JPH02504677A - フローフイールドフローフラクシヨネーシヨンのための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フローフィールド７０−フラクシヨネーシヨンのための方法及び装置 技術分野 本発明は７０−フィールド７０−７ラクシヨネーシヨン（ｆｌｏｗ　ｆｉｅｌｄ 　ｆｌｏｗ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）のための方法及び装置に関する。

発明の背景 ジョン（ＦＦＦ）は液体クロマトグラフィーとは関連のある用途の広い１群の分 離方法である。その下位の技術（５ｕｂｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）がいずれも分離の ための固定床を用いておらず、従って、古典的なりロマトグラフイーのような平 衡過程に依存しないので、ＦＦＦは厳密な意味ではクロマトグラフィー技術には 属さない。

ＦＦＦは溶液へ外部力場（ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｆｏｒｃｅ　ｆｉｅｌｄ）をかけ て、その成分を分離チャネル壁へ向かって移動させることを含む。力場の大きさ 及び化学的／物理的性質によって、ある溶質は最終的に分離チャネル壁から一定 距離である濃度分布に達する。この過程は緩和（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）と呼ば れる。チャネル内の溶液を層状に前進させるならば、放物線流プロフィルが生じ 、成分は溶質のほとんどがそこに位置する軸方向速度ベクトルに等しい速度で前 進するであろう。

印加力場（ａｐｐｌｉｅｄ　ｆｉｅｌｄ）は、例えば熱的勾配（熱的ＦＦＦ）　 、遠心力（沈降ＦＦＦ）　、電気力（電気的ＦＦＦ）　、横方向流又はラテラル ７０−（７０−ＦＦＦ）及び横方向圧力勾配（圧力ＦＦＦ）であることができる 。ＦＦＦに於ける種々の力場型を最近Ｊａｎｃａ　Ｊ、が記載している（Ｆｉｅ ｌｄ　Ｆｌｏｗ　Ｆｒａｃ−ｔｉｏｎａｔｉｏｎ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅ ｒ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８８．　Ｃｈａｐｔｅｒ３）。

最も一般的なＦＦＦ技術はフローＦＦＦであり、ウィルス試料（Ｇｉｃｌｄｉｎ ｇｓ、　Ｊ、Ｃ，；Ｙａｎｇ、　Ｆ、Ｊ、　；Ｍｙｅｒｓ、　Ｍ、Ｎ、、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　１９７７、２１．１３１）　、蛋白質（Ｇｉｄｄｉｎｇｓ、　Ｊ 、Ｃ，；Ｙａｎｇ、　Ｆ、Ｊ、　；Ｍｙｅｒｓ、　Ｍ、Ｎ、、　Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　１９７７＋　８１゜３９５）　、及びシリカゾル（Ｇｉｄｄｉ ｎｇｓ、　Ｊ、Ｃ，；　Ｌｉｎ、　Ｇ、Ｃ，；Ｍｙｅｒｓ、　Ｍ、Ｎ、、　Ｊ− Ｃｏ１１．　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、　１９７８．６５．６７）並びに親 油性合成重合体（Ｂｒｉｍｈａｌｌ、　　Ｓ、Ｌ、、；Ｍｙｅｒｓ。

Ｍ、Ｎ、　；Ｃａｌｄｗｅｌｌ、　Ｋ、Ｄ、　；Ｇｉｄｄｉｎｇｓ、　Ｊ、Ｃ， 、Ｊ、　Ｐｏｌｙｍ。

Ｓｃｉ、　Ｐｏｌｙｍ、　Ｌｅｔｔ、　Ｅｄ、　１９８４．２２．３３９）と親 水性合成重合体（Ｇｉｄｄｉｎｇｓ、　　Ｊ、Ｃ，；Ｌｉｎ、　Ｇ、Ｃ，；Ｍｙ ｅｒｓ、　Ｍ、Ｎ、、　Ｊ。

Ｌｉｑ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１９７８．１．１）との両方の合成重合体 を含む広範囲のキャラクタリゼーション問題について探求されている。

近年、７Ｏ−ＦＦＦに於けるかなりの技術的改良がＷａｈｌｕｎｄ及びＧｉｄｄ ｉｎｇｓとその共同研究者によってなされ（Ｗａｈｌｕｎｄ、　Ｍ、−Ｇ、　； 　Ｗｉｎｅｇａｒｔｎｅｒ、　Ｈ，Ｓ、　；　Ｃａｌｄｗｅｌｌ、　Ｋ。

Ｄ、　；Ｇｉｄｄｉｎｇｓ、　Ｊ、Ｃ１，Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ＋　１９８６＋ 　５８．５７３；Ｗａｈｌｕｎｄ、　Ｌ−Ｇ、　；Ｇｉｄｄｉｎｇｓ、　Ｊ、Ｃ ，、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｔｌｌ、　１９８７゜５９、１３３２；及びＧｉｄｄｉ ｎｇｓ、　Ｊ、Ｃ，；　Ｘｉｕｒｏｎｇ、　Ｃ，；　Ｗａｈｌｕｎｄ。

Ｋ、−Ｇ、；　Ｍｙｅｒｓ、Ｍ、Ｎ−、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、１９ｇ７，５９． １９５７）　　、彼らはより短い溶出時間及びより良好な分解能を得ている。

圧力ＦＦＦは７Ｏ−ＦＦＦと密接に関係がある下位の技術である。７Ｏ−ＦＦＦ 及び圧力ＦＦＦの両方共、クロスフローは横方向の力場を示し、分離チャネルは ほとんど常に平行平板膜型である。７Ｏ−ＦＦＦと圧力ＦＦＦとの間の主な差違 は、７Ｏ−ＦＦＦでは、フロー７°イールドが別個のポンプで外部からチャネル を横切って印加されるが、圧力ＦＦＦでは半透膜上の圧力降下によって横方向流 が生ずる。

１９７４年に、Ｌｅｅら（Ｌｅｅ、　Ｈ，−Ｌ、　；　Ｒｅ１ｓ、　Ｊ、Ｆ、Ｇ 、　：　Ｄｏｈｎｅｒ。

Ｊ、　；　Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ、　Ｅ、Ｎ、、　Ａ、１．　Ｃｈ、　Ｊ、　１９ ７４．２０．７７６）は円形チャネル内の圧力ＦＦＦについての最初の実験的研 究が示された論文を発表した。

Ｄｏｓｈｉら（Ｄｏｓｈｉ、　Ｍ−Ｒ，、；Ｇ１１ｌ、　Ｗ、Ｎ、、　Ｃｈｅｍ 、　Ｅｎｇｉｎ。

Ｓｃｉ、　１９７９．３４．７２５）はこの方法が理論的に平行平板膜による。

７Ｏ−ＦＦＦ及び圧力ＦＦＦの両方よりも良好な分解能を与えると期待されるこ とを示した。

発明の詳細な説明 本発明の１′）の目的は、流速をより正確に制御することができ、かつより良い 精度を与えることに加えて、勾配溶出技術の適用をも可能にする７Ｏ−ＦＦＦの 装置を提供することである。

本発明のもの１つの目的は、従来知られている装置よりも良好な機械的性質を有 しかつ液体クロマトグラフィー装置への連結がより容易である装置を提供するこ とである。

本発明のさらにもう１つの目的は、該装置を利用しかつ相当に改良された分離結 果を得ることを可能にするＦＦＦの改良方法を提供することである。

これらの目的は本発明の装置が 一多孔性中空フアイバー（ｐｏｒｏｕｓ　ｈｏｌｌｏｗ　ｆｉｂｅｒ）が管の末 端フィッティング間に縦方向に伸び、該ファイバーの一端が分別されるべき液体 試料を導入するための弁を通して第１キャリア液体を該ファイバー中へ送りこむ だめの第１ポンプに連結されており、該ファイバーの他端が該試料のフラクショ ンを検出するための７０−スルー検出器に連結されており、 −第２ポンプが多孔性ファイバー壁を通してキャリア流体を送り出し、それによ つてファイバー内の半径方向の流れの直接制御を可能にするために管とファイバ ーとの間の空間に連結されており、かつ −制御装置が該試料の注入及び緩和中は該第１ポンプを該第２ポンプより低い流 速を有するように、又試料を溶出させるためには該第２ポンプより高い流速を有 するように制御するようになっている ことを特徴とすることによって達成される。

図面の簡単な説明 以下、添付図面を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。第１区は、本発 明の装置の１つの実施態様を示し、第２図′は第１図中に示したポンプの流速〜 時間線図を示し、第３図は２種のポリスチレンラテックスビーズの分離を示す７ ラクトグラムすなわち濃度〜時間線図を示し、かつ第４図はプラスミドＰＵＣ− ８のその２量体からの分離を示すフラクトグラムを示す。

発明の詳細な説明 第１図は本発明の装置の１つの実施態様を示す。

多孔性中空ファイバー１は管４のそれぞれ末端フィンティング２及び３の間に縦 方向に伸びている。

ファイバー１の一端はポンプ５に連結され、ポンプ５は分別されるべき液体試料 がその中を通って導入されるチュービング８及び弁９を通ってキャリア液体を容 器７からファイバー１中へ送るように制御装置によって制御される。

第１図に示した実施態様では、ファイバー１の他端も、チュービングｌＯと弁９ から導入される試料のフラクションを検出するためのフロースルー検出器１１と を通して容器７に連結されている。チュービング１ｏが等しく良好にやはりキャ リア液体を含む別の容器（図には示してない）へ連結され得ることは言うまでも ない。

ポンプ１２はチュービング１３を通し、末端フィッティング３を通して管４とフ ァイバー１との間の空間に連結される。ポンプ１２は制御装置６によって制御さ れ、多孔性ファイバーの壁を通してキャリア流体を廃棄物へ送り出すようになっ ている。

第１図に示した装置の作動は第２図によって説明される。第２図はポンプ５及び １２の流速をそれぞれ制御装置６によって制御されるときの時間の関数として示 す。ポンプのシーケンスは４つの異なる段階に分けられ、段階工は試料導入期、 段階■は試料ｆＩｋ５Ｐａ期、段階ｍは流回復期、段階■は試料溶出期である。

第２図中、ポンプ５の流速は曲線ａで示されるが、ポンプ１２の流速は曲線すで 示される。

第２図かられかるように、ポンプ１２の流速は段階工、■、■中一定に保たれる 。段階１１すなわち試料注入期中、ポンプ５の流速はポンプ１２の流速より低く 保たれる。

段階■、すなわち試料緩和期中、ポンプ５の流速は段階１中よりも低く下げるこ とができる。このことは、段階工及び■中、容器７からのキャリア液体はチュー ビング１０及び検出器１１を通ってファイバー１中へ逆流することを意味する。

かくして、ファイバー１中のある点に於て、軸方向流は零になる。この点すなわ ち緩和点の位置は流速ａとｂとの間の関係に依存する。弁９を通って７アイパー １中へ注入される試料中の分子は最終的にこの特２りな点に於て集まりかつｉ和 する。

段階工（導入期）の所要時間は注入弁から緩和点まで試料を送るだめの所要時間 に等しい。

緩和が完成されるツ；めの所要時間は半径方向流が粒子を最大距離、すなわちフ ァイバー１の中心からファイバー壁まで運ぶための所要時間に等しい。

段階■、すなわち流回復期中、ポンプ５の流速ａは試料の溶出に用いられる値ま で増加される。この値はポンプ１２の依然として一定の流速すより高くなる。

溶出された試料で容器７を汚染しないようにするため、三路弁又は２個の逆止め 弁（図には示してない）を容易にチュービング１０中に組み込んで溶出された試 料を別の容器（図には示してない）へ送ることができる。

段階■、すなわち試料溶出期中、ポンプ１２の流速すは点線す、で示されるよう に依然として一定に保たれることができる。試料の勾配溶出を得るために、段階 ■中にポンプ１２の流速すを点線す、で示されるように減少することもできる。

この方法によって、幾つかの場合には処理時間を相当に短縮することができる。

管の末端フィッティング間に縦方向に伸びるホローファイバーでＦＦＦ技術によ って試料成分を分離するための本発明の方法は下記段階１〜■からなり、ファイ バーの一端に連結されかつ液体をファイバー中へ送るように制御される第１ポン プ５の流速とファイバーと管との間の空間に連結されかつ多孔性ファイバーの壁 を通して流体を廃棄物へ送り出すように制御される第２ポンプ１２の流速とを特 徴とする。

工　（試料注入）：第２ポンプ１２の流速ｂｌは第１ポンプ５の流速ａＩより高 い値に保たれる。試料は縦方向流によってファイバー中へ導入される。従って試 料はファイバー中へ入るが、ａＩ＜ｂＩであるのでファイバーの他端へは達しな い。

■　（緩和）：ポンプ５の流速はポンプ１２の流速ｂｎより十分低い一定値ａｎ に保たれ、ポンプ１２の流速ｂｎも一定に保たれるので、縦方向流が零になるフ ァイバー中の特別な点に試料成分が集まりかつ緩和する。

随意に、流速ａｍはｂｒより低い。

■　（流回復）：ポンプ５の流速ａＩ［［はポンプ１２の流速ｂｍより高い値へ 増加される。このことは試料がファイバーの末端に対して再び移動し始めること を意味する。

■　（試料溶出）：ポンプ５の流速はポンプ１２の流速ｂｌＶより高い値ａｌＶ に保たれる。ファイバー中の試料の勾配溶出を得るために流速ｂｌＶをこの段階 中減少させることができる。

随意に、第２ポンプの流速は全分離操作中一定に保たれる。

実施例 内径０　、５＄１１！Ｉ＋のモデルＨ１０−Ｐ１００−２０又は直径１．１ｍｍ のモデルＨ５−Ｐ　１００−４３のいずれかの多孔性中空ファイバー（Ａｍｉｃ ｏｎ　Ｉｎｃ、　Ｄａｎｖｅｒ、　ＭＡ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を空の改良ポリン（ Ｖｏｌｙｍｅ）管（モデルＣ１６，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌ ａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）中に封入した。空気圧式制御装置を装備した内部容量（５μΩ） 注入弁（モデル７４］０＋　Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　Ｉｎｃ、。

Ｃｏｔａｔｉ、　ＣＡ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）で試料を注入した。検出器は固定波長 （２５４ｎｍ）　ＵＶ検出器（ＵＶ−１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　Ｕｐｐ ｓａｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）であった。第１図に示すようにファイバーに連結された２個のシ リンジポンプ（モデルＰ−５００，ＰｈａｒｍａｃｉａＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ 、　Ｓｗｅｄｅｎ）で軸方向及び半径方向の液体流をつくった。これらのポンプ はさらにコンピューター化された制御装置（モデルＬＣＣ−５００，Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ。

５ｖｅｄｅｎ）に連結されており、制御装置はポンプを独立に制御しかつ注入弁 を制御するようにプログラミングされていた。

ポリスチレンラテックスビーズの分離に於ては、ｌ＋ｎＭＥＤＴＡ、　　１００ ｍＭ　ＮａＣ４，０，０４％ＮａＮ、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を 有し、ｐＨ−７，０の０．０１Ｍ　トリスＨＣΩの緩衝液をキャリア液として用 いた。　ＰＬＩＣ−８用にはＴｔｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含まない同じ緩衝液を 用いた。

直径がそれぞれ０．０９μｍ及び０．３０μｍの２種類のポリスチレンラテック スビーズの試料（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，Ｕ、ＬＡ−から得た）を内径０．５ｍｍのファイ バー中へ３０μ（１／　ｍ　ｉ　ｎの一定速度の軸方向流と共に導入した（段１ ｆＩ）。緩和期間中（段階■）、軸方向流を６μΩ／　ｒｎ　ｉ　ｎに下げた。

理論によって計算して７分間、試料分子をファイバー壁からその平衡距離へ移動 させかつ試料ゾーンを軸方向に圧縮した。段階■に於て、軸方向流を２００μΩ ／ｍｉｎへ上げかつ段階■ではその値に保った。半径方向流は全部の段階に於て ３０μΩ／ｗｉｎの一定に保った。

得られた分離を第３図に示す、、２種類のラテックスビーズは完坐に分離され、 理論的に計算した値とよく一致する保持時間後に流出する。ゾーン（ピーク）幅 も理論的計算と一致する。

もう１つの寅験では、プラスミドＰＩＩＣ−８（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ ｇｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　 Ｓｗｅｄｅｎから得た）の試料を内径１．１ｍｍのファイバー中へ導入した。

段階ｍ中、軸方向流は８０μΩ／Ｉ！Ｉｉｎであった。１２分間継続する段階■ では、軸方向流を２０μＱ　／　ｍ　ｉ　ｒｒに下げ、上述のように試料を平衡 にさせかつ濃縮させｌ：。段階ｍ中、軸方向流を２分間で５００μＱ／ｗｉｎに 上げかつ段階■中ではこの値に保った。半径方向流は段階工〜ｍ中及び段階■の 開始から１０分間１００μＱ／ｍｉｎの一定に保たれ、直線的に先ず段階■の開 始から１５分後に８０μＱ／ｍｉｎに下げられ、かつさらに６０分後に２０μＱ ／ｒｎｉｎに下げられた。

得られた分離を第４図に示す、２つのピークが現われ、プラスミドＰＬＩＣ−８ （左のピーク）及びその２量体（右のピーク）に帰せられる。

時間 ＩＧ２ ＩＧ　３ ＦＩＧ　４ 国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．管（４）の末端フイツテイング（２，３）間に縦方向に伸びる多孔性中空フ アイバー（１）であって、該ファイバー（１）の一端が分別されるべき液体試料 を導入するための升（９）を通して該フアイバー中へ第１キャリア液体を送るた めの第１ポンプ（５）に連結されており、該ファイバー（１）の他端が該試料の フラクションを検出するためのフロースルー検出器（１１）を通して第２キャリ ア液体用の容器へ連結されている多孔性中空ファイバーと、 管（４）と７アイバー（１）との間の空間へ連結されていて多孔性ファイバー壁 を通してキャリア流体を送り出すための第２ポンプ（１２）と、 該第１ポンプ（５）を試料の注入及び緩和中該第２ポンプ（１２）より低い流速 を有するように、かつ試料を溶出させるために該第２ポンプ（１２）より高い流 速を有するように制御するようになっている制御装置（６）とを含むことを特徴 とするフローフイールドフローフラクションのための装置。
2. ２．該制御装置（６）が該第２ポンプ（１２）の流速を一定（ｂ，ｂ１）にする ように制御するようになっていることを特徴とする請求項１記載の装置。
3. ３．該制御装置（６）が試料の溶出中該第２ポンプ（１２）の流速を一定値（ｂ ）から減少（ｂ２）するように制御するようになっていることを特徴とする請求 項１記載の装置。
4. ４．該第１キャリア液体が該第２キャリア液体と同じであることを特徴とする装 置。
5. ５．管の末端フイツテイング間に縦方向に伸びている中空ファイバー内でＦＦＦ 技術によって試料成分を分離する方法であって、該ファイバーの一端が流速ａを 有しかつ該ファイバー中へ液体を送りこむように制御される第１ポンプに連結さ れており、管とファイバーとの間の空間が流速ｂを有しかつ多孔性ファイバーの 壁を通して流体を廃棄物へ送り出すように制御される第２ポンプへ連結されてお り、 第２ポンプの流速より低い流速で第１ポンプによって送られる液体によりファイ バー中へ試料を導入する工程Ｉと、 試料を半径方向で平衡にさせるために十分な時間、第２ポンプの流速より低い第 １ポンプの流速でファイバー中で試料を緩和する工程ＩＩと、 第１ポンプの流速を第２ポンプの流速より高い値へ上げる工程ＩＩＩと、 第２ポンプの流速より高い第１ポンプの流速でファイバーから試料を溶出させる 工程ＩＶとを含む方法。
6. ６．該第２ポンプの流速が全分離工程中一定に保たれる請求項５記載の方法。
7. ７．試料の勾配溶出を得るために工程ＩＶ中で第２ポンプの流速を下げる請求項 ５記載の方法。