JPH0278698A

JPH0278698A - 尿素分解素子

Info

Publication number: JPH0278698A
Application number: JP63229716A
Authority: JP
Inventors: Naoya Ogata; 直哉緒方; Isao Hagiwara; 猪佐夫萩原
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-03-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は尿素分解素子に間し、尿素分解活性素（ウレア
ーゼ）の利用される分野特に人工腎臓および尿素センサ
ー等に有用な新規な尿素分解素子に間する。

〔従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕現在、
人工腎臓として用いられているものとしては、透析型、
ろ過型、吸着型および酵素固定型人工腎臓が挙げられる
。

しかしながら、酵素固定型を除くこれら人工腎臓は尿素
の分解能を有しておらず、尿中に排泄されるべき最大成
分である尿素を、まったく除去できない等の問題がある
。また、尿素分解能を有している酵素固定型人工腎臓に
おいても、天然酵素であるウレアーゼを用いるため酵素
活性の失活および温度、酸性度等の周囲の環境の制約が
あるという難点がある［特開昭６０−１３７４３３号公
報および人工臓器、第１５巻、第１２７１ページ（１９
８６）コ。

これらの欠点を補う目的として、イミダゾリル基および
カルボキシル基を構成成分として含むビニル系高分子の
遷移金属錯体である金属錯体尿素分解樹脂が考案されて
いる（特開昭６３−６１００７号公報）。

しかし、この尿素分解樹脂の尿素分解能は、最高でも１
７％と低く、大半の尿素は分解されずに残ってしまうた
め、実用するには極めて不十分である。

そこで現在、ウレアーゼと同等な高い活性を持つ尿素分
解素子の開発が望まれている。

また、ウレアーゼを用いる分野、特に酵素固定型人工腎
臓および尿素センサーの分野では、酵素の固定化時での
失活および時間的経過による活性低下の問題がある。

さらにまたウレアーゼは、周囲の環境によっても失活し
易い物質である。たとえばウレアーゼは、−度でも８０
℃以上の温度にさらすと二度と活性を示さない。またウ
レアーゼは中性ないし弱アルカリ性で極めて高い活性を
示すが、酸性側特にｐＨ５以下ではほとんど活性を示さ
ないと言われている。

以上のようにウレアーゼは、周囲の環境により失活する
ばかりか、固定化や時間的経過によっても失活するとい
う難点を持っている。そこで現在、周囲の環境に影響さ
れず、しかも固定化が容易でなおかつ長時間にわたって
高い活性を維持するような尿素分解素子の開発が強く望
まれている。

〔問題点を解決するための手段、作用〕本発明者は、前
記の問題点を解決するべく、天然ウレアーゼのような高
い活性を有する尿素分解素子について鋭意検討を重ねた
。その結果、カルボキシル基およびイミダゾリル基を含
むポリペプチドをニッケル二価塩と共存させることによ
り、驚くべき高さの尿素分解活性が発現することを見出
し、本研究を完成するに至った。

すなわち本発明は、側鎖官能基としてカルボキシル基を
有するアミノ酸および側鎖官能基としてイミダゾリル基
を有するアミノ酸との両者を構成成分として含むポリペ
プチドをニッケル二価塩と混合してなる尿素分解素子で
ある。

また本発明は、−敏式（１）にて示されるポリペプチド
である。

（式中Ｒ１，Ｒ２は、互いに同一または相異なってそれ
ぞれ水素原子、アルキル基およびアラルキル基を表わす
。また式中ｍは１または２の整数を表わし、ｎは３ない
し１０の整数を表わす。）また本発明は、−敏式（Ｉ）
にて示されるポリペプチドとニッケル二価塩とを混合し
てなる、極めて高い活性を有する尿素分解素子である。

また本発明は、−敏式（ＩＩ）にて示されるポリペプチ
ドである。

４Ｎ）Ｉ−ＣＨ−Ｃｏ）。

（ＣＨ２）２　　　−敏式（ＩＩ）Ｃｏ−Ｘ［式中ｐは、５０ないし１５０の整数を表わす。

また式中Ｘの少なくとも一部は、−敏式（ｍ）にて示さ
れるヒスチジン誘導体である。また式中Ｘは、エステル
型保護基が結合したオキシ基を包含する。

−Ｎ）ｌ−ＣＩ−ＣＯＯ−Ｒ３（式中Ｒ３は、アルキル基またはアラルキル基を表わす
。）］さらに本発明は、−敏式（ＩＩ）にて示されるポリペプ
チドをケン化しエステル型保護基を脱保護した物質とニ
ッケル二価塩とを混合してなる、高い活性を有する尿素
分解素子である。ここでエステル型保護基とは、アミノ
酸のカルボキシル基をエステルとして保護するメチルそ
の他のアルキル基、アラルキル基およびβ−シアノエチ
ル基等を意味する。エステル型保護基は、−敏式（ＩＩ
）におけるＸの中に存在する。たとえば−敏式（ｍ）に
示されるヒスチジン誘導体はＸの少なくとも一部であり
、−敏式（ＩＩＩ）中のＲ３はエステル型保護基である
。またＸはオキシ基を介したエステル型保護基をも意味
している。

本発明におけるポリペプチドは、側鎖官能基としてカル
ボキシル基を有するアミノ酸［以下アミノ酸（Ａ）とす
る］を含有する。アミノ酸（Ａ）として、たとえばグル
タミン酸およびアスパラギン酸が好ましい。

また本発明におけるポリペプチドは、側鎖官能基として
イミダゾリル基を有するアミノ酸［以下アミノ酸（Ｂ）
とするコを含有する。アミノ酸（Ｂ）として、ヒスチジ
ンおよびヒスチジン誘導体などが好ましい。

さらに本発明におけるポリペプチドは、グリシン、アラ
ニンおよびフェニルアラニンその他の各種のアミノ酸を
含有することができる。

本発明においてポリペプチド中のアミノ酸配列に特に制
限はない。たとえば、アミノ酸（Ａ）、アミノ酸（Ｂ）
その他のアミノ酸を直線状に配列することが可能である
。

２”　　　　また、−敏式（Ｉ）のように構成成分を規
則的に配列した順次配列ポリペプチドとすることもでき
る。順次配列ポリペプチドにおいて、アミノ酸（Ａ）、
アミノ酸（Ｂ）を除くその他のアミノ酸［以下スペーサ
ーと記す］は、合成のし易さから、構造が単純なものが
好ましい。たとえば側鎖を有しないグリシン、側鎖とし
て炭素数５以下のアルキル基を有するアラニン、バリン
およびロイシン、ならびに側鎖としてアラルキル基を有
するフェニルアラニン等のアミノ酸が挙げられる。特に
好ましいスペーサーは、グリシンである。−敏式（Ｉ）
で示されるｎ＝３〜ｌＯのポリペプチドは、スペーサー
を利用しているので合成が比較的容易であり、しかも尿
素分解素子としたときの活性が極めて高いので、好まし
いポリペプチドである。

さらにまた、アミノ酸（Ａ）をポリペプチドの主鎖に含
有し、側鎖にアミノ酸（Ｂ）を含有するという配列も可
能である。たとえば−敏式（ＩＩ）で示されるような、
主鎖にグルタミン酸そして側鎖にヒスチジン誘導体を含
むｐ＝５０〜１５０のポリペプチドは、合成が容易であ
り、かつケン化して尿素分解素子としたとき活性が高い
ので、好ましいポリペプチドである。

さらに以上述べたような型を混合したようなアミノ酸配
列も可能である。たとえばアミノ酸（Ａ）アミノ酸（Ｂ
）およびその他のアミノ酸を主鎖に含有し、アミノ酸（
Ａ）、アミノ酸（Ｂ）およびその他のアミノ酸を側鎖に
含有するような配列が可能である。

本発明におけるポリペプチドは、ペプチド合成の手法を
適宜に組み合わせることにより合成できる。

すなわち、一般式（Ｉ）にて示されるようなポリペプチ
ドは、その繰り返し単位であるテトラペプチドから導か
れる活性エステルを重合させることにより得られる。さ
らに詳しくは、グリシン・グルタミン酸・グリシン・ヒ
スチジンを繰り返し単位とするポリペプチドの合成を例
に取り説明すると、反応式（Ｉ）にて示されるように末
端カルボキシル基のみが、無保護であるテトラペプチド
を活性エステル前駆体と縮合し、活性エステルに導き、
酸により末端アミノ基を脱保護した後、第三級アミンで
中和することにより重合させる。そして最後に側鎖官能
基の保護基を脱保護することによって目的物が得られる
。

反応式（Ｉ）（式中Ｇ１ｙはグリシン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｈｌ
Ｓはヒスチジンを表わす。Ｒ４はアミノ保護基を表わす
。

Ｒ５はグルタミン酸側鎖のカルボキシル基の保護基を表
わす。Ｒ６はヒスチジンのイミダゾリル基の保護基を表
わす。Ｒａｃは活性エステル基を表わす。

）ＩＸはアミノ保護基の脱保護試薬を表わし、有機溶媒
中ＨＣＩまたは酢酸中ＨＢｒである）合成時に用いる保
護基は、ペプチド合成の分野で知られる数多くの保護基
を適宜組合せて用いる。

たとえばアミノ保護基としては、第三ブトキシカルボニ
ル（以下Ｒｏｅと記す）基、ベンジルオキシカルボニル
（以下Ｚと記す）基等が挙げられる。

グルタミン酸側鎖のカルボキシル基の保護基としては、
アルキル基、ベンジル基等が挙げられる。

アスパラギン酸を用いた場合にも同様な保護基が使用で
きる。ヒスチジンのイミダゾリル基の保護基としては、
ベンジル基、Ｚ基等が挙げられる。

活性エステル前駆体としては、ペンタクロロフェノール
、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド等が挙げられる。活性エステルにする縮合方法として
は、特に限定されないが、好ましくは縮合剤としてカル
ボジイミド類が用いられる。たとえば、Ｎ、Ｎ’−ジシ
クロへキシルカルボジイミドが挙げられる。

アミノ保護基の脱保護方法は、用いた保護基の種類によ
り異なり、Ｒａｃ基を用いた場合には、有機溶媒中ＨＣ
１を用い、Ｚ基を用いた場合には、酢酸中ＨＢｒを用い
る。

重合時に用いる第三級アミンは、特に限定されないが、
トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等が挙げられ
る。溶媒としては、アセトニトリル、塩化メチレン、ク
ロロホルム、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド等が挙げられる。好ましくはＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシドである。

側鎖官能基の脱保護は、酢酸中ＨＢｒ、ＨＦ、ケン化等
の方法の中から選択され、必要に応じてこれらを組み合
わせることにより行われる。

一般式（ＩＩ）にて示されるポリペプチドは、たとえば
、ポリ−Ｌ−グルタミン酸メチルを酸触媒存在下におい
てエチレンシアノヒドリンとエステル交換して得られる
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（β−シアノエチル）（以下Ｐ
ＣＮＧと記す）とカルボキシル基が保護されたヒスチジ
ンとを反応させることにより得られる［反応式（ＩＩ）
コ。

反応式（ＩＩ） −Ｎ）ＩＣ）ｉＣＯ− （ＣＨ２）２ −ＮＨＣ）ＩＣＯ− 番（ＣＨ２）２ ■ （式中Ｒ３は、カルボキシル保護基でありメチル基およ
びエチル基等の低級アルキル基、またはベンジル基等の
アラルキル基を表わす。）ＰＣＮＧ合成時合成砂る酸触媒としては、硫酸、ｐ−）
ルエンスルホン酸が挙げられる。また溶媒としては、塩
化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等
が挙げられる。好ましくは１゜２−ジクロロエタンであ
る。

ＰＣＮＧとカルボキシル基保護のヒスチジンとの反応に
おける溶媒としては、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド等が挙げられる。

このようにして得られる一般式（ＩＩ）で示されるポリ
ペプチドにおいて、側鎖に導入されるヒスチジン誘導体
の含量は、３ｍｏ１％未満では尿素分解素子としたとき
の活性が低く、また１０ｍｏ１％を越えると合成が困難
になるので、３〜ｌｏｍｏ１％が好ましい。

側鎖には２０〜５０ｍ０１ｚのメチル基と５０〜８０ｍ
ｏｌ：のβ−シアノエチル基が残存する。

本発明における尿素分解素子は、前記のようなポリペプ
チドとニッケル二価塩とを混合することにより得られる
。通常この尿素分解素子は水溶液として調製されるが、
この状態では、ポリペプチドのイミダゾリル基とカルボ
キシル基がニッケルに配位した錯体を形成しているもの
と推定される。

なお、−敏式（ＩＩ）にて示されるポリペプチドを用い
る場合には、ポリペプチドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド溶液に１．１当量程度の水酸化ナトリウム水溶液を
加え、エステル型保護基（前記の例では、メチル基、β
−シアノエチル基およびヒスチジンのカルボキシル基の
保護基）をケン化して脱保護する。そしてこの溶液を乾
固して得られる物質とニッケル二価塩とを混合して尿素
分解素子とする。

本発明においてポリペプチドと混合するニッケル二価塩
としては、フッ化ニッケル（■）、塩化ニッケル（■）
、塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物、過塩素を女ニッケル
（ＩＩ）六水和物、臭化ニッケル（■）、硫酸ニッケル
（ＩＩ）六水和物、硝酸ニッケル（ＩＩ）六水和物、チ
オシアン酸ニッケル（ＩＩ）等が挙げられる。好ましく
は、塩化ニッケル（ＩＩ）、塩化ニッケル（ＩＩ）六水
和物、過塩素酸ニッケル（ＩＩ）六水和物、臭化ニッケ
ル（ＩＩ）である。

特に好ましくは、過塩素酸ニッケル（ＩＩ）六水和物で
ある。

また添加するニッケル二価塩の量は、ポリペプチドに含
まれるイミダゾリル基に対し、ｌ／１６〜１（ＩＩｏｔ
／ｍｏｌ）が良く、最も好ましくは、ｌ／８〜１／２　
（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

本発明の尿素分解素子は、尿素の約８５％を室温、２時
間でアンモニアと二酸化炭素に分解することができると
いう高い活性を有している。

また本発明の尿素分解素子は、ｐＨ１から１１という広
い範囲で安定した尿素分解活性を示す。

これに対し天然ウレアーゼは、ｐＨ５以下では極端に活
性が低下する。すなわち本発明の尿素分解素子は、周囲
の環境に影響されにくいという条件を満たした尿素分解
素子である。

本発明の尿素分解素子は、固定化においても優れた長所
を有している。一般に酵素の固定化は、化学結合により
酵素をポリマー担体に固定する方法、あるいは中空ビー
ズ中に酵素を包接する方法が採られる。前者の化学結合
による酵素の固定化は、酵素と基質との接触を考慮する
と非常に有利であるため理想的な固定化方法と言える。

しかしウレアーゼのような天然酵素において、この前者
の方法を用いた場合、化学結合を形成するための試薬に
より目的以外の結合が形成され失活する恐れがある。こ
れは、酵素の各官能基が無保護であることが原因である
。ところが本発明で用いるポリペプチドは、まず各官能
基が保護されたポリペプチド（以下保護ポリペプチドと
記す）として合成される。そして脱保護の場所も保護基
の種類を還ぶことにより自由に行うことができる。すな
わち保護ポリペプチドの一部を脱保護してポリマー担体
と化学結合させることにより固定化できる。

たとえば保護ポリペプチドの末端カルボキシル基を脱保
護してポリマー担体に固定することができる。また末端
アミノ基あるいは側鎖官能基についても同様なことがで
きる。さらにまたペプチド合成における固相合成の手法
を用いれば、予めポリマー担体にアミノ酸を固定化して
おいて順次縮合することによりポリマー担体に固定化さ
れた保護ポリペプチドが得られる。以上のごとくボリペ
ブ〔実施例〕以下、実施例により本発明を具体的に説明するが本発明
は、これら実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において下記の略語は、次の通りの意味を
有する。

［アミノ保護基］Ｂｏｃ　　第三ブトキシカルボニルＺ　　ベンジルオキシカルボニル［カルボキシル保護基］０Ｂ２１　　ベンジルエステル［活性エステルコ０ＮＳｕ　　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステ
ル０Ｐｃｐ　　ペンタクロロフェノール活性エステル［ア
ミノ酸コＨｉｓ　　Ｌ−ヒスチジンＧｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸ｃｒｙ　　グリシンさらにまた、アミノ酸の略号の左側にアミノ保護基の略
号を記する場合は、アミノ酸のα−アミノ基が略号で示
される基で保護されたことを意味し、かっこで保護基の
略号を記す場合は、アミノ酸の側鎖官能基が略号で示さ
れる基で保護されたことを意味する。また、アミノ酸の
略号の右側にカルボキシル保護基の略号を記す場合は、
アミノ酸のα−カルボキシル基が略号で示される基で保
護されたことを意味する。さらに、アミノ酸の略号を列
記した場合は、列記したアミノ酸がペプチド結合で結合
していることを意味する。たとえば、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−０Ｐｃｐは、第三ブトキシカルボ
ニル−グリシル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエス
テルーα−ペンタクロロフェノール活性エステルを表わ
す。

さらにまた脱保護に用いる試薬は下記の意味を有する。

［脱保護試薬コ４Ｎ−）ＩＣ＋／シ゛オキサン無水塩化水素を４ｍｏｌ／２含むジオキサン溶液２５Ｘ
ｔｌＢｒ／酢酸無水臭化水素を２５重量パーセント含む酢酸溶液実施例ＩＧｌｕ（ＯＢｚｌ）　１１．９ｇ（０，０５ｍｏｌ）を
ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略す）　２００
ｍ１に懸濁させ、トリエチルアミン５．１ｇ（０，０５
ｍｏｌ）とＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＮＳｕ　１３．７ｇ（０
，０５ｍｏｌ）を加え一晩攪拌した。反応液を減圧下に
濃縮し、水に溶解しエーテルで２回洗浄して未反応物を
除去した。水層を酸性（約ｐＨ２）とし、酢酸エチルで
抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮す
ると油状のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）が２０
．２ｇ得られた。この油状物Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（
ＯＢｚｌ）とペンタクロロフェノール（以下ＰｃｐＯ■
と略す）　１３．３ｇ（０，０５ｍｏｌ）とをＤＭＦ　
３００ｍ１に溶解し、水冷下においてジシクロへキシル
力ルポジイミド（以下、ＤＣＣと略す）　１０．３ｇ（
０，０５ｍｏｌ）を少量ずつ加えた後、−ａｔ攪拌した
。生成したジシクロヘキシル尿素（以下、ＤＣＵｒｅａ
と略す）を炉別して炉液を減圧下に濃縮した。濃縮液に
メタノールを加えると、結晶としてＢｏａ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ（ＯＢｚｌ）−０Ｐｃｐが２２゜３８得られた。

一方、グリシル−し−ヒスチジン・２臭化水素酸塩７．
５ｇ（０，０２ｍｏｌ）を水５０ｍ１に溶解し次いでト
リエチルアミン３．０ｇ（０，０３ｍｏｌ）を加えた水
溶液を調製した。この溶液に先に合成したＢｏｃ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−０Ｐｃｐ　１６．１ｇ（０，
０２５ｍｏｌ）をＤＭＦ　１５０ｍ１に溶解した溶液を
加え２日間攪拌した。

反応液を減圧濃縮した後、水１００ｍ１を加えてエーテ
ルで２回抽出することにより副生じたＰｃｐＯＨの一部
を除去した。水層を酸性（約ｐＨ２）にすると不溶物が
析出した。この混合物にエーテルを加えて攪拌後、エー
テル層のみをスポイトで取った。この操作を２回行い未
反応物を除去した。水層を炭酸水素ナトリウムで中和し
、次に炭酸ナトリウム２．１ｇ（０，０１１ｍｏｌ）と
ベンジルクロロホルメート３．４ｇ（０，０２ｍｏｌ）
とを加え４時間攪拌した。反応液をエーテルで洗浄し未
反応のベンジルクロロホルメートを除去した後、水層を
酸性（約ｐＨ２）にし、酢酸エチルで抽出し、抽出液を
無水’ｆＪＲ’Ｍナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し
た。

ここで得られた粗製のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ
ｌ）−Ｇｌｙ−）１ｉｓ（Ｚ）とペンタクロロフェノー
ル５．３ｇ（０，０２ｍ。

１）とをＤＭＦ　１００ｍ１に溶解し、ＤＣＣ４，１ｇ
（０，０２ｍｏｌ）を少量ずつ加え一１ｔｉ攪拌した。

生成したＤＣＵｒｅａを炉別し、炉液を減圧濃縮し、濃
縮液にメタノールを加えると結晶としてＢｏｃ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−１１ｉｓ（Ｚ）−０Ｐ
ｃｐがｔ３．ｔ３得られた。

このＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｈ
ｉｓ（Ｚ）−０Ｐｃｐ　１２゜ｅｇ（０，０１３ｍｏｌ
）に４Ｎ−）ＩＣＩ／シ゛オ甘ン５せ■１を加え４時間
攪拌した後、反応液をエーテルに投入すると結晶として
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（０８ｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｚ）−
０Ｐｃｐの塩化水素酸塩が１１．５ｇ得られた。

このＧｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｚ
）−０Ｐｃｐ塩化水素酸塩０．Ｏ１３ｍｏｌをジメチル
スルホキシド５０ｍ１に溶解し、トリエチルアミン２．
０３（０，０２ｍｏｌ）を加え４日間攪拌した。反応液
をメタノールに投入すると順次配列を持ち側鎖官能基が
保護されたポリペプチド　（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ
）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｚ）］、、が粉体として　１．８
ｇ得られた。

この　（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−）１ｉ
ｓ（Ｚ）ｈ　１．８ｇに２５Ｚ）ＩＢｒ／酢酸２０ｍ１
を加え一晩攪拌した後、反応液をアセトンに投入し不溶
物を集めクロロホルムで洗浄後、減圧乾燥すると順次配
列を持つポリペプチド　（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈ
ｉｓ）、　（以下、「順次配列ポリペプチド」と略す）
の臭化水素酸塩が１．１ｇ得られた。

この「順次配列ポリペプチド」および中間体はＩＨ−Ｎ
ＭＲにより構造を確認した。

Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−０Ｐｃｐ’）ｌ
−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）　：　１．４（９Ｈ，ｓ）　２．
４〜２．８（４Ｈ，ｍ）３．７〜３．８（２）１．ｔ）
　５．０（ＩＨ，ｍ）５．１（２）１．ｓ）　　７．３
（５Ｈ，５）Ｂｏａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）Ｇｌ
ｙ−）１ｉｓ（Ｚ）−０Ｐｃｐ’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ
）　：　１．４（９）１．ｓ）　２．０〜２．７（２）
１．ｍ）３．０〜３．２　（２ＨＪ　ｍ　）３．９〜４．０（４Ｈ，ｍ）　５．１（２Ｈ，ｓ）５．
４（２Ｈ，ｓ）　７．３（６Ｈ，ｓ）７．４（５）１．
ｓ）　８．１（ＩＨ，ｓ）王Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
）１ｉｓ）。

’Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０）　　：　１．８〜２．２（２Ｈ
２ｍ）２．３〜２．５（２Ｈ，ｍ）３．１〜３．４（２Ｈ，ｍ）３．８〜３．９（４Ｈ，ｍ）４．３〜４．６（２１１，ｍ）　７．３（１）１．Ｓ）
８．６（１）１．ｓ）ここで得られた「順次配列ポリペプチド」の分子量はＧ
ＰＣにより１５００〜２０００であり、したがってＧｌ
ｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓの繰り返し数は４〜５であ
った。

この「順次配列ポリペプチド」と過塩素酸ニッケル（Ｉ
Ｉ）六水和物とを混合してなる尿素分解素子について、
以下の方法で尿素分解活性を狽す定した。

「順次配列ポリペプチドＪ　０．１ｇに過塩素酸ニッケ
ル（ＩＩ）六水和物０．０１３３　［ｒｌ１ｍ次配列ポ
リペブチド」中のイミダゾリル基に対して１／６（ｍｏ
ｌ／ｎｏｔ）　］を含む水溶液を加え尿素分解素子の水
溶液を調製した。この溶液のｐＨ値は４であった。なお
ｐＨ調整が必要な場合には、この段階でｐＨ調整を行っ
た。

次にこの尿素分解素子溶液の全量を５０−とし、１００
ｍｇ尿素／ｄ２水溶液を５−加えて室温で２時間かき混
ぜを行った。その後反応液の５−をガス通気可能な試験
管に取り、飽和炭酸カリウム水溶液を約１０ｒｎ！２加
えＡ液とした。他の通気可能な試験管にＮ／１０硫酸水
溶液５ｍｌを入れＢ液とした。Ａ液からＢ液に通気され
るように二つの試験管を接続して約２００ｎＬＩ２／分
の流速で空気を１時間以上通気した。この操作でＡ液中
にあったアンモニアをＢ液に捕集した。このＢ液中のア
ンモニア量をインドフェノール法を用いて測定すること
により尿素の分解量を計算した。その結果、８５％の尿
素が分解している事実が判明した。

比較例として、過塩素酸ニッケル六水和物を共存させず
に上記と同じ試験を行なったところ、尿素は分解してお
らず、アンモニアの発生は全く見られなかった。また、
過塩素酸ニッケル六水和物のみを用いた場合も、尿素の
分解はみられなかった。

また、尿素分解素子水溶液をｐＨ調整し同様に試験した
ところ、ｐＨ１で５１％、ｐＨ３で７３％、ｐＨ５で７
０％、ｐＨ７で６９％、ｐＨ９で５６％、ｐＨ１１で４
０％の尿素分解活性を示した。この結果から、この尿素
分解素子は広いｐ）（範囲で安定した活性を示すことが
判った。これに対しウレアーゼはｐＨ５以下では極端に
活性が低下すると言われている。したがって、この尿素
分解素子は、ウレアーゼにはない長所を有していること
が判った。

さらに、過塩素酸ニッケルの添加量をポリペプチドに含
まれるイミダゾリル基に対して１／１６〜１／２　（ｍ
ｏｌ／ｍｏｌ）の範囲で尿素分解素子水溶液を調製した
。そしてｐＨ４において同様に尿素分解活性試験を行っ
たところ、１／１６で４８％、１／８で８０％、１７６
で８５％、１／４て６８％、１／２て７５％の尿素分解
活性を示した。この結果１／１６（ｍｏｆ／ｍｏｌ）で
は、やや活性が低下するが、ｌ／８（ｍｏｆ／ｎｏｔ）
以上では高い活性を示すことが判った。

実施例２ポリ−Ｌ−グルタミン酸メチル（商品名アジコート、分
子ｆｆ１ｌｏｏ、０００、味の素社製、以下ＰＭＧと略
す）の１，２−ジクロロエタン１０％溶液５０ｇにエチ
レンシアノヒドリン５０ｇとｐ−）ルエンスルホン酸−
水和物ｔｏｇを加えて６０℃で攪拌した。

エステル交換反応で生成したメタノールは、減圧とする
ことで除去した。またメタノール除去時に溶媒も留去さ
れるので適宜溶媒を追加した。メタノール除去を繰り返
し７日間反応させた後、反応液をメタノールに滴下しポ
リ−Ｌ−グルタミン酸（β−シアノエチル）［以下ＰＣ
ＮＧと略す］を４．８３ｇ７９χの収率で得た。

生成物の確認は、Ｈｌ−ＮＭＲ（ＣＦ３ＣＯＯＤ）を用
い次のように行った。ＰＭＧ由来のピークδ＝４．８、
δ＝３．９、δ＝２．６５〜２．８、δ＝２．１〜２．
５のうちメチル基に相当するピーク（δ＝３．９）が、
減少し新たにシアノエチル基に相当するピークδ＝４．
５とδ：２゜９５が検出されたことて、生成物がＰＣＮ
Ｇであることを確認した。また両者の積分比からメチル
基＝２０ｍｏｌχ、シアノエチル基＝８０ｍｏｌＸであ
ることが判明した。

ＰＣＮＧ　１．２３３をＤＭＦ　５０＋ｄに溶解し、Ｌ
−ヒスチジンエチルエステルのＤＭＦ　５０ｍＱｉ液［
Ｌ−ヒスチジンエチルエステルの２塩酸塩９．０ｇ（０
，３５ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液にトリエチルアミン（０，
７ｍｏｌ）を加えた溶液］を加え８０℃にて２日間反応
させた。反応液をメタノールに滴下しＬ−ヒスチジンが
導入されたＰＣＮＧ（以下ＰＣＮ−ＨｉｓＧと略す）を
１．２ｇ　９１％の収率で得た。

生成物の確認は、Ｈ’−ＮＭＲ（ＣＦ３ＣＯＯＤ）を用
い次のように行った。ＰＣＮＧ由来のピークの他にイミ
ダゾリル基に相当するピーク　δ＝８．０５、δ＝８．
６５とエチルエステルに相当するピーク　δ＝１．４〜
ｌ。

５、δ＝３．３〜３．４が検出されたことで、生成物が
ＰＣＮ・旧ｓＧであることを確認した。また、それぞれ
の積分比から導入比は、メチル基＝２４ｍｏｌ＄、シア
ノエチル基＝　７０ｍｏ　１　％、ヒスチジン誘導体＝
６ｍｏｌ＄であることが判明した。

ここで得られたＰＣＮ−）１ｉｓＧ　１．０ｇをＤＭＦ
　５０艷に溶解してＩＮ水酸化ナトリウム水溶液７．６
−を加えてエステル基をケン化して除去した。この溶液
を減圧下で溶媒を除去するとＬ−ヒスチジンが６ｍ０１
％導入されたポリグルタミン酸く以下Ｐ）ＩｉｓＧと略
す）が得られた。

Ｐ　ＣＮ−ＨｌｓＧ　１．Ｏｇから得られたＰＨ１ｓＧ
に過塩素酸ニッケル０．０１９ｇ　［Ｐ　ＨｉｓＧに含
まれるイミダゾリル基に対して１／６　（ｍｏｌ／ｍｏ
ｌ）　］を含む水溶液を加え尿素分解素子を調製した。

この尿素分解素子水溶液ＯｐＨ値は９であった。そして
実施例１と同様に尿素分解試験を行ったところ、尿素の
４０％が分解されることが判った。

〔発明の効果〕

本発明の尿素分解素子は、新規なものであり、尿素の８
５％を室温、２時間でアンモニアと二酸化炭素に分解す
ることができ、また合成ポリペプチドを用いるためポリ
マー担体への固定化が容易であり、さらに固定化による
活性低下の心配が無いので、ウレアーゼを用いる分野特
に人工腎臓や尿素センサー等に有用であることが期待さ
れる。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社代表者　西用禮二

Claims

【特許請求の範囲】

（１）側鎖官能基としてカルボキシル基を有するアミノ
酸および側鎖官能基としてイミダゾリル基を有するアミ
ノ酸との両者を構成成分として含むポリペプチドとニッ
ケル二価塩とを混合してなる尿素分解素子。
（２）一般式（ I ）にて示されるポリペプチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式（ I ）（式中Ｒ＾１、Ｒ＾２は、互いに同一または相異なって
それぞれ水素原子、アルキル基およびアラルキル基を表
わす。また式中ｍは１または２の整数を表わし、ｎは３
ないし１０の整数を表わす。）
（３）一般式（ I ）にて示されるポリペプチドとニッ
ケル二価塩とを混合してなる尿素分解素子。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式（ I ）（式中Ｒ＾１、Ｒ＾２は、互いに同一または相異なって
それぞれ水素原子、アルキル基およびアラルキル基を表
わす。また式中ｍは１または２の整数を表わし、ｎは３
ないし１０の整数を表わす。）
（４）一般式（II）にて示されるポリペプチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式（II）［式中ｐは、５０ないし１５０の整数を表わす。また式中Ｘの少なくとも一部は、一般式（III）にて示
されるヒスチジン誘導体である。また式中Ｘは、エステ
ル型保護基が結合したオキシ基を包含する。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式（III）（式中Ｒ＾３は、アルキル基またはアラルキル基を表わ
す。）］
（５）一般式（II）にて示されるポリペプチドをケン化
しエステル型保護基を脱保護した物質とニッケル二価塩
とを混合してなる尿素分解素子。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式（II）［式中ｐは、５０ないし１５０の整数を表わす。また式中Ｘの少なくとも一部は、一般式（III）にて示
されるヒスチジン誘導体である。また式中Ｘは、エステ
ル型保護基が結合したオキシ基を包含する。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式（III）（式中Ｒ＾３は、アルキル基またはアラルキル基を表わ
す。）］