JPH02500861A - カラーコード化固相分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ″カラーコード化固相分析方法′ は、免疫学的固相方法による抗体または抗原の検知のためのカラーコード化検定 方法に関する。

背景 本明細書で用語ｒｔ−ＰＡＪは、組織プラスノミゲン活性剤を意味する。臨床技 術者は、多数の試薬を容器へ順次加え、試験すべきサンプルをさらに加える化学 的な検定をしばしば行う。技術者は試験管立て、マイクロテストプレート、また は他の容器を固相として使うことができる。試薬またはサンプルのアリコートは 大きな容器から、通常、各試験管またはマイクロテストプレートウェルへ１つを １回に加える。通常、試薬はすべてのウェルにまず加えられ次にサンプル溶液の アリコートがそれぞれのウェルに加えられる。もし技術者が、サンプルを加える プロセスの間、中断したり、または機をそらすと、試験管またはウェルが無視さ れ、て、またがった試験結果がもたらされることになる。試薬溶液は、通常、す べと無色であるかまたはわずかに色のついた流体であることからサンプル溶液に 対してほぼ同一であるので、技術者は、通常、どのウェルがサンプルを含んでい るかを決めることかできない。

技術者によって指またはピペットをウェルのふちにあて、サンプルを一番最後に 加えた試験管またはウェルをモニターしようとするが、この方法はしばしばクロ スコンタミオーシジンを起こし、技術者が、マイクロテストプレートのすぐ近か ら離れるとうまくいかない。

必要なことは、溶液が、サンプルを含んでいるかどうかを決める視覚による方法 である。

改良した固相分析方法が、米国特許出願節７１０３８゜７４０号（参考のための ものである）およびニンビーらによる「改良した酵素−結合免疫吸着剤検定によ り研究されたような「血漿中の組織プラズミノゲン活性剤濃度の年齢依存」臨床 化学、３２．２１６０　（１９８６年）（Ｒａｎｂｙ、　ｅｔ　ａｔ、　、−Ａ ｇｅ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｆ’　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐ　Ｉａｓｓｉｎｏｇｅ 　Ａ　ｃｔｖａｔｏｒ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｐｌａｓｍａ、ａ ｓ　５ｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ＩｍｐｒｏｖｅｄＥ　ｎｚｙｍｅ　−Ｌ　１ ｎｋｅｄ　Ｉ　ｍ＋ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａ　５ｓａｙ“、Ｃ１１ｎｉｃａ ｌ　Ｃｈｅｓｉｓｔｒｙ、３２．２１６０（１９８６））（参考のためのもので ある）に開示された。この改良した固相分析方法は、各サンプルに対して２つの マイクロプレートウェルを用いる。両方のウェルは、抗原特異性抗体（ａｎｔｉ ｇｅｎ　−５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂ’ｏｄｙ）で被覆されていて、第２の ウェルは、同じ抗原特異性抗体溶液にさらされていて、第１のウェルが、非特異 性抗体にさらされている。抗原を含むサンプルが、次に加えられて、定量的な抗 原値が得られる。第２のウェルのサンプルに対して得られた値を、第１のウェル の同じサンプルに対して得られた値から差し引くことにより、非特異性吸収（ま たは結合）から生ずる部分が、相殺する。

この方法に従って検定を行う技術者は、同じサンプルを２つまたはそれ以上のウ ェルに加え、サンプルを特定のウェルに加えることを無視する確率を増加させね ばならない。

したがって、必要なことは、２つまたはそれ以上の同一のウェルを相互について 容易にかつ迅速に識別する方法およびサンプルがまだ加えられていないウェルか らサンプルを含んであるウェルを区別する容易で迅速な方法本発明にしたがえば 第１の固相および第２の固相を抗原特異性抗体で被覆する段階、第１の染料を第 ２の固相へ加える段階、既知量の抗原を有する標準溶液へ第１の固相をさらす段 階、未知量の抗原を有する溶液へ第２の固相をさらす段階および第１の固相およ び第２の固相へ結合した抗原の量を測定する段階を含んでなるサンプル中の抗原 を検知する改良方法が提供される。本発明のもう１つの実施態様では、第１の染 料とは異なる色を有する第２の染料が、第２の固相へ加えられてもよい。

試験を受けるサンプルがくわえられたとき、第１の染料または第２の染料あるい は第１と第２の両染料が、色を変える能力を持っていてもよい。たとえば血液ま たは血漿を含むサンプルが試験されることになる固相ヘヘロムフェノールブルー を加えると、血漿サンプルが加えられたときにブロムフェノールブレーは、紫色 から青色へ変化することになる。このことは、試験を行っている技術者がサンプ ルの添加をモニターするのを助ける。

本発明は、典型的な検定の間に多数のサンプルを多くのウェルに加えるマイクロ テストプレートを使う検定において特に有用である。マイクロテストプレートの ウェルはカラーコード化されているので、技術者がどのウェルにサンプルが加え られているかを知るのがより容易である。

したがって本発明の目的は、免疫学的検定でのサンプリングの誤りを減じる方法 を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、サンプルをすでに加えた溶液を、サンプルの入って いない溶液から区別する方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、再形成（ｒｅｃｏｎｓｔｌｔｕｔｉｏｎ）後の凍結 乾燥された試薬どうしを相互に区別する方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、各種の生化学的染料を用いることにより、固相どう しを区別する方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、カラーコード化免疫検定キットを提供することであ る。

本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および利点は、下記の図示した実施 態様の詳細な記載から明らか第１図は、本発明を具体的に示すマイクロテストプ レートの平面図である。

開示された実施態様の詳細な説明 本発明にしたがえば、固相の表面への抗原特異性抗体の不動化、固相への染料の 添加、未知量の抗原を含むサンプルの添加および、固相の表面に結合した抗原の 量の測定の各段階を含むサンプル中の物質を検知する改良方法が開示されている 。固相の表面に結合した抗原の量を測定することは、本分野の通常の知識を有す るものに周知である。

本発明はまた、第１の固相と第２の固相を抗原特異性抗体で被覆すること、第１ の染料を第１の固相へ加えること、既知量の抗原を有する基準溶液へ第１の固相 をさらすと、未知量の抗原を有する溶液へ第２の固相をさらすこと、および第１ の固相と第２の固相とへ結合している抗原の量を測定すること、の各段階を含む サンプル中の抗原を検知する改良方法も含んである。本発明のもう１つの実施態 様では、第１の染料と異なる色を有する第２の染料を第２の固相へ加えてもよい 。

第１の染料または第２の染料あるいは第１と第２の両染料は、試験を受けるサン プルが加えられたときに、色を変える能力を有していてもよい。たとえば血漿を 含むサンプルが試験されることになる固相ヘブロムフェノールブルーを加えると 、血漿サンプルが加えられたときにブロムフェノールブルーは紫色から青色へ変 化することができる。このことは、試験を行っている技術者がサンプルの添加を モニターするのを助ける。

サンプルは、加えられたとき、ｐＨ変化をしてもよい。

この場合、多くのｐＨ指示薬染料が、本発明での使用に合っているであろう。色 の変化は、ｐＨ変化により支配されてもよく、またはイオン変化、成分の濃度の 変化などの他の因子により支配されてもよい。

抗原特異性抗体を測定するだめの免疫学的検定に、同じ概念を適用することがで きる。これらの検定では、抗体特異性抗原（ａｎｔＩｂｏｄｙ−ｓｐｅｃｉｆｉ ｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　）を、固相に伏する。サンプル溶液は、溶液中に既知量ま たは未知量の抗体を有している。本発明は、抗原特異性（ａｎ’ｔｉｇｅｎ−ｓ ｐｅｅｉｒｉｃ）であるポリクロナール抗原またはモノクロナール抗原を分析す るための利用できる。

本発明は、典型的な検定中、多数のサンプルが多くのウェルに加えられるマイク ロテストプレートを用いる検定で特に有用である。マイクロテストプレート中の ウェルは、カラーコード化されているので、どのウェルにサンプルが加えられて いるかを技術者が知るのはより容易である。

マイクロテストプレートのすべてのウェルが使われている本発明のもう１つの実 施態様では、抗体または抗原のいずれかが測定されることに依存して、抗原また は抗体で被覆されている第１列のウェルへ第１の染料を加えることができる。第 １の染料が第１列のウェルへ加えられ、第１の染料と異なる色を有する第２の染 料をプレートの第２列のウェルへ加えることができる。次に第１の染料を第３列 へ加え、プロセスはすべてのウェルが着色するまで、くり変えされる。このこと は、交互する色を有する交互する列のウェルを有するマイクロテストプレートを もたらす。列は交互する色を有するので溶液が加えられたのはどのウェルである かをモニターすることがより容易である。

米国特許出願節７１０３８，７４０号およびランビーらによる「改良した酵素− 結合免疫吸着剤検定により研究されたような「血漿中の組織プラズミノゲン活性 剤濃度の年齢依存」臨床化学、３２．２１６０　（１９８６年）（Ｒａｎｂｙ、 　ｅｔ　ａｌ、　、”Ａｇｅ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐ 　Ｉａｓ＋＊ｉｎｏｇｅ　Ａ　ｃｔｖａｔｏｒ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ　Ｐｌａｓｍａ、　ａｓ　５ｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ａｎ　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｅ　ｎｚｙｍｅ　−Ｌ　１ｎｋｅｄ　Ｉ　ｍ５ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａ　５ｓ ａｙ“、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２．２１６０（１９８６） ）（参考のためのものである）に開示された。この改良した固相分析方法は本発 明とともに用いるのに特に適している。

改良した固相分析方法は、各サンプルに対して２つのマイクロテストプレートウ ェルを用いて、ウェルの内面への抗体の被覆または物理的吸着の量を説明（ａｃ ｃｏｕｎｔ’ｆｏｒ）する。両ウェルは抗原特異性抗体により被覆されていて、 第２のウェルは同じ抗原特異性抗体溶液にさらされていて、第１のウェルは非特 異性抗体にさらされている。次に抗原を分んでいるサンプルを加え、定量的な抗 原の値が得られる。第２のウェルのサンプルに対して得られた値を第１のウェル の同じサンプルに対して得られる値から引くことにより、非特異性吸着（または 結合）の量が除かれる。

改良した固相分析方法は、各サンプルに対してマイクロテストプレートの第２の 容器すなわちウェルを用いるので、試薬またはサンプルをマイクロプレートのウ ェルへ加える時にまちがいをよりおこしやすい。本発明にしたがい、マイクロテ ストプレートの各種ウェルに異なる着色した染料を加えることによって、試験を 受けることになるサンプルまたは試薬を加えるのに対してまちがいをおこす可能 性が大きく減少する。

本発明の改良固相分析方法は、染料を任意の順番で免疫学的検定のために加える ことを含み、試験を受けるサンプルおよび試薬の添加が容易にモニターできると いうことが理解されるべきである。典型的な免疫検定システムに用いられる各種 のウェルへ染料が個々に加えられてよいということは本発明の意図するものであ る。本発明の改良固相免疫検知を行うにあたり、固相たとえば一連の試験管また はより好ましくは、エリサ型検知（ＥＬＩＳ　Ａ　ｔｙｐｅ　ａｓｓａｙ　）で 使用されているようなマイクロテストプレート中のウェルが抗原特異抗体により 被覆される。

次に本発明を特定の例を用いて説明するが、これらの例は本発明を説明するため のものであり、本発明の目的を制限するものではない。

例１ マイクロテストプレートは、約１／１００ｍｇ／ｌの抗体を約０．１〜１．０Ｍ ／ＪｊのＮａＨＣＯ３を含む約３０〜３００μ更の溶液中でプレートのウェル内 で約２〜４時間２０〜３０℃で注意深く振盪させながら培養することにより、抗 原により被覆される。次にウェルを空にし、内容物をＰＢＳ　）ウィーン（Ｐ　 Ｂ　Ｓ　Ｔ　ｖｅｅｎ）で洗浄する。

本発明で用いることのできる染料にはフェノールレッド、ブロムフェノールブル ー、ブロムクレゾールグリーン、アリザリンレッドＳ１ブロムクレゾールパープ ル、ブロムチモールブル−、ニニートラルレッド、ブリリアントアエロ−および メチルオレンジがあるが、これらに限定されるものではない。

第１図を参照して本発明の１つの実施態様を次に説明する。典型的なマイクロテ ストプレート１０は、約１２の縦のコラム１２からなっていて、各コラム１２は 約８このウェル１４を含んでいる。横列はＡ−Ｈまでの文字１３をしばしばつけ てあり、対のコラムは第１図に示しであるように１〜１２までの数字１５をしば しばつけである。各サンプルまたは標準に対して、隣り合う縦のコラムの２つの ウェルが次のように使われる。コラム１と名がつけである最も右の列１６は、Ｐ ＳＢトウィーンに溶解させた正常な抗体または非特異性抗体（５〜１５ｍｇ　／ ｓ　ｆｌ）約１００〜２００μ文であらかじめ満たされている。最も左側のコラ ム１６にすぐ隣り合うコラム２と付けであるコラム１８は、ＰＢＳトウィーンに 溶解している特異性抗体（５〜１５ｍ　ｇ　／ａ　ｉ）　１００〜２００μ更で あらかじめ満たされている。特異性抗体は、好ましくは、被覆に対して用いたの と同じ抗原特異性抗体である。

コラム３と名づけである次の隣りのコラム２０は正常な抗体によりあらかじめ満 たされていて、コラム４と名づけである次の隣接するコラム２２は抗原特異性抗 体であらかじめ満しである。次にコラム１２は、正常な抗体または抗原特異性抗 体により交互にあらかじめ満しである。

特有な色を有する染料たとえばフェノールレッドを２つの最も左側のコラム１６ および１８のそれぞれのウェルに加える。

異なる色を有する染料を次のコラム２０に加える。この染料は試験を受けるべき 流体にさらされると色を変える染料からなる群から選択することができる。たと えばブロムフェノールブルーはアルブミンを含んでいる溶液を加えたとき紫色か ら青色へ色を変える。したがって、血漿を試験するならばブロムフェノールブル ーは用いるのにすぐれた染料である。

コラム１６．１８．２０のウェル内の染料から区別することのできる色を有する 染料がコラム２２のウェルに加えられる。好ましくは、この染料はメチンオレン ジである。

次にウェルは後半の２つの生化学的染料で交互に満され、非特異性抗体を含んで あるすべてのウェルが生物学流体にさらされたとき色を変える生化学的染料を含 むようになる。

したがりでもしフェノールレッド、ブロムフェノールブルーおよびメチルオレン ジが染料として用いられると、サンプルの添加まえは始めの２つのコラムの色は 赤色でアリ、残りのコラムは１つのコラムが紫色で隣りのコラムが黄色である交 互した色となる。

次に最も左側のコラム１６および１８が、Ｏｎｇ／ｓ愛から約３０ｎｇ／ｍｕま での濃度の漸増する濃度の抗原を含んでいる等しい量の標準血漿で満される。生 化学的フィラー溶液たとえばマンニトールをすべてのウェルに加えてよい。フィ ラーはウェルの内容物を物理的に安定させる目的を果し、内容物はマイクロテス トプレートが凍結乾燥されたのちウェルに残ったままでいるようになる。マンニ トールフィラーはまた凍結乾燥プロセスの間、蛋白質成分が変性するのを保護す る。フィラーとして用いることのできる他の物質には、アルブミン、グリシン、 ポリエチレングリコールおよびプルロニックＲ−６８（二ニーシャーシー州、パ ージパンニー、ＢＡＳＦ社）［Ｐ　１ｕｒｏｎｉｃ■Ｆ　−６８（Ｂ　Ａ　Ｓ　 Ｆ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ　Ｎ　Ｊ　）　］がある がこれらの限定されるものではない。

血液サンプルは慣用の方法によって採取され、数分間１０００〜３０００　Ｘｇ で延伸分離をすることによって数分間で延伸分離するようにする。

試験を受けることになる各プラズマサンプルからの１０〜１００μ更のアリコー トを、生化学的な染料を含み、ＰＢＴ）ウィーンに溶解させた５〜１５ｍｂ／ｉ の濃度の正常な抗体または特異性抗体であらかじめ満たした。

したがりて、第１の隣接する列２０にある最も上のウェル３０はウェルの第２の 隣接する列２２の最も上にあるウェル３２と同じサンプルを含むことになる。同 様にして区別のできる色の溶液を含んでいる隣接するウェルの対４０は同じサン プルのアリコートを含むことになる。

正常な抗体とブロムフェノールブルーを含んでいるウェルへ血漿を加えると、溶 液の色が紫色から青色へ変わり、技術者が、血漿サンプルをすでに含んでいるウ ェルと結晶サンプルがまだ加えられていないウェルとを区別することができる。

前記したようにキットは、赤く着色した標準血漿を有するウェルを有し、非特異 性抗体を有するウェルが紫色に着色していて、抗原特異性抗体を有するウェルが 黄色に着色している。このようなキットは、試験を行っている技術者が容易にサ ンプルの添加をモニターできるので使うのがより容易であり、サンプル採取の誤 りの可能性が大きく減少する。

標準とサンプルとを、注意深く２０〜３０℃で３時間培養する。

ＰＢＳ　）ウィーンに溶解させたＨＲＰ−接合抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔ ｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（８ｍ　ｇ　／　１）の５０μ更のアリコートをマ イクロテストプレートのそれぞれのウェルに加える。次にマイクロテストプレー トはウェル内で２０〜３０℃で２時間培養させる。

ウェルはその中味をあけてから、ＰＢＳトウィーンで洗浄する。

次にくえん酸−燐酸緩衝液（Ｐ　Ｈ５）に溶解させたパーオキシダーセー基質の ２００μ更のアリコートを暗所で２０〜３０℃で５〜４０分間、ウェル中で培養 させる。

基質反応は５０μ文の４〜５Ｍ／１のＨ２ＳＯ４を加えることによって中断させ る。

４９２ｎ＋ｇでの吸光度を記録する。正常な抗体で満されたウェルと特異性抗原 で満されたウェルとの間の吸光度の差を各血漿サンプルに対して計算する。この ことは、応答（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の抗原特異性部分を示している；このことは 、抗原が抗原のなくなった血漿に希釈されている標準曲線と比較される。

例２ ｔ　−ＰＡに対するポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体を用いて血漿 中にある人間の組織プラスミノゲン活性剤抗体の測定のための（２段階）方法を 次に水入間のシングルチェーン組°織ブラスミノゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）は、モ ノクロナール抗体［Ｐ　ＡＭ　１セフアローゼ（Ｐ　Ａ　Ｍ　Ｉ　Ｓ　ｅｐｈａ ｒｏｓｅ）　］　ヘの親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロストグラフィーおよびセ ファクリル５Ａ−２００スーパー７フイン（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　５Ａ−２００ ）ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ　）への後続するゲルろ過により、使用済み黒色腫細胞培 地から精製される。最終的な生成物は約１ｍｇ／＋ａＩＬの濃度とされ、使用さ れるまで液体窒素内に貯蔵される。最終生成物は還元条件下でナトリウムドデシ ルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動でシングルバンドを与える。蛋 白質含量は酸加水分解ののちアミノ酸分析により測定される。

ｔ−ＰＡに対するポリクロナール抗血清は、高度に精製した人間のシングルチェ ーンｔ　−ＰＡで８匹のヤギを免疫とさせることによって作られる。

ＩｇＧ画分は硫酸アンモニウム沈殿法と蛋白質Ａ親和カフロストグラフィーによ り分離される。

ＩｇＧは、１５０　ｍａ＋ｏｌ／　ｌのＮａＣＪｊを含む２０　ｍａｏｌ／ｌの 燐酸塩緩衝液（ｐ”７．２）に対し透析し、１０■ｇ／■更に濃縮し、使用する まで一２０℃以下に保存する。蛋白質含有量は、１．６ｍｇ’ｉ　斐−１０１″ １の吸光力を用いて測定される。

非免疫ヤギＩｇＧは、硫酸アンモニウム沈殿方と蛋白質Ａ親和力クロマトグラフ ィーとにより分離される。ＩｇＧは、１５０５ｓｏｌ／　ｌのＮａＣｕを含む２ ０　＋ｎ＋ａｏｌ／　１の燐酸塩緩衝液（ｐ”７．２）に対し透析し、１０ｉｇ ／四更に濃縮し、使用するまで２０℃以下に保存する。

蛋白質含有量は、１　、６ｍ　ｇ　”　ｍ　ＩＪ、−’　ｃｒ’の吸光力を用い て測定される。

シングルチェーンおよびダブルチェーンｔ　−ＰＡ　（ＰＡＭ３）に対する高い 親和力を有するＩｇＧＫモノクロナール抗体は、硫酸アンモニウム沈澱法と蛋白 質Ａ親和力クロマトグラフィーとによりマウス腹水から精製される。このＩｇＧ は、１００５ｌＲａｌ／　ｌのＮａ　ＨＣＯ３（ｐＨ９，２）に対し透析されて から２０ｉｇ／ｉｌに濃縮し、使用するまで一２０℃以下に保存する。蛋白質含 有量は、１　、４　ｙａ　ｇ　−’　ｒａ　−’　ｃｍ−’の吸光−力を用いて 測定すレる。

１００のマイクロテストプレートに対するＰＡＭ　３／ＨＲＰは、として行われ る。１００１ｇの［米国、ミズリー州、セントルイス（Ｓｔ　、　Ｌｏｕｔｓ、 　ＭＯ，、ＵＳＡ）］をＮａＣ１を含むｐＨ７，２の５０　ｍ１ｏｌ／　ｌの燐 酸ナトリウム炎症液に溶解させたもの）を用いて溶解させる。有益は暗所で２５ ℃で１８時間培養する。培養後、溶液は１００■のＮａＨＣＯ３により９ｍ更ま で希釈し、同じ緩衝液に対し８時間透析する。０．３ｍ　ＩＬのＰＡＭ３の抗体 （２０ｉ　ｇ　／ｌａ　ｌ）を加え、この混合物を暗所で２５℃で１８時間培養 する。リシンモノハイドロクロライド（２１１ｏｌ／ｌ）の１００μ更を加えて 残りの活性部位をブロックアウト（ｂｌｏｃｋｏｕｔ）する。９０分の培養のの ちコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）を滅菌ろ過し蛋白質に適用する。セ ファローズコラム［２５ｉ更のセファローズ（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　６８　 Ｆ　Ｆに結合した７５ｍｇ（７）蛋白質Ａ］は、１００ＩＩＩＩＩ１０１／ｆＬ のＮａＨＣＯ３により平衡とさせる。コラム平衡緩衝液により洗浄したのち、コ ラムは１００　ｍｍｏｌ／　ｌの酢酸ナトリウム（ｐ’　５．０）により溶解す る。コンジュゲート画分を厚め、ＰＨを７゜２まであげ、溶出度は２００　ｍｅ ａｌ／　ｎのＮａＣＪｌを含んでいる２　０１ａｏｌ／愛の燐酸ナトリウム（ｐ ”７．２）に対で２０時間透析をする。４０３■ｍと２８０　ｎｏのきうこうど を測定し、Ａ４０３／Ａ２８０比例を計算し０．２〜０．３の間であることがわ かる。コンジュゲートは約ｌａ　ｇ　／ｌ１ｌｌの蛋白質濃度に濃縮させ、使用 されるまで一２０℃以下に保存する。

ｔ−ＰＡ枯渇人間血漿（ｔ　−Ｐ　Ａ　ｄｅｐｌｅｔｅｄ　ｈｕｍａｎｐｌａｓ ｍａ）。肝炎およびエイズ（ＡＩＤＳ）抗体のないことがわかっている人間の血 漿を人間ｔ　−ＰＡに対するセファローゼ結合ポリクロナールヤギ抗体への免疫 吸着によりｔ　−ＰＡ枯渇させる。

ウシ漿液アルブミン（Ｎｏ、Ａ　−７６３８）は、米国ミズリー州セントルイス のジグ７　（Ｓ　ｉＨａ、Ｓ　ｔ、Ｌ　ｏｕｉｓ。

ＭＯ，、ＵＳＡ）から購入される。

他の試薬 マンニトール、フェノールレッド、メチルオレンジおよびポリオキシエチレンソ ルビターンモノラウレイト［ツイーン（Ｔｖｅｅｎ）　２０１はスエーデンのス トックホルムのケボＡＢ　（Ｋｅｂｏ　ＡＢ、　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｗ、　Ｓｗｅ ｄｅｎ　）から購入される。

加酸化水素水（３０％）はスエーデンのストックホルムのラバス：Ｔ　（Ｌ　ａ ｂｂａｓｓｅｏ、Ｓ　ｔｏｃｋｈｏＬｓ、Ｓ　ｖｅｄｅｎ　）から購入される。

ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムおよび０−フェニレンジアミン はＦＲＧのグーマスタラドのメルク（Ｍ　ｅｒｃｋ、　Ｄ　ａｒｍｓｔａｄｔ、 Ｆ　ＲＧ　）から購入される。

マイクロテストプレート、マイクロテストプレート（免疫プレー）ＩＩ）はデン マークのナン（Ｎｕｎｅ　、　Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入される。

ＰＢＳ　）ウィーン緩衝液である１０ｓ■ｏｌ／、ｉの燐酸ナトリウム緩衝液（ ｐ’　７）　、Ｎａ　Ｃ１１４０ｍ＋＊ｏｌ／吏、２０゜４．５ｓ　ｏｆ／、ｉ のＨ２ＳＯ４゜すでに使用できる基質。２５０個のバイアル、５６゜７７ｇのＮ ａ　２　ＨＰＯ４＋３８．４ｇのくえん酸を蒸留水により６２５■吏まで希釈す る。すべてが溶液となったとき、２．４ｇの１．２−フェニレンジアミン（０゜ Ｐ、Ｄ、）を加える。Ｏ，Ｐ、Ｄ、が溶解したとき、溶液は滅菌濾過し、２．５ −文部づつ凍結乾燥させる。

以上の記載は本発明の好ましい実施態様に関するものであり、本発明の精神と範 囲から逸脱することなく多くの変更態様が可能であることも理解されたい。

国際調査報告 “°°〜゛〜゛−ａｍ−ｍｈ′ｍ＊＠ＦＣ：、三、、、、；７゜

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）固相の表面への抗原特異性抗原の不動化；（ｂ）固相への染料の添加 ； （ｃ）未知量の抗原を含むサンブルの添加；および（ｄ）固相の表面に結合した 抗原の量の測定；の各段階を含んでてるサンブル中の抗原を検知する改良方法。
2. ２．抗原特異性抗体がポリクロナール抗体とモノクロナール抗体とからなる群か ら選択される請求項１記載の方法。
3. ３．サンプルの添加により染料が色を変える請求項１記載の方法。
4. ４．第２の固相が抗原特異性抗体によって被覆されている請求項１記載の方法。
5. ５．第１の染料と異なる色を有する染料を第２の固相へ加える請求項４記載の方 法。
6. ６．既知量の抗原を含む標準溶液へ第２の固相をさらす請求項５記載の方法。
7. ７．サンブルの添加に先だち染料を含有する第２の固相および第１の固相を凍結 乾燥させる段階をさらに含んでいる請求項６記載の方法。
8. ８．サンブルの添加に先だって固相を凍結乾燥させる前に緩衝溶液を加える段階 をさらに含む請求項７記載の方法。
9. ９．染料がフェノールレッド、ブロムフェノールブルー、ブロムクレゾールグリ ーン、アリザリンレッドＳ、ブロムクレゾールパーブル、ブロムチモールブルー 、ニュートラルレッド、ブリリアントイエローおよびメチンオレンジからなる群 から選択される請求項１記載の方法。
10. １０．第１の染料と異なる色を有する染料がフェノールレッド、ブロムフェノー ルブルー、ブロムクレゾールグリーン、アリザリンレッドＳ、ブロムクレゾール パーブル、ブロムチモールブルー、ニュートラルレッド、ブリリアントイエロー およびメチンオレンジからなる群から選択される請求項５記載の方法。
11. １１．固相の表面へフィラーを加える段階をさらに含む請求項１記載の方法。
12. １２．フィラーがマンニトール、アルブミン、グリシン、ポリエチレングリコー ルおよびブルロニックＲＦ−６８（Ｐ１ｕｒｏｎｉｃＲＦ−６８）からなる群か ら選択される請求項１１記載の方法。
13. １３．（ａ）第１の固相と第２の固相を抗原特異性抗体で被覆すること； （ｂ）第１の染料を第１の固相へ加えること；（ｃ）既知量の抗原を有する標準 溶液へ第１の固相をさらすこと； （ｄ）未知量の抗原を有する溶液へ第２の固相をさらすこと；および （ｅ）第１の固相と第２の固相とへ結合している抗原の量を測定すること； の各段階を含むサンブル中の物質を検知する改良方法。
14. １４．第１の染料と異なる色を有する第２の固相へ加えるようにしてなる請求項 １３記載の改良方法。
15. １５．未知量の抗原を有する溶液の添加により、第２の染料が色を変える請求項 １４記載の改良方法。
16. １６．未知量の抗原を有する溶液への添加により、第１の染料が色を変える請求 項１３記載の改良方法。
17. １７．段階（ｃ）に先だって染料を含有する第２の固相および第１の固相を凍結 乾燥させる段階をさらに含んでいる請求項１３記載の方法。
18. １８．段階（ｃ）に先だって第１および第２の固相を凍結乾燥させるまえに、緩 衝溶液を加える段階をさらに含んでいる請求項１３記載の方法。
19. １９．段階（ｃ）に先だつ第１および第２の固相を凍結乾燥させるまえにフィラ ーを加える段階をさらに含む請求項１３記載の方法。
20. ２０．該第１の染料がフェノールレッドである請求項１３記載の方法。
21. ２１．該第２の染料がブロムフェノールブルーである請求項１３記載の方法。
22. ２２．未知量の抗原を含む該溶液が血液中に含まれている請求項２１記載の方法 。
23. ２３．（ａ）第１の固相および第２の固相上に抗原特異性抗体を不動化させるこ とを； （ｂ）第１の色を有する第１の染料溶液を第１の固相を加えることおよび第１の 染料とは異なる色を有する第２の染料の溶液を第２の固相へ加えること； （ｃ）非特異性抗体を含む溶液を第１の固相へ加えること； （ｄ）第１および第３の固相を被覆するために用いた同じ抗原特異性抗体を含む 溶液を第２の固相へ加えること； （ｅ）サンブルを第１および第２の固相へ加えること； （ｆ）第１および第２の固相へ結合している抗原の量を測定すること；および （ｇ）第２の固相に対する検定値を第１の固相に対する検定から引くことにより サンブル中の抗原の量を測定すること； の各段階を含むサンブル中の抗原を検知する改良方法。
24. ２４．第３の固相が抗原特異性抗体により被覆されていて、第２の染料が第３の 固相へ加えられる請求項２３記載の改良方法。
25. ２５．既知量の抗体を有している溶液を第３の固相へ加える請求項２４記載の改 良方法。
26. ２６．（ａ）第１の固相および第２の固相を抗体特異性抗原により被覆すること ； （ｂ）第１の染料を第１の固相へ加え、第１の染料３０なる色を有する第２の染 料を第２の固相へ加えること； （ｃ）既知量の抗体を有する標準溶液へ第１の固相をさらすこと； （ｄ）未知量の抗体を有する溶液へ第２の固相をさらすこと；および （ｅ）第１の固相と第２の固相とへ結合している抗体の量を測定すること； の各段階を含んでいるサンプル中の抗体を検知する改良方法。
27. ２７．（ａ）第１の固相および第２の固相上に抗体特異性抗原を不動化させるこ と； （ｂ）第１の色を有する第１の染料溶液を第１の固相へ加えることおよび第１の 染料と異なる色を有する第２の染料溶液を第２の固相へ加えること； （ｃ）非特異性抗原を含む溶液を第１の抗体へ加えること； （ｄ）第１および第２の固相を被覆するために用いた同じ抗体特異性抗原を含む 溶液を第２の固相へ加えること； （ｅ）サンプルを第１および第２の固相へ加えること； （ｆ）第１及第２の固相へ結合した抗体の量を測定すること；および （ｇ）第２の固相に対する検定値を第１の固相に対する検定値から引くことによ りサンブル中の抗体の量を測ること； の各段階を含むサンブル中の抗体を検知する改良方法。
28. ２８．第３の固体相が抗体特異性抗原により被覆されていて、第３の染料が第３ の固相へ加えられる請求項２８記載の改良方法。
29. ２９．既知量の抗体を有する溶液を第３の固相へ加える請求項２９記載の改良方 法。