JPH0669362B2 - バイオセンサ - Google Patents

バイオセンサ

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JPH0669362B2
JPH0669362B2 JP23900588A JP23900588A JPH0669362B2 JP H0669362 B2 JPH0669362 B2 JP H0669362B2 JP 23900588 A JP23900588 A JP 23900588A JP 23900588 A JP23900588 A JP 23900588A JP H0669362 B2 JPH0669362 B2 JP H0669362B2
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JP
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enzyme
immobilized
biosensor
silk fibroin
hydrogen peroxide
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哲郎 朝倉
弘基 田村
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Stanley Electric Co Ltd
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Stanley Electric Co Ltd
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明はバイオセンサに関し、特に酵素を用いたバイオ
センサに関する。
[従来の技術] 第6図を参照して、従来の酵素を用いたバイオセンサを
説明する。
一端を閉じた透明な石英ガラスパイプ57の先端部58の内
側にシリコンのPINホトダイオードのような光センサ51
を納め、その受光面と対向するようにガラスパイプ57の
先端部58の外面に酵素52を吸着法で埋め込んで製膜した
セルローストリアセテート膜53が密着して張り付けられ
てバイオセンサ50を構成している。
このように固定化される酵素52としては、触媒として働
くパーオキシダーゼ(POD)または触媒酵素PODとある種
の生体成分酵素との組み合わせ等がある。
光センサ51の出力は電流計55、記録計54に接続されて、
測定結果を読み取り、記録できるようにされている。
測定すべきサンプルは、化学発光物質ルミノールを含有
させたサンプル溶液61として試料室62に納められてい
る。測定対象は、過酸化水素ないしはある種の生体成分
である。
第7図を参照して、測定動作を説明する。測定対象が過
酸化水素である場合を説明する。まず第6図に示すよう
に、試料室62にサンプル溶液61を納め、そこにバイオセ
ンサ50を浸す。サンプル溶液61がセルローストリアセテ
ート膜53中に浸透して、第7図に示すように触媒酵素PO
Dの存在下で、過酸化水素とルミノールが以下のように
反応する。
ルミノール+H2O2 →アミノフタレート+N2+H2O+hν この化学発光hνが光センサ51を照射し、電流計55で検
出される。発光は青色である。このようにして過酸化水
素の定量分析を含む検出が行える。
つぎに検出対象がある種の生体成分(グリコースを例と
する)である場合を説明する。
グリコースと化学発光物質ルミノールとを含むサンプル
溶液61を準備する。セルローストリアセテート膜53中の
酵素52は触媒酵素PODとグリコースオキシダーゼGODとの
組合せを含むものとする。サンプル溶液61がセルロース
トリアセテート膜53中に入って酵素52と接触する。する
と、サンプル溶液61中にグリコースが膜中の生体酵素で
あるグリコースオキシダーゼと反応して過酸化水素H2O2
を発する。この発生したH2O2が触媒酵素PODの存在下で
ルミノールと反応し、ルミノール化学発光反応によって
青色光を発する。この青色光を光センサ51で受光して光
電流に変換し、電流計55で検出して、記録計54に記録す
る。このようにして生体成分(本例の場合はグリコー
ス)が定量分析を含めて検出される。
このように、従来のバイオセンサによって過酸化水素な
いしある種の生体生物を検出することができる。
しかしながら、このような従来のバイオセンサは以下の
如き課題を有している。
(1)成膜法が吸着法のため酵素固定化能が低く酵素が
離脱しやすい。
(2)固定化できる酵素の量が限られる。
(3)測定物質の濃度範囲が狭い。
(4)センサとしての反応速度が遅い。これは吸着法で
あり、セルローストリアセテートの構造のため発光サイ
トが多く一度に発光しないためと考えられる。
(5)酵素固定化膜の形状が限られている。
ここで固定化能とは、酵素を離脱しないようにしっかり
固定化する能力をさす。
[発明が解決しようとする課題] 従来例のバイオセンサにおいては、セルローストリアセ
テート膜に吸着法により酵素を固定化していたため、酵
素固定化能が低く、かつ酵素を十分多量に固定化して使
用できなかった。固定化できる酵素の量が少ないため測
定物質の検出濃度範囲を広くできなかった。
本発明の目的は、光透過度の高い材料に酵素固定化能が
高い状態で、酵素を固定化したバイオセンサを提供する
ことである。
本発明の他の目的は、光透過度の高い材料に触媒酵素パ
ーオキシダーゼを酵素固定化能が高い状態で、固定化し
たバイオセンサを提供することである。
本発明の他の目的は、光透過度の高い材料に触媒酵素パ
ーオキシダーゼと過酸化水素発生機能を有する生体成分
酵素との複合酵素を酵素固定化能が高い状態で、固定化
したバイオセンサを提供することである。
[課題を解決するための手段] 酵素を絹フィブロイン膜の内部に膜の厚さ方向に関して
非対対称的に、例えば、1表面層のみ、包括法によって
固定化し、光センサを絹フィブロイン膜と光学的に結合
する。
また、酵素として触媒酵素パーオキシダーゼを用いる。
また、酵素として触媒酵素パーオキシダーゼと過酸化水
素発生機能を有する生体成分酵素との複合酵素を用い
る。
[作用] 絹フィブロインは包括法によって酵素を固定化でき、酵
素の固定化能が優れていることが判った。複数枚の絹フ
ィブロイン膜を一体化することもできる。
まだ、絹フィブロインは可視光に対する透過率が非常に
高い。
従って、絹フィブロイン膜に酵素を薄膜状に固定化する
と、優れた特性のバイオセンサを提供できる。
[実施例] 以下図面を参照して実施例を説明する。
第1図はバイオセンサを利用した測定システムを示す概
略図、第2図はその要部を拡大して示す概略断面図であ
る。片端を透明石英の底板8で閉じた石英管7を用意
し、その内側に受光面を底板8と結合させて光センサ1
を配置する。光センサ1は、例えば、光起電力型のシリ
コンホトダイオードである。
透明石英の底板8の反対側(外面)には酵素固定化絹フ
ィブロイン膜3を光センサ1と対向して密着させて張り
付け、バイオセンサ10を形成している。
酵素固定化絹フィブロイン膜3は、絹フィブロイン膜部
分3bと酵素を高濃度に包括法で固定化した酵素固定化絹
フィブロイン膜部分3aとを一体化したものである。第3
図(A)に示すように、絹フィブロイン膜部分3bを透明
石英の底板8に接しさせて、酵素固定化絹フィブロイン
膜部分3aを外側にする場合と、第3図(B)に示すよう
に酵素固定化絹フィブロイン膜部分3aを底板8に接しさ
せて、絹フィブロイン膜部分3bを外側にする場合とがあ
る。絹フィブロイン膜は薄く成形でき、操作性に優れて
いる。
このような酵素固定化絹フィブロイン膜3は、絹フィブ
ロイン膜部分3bと、酵素を固定化した酵素固定化絹フィ
ブロイン膜部分3aとを別に準備して一体化することによ
っても、一度に濃度勾配のある膜を成膜することによっ
ても作ることができる。前者の場合、担体である絹フィ
ブロインと機能物質である酵素とを混合して、均一な分
布状態の混合物を作り、これを成膜して酵素固定化絹フ
ィブロイン膜部分3aを作り、別の絹フィブロイン膜と一
体化すればよい。種々の濃度の膜を作って適当に積層し
てもよい。後者の場合、担体である絹フィブロイン膜と
機能物質である酵素とを所望の分布を実現するように厚
さ方向に分布させ、成膜すればよい。
酵素としては、過酸化水素検出の場合はパーオキシダー
ゼ(POD)等を、ある種の生体成分を検出する場合はそ
の生体成分と反応して過酸化水素を発生させる過酸化水
素発生機能を有する生体成分酵素と触媒酵素パーオキシ
ダーゼとの複合酵素を用いることができる。このような
生体成分酵素としてはグリコースに働くグリコースオキ
シダーゼ、尿酸に働くウリアーゼ、ピリビン酸に働くピ
リビン酸オキシダーゼ、コレステロールに働くコレステ
ロールオキシダーゼ等がある。
包括法で固定化した酵素は感度は高くないが、高濃度領
域まで感度をもち、高濃度領域で感度が飽和してしまう
従来技術の課題を解決できる。固定化酵素量が多いこと
が影響していると考えられる。
また、絹フィブロインに固定化した酵素は、その活性を
うしなう失活温度が高い。このため特性の温度に対する
安定性が高い。
第3図(A)に示すように、高濃度に酵素を固定化した
部分3aを外側にすると、サンプル溶液が直接高濃度酵素
固定化部分3aに接するので反応速度が速い。絹フィブロ
イン膜3bは可視光透過度が通常95%以上あるので、高濃
度酵素固定化部分3aと光センサ1との間に絹フィブロイ
ン膜3bが存在することによる発光光量の損失は極めて少
ない。
第3図(B)に示すように高濃度酵素固定化部分3aを透
明石英の底板8に密着させ、絹フィブロイン膜3bを外側
にすると、高濃度酵素固定化部分3aは絹フィブロイン膜
3bで保護される。高濃度酵素固定化部分3aで発光した光
は石英底板8のみを介して光センサ1に光結合されるの
で光結合の程度が高くなる。
なお、特に石英の底板8のような底板を設けずに光セン
サ1の受光面を利用して石英管7の底部端を封止しても
よい。その場合は、光センサ1の受光面に直接酵素固定
化絹フィブロイン膜3を装着する。
光センサ1からの出力リード線6は電流計5、記録計4
に接続されている。
測定試料11は、化学発生物質ルミナールを添加した溶液
であり、溶液導入口13、溶液排出口14を備えた試料室12
に収納されている。ポンプ15が測定試料11をフローさせ
ている。フローにより連続測定が可能にされ、バイオセ
ンサ10の反応速度が速いことにより、高速測定が可能に
されている。
測定対象は試料11中の過酸化水素H2O2、又はグリコー
ス、尿酸、ピルビン酸、血液等の生体成分である。
このバイオセンサが過酸化水素(H2O2)の検出センサで
ある場合、高濃度酵素固定化部分3aは、触媒酵素のパー
オキシダーゼ(POD)を含んで形成される。まず試料の
溶液の化学発光物質ルミナールと過酸化水素が酵素固定
化絹フィブロイン膜の表面の高密度固定化酵素PODの触
媒作用によって化学発光をし、青色(λp=425nm)の
光を発光する。これを直ちに光センサ1のシリコンホト
ダイオードで受光して光電流に変換し、これを電流計5
で検出し、記録計4で記録して過酸化水素の検出をす
る。
ルミノール反応は、 ルミノール+H2O2 →アミノフタレート+N2+H2O+hν である。
このバイオセンサが種々の生体成分の検出センサである
場合は、酵素はある種の生体成分酵素(例えばグリコー
スオキシダーゼ)と触媒酵素パーオキシダーゼとの複合
酵素である。
まずある種の生体成分(例えばグリコース)とその生体
成分酵素(例えばグリコースオキシダーゼ)とが反応し
て過酸化水素を発生する。試料溶液中の化学発生物質ル
ミノールが先に述べた膜中の触媒酵素PODの触媒作用で
この過酸化水素と化学発光反応(ルミノール反応)を起
こし、青色(λp=425nm)の光を発光する。これを光
センサ1のシリコンホトダイオードで受光して、光電流
に変換してこれを記録し、ある種の生体成分(例えばグ
リコース)の検出並びに定量を行う。
絹フィブロイン膜は、包括法で酵素を固定化でき、以下
のような特性を持つ。
(1)絹フィブロインは、酵素の固定化能が従来品に比
し優れ、酵素が離脱しにくい。
(2)酵素の固定化量を多くすることができる。
(3)検出濃度範囲を広くすることができる。
(4)絹フィブロインの膜は生体親和性に優れ、安定で
ある。従って、生体内測定が可能である。
(5)絹フィブロインの膜は可視光透過率が非常に高い (6)応答速度が速い。酵素を表面部分に固定化すると
膜内部に分散させたものよりさらに応答速度が速い。
(7)膜、粉末、ゲル等の形態での使用が目的に応じて
可能である ここで、本実施例の応答速度について測定した結果を示
す。
過酸化水素測定の場合を例として、第4図に上記実施例
による過酸化水素検出バイオセンサの例の応答速度に測
定結果を示す。
酵素としてのPODを1%絹フィブロイン膜の表面の部分
に固定化し、H2O2濃度9.12×10-2Mの溶液(25℃でpH8.
0)を測定した。矢印がH2O2の投入時点である。出力信
号は鋭く立ち上がり、後鋭く落ちて、ほぼ元の状態に戻
っている。
第8図にセルローストリアセテート膜を用いた従来例の
測定結果を示す。第4図と第8図とを比べると応答速度
がいかに異なるかがより理解しやすいであろう。従来例
バイオセンサの測定においては、立上がりがゆっくり上
昇し、溶液のフローもないので測定値はやがて飽和して
いる。
第5図は上述の実施例によるバイオセンサの感度特性を
示す。約10×10-2Mまでの濃度範囲でほぼリニアな感度
が得られている。
第9図に従来例のバイオセンサの感度特性を示す。従来
例のバイオセンサでは約1×10-2Mまでの濃度範囲でし
かほぼリニアな感度は得られない。
このように、本実施例によれば応答速度が速く、検出応
答範囲が広いバイオセンサが得られる。
[発明の効果] 光透過度の高い材料に酵素固定化能が高い状態で、酵素
を固定化した高性能のバイオセンサが得られる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の1実施例によるバイオセンサを備え
た測定システムを示す概略ブロック図、 第2図は、第1図のバイオセンサ部を拡大して示す概略
断面図、 第3図(A)、(B)は、バイオセンサの酵素固定化絹
フィブロイン膜の2つの形態を示す断面図、 第4図は、本発明の1実施例によるバイオセンサの応答
速度を示すグラフ、 第5図は本発明の1実施例によるバイオセンサの測定濃
度範囲における応答を示すグラフ、 第6図は、従来技術によるバイオセンサを含む測定シス
テムの概略ブロック図、 第7図は、第6図のバイオセンサ部を拡大した概略断面
図、 第8図は、従来技術によるバイオセンサを用いた測定シ
ステムの応答速度を示すグラフ、 第9図は従来技術によるバイオセンサを用いた測定シス
テムの測定濃度範囲における応答を示すグラフである。 図において、 1……光センサ 3……酵素固定化絹フィブロイン膜 3a……高濃度酵素固定化部分 3b……絹フィブロイン膜部分 4……記録計 5……電流計 6……出力リード 7……石英管 8……底板 10……バイオセンサ 11……サンプル溶液 12……サンプル室 13……溶液導入口 14……溶液排出口 15……ポンプ

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】膜の厚さ方向に関して非対称の濃度分布を
    もって酵素を包括法で固定化した酵素固定化絹フィブロ
    イン膜と、 前記酵素固定化絹フィブロイン膜と光学的に結合した光
    センサと を含むバイオセンサ。
  2. 【請求項2】前記酵素がパーオキシダーゼであり、過酸
    化水素を検出する請求項1記載のバイオセンサ。
  3. 【請求項3】前記酵素がパーオキシダーゼと過酸化水素
    発生機能を有する生体成分酵素との複合酵素であり、生
    体成分ないし過酸化水素を検出する請求項1記載のバイ
    オセンサ。
JP23900588A 1988-09-26 1988-09-26 バイオセンサ Expired - Lifetime JPH0669362B2 (ja)

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