安定で
ある。従って、生体内測定が可能である。

（５）絹フィブロインの膜は可視光透過率が非常に高い （６）応答速度か速い、酵素を表面部分に固定化すると
膜内部に分散させたものよりさらに応答速度か速い。

（７）膜、粉末、ゲル等の形態での使用か目的に応じて
可能である。。

ここで、本実施例の応答速度について測定した結果を示
す。

過酸化水素測定の場合を例として、第４図に上記実施例
による過酸化水素検出バイオセンサの例の応答速度の測
定結果を示す。

酵素としてＰＯＤを１％絹フィブロイン膜の表面に部分
に固定化し、Ｈ２Ｏ２濃度９．１２ＸｌＯ−２Ｍの溶液
（２５℃でｐＨ８，０）を測定しな。

矢印がＨ２Ｏ２の投入時点である。出力信号は鋭く立ち
上がり、後鋭く落ちて、はぼ元の状態に戻っている。

第８図にセルローストリアセテート膜を用いた従来例の
測定結果を示す。第４図と第８図とを比べると応答速度
がいかに異なるかがより理解しやすいであろう、従来例
バイオセンサの測定においては、立上がりかゆっくり上
昇し、溶液のフローもないので測定値はやがて飽和して
いる。

第５図は上述の実施例の例によるバイオセンサの感度特
性を示す、約１０Ｘ１０’Ｍまでの濃度範囲でほぼリニ
アな感度か得られている。

第９図に従来例のバイオセンサの感度特性を示す、従来
例のバイオセンサでは約ｌＸｌ０−”Ｍまでの濃度範囲
でほぼリニアな感度が得られている。

このように、本実施例によれば応答速度が速く、検出応
答範囲か広いバイオセンサか得られる。

［発明の効果コ 光透過度の高い材料に酵素固定化能が高い状態で、酵素
を固定化した高性能のバイオセンサが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１実施例によるバイオセンサを備え
た測定システムを示す概略ブロック図、第２図は、第１
図のバイオセンサ部を拡大して示す概略断面図、 第３図（Ａ）、（Ｂ）は、バイオセンサの酵素固定化絹
フィブロイン膜の２つの形態を示す断面図、 第４図は、本発明の１実施例によるバイオセンサの応答
速度を示すグラフ、 第５図は本発明の１実施例によるバイオセンサの測定濃
度範囲における応答を示すグラフ、第６図は、従来技術
によるバイオセンサを含む測定システムの概略ブロック
図、 第７図は、第６図のバイオセンサ部を拡大した概略断面
図、 第８図は、従来技術によるバイオセンサを用いた測定シ
ステムの応答速度を示すグラフ、第９図は従来技術によ
るバイオセンサを用いた測定システムの測定：Ｒ度範囲
における応答を示すグラフである。 図において、 　ａ ｂ 光センサ 酵素固定化絹フィブロイン膜 高４度酵素固定化部分 絹フィブロイン膜部分 記録計 電流計 出力リード 石英管 底板 バイオセンサ サンプル溶液 サンプル室 ／ｇ液導入口 溶液排出口 ポンプ 第１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）、膜の厚さ方向に関して非対称の濃度分布をもっ
   て酵素を包括法で固定化した酵素固定化絹フィブロイン
   膜と、 前記酵素固定化絹フィブロイン膜と光学的に結合した光
   センサと を含むバイオセンサ。
2. （２）、前記酵素がパーオキシダーゼであり、過酸化水
   素を検出する請求項１記載のバイオセンサ。
3. （３）、前記酵素がパーオキシダーゼと過酸化水素発生
   機能を有する生体成分酵素との複合酵素であり、生体成
   分ないし過酸化水素を検出する請求項１記載のバイオセ
   ンサ。