JPH0276581A - 微生物の包括法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、発酵法に使用可能な微生物またはその一部を
ゲル中に閉じ込めるための、改善された方法（包括法）
に関する。

（従来の技術） よく知られているように、発酵法は、固定化された微生
物またはその一部（例えば、胞子懸濁液、細胞片、気中
菌子、完全栄養細胞培地、増殖培地等）により、非常に
有利に行なうことができる。

固定化の目的は、発酵における生体触媒として適用され
る微生物を反応容器内に留め、反応容器から流出する流
れによって洗い出されることを防ぐことにある。微生物
を固定化形で用いると、生体触媒の安定性（寿命）を改
善でき、また、触媒反応による単位容量光たりの生産効
率を改善でき、しかも発酵を連続的に行なうことができ
る。

固定化の１つの可能な方法は生体触媒を繊維やゲルの空
所に閉じ込めることである。ポリアクリルアミドのよう
な合成ゲルや天然源のゲル形成物質は、この目的に等し
く使用することができる。

ペニシリウム・クリソゲナム（ｆ’ｃｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）分生胞子、菌子および原
形質は、ゲル中に閉じ込めると、常法によりペニシリン
Ｇの生合成に適用できることが知られており〔ハ゛イオ
テク１０シ゛イ・アンド・ハ゛イオエンシ゛二γリンク
゛（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、）２６巻、
１９８４年〕、また、ポリアクリルアミド〔ハ゛イＡテ
クノロジゝイ・γントゝ・ハ゛イオエンシゝニアリンク
″（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　、Ｂｉｏｅｎｇ。

）２１Ｌ２６１頁、１９７９年〕およびアルギン酸カル
ンウムゲル　〔ユーロ・シ゛エイ・７７°ル・マイクロ
バ゛イオール・ハ゛イＡチクノール（ｌシｕｒ、Ｊ、Ａ
ｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、
）１５巻、２１１頁、１９８２年〕を閉じ込め用のゲル
として用いることが知られている。

また、ポリアクリルアミド中に閉し込められたエンエリ
キア・コリ（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ　Ｃ０１ｉ）の
細胞は、６−アミツーベニソラン酸の生合成に利用でき
ることが知られている〔ニーａ・ン゛召・γ７°ル・召
りロハ゛イオール（Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、）２巻、１５３頁、１９７６年〕。

キトサン（ｋｉＬｏｚａｎｅ）中に閉じ込めらイ′また
プレウロタス・オステアラス（ＰＩｕｒｏＬｕｓ　ｏｓ
ｔｅａｔｕｓ）細胞を、６−アミツーベニソラン酸の生
合成に用いることも報告されている　〔へ゛イオテクノ
ロゾ゛イ・レタース゛（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｌｅｔ
ｔ、）４巻、２９３頁、１９８２年〕。バイオチクノロ
シイ・アンド・バイオエンジニアリング（２３巻、２７
４７頁、１９８１年）によれば、ポリアクリルアミド中
に閉じ込められたストレプトマイセス・クラブリジェル
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒ
ｕｓ）細胞はセファロスポリンＣの生産に用いられてい
る。ポリアクリルアミドゲル中に閉じ込められｌニバヂ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ、細胞をバシトラシンの
生産に用いることも報告されている　〔アンチマイクロ
バイフル・エージェント・γンド・ケモセラフイ（Ａｎ
ｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａｇｅｎｔｓ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
、）１５巻、１２６頁、１９７９年、バイオチクノロシ
イ・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、）２２巻、１０１５頁、１９８
０年〕。また、アルギン酸カルシウム中に閉じ込められ
たストレプトマイセス細胞をヂロシンおよびニコマイン
ンの生産に利用できることも知られている〔ユーロ・シ
゛１イ・７ブル・マイクロバ゛イオール・ハ゛イオｔク
ノール（Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、）１５巻、２０６頁
、１９８２年〕。カリウム・キャラギネート中に閉じ込
められたペニシリウム・ウルチカエ・コンシア（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｕｒｔｉｃａｅ　ｃｏｎｄｉａ）は
、パラリンのグルコースからの生産に使用されている〔
バイオチクノロシイ・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
、Ｌｅｔｔ、）５巻、１２５頁、７８５頁、１９８３年
〕。

ポリアクリルアミドを包括剤（エントラ１ピング・エー
ジェント）として用いる場合、ゲル化過程で形成される
遊離基は、激しい細胞損傷を引き起こし、またある種の
酵素の機能を阻害しうる。イオン親和性ゲル形成剤、例
えばアルギン酸塩、ギー＼・ラギネート等はゲル形成工
程に必要な金属イオンが細胞毒となりうる点で、不利で
ある。そのノこめ、前記した公知の方法は、発酵法に利
用可能な微生物または微生物部分のうち、ごく限られた
範囲についてのみ成功しているにすぎない。

発酵法に利用可能な微生物または微生物部分を寒天ゲル
中に閉じ込めることにより、これらを固定化することが
有利である。よく知られているように寒天ゲルは、微生
物の培養に用いられる栄養培地のうち、最も通常の成分
であり、微生物に対し有害な効果を全く与えず、また生
７ｆ細胞および胞子に対し最適の生存条件を保障する乙
ので、そのゲル構造は系内における菌糸の発現に適して
いる。

微生物の寒天ゲルへの閉じ込め（包括）はバイオチクノ
ロシイ・アンド・バイオエンジニアリング（ＢｉｏＬｅ
ｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、Ｘ１７巻、１７２９頁、１
９７５年）お上びマイクロバイオし１ジヤ（Ｍｉｃｒｉ
ｂｉｏｌｏｇｉｙａＸ４９巻、４７９頁、１９８０年）
に開示されている。上記文献に開示の方法によれば、寒
天２〜４重出％含有水溶液をゲル化点近くの温度に冷却
し、これを、エシャリキア・コリまたはメヂルオモナス
（Ｍｅｔｈｙ　ｌｏｍｏｎａＳ）の細胞＠副液と均一に
し、得られた混合物を冷却蒸留水またはリン酸緩衝液中
に滴下するかまたはブロック形に固化し、次いで粉砕し
ている。

（発明が解決しようとする課題） 公知方法の不利な点は、水中？こ滴下した場合、固化し
たゲル粒子の形状および寸法が非常に広範に変化するこ
とである。得られノコ粒子の形状（繊維形、半球体、不
規則体など）および寸法が著しく不均一な分布を示し、
このような粒子を用いれば、かかるゲル粒子の存在下で
は発酵媒体の均一な流れを保障することができなく、か
つ液体流が、該液体からの分離が非常に困難なゲル粒子
を洗い流すという、欠点を示す。他方、同化寒天ブロッ
クは、粉砕が非常に困難であり、扱いにくい。ゲル粒子
が規則的な球体形と狭い範囲の寸法を有すれば、発酵法
に最良の結果をもって適用することができるが、このよ
うな粒子は、前記した公知方法では製造することができ
ない。

（課題を解決するだめの手段） 本発明者らはゲル形成法について鋭意検討した結果、ゲ
ル形成法の媒体として利用される液体の物性が、形成ゲ
ル粒子の形状および寸法を決定する要因であることを見
出したのである。本発明者らの知見によれば、規則的な
球体形と狭い範囲の寸法（一般的には１〜５Ｒすは、加
温（４５〜５０℃）液体寒天溶液を、微生物に対し有害
な効果を与えずかつ以下に示す物性値を有する（Ｔ機溶
媒または溶媒混合液に滴下し、かつ小滴の沈降速度が０
．０１ｃｍ／秒以上である場合に、はじめて得ることが
できるのである。

溶解度／水：１０＋７／１００ｇ未満 密度：１．２ｇ／ｃπ３未満 粘度（２０°Ｃで測定）＋　　１０〜１００ｃｐ沸点、
７５〜２５０℃ （発明の詳説） −７〜 本明細書に用いられる「発酵法に使用される微生物また
は微生物部分」なる語は、発酵目的に適用可能な存在し
うる微生物全ての形態を意味し、問題となる微生物の栄
養培地、胞子懸濁液、単離細胞、分生胞子、菌子、細胞
片、増殖培地、細胞成分等が挙げられる。

ゲル形成において液体媒体として使用される有機溶媒ま
たは溶媒混合物は、好ましくは０．８〜１　、　ｌ　ｇ
／ａｍ３の密度であって、その水溶解度は、好ましくは
０．１〜１０ｇ／水１００ｇである。さらに重要な要件
は、有機溶媒中に滴下したゲル小滴が該溶媒において浮
」ユしないこと、すなわち小滴の沈降速度がＯ，０１ｃ
ｍ７秒を越えねばならないことである。沈降速度は、好
ましくは０．０５〜ｌＱｃｍ／秒である。

本発明に従えば、ゲル形成用の液体媒体として、例えば
酢酸エチル、イソオクタノール、シクロヘキサノン、ｎ
−アミノアルコール、ベンジルアルコール、アセト酢酸
エチル、これらの溶媒の混合液、メチル・イソブチル・
ケトン１０容量％含有アセト酢酸エチルを用いることが
できる。

ゲルビーズの形成を促進するには、液体媒体を０〜１０
°Ｃに冷却することが好ましい。所望により、不活性ガ
スをゆっくりとした流Ａ１で液体媒体中に導入して、形
成されたゲル粒子の相互付着を防止することができる。

得られたゲルビーズはろ過により分離することができる
。所望により、分離したゲルビーズは、蒸留水で洗浄し
て溶媒を除去し、次いで乾燥する。

（実施例） つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。

実施例１ 胞子懸濁液（５ｘ１０’胞子／Ｃ１１３）を、滅菌蒸留
水を用い、ストレプトマイセス・ラベンデュレ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ａ　Ｔ　
ＣＣｌ　２９５０の斜面寒天培地（７〜８日令）から、
生成した。得られた胞子懸濁液１０ｃｍ’を４重量％水
性寒天溶液９０ｃＲ”に加え、１２１℃で３０分間滅菌
し、次いで５０℃に冷却した。得られた混合物をゼン動
ポンプにより、冷却（５℃）イソオクタノール（２−エ
ヂルヘキサノール）＋０００ｃｍ’に滴下した。

これらの操作には滅菌した用具を用いた。窒素をイソオ
クタノール媒体中にゆっくりした流れで通して、ゲルビ
ーズの相互付着を防止した。滴下終了後、窒素の導入を
４〜５分間続け、次いでゲルビーズをろ取し、ツイーン
８０（０，０２重量％）含有滅菌蒸留水で洗浄した。規
則的な球体形のゲルビーズ（直径１〜５龍）を得た。

上記方法において、イソオクタノールに代えて、酢酸エ
ヂル、ンクロヘキザノン、ｎ−アミノアルコール、ベン
ジルアルコールまたはアセト酢酸エヂルを用いることに
より、同様な結果が得られた。

」只ス 斜面寒天培地（大豆粉０．５重量％、グルコースＩ　０
重量％および繊維状寒天２．０重量％）上に培養したス
トレプトマイセス・アグリラセウム（ａｇｒｉｌｌａｃ
ｅｕｍ）の胞子懸濁液を、以下の成分の培地に接種し、
＋２１’ｃ２０分間滅菌し、次いで室温まで冷却した。

ハシバミの実のあら粉　　　　２．０重量％（ハゼルナ
ッツ・ミール） 加水分解カゼイン　　　　　　０．２重里％グリセロー
ル　　　　　　　　４．０重量％塩化ナトリウム　　　
　　　　０．３重量％炭酸カルシウム　　　　　　　０
５重量％（水道水を満たした培地のｐｌ（は、滅菌＋ｉ
ｉｆ　７　、０である）培地を４８時間、３２℃にて速
度３６０　ｒ、ｐ、ｍ。

で振とうした。得られた栄養培地Ｉ（Ｒｎ３を４５℃の
４％寒天水溶液９０Ｇ１１３に加え、得られた混合物か
ら実施例１記載と同様にしてケルビーズを形成した。

実施例３ ストレプトマイセス・ジアスタトクロモゲネス（ｄｉａ
ｓｔａｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ｖａｒ、　ＲＯ−
３１（Ｍ　Ｎ　Ｇ　００３６６）の胞子を以下の成分か
らなる斜面寒天培地」二に形成した。

酵母エキス　　　　　　　　　０１重量％肉エキス　　
　　　　　　　　０１重量％トリプトン　　　　　　　
　　　０２重量％１ｌ−− ＦｅＳＯ４３ｘ　Ｉ　Ｏ−’重量％ グルコース　　　　　　　　　１．０重量％Ｎａ２ＨＰ
　０４　　　　　　０　、７１３重量％ＫＩ−Ｉ２Ｐ０
．　　　　　　　０．３６３重量％洗浄繊維状寒天　　
　　　　　２．０重量％（水道水を満たした培地のＩ）
ＩＩは、滅菌前７．０である）約７〜８日令の胞子形成
培地を滅菌蒸留水または生理的食塩水で洗い落とし、胞
子懸濁液の濃度を３Ｘ１０６胞子／ｃ１１３に調節した
。得られた胞子懸濁液を実施例１記載のように処理して
寒天ゲルビーズを形成した。

割敬Ｗ± ８ＸＩ０８細胞／滅菌蒸留水１　ａｍ３含有細胞懸濁液
を、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ、　
Ｎ　ＣＡ　Ｔ　Ｍ８００１００３の斜面寒天培地（４日
令）から調製した。胞子懸濁液１０ｃｍ３を、滅菌加温
（４５°Ｃ）４％寒天水溶液９０ｃｍ３に加え、この混
合物から実施例１と同様にしてケルビーズを形成した。

以下の組成の培地を１２１℃で２５分間滅菌し、次いで
室温に冷却した（培地のＩ）ＩＩは滅菌前、６，０であ
る）。

コレステロール　　　　　　１．０小量％糖類　　　　
　　　　　　　０　、５１Ｉ￥量％大豆粉　　　　　　
　　　　０　、７　ＴＴｉ量％粗ヒマワリ・レンチン　
　　０．５１１’ｊ屯％ツイーン６０　　　　　　　０
．２重量％ＫＩ（、Ｐ　０．　　　　　　　　０　、１
　ｉＴｆ量％ＣａＣＯ３０，Ｉ　ｆｆｉ量％ ＮａＣ（ｌ　　　　　　　　　　　Ｏ，１重量％Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ７ＯＯ，０５重量％ス）・ラクトール
（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ）　　Ｏ，しＲ量％培地に、前記し
たようにして得ノニケルビーズを接種し、次いでプレー
ン・シェイカーにより３日間、３０℃にて速度３００　
ｒ、ｐ、ｍ、で振とうした。

得られた肉汁のコレステロール・オ；）−ノダーゼ・レ
ベルを、アラインら（Ａｌｌａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）の
方法により測定した。

実施例５ ストレプトマイセス・ルブリファシエンス（ｒｕｂｒｉ
ｆａｃｉｅｎｓ）株の胞子を、実施例１記載の組成を有
する斜面寒天培地に形成した。約４〜５日令の胞子形成
培地を滅菌蒸留水または生理食塩溶液で洗い落とし、胞
子懸濁液の濃度を約５ＸＩ００胞子／ａｍ３に調節した
。寒天ゲルビーズを、得られた胞子懸濁液から実施例１
と同様にして生成した。

以下の組成を有する寒天培地を１２１℃で２５分間滅菌
し、次いで室温まで冷却した（培地のｐＨは、滅菌前７
である）。

酵母エキス　　　　　　　０１重Ｍ％ 肉エキス　　　　　　　　Ｏ１重量％ トリプトン　　　　　　　　０２重量％ＦｅＳ　０４　
　　　　　３　Ｘ　１０−’重量％グルコース　　　　
　　　１．０重量％寒天　　　　　　　　　　２０重量
％ 培地に、得られたゲルビーズを接種し、この培地をプレ
ーン・シェイカーにより５〜６日間、２８℃にて速度２
８　Ｏｒ、ｐ、ｍで振とうした。生成した抗生物質を公
知の薄層クロマトグラフィー法で検出した。

実施例６ ミクロモノスポラ・インヨエンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎ
。

５ｐｏｒａ　１ｎｙｏｅｎｓｉｓ）Ａ　Ｔ　Ｃ０２７６
００株の胞子を実施例３記載の組成を有する斜面寒天培
地上に形成した。

約７〜８日令の培地を滅菌蒸留水または生理食塩水で洗
い落とし、濃度約６ｘ１０６１ａ子／ｃｒｙｔ”の胞子
懸濁液を形成した。寒天ゲルビーズをこの胞子懸濁液か
ら実施例Ｉ記載と同様に形成した。

得られたゲルヒーズを用いて、実施例５の組成を有する
滅菌液体培地に接種し、培地をプレーン・シェイカーに
より５〜６日間、２８℃にて速度２８０　ｒ、ｐ、ｍ、
で振とうした。

生成した抗生物質は、測定用の微生物としてバチルス・
スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｂｔｉｌｌｕｓ）を
用い、常法で検出することができた。

特許出願人　レアナル・フィノムヴエヂイセルヂアール 代理人弁理士青山　葆　はか１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発酵法に使用される微生物または微生物部分をゲル
   中に閉じ込めるにあたり、 微生物または微生物部分を４０〜５０℃の液体寒天溶液
   と混合し、次いで得られた混合物をゲル形成液体媒体中
   に滴下すること、 上記ゲル形成液体媒体が、微生物に対し有害な効果を与
   えずかつ以下に示す物性値： 溶解度／水；水１００ｇに対し１０ｇ未満 密度；１．２ｇ／ｃｍ＾３未満 粘度（２０℃で測定）；１０〜１００ｃｐ 沸点；７５〜２５０℃ を有する有機溶媒または溶媒混合物であること、および 上記小滴の沈降速度が、０．０１ｃｍ／秒以上であるこ
   と を特徴とする微生物または微生物部分の包括法。 ２、ゲル形成液体媒体が、水溶解度０．１〜１０ｇ／１
   ００ｇを有する有機溶媒または溶媒混合物である請求項
   １記載の方法。 ３、ゲル形成液体媒体が、密度０．８〜１．１ｇ／ｃｍ
   ＾３を有する有機溶媒または溶媒混合物である請求項１
   または２記載の方法。 ４、小滴の沈降速度が、０．０５〜１０ｃｍ／秒である
   請求項１〜３の１項に記載の方法。 ５、ゲル形成液体媒体が、酢酸エチル、イソオクタノー
   ル、シクロヘキサノン、ｎ−アミルアルコール、ベンジ
   ルアルコール、アセト酢酸エチル、またはこれら溶媒の
   混合液である請求項１〜４の１項に記載の方法。 ６、ゲル形成液体媒体の温度が、０〜１０℃である請求
   項１〜５の１項に記載の方法。