JPH02502007A - 細胞内寄生体の抗原分子を有する感作リポソーム、それらの調整方法、および診断手段として、および免疫化剤としてのそれらの適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞内寄生体の抗原分子を有する感作リポソーム、それらの調整方法、および診 断手段として、および免疫化剤としてのそれらの適用 発明の主題 この発明は、細胞内寄生生物の抗原分子に対するリポソームの感作に基づいてな され、血清またはその他の器官液（胸膜、腹膜、気管支肺胞の洗浄液）における 、前記の感染性抗原に対するＩｇ　（溶解性または非溶解性）を検知する手段、 および前記伝染性因子に対する免疫性（細胞性および体液性）を引き出すことが できる予防接種剤としてのこのように感作されたりリポソームの新規な利用法を 提供するものである。

この発明で例証される特定の応用例によれば、より具体的な目標は結核に対する 診断と免疫化の手段を提供することであるが、この発明はもちろんこの応用例に 限定されるものではなく、以下の説明で明確になるであろう。

従来の技術の要約 リポソームについては、種々の薬理学的用途、特に医薬活性を有する物質の担体 としての用途について多くの研究がされている。

天然のまたはハプテンの抗原分子がリポソームの表面で暴露されている。これら のいわゆる感作されたリポソームは、免疫化された動物の血清中の免疫グロブリ ンの検知に、または体液性や細胞性の免疫化を増大させることができる免疫アジ ェバン、トとして用いられている。

結核につ、いては、各種のマイコバクテリア、特に、マイコバクテリウム・ラベ ルクローシス・変種・ホミニス（Ｈ３７Ｒｖ）　−ＰＰＤ　Ｈ３７Ｒｖ−ツベル クリンＨ３７Ｒｖの精製蛋白質抽出物がある。ツベルクリンは、予防接種された かまたは感染したヒトもしくは動物にすでに存在している細胞性免疫を発現させ ることができるが（皮膚試験反応もしくは、遅延過敏性反応）、ツベルクリンは 免疫原性的でないから免疫化を行うことはできない。

この発明の特徴事項 具体的に述べれば、この発明は、上記目的（イムノアッセイと予防接種）に用い ることができる新規な試薬としての、細胞内寄生生物に特異的な抗原分子に感作 されたリポソームに関する。

このようなリポソームとしては、コレステロールを含有するかまたは含有しない 、いわゆる「多重層Ｊ　（ＭＬＶ）形のものが好ましい。

この発明によれば、卵Ｐｃ／Ｃｈ比が４：１〜４：４でコレステロールを含有す る多重層リポソームが一般に好ましく、また後者の比率もしくはこれに近い比率 が特に好ましい。

またこの発明は、感作されたリポソームの製造方法に関する。

このために２種類の方法が利用できる。すなわち、抗原分子を直接カブル化する か、または予め作製されたリポソームをこれら抗弁分子に接触させて製造するこ とができる。

両タイプの感作されたリポソームは、抗弁分子に対応する免疫グロブリンと結合 することができる。

第１の場合には、より多くの免疫グロブリンがリポソームに結合するが、予め形 成された小胞に暴露することによって組み込まれた蛋白質は、対応する抗体に対 して一層高い親和性を持っている。その結果、免疫グロブリンの混合物に対する リポソームの感作のタイプは、リポソームの表面で暴露された選択された抗原分 子の各種の量と、これら抗原の暴露と親和性の差とに対応する。

両タイプのリポソームを、モルモットの皮下もしくは腹腔内に投与すると、細胞 性免疫の証拠がある遅延性過敏症が現れてくる。

この発明に含まれる特別な応用例は以下に列挙する。

マイコバ　−１ム・・１ベル　ローシス　に脂賀の全濃度：１０または２０　Ｂ ／ｍ１モル比　１）　卵Ｐｃ　（もしくは卵Ｐｃ　−４／Ｃｈ　−０）２）　卵 Ｐｃ／Ｃｈ　４：１ ４：２ ４：３ ４：４ ＰＰＤありもしくはなしの滅菌０．１５　Ｍ　ＮａＣ１（・生理食塩水）中での ＭＬＶの作製。

２つの感作法を実施する。

ａ、　リポソーム内へのＰＰＤの直接カプセル化、１５０ｓＭＮａｃｌ　中０． ７５　ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＰＤ溶液中でリポソームを作製する。得られた標品 は、室温で３０分間放置する。

ｂ、　予め作製したリポソームとＰＰＤとの接触、ＭＬＦを１５０　ｍＭ　Ｎａ Ｃ１中で作製し、３０分間放置し、３．５００　ｇで１０分間遠心分離し、１５ ０１１Ｍ　ＮａＣｌ中０．７５　Ｂ／ｍｌ濃度のＰＰＤ溶液と３０分間接触させ 、同じ溶媒で５回濯ぐ。

率　・１ボゝ−ム　い−−ジオイム　・セイ各種組成を有しかつ療法の方法で感 作されたリポソームを８３７Ｒｖに対応するヒツジ抗血清に暴露し、１１１１で 標識し、ついで標識をはずした。上記の抗血清の標品とｔｔＡｆによるＩｌｌ付 けについては、同じ日に出願した本願出願人の特許Ｉｌｌ　ｒＰｒｏｃＩｉｄｊ 　ｄｏ　ｄｔｉｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｐｉｄｅ　ｄ’１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　’ ａ　ｇｅｒ−ｍｅｓ　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｉｒｅｓ＋　ｅｎ　ｐａｒｔｉ ｃｕｌｉｅｒ　ｄｅ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ　ｏｕ　ｄｅ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｔｕｓ　１ｅｐｒａｅ　ｅｔｔｒｏｕｓ ｓｅ　ｃｏｎｖｅｎａｎｔ　ｆ、ｃｅｔ　ｅｆｆｅＪ　［細胞内の微生物、特に マイコバクテリウム・ラベルクローシスもしくはマイコバクテリウム・レプレに よつて起こる感染症の迅速検知法およびこの目的に対して適切なキット〕に記載 さている。

＋！Ｊ抗血清の量と、標識をはずした抗血清の各種希釈物（１／１０〜１／１０ ．０００）との競合曲線が得られている。　ＰＰＤ−リポソームに結合した、目 ｓＩでｔｌｍした分子の比率と、その分子の解離定数を測定する。最大の親和性 で最大数の１０１標識分子と結合するリポソームの組成は、ＰＰ［ｌを直接カプ セル化した場合の卵Ｐｃ／Ｃｈ　４：４の時のようである。

ヒ　ゞの一ジオイム　・セイ ７１％１標識ヒツジ抗血清と、ヒト血清の各種希釈物（１／１０〜１／１０，０ ００）間で競合試験を行った。非結核患者の血清については、競合は全く認めら れなかった。これに対５して、結核患者の６つの血清には、ｌ　！＄１抗血清と 競合する１ｇが含有されていた。これらの患者の血清中にＩｇが存在することは 、ＥＬＩＳＡ法で確認した。同じ方法を、非結核患者の血清中に１．が存在しな いことを確認するのに利用する。この試験で用いたリポソームは、卵Ｐｃ／Ｃｈ 比が４：３であり、ＰＰＤを直接カプセル化するか、またはＰＰＤを予め作製し たリポソームに暴露したものである。これをラジオイムノアッセイに付すと、結 核患者の血清にはｒｇが検知されるが、これらのＩｇの性質についてはなんの情 報も与えない。

、　Ｉポ゛−ムの　に　るイム　−セイ　−″　”イム　・セイ　の ′蛍光標識（カルセイン）を、直接カプセル化法でＰＰＤに感作された卵Ｐｃ／ Ｃｈ（４：３）リポソームに組み込んだ、この標識は、カプセル化されている限 りつまり「消光Ｊされている場合蛍光を発しない、リポソームが溶解したならば 、標識が培地に放出され、リポソームの溶解の程度に比例する蛍光を測定するこ とができる。

リポソームの溶解は、溶解性１ｇＧが、補体の存在下で、小胞によって暴露され た抗原（この場合ＰＰＤから抽出された抗原）に結合するようになった場合に起 こる。このイムノアッセイは、現在、溶解性１ｇを定性的に検知する唯一の方法 である。

リポソームの溶解は、Ｉｇが小胞によって暴露された抗原に結合した一場」シｇ 」鉦り一起こるので、偽陽性は除外する。その上、（３）項で述べたラジオイム ノアッセイは、競合点当たり２０　Ｂの脂質を必要とするが、カルセインによる 免疫熔解アッセイは同じ測定に０．１　ｓｇＬか必要でない。

卵ＰｃとＣｈ　（４：３）で構成され、カルセインを含有し、上記の両方法（カ プセル化法と接触法）でＰＰＤに感作されたリポソームは、ウサギ抗ＢＣＧ血清 （Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）またはヒツジ抗マイコバクテリウム・ラベルクローシス 血清、およびウサギ血清起源の補体の存在下で免疫溶解性を示す（培地内へのカ ルセインの放出と測定可能な蛍光の出現）、この反応は、抗マイコバクテリアの 抗体を持っていないことが分かっている清の存在下または補体が存在していない 場合には観察されなかった。

ＰＰＤに感作されたこれらの同じリポソームを、結核患者と、負の皮膚試験反応 を示す非結核患者のヒト血清に接触された。３０分後に測定した溶解性（Ｌ、Ｓ 、）を、ＰＰＤもしく・　は他の蛋白質抗原に感作されていないリポソームにつ いてり、Ｓ、とＬＮＳとの百分率の差を夏山した（ＬＩＬＡ）　、得られた結果 を以下の表に示す。

Ｓ−スチェーデントの検定法により統計的に有意。

ＭＳ−スチューデントの検、定法により統計的に非存意。

これらの結果から、ＰＰＤを保有するリポソームの免疫溶解性は、非結核の検体 の血清中よりも結核の検体の血清中の方が有意に高いことは明らかである。同様 に、ＰＰＤを保有していないリポソームの溶解性は、ＰＰＤ保有リポソームの熔 解性より存意に低いが、結核患者の血清中の方が大きい、このように、結核患者 の血清は、ＰＰ［ｌの成分に対応する抗体と、非結核の検体中よりもしかしＰＰ Ｄリポソームをより太き（溶解させることができる因子とを含有している。

したがって結核患者の血清中の抗血清バクテリア抗体を検知できる、ＰＰＤの感 作されたリポソームの免疫溶解試験法が、この発明によって開発されたといえる 。この試験が速いということ　（３０分間）も明らかである。

この試験法によれば、感染性微生物の抗原を保有するリポソームを用いて血清中 の抗体を検知することによって、すべての感染症を診断することができる。

、　のＩポ１−ムの　の− 抗原で感作されたリポソームは、感染因子を模造しくこの因子の免疫原性分子を 保有するリン脂質二重層）、感染宿主の局所マクロファージが取り込むか、また は感染因子を「処理し」、表面に該因子の抗原分子のいくつかを暴露する局所マ クロファージを模造することによって、生体内免疫の細胞の機構に役割を果たす ことができることが知られている０両方の場合、リポソームが感作された抗原分 子は、リンパ球に与えられて受容体で認識され、細胞性免疫と体液性免疫の機構 を刺激することができる。この点については、感作されたリポソームは、免疫シ ステムに抗原分子を提供する事実上天然のモデルを示すので、新形の予防接種用 の賦形剤の構成要素とすることができる。

この俵説が正しければ、ＰＰＤ−リポソームは、予めＢＣＧで感作された動物に 、陽性の遅延過敏反応（陽性皮膚試験反応）を誘発できるはずである。

ＰＰＤに感作されたリポソーム　（卵Ｐｃ５ＰＰＤの直接カプセル化、または予 め作製後に接触させることによる感作されたリポソーム；卵Ｐｃ／Ｃｈ、４：３ の上記２方法にしたがって感作されたリポソーム）を、免疫化されたモルモット の直皮に注射した。４種のリポソームが皮膚試験反応を起こしたが、その強度と 過程はカプセル化されていないＰＰＩＩのそれとは異なっている　（この点につ いては、研究論文「Ｉｍ−ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｅｉｔｙ　ｏｆ 　ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ　５ｅｎｓｉｔｉｚｅｄ　１ｉｐｏ−３ＯＩＩ＠ＩＳ　 Ｊの特に、卵Ｐｃリポソームに関する第７項と第１図と２図を参照）、これに対 して、ＰＰＤ抗原を保存していないリポソームは、上記の動物に陽性の皮膚試験 反応を示さない（上記研究論文第１図）。

従って、真皮に注射されたＰＰＤ−リポソームは、マクロファージによって捕食 され、これらのリポソームが保有している抗原が、感作されたリンパ球に与えら れてリンパ球を誘引し、その結果、陽性の皮膚試験反応の紅斑と硬結特性が出現 すると結論することができる。

上記の結論から、リポソームは予防接種用の賦形剤として使用することができる 。

ＰＰＤ−１ボ゛−ムのｔ　のモルモ・　にオ番の ラベルクローシス・マイコバクテリアに感染しておらずまた感作されていないモ ルモット（ＰＰＤに対して負の皮膚試験反応）に、皮下もしくは腹腔内に、ＰＰ Ｄ−リポソームを１週問おきに３回注射した〔上記２条件で作製した卵Ｐｃ／Ｃ ｈ、４：３、リポソーム生卵Ｐ　ｃ　ｓ　１の項参照〕、最後の注射をしてから ２週間後（すなわち最初の注射をしてから６週間後）に、皮膚試験を、ＰＰＤ単 独、ＰＰＤ−リポソームもしくはリポソームについて実施した。マイコバクテリ ウムで予め感作されたモルモット　（例えばＢＣＧの予防接種）、と全く同様に 、これらの動物は、ＰＰＤもしくはＰＰＤ−リポソームに対して陽性の皮膚反応 を示すが、ＰＰＤを保有していないリポソームには陽性反応を示さなかつた。こ れらの実験は、ＰＰＤに感作されたリポソームが、モルモットに細胞性免疫形の 防御反応を誘発することを示している。　ＰＰＤだけでは、マイコバクテリウム と予め接触させていなかった動物（またはヒト）に、免疫性をごくわずかでさえ も出現させることができないということを思い起こすべきである。

したがってＰＰＤ−リポソームは、脂質　（卵Ｐｃ、　Ｃｈ）　と、マイコバク テリアとその遺伝物質を除いたマイコバクテリアから抽出した蛋白質だけを含有 しているので、弱毒化されたマイコバクテリアを投与する現在のＢ、Ｃ，Ｇ、ワ クチンよりも安全な予防接種剤を構成すると考えられる。

この技術は、該バクテリウムの蛋白質と、一般的で非特異的な免疫原性の特性で よく知られている該バクテリウムの表面にあるＩＩＩ質と多糖類とを含有するｒ 旧ツベルクリン」、およびマイコバクテリウム・ラベルクローシスに特異的な抗 原分子にも同様に利用できる。「旧ツベルクリン」に感作されたリポソームは、 マイコバクテリウムの細胞内感染性因子の蛋白質、多糖類および脂質を保有する マイコバクテリウム膜のリン脂質二重層を、せいぜい模造するにすぎない、細胞 性免疫に関連する反応を引き出すことによって、マイコバクテリウム・ラベルク ローシスからなる細胞内寄生生物に対して有効なワクチンが入手可能になる。

さらにマイコバクテリウム・レブレ（パンセン病）は、エム・ラベルクローシス に非常によく憤でいることが知られている。その組成中には旧ツベルクリンによ く偵たレプロミンが存在する。レブロミンーリポソームの形成は、現在まで有効 なワクチンが全く存在しない疾病であるパンセン病に対する免疫化の方法として 適切なものである。

またこの発明の技術は、第１表に挙げた細胞内寄生生物が原因の疾病に対する予 防接種法としての用途がある。

土−１ｌ見 １、　クリプトコックス・ネオフォルマンス：　クリプトコックス症 一日和見性微生物。

一免疫抑制された患者の肺から侵入し患者の９０χは全身化する０重傷の髄膜炎 。

２、　カンジダ・アルビカンス　（主に）：　カンジダ症−特に日和見的な微生 物：糖尿病患者、コルチコイド類で治療された患者、広スペクトルの抗生物質で 治療された患者。

一最初は皮膚もしくは粘膜での発作（皮膚、口、食道、膣、呼吸器官）；　全身 レベルに散在することがある（好ましい限局化：腎臓、眼、髄膜、皮膚および心 筋）。

３、　ヒストプラズマ・キャブスラーツム：　ヒストプラズマ症　（米国） −重い一般的な兆候の膣での発作。

−全身に散在することがある。

４、　コクシジオイデス・イミチス：　コクシジオイデス症−肺での発作（！Ｉ 胞−薩瘍など）。

１−亙ｌ１ ５、　サルモネラ：サルモネラ症 一胃腸炎、二次発作、骨髄炎、動脈瘤。

６、　リステリア・モノサイトゲネス：　リステリア症−敗血症−骨髄炎、免疫 抑制された患者の場合は重傷。

７、　プルセラ　（スイス、マルタ熱、流産）：　プルセラ症−全身化慢性肉芽 腫性疾病（牌臓、骨など）８＋　フランジセラ・ツラレンシス：　ツラレミアー 皮膚もしくは肺から侵入、局在膿瘍形成、局部アゾツバシー腺症。

■　クーミジア ９、　クラミジー（ベトソニー）：　オウム病−肺炎（稀れにヘプタシス、脳炎 ） ■、！ケーチア １０、リケフチ−（プロヮゼフキー、、、）：　リケッチア症−発熱、頭播、発 疹 １１、コクシェラ・プルネフチイ＝　Ｑ熱−発熱、高熱、肺炎、ヘプタシス ■、マイコバクテリア症 １２、マイコバクテリア：　−結核、ボビス：結核−レプレニ　パンセン病 すべての場合、与えられた寄生生物の抗原で感作された同じリポソームが、予防 接種用およびヒト血清中のＩｇ　（溶解もしくは非溶解）の検知の両方に利用で きるといえる。

７、　エイズの　クチンと　゛ エイズウィルス　（ＨＴＬν３）抽出物のカプセル化は、オクチルグルコシドを 用いて行うことができる。以下にその製造法を示すが、単に非限定の実施例にす ぎない。

リポソームは、この場合２工程で製造される。すなわち、ａ）　注射法による単 分子層リポソームの製造。

ｂ）　糖蛋白質−界面活性剤複合体の形成とリポソームの「流動化」の後、リポ ソーム二重層における疏水性成分を有する分子とＨＴＬＶ３抽出物との結合。

ａ　リポソームの　゛ 脂質を、１００　ｍＭオクチルグルコシドを含有するトリス塩酸緩衝液ｐＨ７， ２中２０’Ｃで、オクチルグルコシド（オクチルβ−ローグルコピラノシド）に 可溶化し、下記の濃度の液を得る。

１．５１１　Ｍ／ｓ＋ｌ　Ｃｈｏｌ。

２１　ｌ！Ｍ／ｍｌ　Ｅｇｇ　Ｐｃ ３７５　μガのコレステロールと３ｍのＥｇｇ　Ｐｃを混合する。得られた混合 物を、３１のリン酸緩衝液（ＰＢ）　ｐＨ７，４（ＮａＣＩ−０，１３７Ｍ、　 ＭＣｌ−８，７ｍＦＩ、ＫＨｚＰＯａ−１，４７ｍＦＩ。

ＮａｚＨＰＯａ−８，１ｍＭ）にゆっくり注入し、４℃に冷却し、次いで同じｌ ｌ？ｋＩ液（ＰＢ）に対して透析する０次にリポソームを、前記緩衝液（ＰＢ） で予め平衡したファデックスＧ−７５カラムで濾過することによってプレーナー リキッドから分離する。

ｂ　ＨＴＬＶ　（７１ホ’　−１，１７）　ムＨＴＬν３をオクチルグルコシド で抽出した（最終濃度７．５　ｓＭ）　、リポソームを１■ｎオクチルグルコシ ドで流動体にする。これら２つの溶液を、脂質の１　ａｍ　当たり５００　μｇ の）ＨＴＬＶ３の比率で混合する。このことは、０．３７５　ｐｍ　（Ｄ脂質が １３７　ｔＩｇ　（７）ｔｌＴＬＶｓ抽出物に加えられることを意味する。

抽出物−界面活性剤複合体と流動体化されたリポソームを、第１に、減少濃度勾 配のオクチルグルコシド（７，５〜０−Ｍ）に対して透析してリポソームを保有 するＨＴＬＶ３分子を形成し、次に１■Ｍ　ＮａＮ１を含有する緩衝液（ＰＢ） に透析する。

上記のようにして得られたリポソーム、すなわちエイズウィルスから抽出された 分子に感作されたリポソームを、マウスに静脈注射した。上記製剤を３週間間隔 で３回注射した後、抗＋１ＴＬν３抗体の存在がそれらマウスの血清中に検知さ れた。

上記のことから、この発明の技術は、結核の場合と全く同様に、抗エイズ予防接 種の手段と、この疾病を診断する手段を構成すると結論することができる。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞内寄生生物に対して特異的な抗原分子に感作されたリポソームからなる 、細胞内寄生生物に対する診断手段および免疫化試薬として適切な試薬。
2. ２．リポソームは、いわゆる「多重層形」のもので、コレステロールを含有もし くは含有していない請求項１記載の試案。
3. ３．リポソームが、４：１〜４：４の卵Ｐｃ／Ｃｈ比でコレステロールを含有す る多重層リポソームである請求項２記載の試薬。
4. ４．卵Ｐｃ／Ｃｈ比が、４：４に等しいか、この値の近傍の値である請求項３記 載の試薬。
5. ５．抗原分子の直接カプセル化を行う、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の 感作されたリポソームの製造方法。
6. ６．予め作製されたリポソームを抗原分子に接触させる、請求項１乃至４のいず れか１つに記載の感作されたリボソームの製造方法。
7. ７．抗原分子が、ツベルクリン、旧ツベルクリン、レプロミンまたはＨＴＬＶ３ からなる請求項５または６に記載の方法。
8. ８．ウイルス、細菌および真菌の因子に対応する特異的免疫グロブリンの形成に よって起こる感染症の診断手段、および細胞性免疫を出現させる、細胞内病原体 に対する免疫化手段（予防接種）としての、請求項１乃至４のいずれか１つに記 載の試薬の用途。