JPH0254078B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は動脈硬化症、特に粥状硬化症の血管病
巣部位を抗原として認識し、結合するモノクロナ
ル抗体に関し、さらにこのモノクロナル抗体の１
種または２種以上を含有してなる動脈硬化巣反応
試薬に関する。 従来技術および問題点 粥状硬化症（アセロスレローシス：
Atherosclerosis）は大動脈、冠動脈および脳動
脈の筋型動脈等に多く発生し、心筋梗塞、脳梗塞
等の主因となる病気である。 その成因はまだ明らかになつていないが、大動
脈を例にとると、正常な大動脈は内皮細胞よりな
る内膜、弾性繊維と中膜平滑筋よりなる中膜、弾
性繊維よりなる外膜の３層構造からなるものであ
るが、この大動脈が何らかの原因でこの内膜と中
膜の境界の内膜側に肥厚が生ずることが、粥状硬
化症の特徴で、この肥厚部には、 イ 中膜平滑筋細胞の遊走と増殖、 ロ 細胞内に大量の脂質を取り込んだ泡沫細胞の
発生、 ハ 結合組織、カルシウム塩の沈着、 ニ 細胞外脂質沈着、 ホ 血栓形成、 等が起こつている事が報告されている。 従来の動脈硬化症の検査方法としては、人体を
直接被検体とする方法として、音波の伝搬速度
や反射エコーを利用する方法、血管像映により
映像を直接観察して検査する方法等がある。 他方、間接的な検査方法としては、人体から血
液を採取し、これを検体とし、血中コレステロー
ル値、リポタンパクの分析、凝固因子の検査から
危険度を評価し、血圧等の変化を含めて、硬化度
を予測する方法がある。前記の方法は解像度が
悪く確度が良くない欠点があり、前記の方法は
危険度が高く、機械的操作が煩雑で技術的に難し
い欠点があり、前記間接法は危険因子を観ている
だけで動脈硬化巣を直接観るものでなく、かつ危
険因子と動脈硬化巣の状態が必ずしも相関するこ
とが確認されていないことから、確度の高い検査
法と言えないという欠点があつた。従つて、手軽
にでき、安全で、動脈硬化病巣に特異性の高い検
査診断法が望まれている。 また治療においては、今のところ抗高脂血症薬
の投与と食事療法の併用が主流である。 この抗高脂血症薬は文字通り高脂血症の脂質濃
度を下げる目的で使われており、直接動脈硬化巣
に作用するものではなく、脂質濃度を下げても動
脈硬化が治るという相関関係はまだ確認されてい
ない。 すなわち、この療法は動脈硬化巣に直接作用す
るものではなく、その危険因子をわずかに軽減さ
せる働きしかなく、病巣そのものを直接攻撃対象
として治療を行なえるものではない。しかもその
抗動脈硬化作用および治療効果は十分でないとい
う欠点があつた。このようなことから現在、動脈
硬化巣に直接作用する治療薬が求められている。 問題点を解決するための手段 本発明は前述した問題点を解決するもので、本
発明者等が動脈硬化巣に直接作用する治療薬を提
供すべく研究を重ねた結果、動脈硬化巣に存在す
る物質を抗原として認識し、このものに特異的に
結合することのできるモノクロナル抗体を見出
し、本発明に到達したものである。 すなわち本発明は動脈硬化巣の血管病巣部位を
抗原として認識するモノクロナル抗体に関するも
のである。 動脈硬化病巣部位はいずれも抗原となり得る
が、特に治療および診断の観点から好ましい血管
病巣部位の抗原としては粥腫または泡沫細胞を挙
げることができる。 本発明のモノクロナル抗体は正常な血管は認識
せず、動脈硬化巣、例えば血管病巣部位の粥腫又
は泡沫細胞を認識し、これらに特異的に結合する
ことができるのである。 本発明のモノクロナル抗体は、抗動脈硬化症血
管病巣部位抗体産生細胞とミエローマ細胞との融
合細胞から産生することができる。この製造方法
について更に詳しく述べると、まず病巣部を用い
て動物を感作する。病巣部としては上記のように
粥腫または泡沫細胞が好ましい。次いで感作され
た動物と脾臓（外に胸腺、末梢リンパ節、末梢血
等）より感作細胞を単離して抗動脈硬化症血管病
巣部位抗体産生細胞を得、これをミエローマ細胞
（Myeloma cell）と融合させ、抗体産生性融合
細胞（Hybridoma）を得る。この融合細胞を複
数のウエルに分注し、培養し、各ウエルのその上
清を間接蛍光抗体法等の手段により分析し、動脈
硬化巣のみに特異的に結合し、正常な血管には結
合しないモノクロナル抗体を選択した。この選択
したモノクロナル抗体を産生する融合細胞を更に
培養してモノクロナル抗体を製造することができ
る。 一方、このモノクロナル抗体は動脈硬化症の進
展等を測定する反応試薬として用いることができ
るものである。すなわち、この抗体の認識する抗
原のあるものは、その一部が血流中に流出するの
で、その場合は採取した血清を、モノクロナル抗
体を反応試薬として、例えば酵素、放射性同位元
素、蛍光物質等の標識物質を結合せしめて種々の
免疫測定法、例えば酵素免疫吸着法などにより、
その流出抗原を定量することにより動脈硬化の進
展度を予測することができる。 又、この抗体を検査に用いる場合は、一つの方
法として金コロイド等を結合させた抗体のＦ
（ab）₂鎖を血中投与して病巣部に集まる金コロイ
ドを用いた動脈シンチグラムを行うことにより病
巣の局在性と大きさを評価することができる。 このようにして、動脈硬化症血管病巣部位を抗
原として得られる抗体産生細胞である抗動脈硬化
症血管病巣部位抗体産生細胞とミエローマ細胞と
の融合細胞からのモノクロナル抗体は、その１種
または２種以上を用いることにより動脈硬化症の
反応試薬として使用される。 この抗体を治療に用いる場合、モノクロナル抗
体を血管内に投与して病巣部との間に免疫複合体
を形成させる。この複合体はそれ自体で白血球の
遊走能があり、この複合体により補体が活性化さ
れ、それにより多核白血球（PMN）、次いでマ
クロフアージの動員が起こる。動員されたマクロ
フアージは自らのFc受容体（Fc Receptor）を
介して複合体に結合することにより貪食機能が活
性化される。この複合体を貪食したマクロフアー
ジがそのまま血中へ流出することにより、病巣部
の退縮が起こり、動脈硬化症は治癒するものであ
る。 作 用 抗動脈硬化症血管病巣部位抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞との融合細胞から得られ、動脈硬化巣
の血管病巣部位を特異的に認識する本発明のモノ
クロナル抗体は、正常な血管は認識せず、動脈硬
化巣、すなわち血管病巣部位の例えば粥腫または
泡沫細胞を認識し、これらに特異的に結合するこ
とができるものである。従つてこのモノクロナル
抗体に標識物質を結合せしめて血管内に投入し、
動脈硬化の部位、進展度を予測することが可能で
診断薬としても利用できる。また該モノクロナル
抗体と病巣部との間の免疫複合体は、それ自体、
マクロフアージの動員効果、ひいてはマクロフア
ージの貪食機能の活性化を促し、動脈硬化症の治
療にも有効なものである。 実施例 以下、実施例に基いて本発明をさらに詳細に説
明する。本発明はこれらの実施例に限定されるも
のでないことは言うまでもない。 (1) 抗原の調製方法 WHHL―ラビツト（月齢20ケ月前後、体重2.8
〜3.0Kg）の雌のホモ（homo）をネンブタール麻
酔下に放血死させた後開胸し、胸部大動脈を得
た。抗原採取用ラビツトとしては、胸部大動脈が
ほとんど一様に肥厚し、内膜と中膜の湿重量は
1.0〜1.5ｇであり、正常ラビツトのそれより２〜
３倍重いものを数匹選択した。 次に選択したラビツトの胸部大動脈の外膜を剥
ぎ取つて、肥厚部を主とした内膜と中膜部位を取
り出し、それをハサミで１mm角に細切した後、ポ
リトロンホモゲナイザー（polytron
homogenizer）にかけ、ホモゲネイト
（homogenate）を調製した。 全ての操作は1mMEDTA，0.1％エタノールを
含む0.25Mサツカロース溶液（PH7.5）（以下
0.25M SVEという）中にて行なつた。このとき、
0.25M SVEの使用量は内膜と中膜部位の湿重量
１ｇ当り５〜10mlの割合であつた。 このホモゲネイトを４重のガーゼで瀘過し、瀘
液を遠心分離管に取り、その上に等量の1mM
EDTA，0.1％エタノール含有溶液（PH7.5，密度
はサツカロースを含まないので0.25M SVEより
小さい）（以下OVEという）を重層し、不連続密
度勾配を形成させ220×ｇ，30分間遠心した。 この遠心操作により比重の小さい蓄積脂質を
OVE層に回収除去した。更に0.25M SVE層に残
つた蛋白性物質（膜成分を含む）に予め−20℃迄
冷却しておいた４倍量のアセトンを加えてよく撹
拌し、−20℃に30分間放置した。 この冷却操作により生じた沈澱画分を０℃，
1000×ｇ，30分間遠心して集め、リン酸緩衝生理
食塩水（PBS）をSVE量と等量加えて分散させ、
抗原液とした。この溶液は２〜５mg／mlの濃度の
蛋白質を含み、以下、アセトン―パウダー溶液と
して、抗原分画に用いた。 (2) 動脈硬化巣特異的モノクロナル抗体の製造方
法 ２頭のBALB／ｃのマウスの雌（８週）を、
前記(1)で調製した抗原溶液とそれと同量のフロイ
ンド（Freund）の完全アジユバント
（Adjuvant）の混合溶液で免疫した。１頭当り
0.2mlの抗原溶液を使用した。31日後、免疫マウ
スを抗原溶液とそれと同量の不完全アジユバント
の混合液で免疫した。65日後、免疫マウスを0.25
ml／マウスの抗原溶液で免疫した後、３日後に脾
臓を摘出し、脾臓細胞（Spleen Cell）を得た。
脾臓細胞数は4.4×10⁸個であつた。これを予め培
養しておいたミエローマ細胞（P3―U1）4.8×
10⁷個と50％ポリエチレングリコール〔メルク
（Merk）社製PEG4000〕溶液の存在下に混合し
た。 これを96穴マイクロプレートに１ウエル当り
4.5×10⁵個の脾臓細胞を含むよう分注し、合計10
プレート、980ウエルに分注した。常法によりハ
ツト（HAT）選別を行い、ハイブリドーマを成
育させた。その結果、980ウエル中、99％の974ウ
エルでハイブリドーマの成育が見られた。 ハイブリドーマの成育したウエルの上清を酵素
免疫吸着法（酵素免疫定量法ともいう）により分
析した。 抗原として前記のアセトン―パウダー溶液を33
倍に希釈した溶液を、イムノプレート（ヌンク社
製）に吸着させ、２次抗体としてアルカリ性ホス
フアターゼ結合マウスｇ（Ｍ＋Ａ＋Ｇ）を用い
た。アルカリ性ホスフアターゼの基質であるパラ
ニトロフエニルホスフエートの発色の強さに応じ
て全体を５グループに分け、強い方から２つのグ
ループ（第１のグループは78ウエル、第２のグル
ープは284ウエルで合計362ウエル）について顕微
鏡下で間接蛍光抗体法により分析した。 この中から特異的な染色性を示す50ウエルを選
択し、継代培養後、再度分析し、重複したものを
除いて、全部で11個のハイブリドーマを限界希釈
法でクローニングした。 さらに２回のクローニングを行い、最終的に８
個のクローン２０１Ｆ，２１２Ｄ，２１２Ｅ，３
０５Ｄ，４０３Ｄ，５１０Ｄ，８０９Ａ，９０４
Ｂを得た。それぞれのクローン化した細胞の培養
上清を用いて間接蛍光抗体法により染色した結果
および各免疫グロブリンのクラス判定結果を第１
表に示す。 ２１２Ｅと４０３Ｄは動脈硬化を生じていない
もの（normal）の内皮細胞や、中膜平滑筋細胞
も染色したが、他の６クローン抗体は病巣部位の
みを特異的に染色した。 これらの８個のクローンは各々、0.5mlのプリ
スタンで１週間前に処理したBALB／ｃマウス
に、１×10⁷個細胞／mlの条件で腹腔に移植し、
増殖せしめた。その後、これらの腹水を採取し、
硫安で免疫グロブリン分画を沈澱せしめ、これを
PH7.4のリン酸緩衝液に溶解した後透析すること
により粗製の免疫グロブリン含有液を得ることが
できた。

【表】

【表】 ＋は染色、−は非染色を示し、＋の数の増大に
伴い染色の強さが増す事を示す。
なお各ハイブリドーマが産生したモノクロナル
抗体の免疫グロブリンクラスの判定方法としては
マウス免疫グロブリンである。IgA，IgG₁，
IgG₂a，IgG₂b，IgG₃，IgMに対するウサギ抗体
を用いて、オクターローニー（Ouchterlony）法
ならびに酵素免疫吸着法によつて行なつた。なお
免疫グロブリンのクラスの判定は、各クローンの
培養上清を硫安処理して得られた免疫グロブリン
分画を用いて行なつたものである。 また染色状態を顕微鏡写真によつて、さらに詳
述する。各図面におけるａは蛍光抗体免疫顕微鏡
像の場合を示し、ｂは位相差顕微鏡像の場合を示
す。 第１図ａ，ｂは対照群で、ミエローマ細胞培養
上清を用いた顕微鏡像（×200）である。第１図
ａ右下部に弾性線維に対応して自己蛍光のみが観
察され、他に蛍光は観察されなかつた。 第２図ａ，ｂは２０１Ｆの培養上清を用いた顕
微鏡像（×200）で、第２図ｂより２層の粥腫が
重なり合つており、その境界部（右下）より上方
に立ち上つている泡沫細胞が観察される。第２図
ａ，ｂの結果から、その泡沫細胞に対応して染色
されていることがわかる。 第３図ａ，ｂは９０４Ｂの培養上清を用いた顕
微鏡像（×200）で、第３図ｂより粥腫中央部を
横に走る泡沫細胞集団が観察される。第３図ａの
結果から、この泡沫細胞に対応して染色されてい
ることがわかる。 第４図ａ，ｂは２１２Ｄの培養上清を用いた顕
微鏡像（×200）で、第４図ｂより下側に平滑筋
層が認められる。平滑筋の両側には粥腫が観察さ
れ、第４図ａの結果から、図右側の粥腫の細胞間
脂質蓄積部に対応して染色されていることがわか
る。 第５図ａ，ｂは３０５Ｄの培養上清を用いた顕
微鏡像（×200）で、第５図ｂより下側に平滑筋
層が認められる。平滑筋の両側には粥腫が観察さ
れ、第５図ａの結果から、上間の２１２Ｄの場合
とほぼ同じ部位ならびに左右粥腫の内皮細胞近傍
にも染色部位がある。この点で、２１２Ｄとは異
なるモノクロナル抗体であると結論される。 第６図ａ，ｂは５１０Ｄの培養上清を用いた顕
微鏡像（×200）で、第６図ｂにも写真両側に粥
腫が観察されるが、第６図ａの結果から粥腫の内
皮近傍のみが染色されていることがわかる。 第７図ａ，ｂは８０９Ａの培養上清を用いた顕
微鏡像（×200）で、第７図ｂより中央上部に粥
腫が観察される。第７図ａより粥腫の先端部の細
胞間に対応して染色されていることがわかる。 第８図ａ，ｂは２１２Ｅの培養上清を用いた顕
微鏡像（×400）で、第８図ｂより内皮細胞、泡
沫細胞、平滑筋細胞のいずれも観察される。第８
図ａより、これらの内皮細胞、泡沫細胞、平滑筋
細胞のいずれも染色されていることがわかる。 第９図ａ，ｂは２１２Ｅの培養上清を用いて正
常な血管組織を染色せしめた顕微鏡像（×1000）
である。第９図ａより、正常な内皮細胞ならびに
中膜の一部が染色されていることがわかる。 第８図及び第９図よりわかるとおり、比較例と
してのモノクロナル抗体である２１２Ｅは動脈硬
化病巣の他、正常血管組織とも結合しており、動
脈硬化病巣に特異性がない。 発明の効果 WHHLラビツトの雌のホモから採取した胸部
大動脈を本発明のモノクロナル抗体溶液に浸漬し
た。この胸部大動脈を間接蛍光抗体法で観察した
ところ、本発明のモノクロナル抗体を用いた場合
は泡沫細胞、細胞間蓄積脂質、動脈硬化内皮等が
選択的に蛍光染色された。従つて、本発明のモノ
クロナル抗体は動脈硬化巣と特異的に結合する性
質を有する。 また、本発明のモノクロナル抗体を使い分ける
ことにより、例えば動脈硬化巣のうち、細胞間蓄
積脂質、泡沫細胞、動脈硬化内皮等のいずれかに
モノクロナル抗体を結合させたり、または複数の
モノクロナル抗体を結合させて各種の検査、診断
ができる。 また、本発明のモノクロナル抗体を血管内投与
することにより、モノクロナル抗体が血液により
動脈硬化巣に送られたとき、病巣との間に抗原抗
体複合体が生ずる。この複合体により補体が活性
化され、マクロフアージの動員が起こり、マクロ
フアージは泡沫細胞を介して複合体と結合して貪
食能を活性化させる。この複合体を貪食したマク
ロフアージがそのまま血中へ流出することによ
り、病巣部が治癒する可能性が期待される。 この様に、本発明のモノクロナル抗体は動脈硬
化巣に特異的に結合するので臨床検査分野、治療
分野等の利用に有用である。 また、本発明のモノクロナル抗体はハイブリド
ーマの培養によつて同じものを多量に製造するこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

添付の図面は動脈硬化巣部位、および動脈硬化
巣部位と本発明または比較例のモノクロナル抗体
との結合状態を示す顕微鏡写真であり、各図にお
けるａは蛍光抗体免疫顕微鏡像の場合であり、ｂ
は位相差顕微鏡像の場合である。第１図は動脈硬
化巣の対照顕微鏡写真である。第２図ないし第７
図の各ａは、間接蛍光抗体法により本発明のモノ
クロナル抗体が動脈硬化巣に結合している状態を
示す顕微鏡写真である。第８図ａは比較例のモノ
クロナル抗体と動脈硬化巣部位との結合状態を示
す顕微鏡写真であり、第９図ａは比較例のモノク
ロナル抗体と正常な動脈部位との結合状態を示す
顕微鏡写真である。又、第１図ｂ〜第９図ｂは第
１図ａ〜第９図ａに対応する位相差顕微鏡像を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 正常な血管とは結合せず、動脈硬化症の血管
   病巣部位を認識し、これに特異的に結合するモノ
   クロナル抗体。 ２ 血管病巣部位が粥腫である特許請求の範囲第
   １項記載のモノクロナル抗体。 ３ 血管病巣部位が泡沫細胞である特許請求の範
   囲第１項記載のモノクロナル抗体。 ４ モノクロナル抗体が抗動脈硬化症血管病巣部
   位抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞か
   らのモノクロナル抗体である特許請求の範囲第１
   項記載のモノクロナル抗体。 ５ 融合細胞が２１２Ｄ，３０５Ｄ，２０１Ｆ，
   ９０４Ｂ，５１０Ｄ，８０９Ａである特許請求の
   範囲第１項記載のモノクロナル抗体。 ６ 正常な血管とは結合せず、動脈硬化症の血管
   病巣部位を認識し、これに特異的に結合するモノ
   クロナル抗体の１種または２種以上を含有してな
   る動脈硬化巣反応試薬。 ７ 抗動脈硬化症血管病巣部位抗体産生細胞とミ
   エローマ細胞との融合細胞からのモノクロナル抗
   体の１種または２種以上を含有してなる特許請求
   の範囲第６項記載の動脈硬化巣反応試薬。 ８ 血管病巣部位が粥腫である特許請求の範囲第
   ６項記載の動脈硬化巣反応試薬。 ９ 血管病巣部位が泡沫細胞である特許請求の範
   囲第６項記載の動脈硬化巣反応試薬。 １０ 融合細胞が２１２Ｄ，３０５Ｄ，２０１
   Ｆ，９０４Ｂ，５１０Ｄ，８０９Ａである特許請
   求の範囲第７項記載の動脈硬化巣反応試薬。