JPH02500297A

JPH02500297A - 単核白血球免疫システムの免疫調節状態の自動的評価のための方法及び装置

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Publication number: JPH02500297A
Application number: JP62505070A
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Inventors: アンダーソン，ジェフリー，イー．
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Priority date: 1986-08-12
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Publication date: 1990-02-01
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、標準の刺激に応答する単核白血球免疫システムの能力の分析を行なうための装置及び自動化された方法に関する。長時間相互作用した刺激性単核細胞の特定のサブクラスに基づく活性化抗原の発現に関するデータが、流動細胞螢光測定技法を用いて集められる。これらの刺激された単核細胞サブクラス上での活性化抗原の発現の分析は、単核白血球免疫システムの免疫調節状態と相互関係する。

このアッセイは、イン　ビトロでの単核細胞の相互作用、たとえば細胞のサンプルが得られる個人の免疫調節状態に依存する相互作用の分析を提供する。従って、このアッセイの結果は、インビボでの単核白血球免疫システムの免疫調節状態の測定として使用され得る。このデータの分析は、正常体間のマイトジェン応答の異質性を説明し、種々の免疫媒介疾患における免疫調節の異常性を定義し、そして単核細胞活性化の抑制又は強化を含む免疫調節療法をイン　ビボでモニターするための方法を提供することができる。そのアッセイはまた、データ及び調節シグナルプロセッシングに関して、ある変性された流動細胞螢光測定装置の使用も包含し、そしてこれは、刺激された単核細胞のより正確且つ再生できる測定を可能にする。

背景及び従来技術免疫システムは、外来性粒子、たとえば病原性微生物に対して及び腫瘍性トランスフォーメーションを受ける生来の細胞に対して身体を保護することによって恒常性を維持する調節システムである。免疫システムは、循環成分、すなわち体液及び細胞成分によりその調整を身体内に及ぼすことができ、そしてそれらの起点から除去される部位で作用することができる。、免疫システムの複雑性は、比較的明白な細胞タイプに基づいて多重効果を及ぼすことができる複雑なコミュニケーションネットワークに由来する。

免疫システムの細胞成分は、比較的明白な細胞型から成る。

形態学的基準を用いて、細胞成分は、たとえば顆粒球、リンパ球及び単球のクラスに分けられ得る。その形態学的基準は、細胞サイズ及び細胞内オルガネラ、たとえば核の相違を含む。

これらのクラスの中で、リンパ球、単球及び関連細胞は、単核細胞として一緒にグループ分けられる。

さらに細胞タイプの区別は、抗原決定基と命名されているある細胞表面構造体を用いての細胞のサブクラスへの分割を包含し；すなわち、細胞のクラス内に、比較的明白な細胞タイプ：すなわちサブクラスを定義する特定の抗原決定基が存在する。他の抗原決定基又は抗原決定基の組合せは、さらにサブクラスを記載するために使用され得ることが示されるべきであり；この後、用語クラスは、形態学的基準に基づく細胞タイプの差異を言及し、そしてサブクラスは抗原決定基の形態及び発現に関する基準に基づく差異を言及する。

免疫システムの主な単核細胞クラスは、卓球及びリンパ球である。他のクラスの単核細胞、たとえば天然のキラー細胞とを思われるリンパ芽球及び大顆粒状リンパ球が存在する。

末梢血液単球は骨髄単球に由来する。ヒ）ＩＪンパ球は、２種の領域、胸腺及び “嚢”同等物に由来する。これらの領域は、中枢リンパ球システムとして言及される。末梢リンパ球システムは、リンパ節、リンパ結節、膵臓、ＧＩ管のリンパ組織、呼吸管、分泌腺及び血液に見出される成熟リンパ球から成る。

これらの“末梢”位置に見出される単核リンパ球は、この後、末梢単核細胞として言及される。成熟単核リンパ球は、免疫担当細胞として言及され、そして単核リンパ球免疫システムを一緒に構成するために取られる。

単核リンパ球ｊマ、サブクラスに分けられ得る。たとえば、２種の主なタイプのリンパ球；Ｔリンパ球（Ｔ−細胞として言及される）及びＢ　リンパ球（Ｂ−細胞として言及される）が存在する。Ｔ−細胞は、種々の細胞媒介の免疫反応に関係する関連のサブクラスのグループを構成する。これらのサブクラスは、リンパ球としてそれらを同定するそれらの形態及びサブクラスを示す特定の抗原決定基により白血球のサンプルにおいて区別され得る。Ｔ−細胞サブクラスは、種々の細胞媒介調節機能、たとえば免疫応答の増強又は抑制に関与し、そしてエフェクター機能、たとえばウィルス感染された細胞、外来性細胞又は悪性細胞の細胞毒性破壊に直接的に関与する。

単核細胞は、直接的な細胞−細胞接触により又は可溶性因子により情報伝達し、すなわち相互作用する。これらの可溶性因子は、リンパ球により分泌される場合、リンフ才力イン又は単球により分泌される場合、モノカインと呼ばれる。免疫担当細胞は、それらの細胞表面上で特定のリンフす力イン／モノカインのための高い特異性の受容体を発現することができる。その受容体とリンフォカイン／モノカインとの結合は、ある細胞内でき事を開始し又は促進する。

たとえば、リンパ球の増殖はあるリンフ才力インにより影響される。インターロイキン−２（この後ＩＬ−２として言及する）は、培養において長期のＴ−細胞系の増殖を促進するリンパ球由来の因子である。活性化に基づいて、Ｔ−細胞はＩＬ−２及びＩＬ−２受容体（ＩＬ２Ｒとして言及する）を産生ずる。ＩＬ−２受容体へのＩＬ−２の結合は、細胞周期のＳ相にＧ　ｏ　／　Ｇ　ＩからＴ−細胞が進行するのを引き起こし［Ｄ、Ａ、Ｃａｎｔｒｅｌｌ　ａｎｄ　Ｋ、Ａ、Ｓｍ１ｔｈ、　”Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　：　Ｃｏｎ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆａｒ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗ−ｔｈ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、（１５８）　１８９５〜１９１１１１　（１９８３）　］　、そして他のリンフ才力インの産生を調節する。

ＩＬ−２又はその受容体のいづれかの産生の不足は、多くのＴ−細胞免疫応答の不足をもたらす。ＩＬ−２受容体はまた、Ｂ−細胞及び単球上にも見出されて来た。ＩＬ−２はまた、ＩＬ−２受容体の発現を調節せず、すなわちそれは細胞表面上に発現されるＩＬ−２受容体の量を高める。Ｋ、Ｗｅｌｔｅ、など０、’Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２　Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＡＣＡｎｔｉｇｅｎｏｎ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ−インの例は、多くのＴ−細胞依存性免疫応答の増幅のために不可欠であると思われるインターロイキン−１（この後、ＩＬ−１として言及する）である。ＩＬ−１は、あるＥ−ロゼツト受容体の発現を誘発し、そしてリンフ才力イン、ＴＬ−２の産生を刺激する。Ｓ、ＢｏＭｉｚｅｌ、　”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、”　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｒｅｖｉｅｗ、　（６３）５１〜７２　（１９８２）。

８０％の成熟Ｔ−細胞上に見出される特定の４４キロドルトンのタンパク質が、モノカイン、ＩＬ−１のための受容体として機能すると思われる。

外来性（たとえばウィルス又は器官の移植）又は変性された（たとえば腫瘍性）抗原への単核白血球免疫システムの応答の誘発は、特定の抗原のための受容体と共に、単核細胞、たとえばリンパ球の活性化を包含する。この活性化は、抗原が受容体に結合する場合に開始される一連の出来事を伴う。

活性化は、抗原に応答するために細胞のクローンへの細胞分化及び増殖を提供する。

活性化は必ずしも一連の出来事を伴わず、しばしば出来事は同時に生じ、そしてすべての出来事は、細胞分裂を直接的に導ひくとはかぎらない。重要な活性化の出来事は、ある細胞表面分子の架橋、ある酵素、たとえばタンパク質合成、たとえばあるリンフォ力イン／モノカイン及び活性化抗原の産生の増強性を促進する酵素の活性化を導ひくある細胞内出来事、細胞表面上での活性化抗原、たとえばあるリンフォカイン／モノカイン受容体の発現、調節シグナル（たとえばあるリンフォ力イン／モノカイン）を増強又は抑制することによるこれらの出来事の調節、ＤＮＡの複製及び細胞分裂を含む。

タンパク質合成の上昇は、１時間はどで生じ、そしてＤＮＡ複製は、初めの刺激の後約３６時間で始まる。これらの活性化出来事は、それぞれの単核細胞サブクラスのために必ずしも一様ではなく、そして調節シグナルへの応答も一様ではなく；従って、単核白血球免疫システムの細胞の活性化は、それらの異質性により天然においては同時に起こらない。Ｒ，Ｆ。

Ａｓｈｍａｎ、　”Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”、　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

２６７〜３００　（１９８４）。

刺激は、ある細胞表面分子を架橋することによって単核細胞の活性化を開始することができる。抗原は、抗原−存在性細胞、しばしば単球との相互作用の後、機能的に多価にされる場合にそのような架橋を達成する。植物源又は動物源から得られる多価の糖タンパク質（レクチンと呼ばれる）は、ある表面分子を架橋することができ、それによってリンパ球を活性化し、さらに細胞分裂を誘発する。細胞分裂を導ひく活性化を開始せしめる物質は、マイトジェンと呼ばれる。マイトジェンとして作用するレクチンの例として、フィトヘマグルチニン（この後ＰＨＡとして言及する）、コンカナバリンＡ及びアメリカヤマゴボウのマイトジェンを挙げることができる。

リンパ球上に、Ｔ−細胞抗原受容体及びＥ−ロゼツト受容体表面分子の両者が架橋され、それによって細胞を活性化する。たとえば、Ｔ−細胞抗原受容体を同定し、そして結合するモノクローナル抗体受容体がマイトジェンとして作用することができる。レクチンフィトへマグルチニンのマイトジェン効果は、Ｅ−ロゼツト受容体を通して媒介される。従って、単核白血球免疫システムの活性化を開始せしめる刺激は、抗原、抗体及びあるレクチンを含むことができる。架橋するために重要である多価性は、活性化物質の生来の性質であり、抗原−存在性細胞との相互作用により生物学的に達成され又は支持体、たとえばセファロースビーズに結合することによって人工的に達成される。

刺激が一連の活性化出来事を開始した後、休止細胞上に容易に検出されないある細胞表面タンパク質の高められた発現が存在する。これらは、活性化抗原として言及される。活性化抗原は、一定のリンフォ力イン／モノカインのための受容体を含む。１つのそのような活性化抗原は、またＴＡＣ抗原としても言及されるＩＬ−２受容体であり、そして６時間内に検出できることが示されていて、そして活性化の開始の後、７２時間で最大の発現を達成する。Ｄ、Ａ、［：ａｎｔｒｅｌｌ　ａｎｄ　Ｋ、Ａ。

Ｓｍ１ｔｈ、前記。

細胞膜上に発現される他の活性化抗原は、ＤＲ、トランスフェリン受容体、Ｔ１１．と呼ばれるＥ−ロゼツト受容体のエピトープ、ＴＩＯ，Ｔａ、、　Ｂａ、　４Ｆ２．　ＡＡ−３及びＡｃｔ　Ｉを含む。たとえば、Ａ、１．　Ｌａｚａｒｏｕｔｉｓ、など０、”Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎｓ　：　Ｉ、？、（ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、八ｎｔｉ−Ａｃｔ　Ｉ、Ｄｅｆｉｎｅｓ　ａＩｍｍｕｎｏｌｏｇＬ　（１３３）　１８５７〜６２　（１９８４）を参照のこと。特定の活性化抗原が、単核細胞の１つのクラス又はサブクラスに対して必ずしもユニークである必要はなく、そしてそれらは、一連の活性化の出来事の間、同時にそれぞれ発現されない。

従って、刺激が単核細胞の活性化を開始した後、一定の時間で、ある活性化抗原が発現される程度は、特定の一連の前の出来事及びそれを発現する単核細胞に対する調節的な影響に依存するであろう。

すべての活性化抗原の機能はまだ知られていない。トランスフェリン受容体は、マイトジェンに対する単核細胞の応答を高めることが知られていて、そして天然のキラー細胞の分化に関与するトランスフェリンを結合する。あるリンフオカイン／モノカインのための受容体、たとえばＩＬ−２受容体の発現は、刺激による開始の後、活性化出来事の普及において重要である。

従って、外来性又は変性された抗原に対する単核白血球免疫システムの応答は、直接的な接触及び／又はリンフオ力イン／モノカインにより相互作用する明確な機能を有する種々のサブクラスの細胞から成る複雑な調節網を包含する。［］ａｍ　ｌｅ。

ある単核細胞サブクラスの個々の細胞における一連の活性化出来事を開始せしめるであろう。その一連の出来事は必ずしも直線的である必要はなく、すべての細胞が開始し、又はその一連の出来事のそれぞれの段階で等しい時間を費やすとはかぎらない。その一連の活性化出来事は、単核細胞の分化及び増殖に関して、特定の調節機能を有するあるリンフオ力イン／モノカインのための受容体の発現、及びその産生を含む。

Ｊ、Ｊ、Ｆａｒｒａｒ　ａｎｄ　Ｗ、Ｒ９Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　”Ｔｈｅ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｃａ５ｃａｄｅニ一連の活性化出来事の変化は、細胞が属するサブクラス及びこれらの調節シグナルの効果により決定される。単核白血球免疫システムの調節コミュニケーションネットワークの存在下でそのシステムの個々の細胞の活性化は、調節及びエフェクターサブクラスの分化及びクローン増殖、刺激因子の中和及び多少無活動的であることができる定常状態へのそのシステムの起こりつる返還をもたらす。この状態は、開始する時間の長さに関して適切に刺激に応答する単核白血球免疫システムの能力、その応答の性質及び強度を決定する。この単核白血球免疫システムの“初期”状態は、免疫調節状態と呼ばれる。

過去１０年以上にわたって、単核白血球免疫システムの複雑な調節及びエフェクター機能を分析するための新規方法が開発されて来た。モノクローナル抗体の開発は、単核白血球免疫システムにおける種々のサブクラスの同定及び列挙を促進せしめた。これらの抗体は、細胞表面構造体、たとえば抗原決定基に結合することができる。細胞へのモノクローナル抗体の結合は、その抗体が螢元口に直接的又は間接的に結合されている場合、螢光顕微鏡を用いて決定され得る。Ｔ−細胞抗原受容体に対するモノクローナル抗体、たとえば抗−０ＫＴ３、抗−ＣＣＴ３及び抗−Ｌｅｕ−４は、Ｔ−細胞を同定し、そして列挙するために使用され得る。モノクローナル抗体は、他の単核細胞サブクラスを同定し、そして列挙するために使用され得る、たとえば：ヘルパー／インデューサーＴリンパ球、たとえば抗−０ＫＴ４、抗−ＣＣＴ４及び抗−１ｅｕ　３ａ　；サプレッサー／細胞毒性１９７３球、たとえば抗−［］ＫＴ５、抗−〇ＫＴ８、抗−ＣＣＴ８及び抗−１ｅｕ　２ａ　；天然のキラー細胞、たとえば抗えば抗−Ｌｅｕ　−Ｍ３゜アメリカ特許第４．３６４．９３２号、第４．３８１．９３２号及び第４．３８１．２４５号（Ｋｕｎｇによる）　；　Ｇ、Ｅｊ、１ａｎｔｉ、など０、Ｎｏｒｍａｌ　ｔｌｕｍａｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ、　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　５ｕｂｓｅｔＡｎａｌｙｓｉｓ　：　１．Ａｎ　Ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｃｏｍｐａｒｉ−ｓｏｎ　ｏｆ　８５　Ｎｏｒｍａｌ　Ａｄｕｌｔｓ、”　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１２）　４１〜５２　（１９８５）　；等。

同じ又は類似する抗原決定基に結合する抗体は、これらの決定基を“分化の群（Ｃ１ｕｓｔｅｒｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）”に分類するために使用される。Ａ、Ｂｅｒｎａｒｄ、など、　、”Ｔｈｅ　Ｃ１ｕｓｔｅｒｓｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　＜ＣＤ）　Ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａ−ｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎ−ｔｉｇｅｎｓ″’、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　（１１）　１〜１０　（１９８４）　。モノクローナル抗体により同定される抗原決定基は、単核白血球の種々のクラスからの細胞上に見出され、たとえばＬｅｕ　−３ａは、単球及びリンパ球上に見出されることが注目されるべきである。前に述べたように、サブクラスの区別は、形態及び抗原決定基の基準による。また、細胞表面上に発現され、そしてモノクローナル抗体により同定される抗原決定基の量は、細胞の活性化により変化することができ、たとえばＬｅｕ−４の量は、活性化の開始の後、減少するように思われる。

さらにサブクラスの説明は、しばしば同じ細胞上に２種の明白な抗原決定基の同定を必要とする。たとえば、抑制サブクラスのインデューサーは、抗−Ｌｅｕ　 −３ａ及び抗−Ｌｅｕ　−８又は抗−２Ｈ４を用いて同定され、そして列挙され、ヘルパーサブクラスは、抗−Ｌｅｕ−３ａ及び抗−４８４を用いて同定され、そして列挙され、そしてサプレッサーサブクラスは、抗−Ｌｅｕ−２ａ及び抗− Ｌｅｕ−１５を用いて同定され、そして列挙される。

Ｎ、　Ｋ、　Ｄａｍｌｅ、前記０、等。

活性化抗原に結合するモノクローナル抗体、たとえば抗−０ＫＴ９（１−ランスフェリン受容体）及び抗−インターロイキン−２受容体（この後抗−ＩＬ２Ｒと言及する）をまた開発して来た。Ｔ、Ｕｃｈ　ｉｙａｍａ、など０、”Ａ　ｔ、（ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ａｎｔｉ−Ｔａｃ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　Ｍａｔｕｒｅ　）ＩｕｍａｎＴ−Ｃｅｌｌ、”Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（１２６）１３９３〜１４０３　（１９８１）；Ｄ、　Ｌ、　１ｊｒｄａｌ、など０、”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅ−ｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ｆｒｏｍ　Ａｃｔｉｖａ−ｔｅｄ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅ”、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、（８１）　６４８１〜８５　（１９８４）。

流動細胞螢光測定技法は、単核細胞サブクラス、たとえばヘルパー／インデューサー及びサプレッサー／細胞毒性Ｔ−細胞をモノクローナル抗体及び形態的特徴を決定しそして種々の抗原決定基を検出するための装置を用いて、区別するために開発されて来た。アメリカ特許第４．２８４．４１２号において、ｔｌａｎｓｅｎは、特定の血液細胞のリンパ球サブクラスの自動同定及び自動列挙のための方法及び装置を論じる。１（ａｎｓｅｎのアッセイにおいては、完全な血液又はバフイー・コートのサンプルが、リンパ球のサブクラスを同定する別々な抗原決定基と選択的に反応するモノクローナル抗体と共にインキュベートされる。特定の抗原決定基に結合する抗体は、螢元口（螢光色素又はフルオレサーとしても言及される）に直接的又は間接的に結合され、その結果、それらは特定の光（たとえば、アルゴンイオンレーザ−）に螢光的に応答するであろう。単一細胞が、２種の光の散乱パラメーターの測定及び螢光の量に基づいて同定され、そして区別される。値の範囲は、１対象の領域”（また“窓（％１１ｉｎｄｏｗ）”としても言及される）がリンパ球を識別して形成されるように、２種の光の散乱パラメーターに対して電子工学的技法を用いて調整される。対象の領域における個々の細胞のためには、細胞がサブクラスに典型的な抗原決定基の発現を有する場合、螢光の量を用いて決定する。

完全な血液又はバフイー・コートの他に、インキュベーションのための適切なサンプルが、完全な血液の密度勾配遠心法の後、界面から得られることは注目されるべきである。

Ｌ（ａｒｔｉ、など０、前記。この界面は、非成熟顆粒球を含むけれども、はとんど単核細胞をもたらす。また、インキュベートされた細胞のサンプルは、１％パラホルムアルデヒドにより固定され得、そして流動細胞螢光測定を行なうまで、約７日間４℃で貯蔵される。

流動細胞螢光測定器は、細胞が早い速度でオリフィスを通過する場合、単一細胞の性質を測定できる装置である。Ｉ。

５ｃｈｅｒ　＆　ｔ、（、！、ｌａｇｅ、　”Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ、”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　７６７〜６８　（１９８４）　ｏ流動細胞螢光測定器を用いて行なわれる測定は、光、たとえばアルゴンイオンレーザ−からのコーヒーレフト光のビームにより交差される流体の流れに懸濁された細胞に対して行なわれる。レーザーは、これらのシステムにおいて特に重要である。なぜならば、それらは、分析される細胞に多量のエネルギーを運ぶために集中され得る、強く、平行で（平行な光の波）且つ単色の光の源を提供するからである。流体の流れにおける細胞がそのビームと交差する場合、光が散乱される。低角度で前方に（入射光の角度に対して約２〜１５度）及び直角に（入射光及び流れの交差点に対して約９０度）散乱された光が、検出され、そして測定され得る。他の角度での光の散乱もまた検出され、そして測定されることが注目されるべきである。

低角度で前方への（この後、前方と言及する）光の散乱の検出器が、レーザービームと一直線に直接配置される。直角の光の散乱及び螢光収集レンズが、レーザービーム及び流れの交差点に対して直角に配置される。直角の光の散乱の測定は、光電子増倍管（この後、ＰＭＴと言及する）を用いる。前方への光の散乱の検出器及び直角の収集レンズにより受け入れられる光は、およそ円錐形の半角が２０°である。

前方への及び直角の光の散乱の測定は、それぞれ細胞の大きさ及び細胞内構造に関係することが見出された。ある流動細胞螢光測定器は、白血球クラスを示すための２つのパラメーターのうちの１つとして、前方への光の散乱の代わりに、細胞体積の測定を用いることが注目されるべきである。赤血球細胞、血小板及び残骸は、最っとも低いレベルの前方への及び直角の光の散乱をもたらす。流動細胞螢光測定器上の開始トリガーは、光の散乱データがこれらによってもたらされないように調整され得る。死んだ細胞は、生存している細胞よりも低い前方への及び直角の光の散乱測定値をもたらすであろう。サイズ及び細胞内構造の相違のために、種々の白血球クラスが、前方への及び直角の光の散乱パラメーターを用いて区別され得る。１ｌａｎｓｅｎ、前記；　Ｒ，Ａ、Ｈｏｆ　ｆｍａｎ、など６、”Ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　Ｒａｐｉｄ　ｔ、４ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　）Ｉｕｍａｎ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　５ｕｂｃｌａｓｓｅｓ　ｉｎ　ＰｅｒｉｐｈｅｒａＩ　Ｂｌｏｏｄ、”　ｌ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、（７７）　１９１４〜１７　（１９８０）　；アメリカ特許４．４９２．７５２号（Ｈｏｆｆｍａｎ）。はとんどのリンパ球は、前方への及び直角の光の散乱の両者において低レベルであろう。はとんどの単球は、前方への光の散乱において高いレベルであり、そして直角の光の散乱においてわずかに高いレベルであろう。はとんどの顆粒球は、リンパ球及び卓球の前方への光の散乱と重複する光の散乱レベルをもたらすが、しかしながら、直角の光の散乱は、これらのクラスのいずれよりもより高いレベルをもたらすであろうことは注目されるべきである。光が散乱する“対象の領域”は、これらのクラスのそれぞれ同定され得るように限界を定められ得る。前方への及び直角の光の散乱パラメーターに基づいてこれらの区分を重複する重要な単核細胞クラスが存在する。これらはリンパ芽球及び天然のキラー細胞であり、そしてこれらは単球に類似する光の散乱パラメーターをもたらす。そのような場合、螢光団結合のモノクローナル抗体が、これらの単核細胞クラスのサブクラスの区分を促進せしめるために使用され得る。

レーザーは、しばしば４８８ナノメータ（この後、ｎｍと言及する）の光が発生されるように調整される。この光の波長は、フルオレセイン−イソチオシアネート（この後、ＦＩＴＣと言及する）のための最適な励起を提供する。ＦＩＴＣは、モノクローナル抗体プローブに接合される螢光団として通常使用される。

分析される細胞が螢光団結合のモノクローナル抗体に結合されている場合、光は、レーザー光により螢光団の励起から放射され、たとえばＦＩＴＣはグリーンスペクトル（この後、グリーン螢光と言及する）の光を放射する。放射される光は、収集レンズに入いり、そして次に一連のフィルターを通過し、そしてこれはある光の波長のみが螢光検出器、通常ＰＭＴに入いることを可能にする。螢光検出器及び光の散乱検出器は、測定されたパラメーターデータを分析するために装置により使用され得るアウトプットとして電子シグナルを発生せしめる。

レーザービーム中の細胞により発せられる螢光の量は、励起される螢光団の数に比例する。モノクローナル抗体は、既知の数の螢光団に結合され得る。従って、螢光検出器により発生される電子シグナルの大きさは、細胞に結合されるモノクローナル抗体の数に比例し、そしてそれによって、細胞表面上に検出される抗原決定基（又は活性化抗原）の数を測定する。従って、細胞は、前方への光の散乱、直角の光の散乱及び螢光パラメーターを用いて、単核白血球のクラス内の特定のサブクラスに割り当てられ得る。

流れ及び光のビーム軸に対して直角な軸にそって取付けられた３個のＰＭＴにより形成された流動細胞螢光測定器によれば、発光された光の２つの波長が、直角の光の散乱の他に検出され得る。フィルターは、それぞれのＰＭＴにより検出されるべき放射光の波長を単離するために使用される。この技法は、２種のモノクローナル抗体（それぞれは細胞表面上で異なった抗原構造体、たとえば２種の異なった抗原決定基に結合する）と共にインキュベートされた細胞の二重パラメーター螢光測定を促進せしめる。モノクローナル抗体は、レーザー光により照射される場合、異なった光の波長を放射する螢光測定的に区別される螢光団に通常直接的に結合される。

検出のための放射された光の特定の波長を単離するためにフィルターを使用する場合でさえ、ＰＭＴにより検出される発光スペクトルのいくらかのオーバーラツプが存在する。はとんどの流動細胞螢光測定器は、オーバーラツプを修正するためにオペ−ターにより調整され得る電子補整ネットワークを有する。　Ｍ、Ｒ，Ｌｏｋｅｎ、など、　、”Ｔｗｏ−Ｃｏｌｏｒ　ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（２５）　８９９〜９０７　（１９７７）。

ＦＩＴＣの他に、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ色素（アビジンに結合され、そして次にビオチン化されたモノクローナル抗体と共にインキュベートされた）が、しばしば二重螢光測定のために使用される。この色素は、５６８ｎｍの波長で光により最適に励起され、それによって第２レーザーを必要とする。第２レーザーからの光は、第２レーザーの交差点よりもわずかに下の流れの上に集中される。そのような２種のレーザーシステムは、光の散乱及び両螢光パラメーターが同時に評価されるように適切なシグナル遅延エレクトロニクスを必要とする。最近発見された螢光化合物、フィコエリトリン（この後、ＰＥとして言及する）（アメリカ特許第４．５２０．１１０号を参照のこと）はモノクローナル抗体に結合され、そしてそれが４８８ｎｍの波長で光によりまた励起され得るように、ＦＩＴＣによる二重パラメーター螢光測定のために単一のレーザーシステムによす使用される。

ＰＥにより放される光は、オレンジ−レッドスペクトル（この後、レッド螢光として言及する）に存在する。Ｖ、Ｔ、Ｏｉ。

など０、　”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　’ｆｏｒＡｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ−皿、（９３）　９８１〜８６　（１９８２）。二重パラメーター螢光測定の使用は、単核白血球のクラス内での追加のサブクラスの分離を促進せしめ、そしてサブクラス上での抗原決定基の発現を明確にし、たとえばＬｅｕ　−２ａの高いレベルがサプレッサー／細胞毒性サブクラス上に見出され、そしてＬｅｕ　−２ａの低いレベルが天然のキラー細胞上に見出される。Ｌ、Ｌ、Ｌａｎ１ｅｒ　ａｎｄ　Ｍ。

Ｒ，Ｌｏｋｅｎ、“Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ　Ｉｒｎｍ’ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏ−分析を促進するために、流動細胞螢光測定により得られるデータが、表示される１又は２つの測定されたパラメーターを伴って、度数分布プロット、すなわちヒストグラムとして通常表示される。それぞれ２つのパラメーターヒストグラムは、細胞の数を示す輪郭により地形学的な地図に似ている。

ヒストグラムは、分析されるそれぞれの細胞のためのデータ又は単に対象の領域内でのパラメーターデータを示すことができる。細胞当りに検出される抗原決定基及び活性化抗原の量は、ヒストグラム上にすべての細胞のための螢光パラメーターデータを示すために対数尺度の使用を必要とする広い範囲を有する。これは、ＰＭＴにおける予備増幅器により生成される電子シグナル（このシグナルは、しばしばＰＭＴにより検出される全螢光に比例するように調整されている）の対数的増幅を用いて、しばしば達成される。多くの抗原決定基は対数正規分布を有し、それによって分析を促進せしめることが見出された。この対数正規分布は、しばしば、細胞活性化による抗原決定基の調整の後でされ見出される。流動細胞螢光測定データを示すヒストグラムの分析は、単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価する試みにおいて単核細胞のサブクラスを列挙するために使用されて来た。

変えられた免疫調節状態は、多くのヒト疾病、たとえばウィルス疾患、自己免疫疾患及び悪性にかかっているのではないかと思われる。自己免疫疾患は、自己抗原が単核細胞の活性化を開始せしめるような単核白血球免疫システムの一次欠損を含む。器官の移植の場合、薬物投与による正常な免疫調節状態の抑制が、その移植された器官の拒絶反応を避けるために必要とされる。二次薬物投与又は疾病状態のいづれかによる免疫抑制は、ある悪性の増殖を高めると思われる。Ｉ。

Ｐｅｎｎ、”Ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｎ−ｃｅｒ、”　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＬ　（４６）　４５９Ａ＋４７４　（１９８１）。免疫システムを含む、正常なヒトの生理学的機能の障害は、免疫媒介障害として言及され得る。

末梢血液サンプルが、種々の免疫媒介障害を有する患者におけるＴ−細胞サブクラスの百分率を決定するためにモノクローナル抗体及び流動細胞螢光測定を用いて分析されて来た。

ｔ、１．Ａ、Ｂａｃｈ　ａｎｄ　Ｊ、Ｆ、Ｂａｃｈ、“Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　）、１ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ−ＴＣｅｌｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　５ｔｕｄｙ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　（４５）　４４９〜４５６　（１９８１）。たとえば、ヘルパー／インデューサー：サプレッサー／細胞毒性（この後、Ｈ：Ｓとして言及する）Ｔ−細胞の比の上昇が、自己免疫疾患又は多発性硬化症を有する多くの患者に見出された。サプレッサ、−／細胞毒性Ｔ−細胞の上昇が、ウィルス性疾病の患者に見出され、そしてそれはＨ：Ｓ比の低下を引き起こす。後天性免疫不全症候群（この後ＡＩＤＳとして言及する）を有する患者においては、Ｈ：Ｓ比の低下がまた存在するが、しかしながら、これはヘルパー／インデューサーニー細胞の数の減少によるものである。固形腫瘍を有する患者においては、ヘルパー／インデューサー及びサプレッサー／細胞毒性ニー細胞の数の減少が、その百分率は正常であるけれども、見出される。このＴ−細胞サブクラスにおける異常性は、一定の疾病を有するすべての患者において一貫して見出されたことはなく、そしてしばしば、その異常性は、疾病活性の程度と相互関係しない。たとえばＨ：Ｓ比は、全身性紅斑性狼癒を有する患者における疾病活性と相互関係しないことが見出された。Ｊ、Ｓ、Ｓｍｏｌｅｎ’、など０、”Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　５ｕｂｓｅｔｓ　ｉｎ　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙ−ＨＴＬＶＩＩＩ、すなわちＡＩＤＳの病因であると思われるウィルスにより感染された患者は、ヘルパー／インデューサーニー細胞の減少した数を必ずしも有さない。

イン　ビトロでの単核白血球アッセイは、適切に機能する単核白血球免疫システムの能力を測定する試みを進展した。

従来のイン　ビトロ機能的アッセイは、幼若化を誘発せしめるためにマイトジェンを使用する。次に、幼若化の量が、複製ＤＮＡ中に摂取された３Ｈチミジンにより特定される。このタイプのアッセイは、一定の濃度の単離された単核細胞を用いて行なわれ、そして該細胞は、最適濃度のマイトジェンの存在下で培養され、そして次に３Ｈチミジンによりパルスされている。′Ｈチミジンの摂取は一般的に、７２時間の細胞の培養の後、測定される。しかしながら、これらのアッセイは、幼若化の誘発の間、相互作用する単核細胞サブクラスの分析を可能にしない。Ｂ、Ｆ、Ｈａｙｎｅｓ、など、　、”Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅ５−ある疾病は、これらのアッセイに使用されるマイトジェンに対する低められた（たとえば悪性又はＡＩＤＳ）又は高められたくたとえば多発性硬化症）イン　ビトロ応答に関連する。

免疫抑制剤、たとえばグルココルチコイド及びシクロスポリンは、幼若化を抑制することが示された。免疫抑制剤により研究は、リンパ球のあるサブクラスに対する特異的な阻害効果を示した。しかしながら、これらの従来のマイトジェンアッセイは、幼芽化の誘発の間、相互作用するリンパ球サブクラスの分析又は変えられた免疫調節状態に帰する特異的阻害又は相剰効果の測定を可能にしない。Ｆ、Ｋｒ　１ｓｔｅｎｓｅｎ、など０、ｌｌｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　：　１．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎＴ−１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、”　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、（５）　５９〜６３　（１９８２）。

同様に、明確なサブクラスを有さない、単核細胞クラス、たとえばリンパ球上のＩＬ−２受容体の発現の測定はまた、変えられた免疫調節状態の多くの可能性ある病因を区別することにおいて有用でないことが判明した。Ｔ−細胞の活性化は、リンフ才力インのための特定の細胞表面受容体、たとえばＩＬ−２受容体の発現、及びリンフ才力イン、たとえばＩＬ−２の合成をもたらす。免疫抑制剤、たとえばグルココルチコイド及びシクロスポリンは、タンパク質合成を阻害し、そして特にマイトジェンにより刺激された単核細胞によるＩＬ−２の産生をブロックすることが見出された。モノクローナル抗体、すなわち抗−ＴＡＣを用いての研究は、シクロスポリンがそのような細胞におけるＩＬ−２受容体の発現をブロックしないことを示唆する。Ｔ、　Ｍｉｙａｗａｋｉ、など８、”（：ｙｃｌｏ −ｓｐｏｒｉｎ　Ａ　Ｄｏｅｓ　Ｎｏｔ　Ｐｒｅｖｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔａｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ、　ａＰｒｏｂａｂｌｅ　ＴＣＧＦ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　！Ｊｏｌｅｃｕｌｅ、　ｏｎ　Ｍｉｔｏｇｅｎ−３ｔｉｍｕｌａｔｅｄＨｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌｓ、’　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１３）　２７３７〜４２（１９８３）。）ＩＴＬＶＩＩＩにより感染された患者において、ある患者のグループのみは、マイトジェンによる刺激の後、ＩＬ−２受容体を発現しないことが見出された。ＳＬＥを有する患者は、マイトジェンによる刺激の後、ＩＬ−２受容体の正常な発現を有するが、しかしリウマチ様関節炎を有する患者は、ＩＬ−２受容体の発現が減じられた。Ｎ０Ｍ１ｒｙａｓａｋａ、など０、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ　ａｎｄ　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄＳｙｓｔｅｍ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、　”　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　Ｉｍｍｏｎｏｐａｔｈ、。

（３１）　１０９〜１７　（１９８４）。ＭＳ患者からの脳を髄液リンパ球は、ＩＬ−２の産生を低めるけれども、正常な割合のＩＬ−２受容体産生細胞を有する。

本発明の要約本発明は、単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法及び装置に関する。本明細書に記載されるアッセ・ｆは、免疫媒介障害を有し又は免疫調節治療を受けた患者の変えられた免疫調節状態と正常な個人の免疫調節状態とを識別する。その方法は、標準の刺激により単核細胞を培養し、そして特定の単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を測定することを包含する。これらの測定値の分析は、単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度、すなわち刺激に応答する単核リンパ球免疫システムの能力を決定するために使用される。細胞活性化の程度は、単核白血球免疫アッセイは、免疫調節状態の適時（約２４時間以下）で、再生でき且つ正確な評価をもたらす。これらの特性は、診断及び治療測定法を助けるための臨床アッセイのために、たとえば適切な免疫抑制治療の遅延が器官の損失をもたらす移植器官の拒絶反応をモニターするために必要である。

特に、本発明は、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルが一連の活性化出来事を開始するために十分な時間、標準の刺激を伴って培養され、そしてサブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性化の進展を可能にする方法に関する。このアッセイは、刺激の前、特定のサブクラスの単離を含まず、そして従って、それらがイン　ビボで存在する場合、システムの他のザブクラス成分の増強及び抑制効果を保持し、そして測定する。このアッセイのための標準の刺激は、精選したサブクラス上での特定の活性化抗原の発現の再生できる測定が、それぞれ同じ時間の刺激を伴っての培養の後、正常な個人からの単核細胞のサンプルからくり返しの決定に基づいて得られるように、既知の濃度での物質から成る刺激として定義される。標準の刺激の例として、マイトジェンレクチン、ＩＬ−１を有するセファロース結合の抗−０ＫＴ３及びＩＬ−１及びＩＬ−２を有するセファロース結合の特定の抗原を挙げることができるが、但しこれだけには限定されない。

精選したサブクラス上での細胞表面活性化抗原の発現の量の測定は、それぞれの細胞のための光の散乱データ及び螢光パラメーターデータを集めるために、螢光測定的に区別できる螢光団結台のモノクローナル抗体及び流動細胞螢光測定法を用いて行なわれる。光の散乱データは、特定の白血球クラスを同定するために使用され、そして螢光データは細胞サブクラス及び活性化抗原の発現の量を列挙するために分析される。特定のサブクラスにおける活性化された細胞の量は、前もって調節された最少量又は前もって調節された範囲の活性化を用いて決定され得る。精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度は、この流動細胞螢光測定データの分析から決定され、そして免疫調節状態を評価するために用いられる。白血球クラス、細胞クラス及び活性化抗原の発現の量に関するデータの生成及び分析は、適切なソフトウェア−を有するコンピューター装置を有する流動細胞螢光測定装置を用いて行なわれる。このシステムは、得られる測定値及び従って装置により生成される結果の正確さ及び再現性を確保するためのデータ及び調節シグナルプロセッシングを含む。

特に、本発明は、Ｔリンパ球サブクラスがイン　ビボで応答するように、相互作用するそれらの能力を保持しながら、スの能力を決定するために使用され得る。

アッセイは、それらの細胞膜上にある抗原決定基、たとえばＬｅｕ　−３ａ又はＬｅｕ−２ａを担持する細胞を検出することによっであるＴ−細胞サブクラスを列挙することができる。標準の刺激、すなわちＰＨＡと共に１８時間のリンパ球の培養の後、これらのＴ−細胞サブクラスは、測定できる量の活性化抗原、すなわちＩＬ−２受容体を発現する。これらのＴ−細胞サブクラスの活性化の程度を決定するための分析は、個人の免疫調節状態の臨床測定を付与する。同じように、アッセイは、他の単核細胞サブクラスの活性化の程度を決定し、それによってこの臨床測定を再改良する。

これらの技法及び方法を用いて、本発明は、単核白血球免疫システムの変えられた自己調節及びその免疫システムに基づく免疫調節療法の効果のイン　ビボ運動学を評価するために十分に敏感であり且つ特異的である方法及び装置を提供する。

図面の簡単な説明これらの図面に示されるヒストグラムは、ＭＤＡＤＳソフトウェア−パッケージ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ｔｌｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）を用いてＥＰＩＣ３Ｖ流動細胞螢光測定器により測定される４種のパラメーターデータから生成された。それぞれ２種のパラメーターのヒストグラムは、それらが示すパラメーターのためにラベルされたＸ及びｙ軸を有する。それぞれの軸は、チャネルとして言及される６４個の等しく一定の間隔を開けられた区分に分割される。前方への光の散乱（ＦＬＳ）の軸は直線である。直角（ＬＩ９０）　、グリーン螢光（ＬＧＦ）及びレッド螢光（ＬＲＦ＞の軸は対数によるものである。

Ｚ軸は細胞の数に関し、そして直線である。これらの平面プロットにおいては、輪郭が２−軸の値を示すために用いられ、そして散乱密度プロットにより表わされる。それぞれ２種のパラメーターヒストグラムの下に、輪郭が描かれている３種のレベルが存在する。それぞれ１つのパラメーターヒストグラムに関しては、ｙ−軸は細胞の数に関する。ｙ−軸のためのスケールファクターは、上部の左コーナーに存在する。ヒストグラムに示される細胞の合計数は、上部の右コーナーに存在する。

いくつかの図面においては、対象の領域が幾何学的形状又はカーソル線により区画される。その幾何学的形状を得るために使用される点のＸ及びｙ座標は、ヒストグラムの左側に存在する。使用される場合、それぞれ２種のパラメーターヒストグラムのために４種のカーソル線が存在し、そしてそれぞれ１種のパラメーターヒストグラムのために２種のカーソル線が存在する。カーソル線が描かれているチャネル数は、それぞれヒストグラムの下に示される。２種のパラメーターヒストグラムに関しては、軸のラベル（たとえばＬＧＦ）の後に、２種の数が存在し、それぞれはカーソル線が描かれるチャネルを示す。１つのパラメーターヒストグラムに関しては、単語“チャネル”の後に、２種のカーソル線が描かれる場所を示す２種の数が存在する。また、特定の幾何学的形状内に又はカーソル線の間に細胞数を配置するデータパラメーターによる細胞の数が単語“全体”の後に示される。これは、単語“間隔における％”の後のヒストグラムに示される合計細胞の％とじて示される。

第１図は、実線により区画された対象の領域と共に、末梢血液の密度勾配遠心分離により単離された白血球の流動細胞螢光測定により測定される場合の前方への光の散乱及び直角の光の散乱データのヒストグラムを示す。

第２図は、区画された対象の領域と共に、第１図におけるのと同じ白血球の流動細胞螢光測定により測定される場合の前方への光の散乱及び直角の光の散乱データのヒストグラムを示す。

第３図は、１８時間ＰＨＡと共に培養した後、密度勾配遠心分離により末梢血液サンプルから単離された白血球の流動細胞螢光測定により測定される場合の分析されていない２種のパラメーターの光の散乱を示す。

第４図は、リンパ球を示す区画された対象の領域と共に、第３図におけるのと同じリンパ球のための同じデータを示す。

第５図は、抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥ及び抗−Ｌｅｕ　−３ａ−ＦＩＴＣの両者と共にインキュベートされ、そして第４図におけるのと同じリンパ球である刺激された単核細胞の分析されていない２種のパラメーターの螢光データを示す。

第６図は、第５図からの０及び１つのレッド螢光チャネルにおけるそれらの細胞のみを用いて構成されたグリーン螢光データのヒストグラムを示す。

第７図は、第５図において決定されたようなおおよそのＸ−切片で設定されたカーソル線と共に、第５図におけるのと同じ白血球のための同じデータを示す。

第８図は、レッド螢光チャネル１０で設定された第２カーソル線と共に、第７図におけるのと同じ白血球のための同じデータを示す。

第９図は、レッド螢光チャネル２５で設定された第３カーソル線と共に、第７図におけるのと同じ白血球のための同じデータを示す。

第１０図は、第８図におけるのと類似する方法で設定されたカーソル線と共に、抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥ及び抗−Ｌｅｕ　−２ａ−ＦＩＴＣの両者と共にインキュベートされ、そして第４図におけるのと類似するリンパ球である刺激された単核細胞の２種のパラメーターの螢光データを示す。

第１１図は、マウス−１ｇＧ＋　ＰＥ及びマウス−１ｇＧ、−ＦＩＴＣの両者と共にインキュベートされ、そして第４図におけるのと類似するリンパ球である刺激された単核細胞の分析されていない２種のパラメーターの螢光データを示す。

第１２図は、第９図に類似するヒストグラムを示す。

第１２Ａ図は、第９図に類似するヒストグラムを示す。

第１３図は、抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥと共にインキュベートされ、そして第４図におけるのと類似する白血球である刺激された単核細胞の流動細胞螢光測定により測定される場合のレッド螢光データ（対数スケール）の１つのパラメーターのヒストグラムを示す。

第」４図は、単核白血球免疫システムの免疫調節状態の臨床的評価を促進するために流動細胞螢光測定及びシグナルプロセッシングハードウェアー、マイクロコンピュータ−システム及びソフトウェア−を含む装置のための好ましい態様の概略図を示す。

詳細な説明本発明の好ましい態様を詳細に示し、そして測的にいくらか詳細に記載したけれども、これによって本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、添付する請求の範囲及びそれらの同等物により測定されるであろう。

本発明のアッセイにおいては、末梢単核白血球を実質的に含むサンプルを単離し、そしてその白血球を単一細胞懸濁液に分散する。サンプルは、末梢単核細胞を含むいづれかの部位から得られ、そして培養の後、分析されるべき適切な数の細胞が存在するように単核細胞の量を含むべきである。密度勾配遠心分離技法、たとえばフィコール−ハイバーク分離法を用いて、単核細胞の％を高めることができる。この技法は、不釣り合いの数の顆粒球、たとえば急性細菌感染を有する被検体又は単核細胞の数を抑制する疾病を有する被検体からの末梢血液を有するサンプルのために特に重要である。

単離された細胞のサンプルを、単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる量の活性化抗原の発現の進展を可能にするために十分な時間、標準刺激により培養せしめる。この特定の態様においては、百万個の細胞／−の濃度での単離された細胞を、標準の刺激として作用する、３７．５ｘ／ｍ１の濃度でのＰＨＡと共に１８時間培養する。ウシ胎児血清を有するＲＰＮ１１１６４０及びグルタミンが培養培地として作用する。その培養時間は、正常な被検体からのサンプルを用い、異なった時間それぞれのサンプルの一部を培養し、そしてそれぞれの培養時間での活性化抗原の発現の量を決定することによって、それぞれ特定の標準刺激のために決定される。測定できる量のＩＬ−２受容体の発現は、Ｐ　ＨＡによる培養の開始の後、約１８時間で観察される。１８時間の培養時間は、臨床アッセイとしての本発明の使用を容易にする。

培養の後、細胞を洗浄し、標準刺激を開除し、そして次に細胞のアリコートを、螢光測定的に区別できる異なった螢光団にそれぞれ直接結合される２種のモノクローナル抗体と共に同時にインキュベートする。第１の螢光団結合のモノクローナル抗体は精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に結合し、そして第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体は精選した細胞表面活性化抗原に結合する。

インキュベーションの後、その細胞を洗浄し、過剰の抗体を除き、そしてこの特定の態様においては、１％バラホルムアルデヒドにより固定し、いづれかの追加の細胞活性を停止せしめる。

単離された細胞の一部を、培養の前、得ることができることは注目されるべきである。これらの細胞のアリコートをモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして上記のようにして調製する。次にこれらの細胞のアリコートを用いて、標準刺激による培養によりもたらされるデータパラメーター、たとえば培養の前の細胞活性化の程度を測定することができる。標準刺激による培養はまた、細胞の形態及び抗原決定基の調節における変化をもたらすことができる。

好ましい態様においては、モノクローナル抗体に結合される第１の螢光団はＦＩＴＣであり、そして第２の螢光測定的に区別できる螢光団はＰＥである。細胞が光のビーム通過する場合、その特定の細胞により放射されるグリーン及びレッドの螢光の量に関するデータは、細胞上に発現される特定のサブクラスの抗原決定基及び活性化抗原の量の決定を可能にする。

およそ同じ表面積を有する細胞（たとえば対象の領域内の細胞）からの螢光データを調べる場合、発現される抗原決定基又は活性化抗原の量は、密度として言及され得る。

この特定の態様においては、直接的に螢光団結合のモノクローナル抗体、たとえば抗−Ｌｅｕ　−３ａ−ＦＩＴＣ，抗−Ｌｅｕ　−２ａ−ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥを用いて、細胞表面抗原を同定し、そして列挙する（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）。

もう１つの螢光団結合のモノクローナル抗体の例は、抗−Ｌｅｕ−４−ＦＩＴＣ，抗−Ｌｅｕ　−１２−ＦＩＴＣ，抗−Ｌｅｕ　−１１−ＦＩＴＣ及び抗−０ＫＴ９−ＰＲであるが、しかしこれだけには限定されない。

この特定の態様においては、ＥＰＩＣ３Ｖ流動細胞螢光測定器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ｔｌｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）を用いて、前方への光の散乱、直角の光の散乱、グリーン螢光（５１５〜５３５ｎｍ）及びレッド螢光（＞　５９０ｎｒｎ）から成る４種のパラメーターデータを集める。４８８ｎｍの波長で４００ミ！Ｊワツトの仕事率を放すＩｎｏｒａｘコヒーレントアルゴンレーザーが励起源として使用される。

前方への光の散乱のための開始トリガーを用いて、赤血球細胞及び残骸を排除する。前方への光の散乱の検出器の増幅器のための増加を、５で調節する。中立密度フィルターを、前方への光の散乱の検出器の前に配置する。

レーザービームと流体の流れとの交差点に対して垂直に調節された収集レンズは、一連のフィルター及びビームスプリッタ−に光を通す。次のフィルター及びビームスプリッタ−が使用される：直角の光の散乱の検出器に光を反射する４８８ダイクロイツク　（ロングパス）、５１５干渉ロングパス、レッド螢光検出器に光を反射する５６０ダイクロイツク（ショートバス）、レッド螢光のための５９０ロングパス及びグリーン螢光のための５２５バンドパス。直角の光の散乱を検出するために使用されるＰＭＴは、３３０の適用される高電圧で設定される。グリーン及びレッド螢光を検出するために使用されるＰＭＴは、両者とも６５０の適用される高電圧で設定される。

直角の光の散乱の検出器及びグリーン及びレッド螢光検出器からのシグナルは、積分器及び次に対数増幅器に適用される。

対数増幅器への適用の前、螢光団の放射スペクトルのオーバーラツプを調整する補正ネットワークを用いて、それぞれの細胞のためにレッドシグナルからグリーンシグナルを３０％及びグリーンシグナルからレッドシグナルを２０％減じる。

減少値は、単一の螢光プローブ、たとえば抗−Ｌｅｕ−３−ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥと共にインキュベートされる刺激された単核細胞のアリコートを用いて確立される。上に列挙されたフィルター及び設定は典型的なものであり、そして本発明の範囲を限定するつもりはないことが注目されるべきである。

しかしながら、サンプルを比較する場合、本発明の方法と同じ特定の態様が、それぞれのサンプルのために使用されるべきである。

第１〜１１図及びこの詳細な説明に例示的目的のために示されるデータは、器官移植患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態の評価の例を構成する。例は上記のようにして得られた。第１及び２図は、標準の刺激による培養の前に得られた細胞のアリコートからのものである。第３〜１１図は、１８時間ＰＨＡと共に培養した後、処理されたアリコートからのものである。これらのヒストグラムの分析は、ＭＤＡＤＳソフトウェア−パッケージ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ｔｌｉａｌｅａｈ。

ＦＬ）を用いて行なわれた。

第１図においては、前方への及び直角の光の散乱が、肝臓移植患者からの末梢血液のフィコール−ハイバーク分離により得られた実質的に単核の細胞のサンプルからのアリコートにおけるリンパ球、単球及び残留顆粒球を分離するために使用されるヒストグラムが存在する。これらの細胞は、標準の刺激により培養されていない。２種の光の散乱パラメーターを用いて、免疫システムの主な細胞成分を分離する。直角の光の散乱は細胞内構造体に比例するが、前方への光の散乱は細胞の大きさ又は直径に比例する。幾何学的形状を形成する実線により区画された “対象の領域”の光の散乱は、種々の白血球クラスを示す。顆粒球クラスはボックス２により実質的に同定される。単球クラスはボックス３により実質的に同定される。リンパ球クラスはボックス４により実質的に同定される。培養する前に得られた細胞のアリコートが、それぞれの対象の領域における細胞の数を統合することによって、単離された細胞のサンプル中に存在するリンパ球の特定のクラスにおける細胞の量を決定するために使用され得る。

標準の刺激による培養の前に得られた細胞のアリコートが、流動細胞螢光測定器の変動のために、前もって調節された対象の光の散乱領域を調整するために使用され得る。その前もって調節された対象の光の散乱領域を、正常な個人からの細胞のアリコートから採集された前方への及び直角の光の散乱データを用いて区分する。ヒストグラム上のほとんど明確でない細胞クラス間を区別する、培養の時間を長くすることによる細胞の形態の変化（たとえば細胞の死又はリンパ芽球の増殖）により、その前もって調節された対象の光の散乱領域が、培養の前に得られた細胞のアリコートを用いて調整される。次に、この調整された対象の領域を用いて、培養の後に得られたサンプルを含むすべてのサンプルのアリコートを分析する。全サンプルが低い細胞数のために培養されるべきである場合、その前もって調節された対象の光の散乱領域を用いて、細胞のアリコートを分析する。

第２図は、第１図と同じヒストグラムを示す。但し、リンパ球を示す対象の領域、すなわちボックス７（第１図におけるボックス４と同じ）のみが同定される。

幾何学的形状を生成するために使用される点のＸ及びｙ座標は、ヒストグラムの左側に列挙される。これらは、この特定の態様に使用されるリンパ球を実質的に同定する前もって調節された対象の光の散乱領域の座標である。このサンプルのための前もって調節された対象の光の散乱領域の調整は存在しなかった。ヒストグラムの上に示される１５．７８４個の合計細胞のうち、１０．１３２個の細胞又は６４．１９％の細胞が、実質的にリンパ球を同定する対象の領域内に存在する。

２種の光の散乱及び２種の螢光パラメーターを測定することによって、流動細胞螢光測定器は、精選した単核細胞サブクラスの細胞上での活性化抗原の発現を決定するために分析され得る個々の細胞に対する４種のパラメーターデータをもたらす。個々の細胞のためのこの４種のパラメーターデータが、データが得られるアリコートの細胞のすべてのために分類される場合、それは累積する４種のパラメーターデータと呼ばれる。単核細胞のアリコートのための累積する４種のパラメーターデータの分析は、対象物、たとえばリンパ球及び／又はリンパ芽球の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する。次に、特定のクラスの細胞を分析し、精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして細胞を検定するために必要な細胞上での抗原決定基の発現の最少密度、前記最少密度以上の抗原決定基を有する細胞の量、及び活性化される場合、細胞を検定するために必要な前もって調節された最少密度以上の活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定する。

類似する態様において、累積する４種のパラメーターデータの分析が、標準の刺激により培養する前に得られた細胞のアリコートのために行なわれ得る。標準の刺激により培養する前、有意な活性化抗原の発現がほとんど存在しないが、しかしながら、ある疾病を有し又は免疫増強薬物投与を受けた患者においては、活性化抗原の発現の適切な量が存在することが通常仮定される。これらの場合、特定のサブクラスにおける細胞活性化の程度の分析は、細胞活性化における変化の量が決定され得るように標準の刺激による培養の前及び後で行なわれるべきである。また、特定の単核細胞サブクラスにおける細胞の量を決定するための分析は、特定の抗原決定基を調整できる標準の刺激により培養する前に行なわれ得る。

第３〜９図は、ＰＨＰと共に１８時間培養され、そして次に抗−Ｌｅｕ　−３ａ −ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥと共にインキュベートされた細胞のアリコートからの細胞のための累積する４種のパラメーターデータの分析を例示する。好ましい態様においては、グリーン及びレッド螢光データが約１０．０００個の細胞のために分析され、ここで前記細胞の光の散乱データは対象の“リンパ球”領域から得られる。これは、このデータの分析の統計的有意性を高める。第３図は、データが収集される２２、１９９個の細胞のための分析されていない前方への及び直角の光の散乱パラメーターの２種のパラメーターヒストグラムを示す。

第４図は、第３図におけるのと同じヒストグラムを示し、ここでリンパ球を実質的に同定する対象の領域、すなわちボックス１９が区画されている。幾何学的形状をもたらすために使用される点のＸ及びｙ座標は、ヒストグラムの左に列挙される。これらの座標は、培養する前の細胞の類似するヒストグラム上に形状をもたらすために使用されるものと同じである（第２図を参照のこと）。特定のサンプルからの細胞のあらゆるアリコートに関して（刺激の前及び後での両者）、前方への及び直角の光の散乱ヒストグラム上に対象の領域をもたらすために使用される座標は、対象の領域がそれぞれのアリコートのための類似する形態の細胞を区分するような座標である。

あるサブクラスにおける包含のための特定の抗原決定基の最少（及び最大）密度を定義することによって、細胞は、細胞の表面上の抗原決定基を定義する螢光団結台のモノクローナル抗体に関連する螢光の量を測定することによりサブクラスに割り当てられ得る。その割り当てられた細胞は、陽性の抗原決定基として言及される。また、最少密度は、活性化抗原の存在を決定するためにその活性化抗原の発現のために定義され得る。この最少密度以上の密度範囲は、ある活性化抗原、たとえばＩＬ２Ｒのために測定され、そして特定のリンフォーモノカイン、たとえばＩＬ−２産生の直接的な決定として役に立つことができる。

ある特定の抗原決定基の密度は、活性化の間、個人の間で又は抗原調節により多少変化することができる。第１及び第２の螢光結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞の特定のアリコートのための特定の抗原決定基の最少密度を決定するために、細胞数封筒１の螢光口の螢光の量のプロットが行なわれる。この特定の態様においては、第１の螢光団はＦＩＴＣであり、そしてそれは抗原決定基を同定するモノクローナル抗体に結合される。第２の螢光団はＰＥであり、そして活性化抗原を同定するモノクローナル抗体に結合される。細胞がグリーン及びレッド螢光抗体の両者を結合する場合、最少量以下のレッド螢光を有する細胞のみを用いて、非特異的結合細胞の多くを排除することができるであろう。

細胞数対グリーン螢光の量のプロットから、曲線の正の傾きに対する接線の評価が行なわれ得る。その曲線は、抗原決定基の対数正規分布によりおおよそのガウス分布を示す。そのような接線によりもたらされるＸ切片は、最少の特異的抗原決定基密度と相互関係する最少の螢光強度を定義するであろう。

（類似する方法が、負の傾きから最大の抗原決定基密度を決定するために使用され得る。）この特定の態様において、最大密度は、測定され得る最高の密度として設定される。これらの密度の境界を用いて、グリーン及びレッド螢光の２種のパラメーターヒストグラムが、抗原決定基のために陽性である細胞の数を列挙するためにこれらの境界間に統合され得、そして特定のサブクラスに割り当てられ得る。他の方法が、同様の数の細胞がサブクラスに割り当てられるであろうようにこれらの最少及び最大密度を決定するために使用され得ることは注目されるべきである。

最少密度は、活性化抗原の存在を決定するために定義される。この最少密度は、流動細胞螢光測定器のある成分の異なった増強及び高電圧設定により及び特定の光源、配置、フィルター及び螢光検出エレクトロニクスにより変化するであろう。従って、この活性化抗原の発現の最少密度は、標準設定を決定した後、定義されるべきであり、そしてこれらの設定を用いて特定の流動細胞螢光測定器により測定できる最少密度を示すであろうことが見うけられる。

正常な個人からのサンプルの反復分析が（ある期間、標準の刺激による培養の前及び後の両者で）、測定できる活性化抗原の最少密度を決定するために行なわれるべきである。この分析は、抗原決定基及び活性化抗原の両者、抗原決定基及び対照（たとえばヒト以外）抗原の両者、又は抗原決定基のみのいづれかに対する螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞のアリコートからの２種のパラメーター螢光データを用いる。２種のパラメーターヒストグラムから、活性化抗原の発現を示す最少螢光強度が決定され、ここでより特異的（Ｖｓ、非特異的）結合が存在し、そして抗原決定基を示す螢光団の発光スペクトルからのオーバーラツプは有意でない（たとえば約２％以下）。

従って、それぞれのアリコートがまず、試験されるサブクラスにおける包含のための特異的抗原決定基の最少（及び最大）密度を決定するために分析され、そしてそのサブクラスが２種のパラメーター螢光データから列挙される。次に、これらの密度及び前もって調節された最少活性化抗原密度を用いて２種のパラメーター螢光データをさらに分析することによって、サブクラスに属し、そして活性化抗原を発現する細胞の数の列挙が行なわれる。類似する方法においては、列挙は、サブクラスに属し、そして前もって調節された特定の密度範囲内で活性化抗原を発現する細胞の数から成る。第１の螢光団及び第２の螢光団結合の対照モノクローナル抗体の両者と共にインキュベートされたアリコートからの累積する４種のパラメーターデータが、非特異的結合により誤った陽性のおおよその数を決定するためにこれらの同じ密度を用いて分析される。非特異的結合の量が有意である場合、抗原決定基及び活性化抗原に対するモノクローナル抗体と共にインキュベートされたアリコートから選られた結果は訂正され得る。

既知の密度の２種の特異的抗原決定基を有する細胞は、発光される累積螢光がそれらのそれぞれの密度の合計に等しいように、同じ第１螢光団に結合される２種の異なったモノクローナル抗体により同定され得ることが注目されるべきである。この技法は、Ｌｅｕ　−３ａ及びＬｅｕ　−８抗原決定基の両者を有する細胞のサブクラスの追加の差異を可能にする。上記のように、第２の螢光団結合のモノクローナル抗体は、密度の範囲にわたって発現されるある活性化抗原を同定する。他方、３種の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体を用いて、２種の特異的抗原決定基及び活性化抗原を同定することができる。

この特定の態様においては、グリーン及びレッド螢光データが、リンパ球を実質的に同定する対象の領域により決定されるような前方への及び直角の光の散乱基準を満たす細胞に対してのみ分析される。第５図は、第４図においてリンパ球であると同定された白血球の分析されていないグリーン及びレッド螢光データのパラメーターの２種のパラメーターヒストグラムを示す。そのグリーン及びレッド螢光強度は、それぞれモノクローナル抗体、抗−Ｌｅｕ　−３ａ−ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＨにより細胞に結合される励起された螢光団の数に関係する。

この特定の態様においては、細胞数対グリーン螢光の量のプロットが、０及びルッド螢光チャネルにおいて、それらの細胞のみを用いて構成される。その曲線の正の傾きに対する接線の評価が行なわれる。この接線によりもたらされるＸ−切片は、最少の特異的抗原決定基密度を定義する。第６図は、リンパ球のグリーン螢光データのパラメーターの１つのパラメーターヒストグラムを示し、このためには、測定されるレッド螢光の量がＬＲＦ軸上のＯ又は１チヤネルに定められている。おおよそベル形状の曲線が得られる。その曲線の正の傾きに対する接線の近似値を用いて、直線２１を得る。

この曲線は、この近似値を容易にするためにコンピューター化された補正技法を用いて処理され得ることが注目されるべきである。直線のＸ切片、すなわちチャネル２０は、第７図における２種のパラメーターヒストグラム上にカーソル線を引くためにチャネル数として使用される。これは、細胞が精選した単核サブクラスのメンバーとして認められるべきである抗原決定基の発現の最少密度として考慮される。

カーソル線は、Ｘ切片を用いてグリーン及びレッド螢光デ−タビストグラム上に定められる。第７図は、第６図において決定されたようなＬＧＦチャネル２０で定められたカーソル線２２を有する、第５図におけるのと同じ２種のパラメーターヒストグラムを示す。第７図において示されるように、抗原決定基Ｌｅｕ　− ３ａにより同定されるサブクラス、すなわちＬｅｕ−３ａ陽性細胞（この後Ｌｅｕ　−３ａ″″として言及する）に割り当てられ得るリンパ球の％を決定するために使用される対象の領域は、ＬＧＦチャネル２０及び６３の間に存在する。

Ｌｅｕ　−３ａ＋である、第７図において同定されるようなリンパ球の％は、２１．８１である。

この特定の態様においては、レッド螢光カーソル線はグリーン及びレッド螢光データヒストグラム上のチャネル１０で定められ、そして合計細胞、すなわち活性化され、そして抗原決定基により同定されるサブクラスに割り当てられるリンパ球の数が決定される。１０でのＬＲＦチャネルは、上記のような反復分析の後、細胞が活性化されたと見なされるように発現すべきであるＩＬ−２受容体の最少量を示すために選択された。第８図は、ＬＲＦチャネル１０で定められた第２カーソル線２５を有する、第７図におけるのと同じ２種のパラメーターヒストグラムを示す。第８図に示されるように、Ｌｅｕ−３ａ＋であり、そして最少量以上のＩＬ−２受容体（この後ＩＬ２Ｒ＋として言及する）を発現するリンパ球の％を決定するために使用される対象の領域は、ＬＧＦチャネル２０及び６３、並びにＬＲＦチャネル１０及び６３の間に存在する。

Ｌｅｕ−３ａ＋及びＩＬ２Ｒ”　（又はＬｅｕ−３ａ＋　ＩＬ２Ｒ＋）であるリンパ球の％は、２０．６７である。

この特定の態様においては、レッド螢光カーソル線は、精選したサブクラスのメンバーである細胞上でのＩＬ−２受容体の発現の種々の密度範囲を区別するためにグリーン及びレッド螢光データヒストグラム上のチャネル２５で定められる。

精選したサブクラスのメンバーであり、そして高密度のＩＬ−２受容体の発現を有するリンパ球の量が決定される。チャネル数２５は、そのような細胞上に存在する平均密度範囲について試験するために、４８時間培養された正常な個人からのサンプルの反復分析を用いて決定された。２５のＬＲＦチャネルは、細胞がその細胞表面上で高密度のＩＬ２Ｒを有するようにみなされるように発現すべきである最低密度のＩＬ−２受容体を示すために選択された。第９図は、ＬＲＦチャネル２５で設定された第３カーソル線を有する、第７図におけるのと同じ２種のパラメーターヒストグラムを示す。第９図に示されるように、Ｌｅｕ−３ａ＋であり、そし高密度のＴＬ−２受容体を発現するリンパ球の％を決定するために使用されφ対象の領域は、ＬＧＦチ〒ネル２５及び６３、並びにＬＲＦチ丁ネル２５及び６３の間に存在する。Ｌｅｕ−３ａ＋であり、そし高密度のＩＬ−２受容体を発現するリンパ球の％は、８．１６である。

第３〜９図に示されるような累積する４種のパラメーターデータの類似する分析が、末梢単核細胞のサンプルからのそれぞれのアリコートのために行なわれ得る。

この特定の態様においては、高密度のＬｅｕ　−２ａ抗原決定基を有する細胞が、サプレッサー細胞毒性Ｔ−細胞サブクラスのものであるとみなされる。第１０図は、同じサンプルからであり、そして抗−Ｌｅｕ　−２ａ−ＦＩＴＣ及び抗− ＩＬ２Ｒ−ＰＥと共にインキュベートされた細胞のアリコートに関して、第８図におけるヒストグラムに類似する２種のパラメーター螢光データを示す。グリーン螢光カーソル３０がチャネル３７で設定され、そしてレッド螢光カーソル３１がグリーン及びレッド螢光データヒストグラム上のチャネル１０で設定される。

Ｌｅｕ−２ａ“及びＩＬ２Ｒ＋であるリンパ球の％を決定するために使用される対象の領域は、ＬＧＦチャネル３７及び６３並びにチャネル１０及び６３０間に存在する。Ｌｅｕ−２ａ＋及びＩＬ２Ｒ＋であるリンパ球の％は、７．９６である。

培養にかける時間と共にしばしば上昇する、モノクローナル抗体の非特異的結合の発生は、異なった白血球クラスで変化する。顆粒球及び単球は、リンパ球よりもそれらの細胞表面上に比較的高い密度の非特異的結合部位を有する。この非特異的結合は、抗原決定基及び活性化抗原の部位の近くの非特異的結合部位の平均密度として、活性化された細胞の正確な細胞螢光測定を困難にする。しかしながら、正確な測定は、白血球クラスを区画するために前方への及び直角の光の散乱パラメーターを用いて、そして低密度の非特異的結合部位を有するリンパ球のための螢光データを分析する場合、高い密度のそのような部位により前記クラスを排除することにより行なわれ得る。非特異的結合部位に対して高い親和性を有する未結合モノクローナル抗体、たとえば顆粒球及び天然のキラー細胞Ｆｃ受容体に対する抗−Ｌｅｕ　−１１又は単球Ｆｃ受容体に対するモノクローナル抗体が、他のモノクローナル抗体により前記部位の低親和性非特異的結合を阻止するために使用され得ることは注目されるべきである。

上記分析への類似する態様においては、ヒト免疫システムに見出されない抗原に対して向けられた螢光団結台の対照モノクローナル抗体は、これらの細胞が対象の領域に存在するように有意に高い量の非特異的結合部位密度により細胞の数を決定するために使用され得る。第１１図は、第４図に類似するリンパ球であると同定される白血球の分析されていないグリーン及びレッド螢光データパラメーターの２種のパラメーターヒストグラムを示す。グリーン及びレッド螢光強度は、対照のモノクローナル抗体により細胞に結合される励起された螢光口、すなわちそれぞれマウス−１８Ｇ　、　−ＦＩＴＣ及びマウス−ＩｇＧ、−ＰＥの数に関係する（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、　ＣＡ）。第７〜１０図において使用されたのと同じ対象の領域をこのヒストグラムに適用し、非特異的結合によって存在するそれぞれの対象の領域における誤った陽性のおおよその数を測定する。これは、第７〜１０図においてそれぞれ対象の領域のために決定された％の訂正を可能とする。

それぞれのアリコートのための累積する４種のパラメーターデータの分析から、それぞれの単核細胞サブクラスの細胞活性化の程度を決定することができる。これは、末梢単核細胞のサンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するために使用され得、そして臨床的に決定される場合、患者のイン　ビボ免疫調節状態と相互関係され得る。この好ましい態様の例示においては、それぞれのサブクラスのための細胞活性化の程度が、活性化される精選したサブクラスの％及び種々のサブクラスについての活性化の％の割合を用いて決定される。これは、肝臓移植の患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態を臨床的に評価するために利用される。

この例においては、活性化される、すなわち前もって調節された最少密度以上のＩＬ−２受容体を発現する精選した単核細胞サブクラスの細胞の％は、“活性化されたＬｅｕ−３ａ＋”、等と呼ばれる。

末梢血液サンプルを、移植を受けた後、実質的に４カ月以上過ぎた肝臓移植患者から得た。１０人の正常な個人からの血液を対照として用いた。それぞれのサンプルからの単核白血球を単離し、培養し、モノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして４種のパラメーターデータを上記のようにして集め、そして分析した。第１〜１１図に例示される患者のサンプルについての結果が第１表に見られる。

第１表から、ＰＨＡにより１８時間培養した後、ＩＬ−２受容体の発現により測定される場合、患者のヘルパー／インデューサーリンパ球の７３％が活性化されたことが見うけられる。同様に、患者の細胞毒性／サプレッサーＴ　ＩＪンパ球の２６％が活性化された。２種のサブセットの％活性化の割合は、２．８であった。

本アッセイの結果は、サンプルと同じ日に得られた肝臓生検の拒絶反応の病理学的決定と相互関係した。“拒絶反応なし”の診断のための形態学的基準は、リンパ球から主に成る正常な又は軽い非特異的な門脈の炎症を含んだ。“拒絶反応” の診断のための形態学的基準は、胆管上皮の一部の壊死、崩壊及び劣化性変化、及び中心静脈の静脈炎をもたすらリンパ球及び血漿細胞による二連構造の炎症性浸潤を包含した。

によりこれらのサンプルに与えられた。肝臓移植を受けた患者からのサンプルのアリコートからの４種のパラメーターデータの分析の結果は、第■表に要約される。サンプルは、対応する生検が″拒絶反応なし”の診断を有し、そしてサンプルが、移植手術の７日以内又は“疑わしい”又は“拒絶反応”の生検診断の１０日以内に得られない場合、表土の“拒絶反応なし”のカテゴリーに含まれた。“ 拒絶反応”カテゴリーのサンプルは、免疫抑制薬物（グルココルチコイド及びシクロスポリン）の永続的な投与を受け、そして“拒絶反応”の対応する生検診断を有する患者から得られた。

第■表正常（ｎ＝１０）　７５±６Ｉ　１１±４４〜１４拒絶反応　８０±９３７±１３　１．５〜３．０（ｎ＝　６　）本　平均上標準偏差肝臓の拒絶反応は、高い％の活性化されたＬｅｕ−２ａ＋　！Ｊンバ球と相互関係し、すなわち変えられた免疫調節状態がＬｅｕ−２ａ十細胞活性化の程度から評価され得ることが第■表における要約された結果から見うけられ得る。従って、本明細書に記載される方法を用いて、臨床医は、移植された器官の拒絶反応の診断を容易にするために単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価することができる。

例２この例は、免疫抑制治療を受けた患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態の分析を示す。末梢血液サンプルを、１０人の正常な個人及び６人の肝臓移植を受けた患者から得た。その移植患者を２つのグループに分ける。第１グループは、移植後４〜８週間、拒絶反応のエピソードを有しなかった４人の患者から成る。第２グループは、両者とも“拒絶反応”の対応する生検診断を有する２種の一連のサンプルによる２人の患者から成る。

それぞれのサンプルからの末梢血液単核白血球を密度勾配遠心分離により単離し、ＰＨＡと共に１８時間培養し、モノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして４種のパラメーターデータを“詳細な説明”に記載されるようにして集め、そして分析した。特にことわらないかぎり、すべてのサンプルは、免疫抑制薬物投与を受ける約１時間前に患者から得られた。生検を得、そして病理学的決定を上記のように行なった。

それぞれ正常な人から１つのサンプルを得、そして移植患者の第１グループのそれぞれから、移植後４〜８週間にわたって異なった日に４〜８個のサンプルを得た。入院の間、患者は、免疫抑制治療のためにシクロスポリン及びコルチコステロイドにより処理された。シクロスポリンの血液レベルを、ＨＰＬＣ法を用いてモニターした。Ｇ、　Ｌ、　Ｌｅｎｓｍｅｙｅｒ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｌ、　Ｆｉｅｌｄｓ。

”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｌｉｑｕｉｄ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏ−ｓｐｏｒｉｎ、　ｗｉｔｈ　Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃｅ１ｌ−Ｂｏｕｎｄ　Ｍｅｔａ−ｂｏｌｉｔｅ、”　（：ｌ１ｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒＬ　（３１）　１９６〜２０１　（１９８５）。それらの入院の間、シクロスポリン投与量、シクロスポリンレベル及び／又はコルチコステロイド投与量におけるある変化が存在した。

適切な臨床データ及び結果が第■表に要約される。次のことを注意すべきである：すべでのシクロスポリン投与量が、経口投与のために１／３の転換因子を用いて、同等の静脈内投与量に転換され（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、　１９８６）、そしてすべてのグルココルチコイド投与量は、プレドニゾン同尋物に転換された（３６５ページ、）、Ｉａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕ−変化の分析を促進するために患者によりグループ分けする。

また、すべてのサンプルを、肝臓移植を受けた後、約１週で引き続いて列挙し始める。サンプルを、３〜７日ごとに得た。

試験されるそれらの患者のためには、移植の前に得られたサンプルの分析について値が正常な値に近かった。

正常（ｎ＝１０＞　０　０　０　７５±６０　４０±９０　（ｎ＝ｏ）　１２０　２２８±４２２５７　１４２０　（ｎ＝３）　２８±４　１７±ＩＨ（ｎ＝８）　８０　１２２±３１　３８　１５　１３２５　（ｎ＝５）　３５±８　３１ ±６２０　（ｎ＝２）　７４±５３１±６１　（ｎ＝４）　１８０（ｎ＝２）　１７６±４０２０６２±４１６±１１１７０（ｎ＝２）””　４０８±１０６　１３±４　１４±７Ｊ（ｎ＝８）　２００　２５４　５０　４５　３１第　■　表（続き）Ｊ（ｎ＝８＞　７５　４３　１３　７３　６６本　活性化されたＬｅｕ−３ａ＋＝最少密度以上にＩＬ−２受容体を発現するＬｅｕ　−３ａ＋の％。

草本　平均±標準偏差。

草本本　この患者は、血液レベルを高める意外に高い経口吸収性を有した。

シクロスポリン投与量＝　ｍｇ、１２時間ごと、レベルはｎｇ／ｍｊ！この研究から、本発明の方法は、免疫抑制治療により免疫調節状態の変化を検出することが見うけられ得る。第■表における要約された結果から、免疫抑制治療における変化は、高い密度のＩＬ−２受容体を発現する活性化されたＬｅｕ　−３ａ＋’ Ｊンパ球及び活性化されたＬｅｕ　−３ａ十の％の変化と負の相互関係を有し、たとえば免疫抑制治療の増強は活性化されたＬｅｕ−３ａ＋の減少をもたらすことが見うけられ得る。患者Ｇ及びＨにおいては、シクロスポリン投与量及びそのレヘ）しは、およそ一定であるが、しかしグルココルチコイド（プレドニゾン）投与量は低められた。活性化されたＬｅｕ−３ａ＋Ｕンハ球の％は、これらの患者において、グルココルチコイドの投与量の減少に伴って、高くなることが見うけられる。患者Ｉにおいては、患者が静脈内投与から経口投与に変えられる場合、意外に高い経口吸収性が存在することが見うけられる。患者のシクロスポリンレベルは高まるが、しかしグルココルチコイド投与量は一定にとどまった。活性化されたＬｅｕ−３ａ＋リンパ球の％は、この患者において、シクロスポリンの血液レベルが高まるにつれて、低下したことが見うけられる。患者Ｊにおいては、８種のサンプルが列挙され、そしてそれらはシクロスポリン投与量、シクロスポリンレベル及びグルココルチコイド投与量の減少を連続的に示す。活性化されたＬｅｕ　−３ａ＋リンパ球の％は、この患者において、免疫抑制治療のレベルの低下に伴って、高まることが見うけられる。

シクロスポリンレベル及びグルココルチコイドの投与量が０に近づくにつれて、高い密度のＩＬ−２受容体を発現する活性化されたＬｅｕ−３ａ＋　’）ンパ球の％が上昇することは、免疫抑制薬物投与によるＩＬ−２産生の抑制の開放にたぶん関係することもまた見うけられ得る。それによって、高レベルのＩＬ−２産生は、ＩＬ−２受容体を調節しないであろう。

移植患者の第２グループからのサンプルからの結果は、拒絶反応のエピソードの間でさえ、免疫抑制治療の急性効果を示す。適切な臨床データ及び結果は、第■ 表に要約される。

第■表Ａ　６８　２００　１５　７３　３９Ａ”　６８　Ｎ、Ｄ、　１５　６６　１０Ｂ　１５０　２１７　２５　９１　６９Ｂ””　１５０　３２５　１．２５０　８２　３８＊第■表の記載を参照のこと。

草本このサンプルは、患者が免疫抑制薬物投与を受けた後、約２時間後、採取された。

草本本このサンプルは、患者がひじように多量のコルチコステロイドを受けた後、約１８時間後、採取された。

Ｎ、Ｄ、＝行なわれなかった。

シクロスポリン投与量＝ｍｇ、１２時間ごと、レベルはｎｇ／本発明の方法は、拒絶反応エピソードの間でさえ、免疫抑制治療の急性効果によって免疫調節状態の変化を検出する。

この免疫抑制治療の急性効果は、高い密度のＩＬ−２受容体を発現する活性化されたＬｅｕ−３ａ＋　’Ｊンバ球の％の減少と相互関係する。

第４２及び１２Ａ図は、第９図に類似するヒストグラムを示し、そして、第■表に列挙された患者Ｂからのサンプルからもたらされた。比べると、Ｌｅｕ−３ａ＋サブクラス上のＩＬ−２受容体の密度分布は、種々のデータに基づいて、同じ被検体からのこれらの２種のサンプルのために異なることが見うけられる。第１２Ａ図は、多量のグルココルチコイドの投与の後、１８時間後採取されたサンプルからもたらされた。第１２図を得るために使用される４種のパラメーターデータの分析は、２９．５５％の細胞がＬｅｕ　−３ａ十であり、２６．８７％の細胞がｌｅｕ　−３ａ＋及びＩＬＺＲ＋であり、そして１８．４９％の細胞がＬｅｕ　−３ａ＋であり、そして高い密度のＩＬ２Ｒを発現することを示した。１１２Ａ図を得るために使用される４種のパラメーターデータの類似する分析は、それぞれ２９．５９．２２．９３及び７．８０％の細胞をもたらした。

この例に示される結果は、本発明の方法が患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態に基づいて免疫抑制治療の効果をモニターするために使用され得ることを例示する。精選した単核細胞サブクラスを区別することによって、このアッセイは、特定のサブクラスのための免疫抑制又は免疫増強治療の標的を容易にすることができる。また、たとえば免疫抑制又は免疫増強治療に基づいて培養物中に患者からの血清を用いる本発明の他の方法も、免疫調節状態に基づく患者の薬物投与の効果の評価のくふうを促進することができ、そしてこれも本発明の範囲内に存在する。

例３この例は、Ｔ　ＩＪンパ球抗原決定基の発現、ＩＬ−２受容体の発現及びＴ’Ｊンバ球抗原決定基陽性の単核細胞上でのＴＬ−２受容体の発現の分析を示す。この分析は、３Ｈチミジン摂取により７２時間のＰＨＡ培養により測定される場合、その刺激指数と相互関係する。正常な供与体からの末梢血液単核細胞を、密度勾配遠心分離により単離し、ＰＨＡと共に培養し、精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基及びＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして４種のパラメーターデータを、“詳細な説明”に記載されるようにして得、そして分析した。使用されるモノクローナル抗体は、抗原決定基Ｌｅｕ−４，Ｌｅｕ−３ａ又はＬｅｕ−２ａのためのＦＩＴＣ−結合の抗体、及びＩＬ−２受容体のためのＰＥ−結合のモノクローナル抗体を包含した。４種のパラメーターデータを、“詳細な説明”に記載されるようにして形成されたく但し次の修飾を伴う：アルゴンレーザーを５００ｍ１’ｉで使用した）ＥＰＩＣ３−Ｖ流軸細胞螢光測定器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ、　Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）を用いて細胞に対して集めた。前方への及び直角の光の散乱パラメーターを分析し、細胞が実質的にリンパ球、リンパ芽球及び単球を含む対象の領域内に存在するかいづれかを決定した。グリーン及びレッド螢光データの分析をそのような細胞のために行なった。抗原決定基及び／又はＩＬ−２受容体陽性単核細胞、すなわちＬｅｕ　−４＋　。

Ｌｅｕ−３ａ十、Ｌｅｕ−２ａ＋、ＩＬ２Ｒ＋、Ｌｅｕ−４＋ＩＬＺＲ＋、Ｌｅｕ−３ａ＋　ＩＬ２Ｒ＋及びＬｅｕ　−２ａ　＋ｌ　Ｌ２Ｒ十の％を、本明細書に記載される方法に従って決定した。その結果は、非特異的結合のために訂正されなかった。

初めに、ＰＨＡにより刺激された単核細胞の単核細胞サブクラスの抗原決定基及び活性化抗原の分析を、１種のモノクローナル抗体のみと共にインキュベートされたアリコートを用いて行なった。その結果は第７表に要約される。

Ｌｅｕ４＋　６８±２．７９７９±２．４　７７±１．９　８１±２．２Ｌｅｕ３ａ＋　４７±２．９　５４±１．７　５４±１．３　５３±２．８Ｌｅｕ２ａ＋　１３±０．７　１８±１．０　１８±０．７　１９±２．０ＩＬ２Ｒ＋　６ ±１．２　６１±１．９　７１±１．９　８０±１．５零％陽性士標準誤差として示される。

４８時間までの種々の時間刺激された細胞の上記研究から、活性化の開始の後、早くとも１８時間で有意なインターロイキン−２受容体の発現が存在したことが見出された。約１８時間で、対象の領域における単核細胞の約６０％がＩＬ−２受容体を発現したことが観察された。

ＰＨＡにより刺激された単核細胞の分析を、抗原決定基及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥを検出するためにＦＩＴＣ−結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされたアリコートを用いて行なった。その結果は、第■表に要約される。

第■表活性化されたＬｅｕ−４＋”　ｌ±０．３　４９±６．１　６２±３．７　７２ ±５．５活性化されたＬｅｕ−３ａ＋３±１．７　４９±８．９　６２±８．５　７０±９．５活性化されたＬｅｕ−２ａ＋　２±０．８　２５±６．４　３２土４．５　５５±８．０本刺激後７２時間で、その刺激指数を、３Ｈチミジンの摂取を用いて決定した（ｃｐｍ刺激された細胞／　ｃｐｍ刺激されていない細胞）。その結果は３６７±８８であった。　（比較のために、１８時間での結果は２．７５±０．２５であった。）本末前もって調節された最少密度以上のＩＬ− ２受容体を発現する抗原決定基陽性細胞の％。

これらのデータは、ＰＨＡがこの例に示されるように、Ｌｅｕ−３ａ＋である単核細胞によりヘルパー／インデューサーＴ−細胞を活性化する前記研究を支持する。この例に使用される４種のパラメーターデータが、すべての単核細胞を実質的に同定する対象の光の散乱領域を用いて分析され、従って活性化されたＬｅｕ　−３ａ＋及び活性化されたＬｅｕ−２ａ＋（第■、■表）のための結果は、リンパ球を同定する対象の光の散乱領域を用いて決定される結果と同一でないことが注目されるべきである。抗原決定基陽性単核細胞上でのＩＬ−２受容体の発現の分析は、従来の３Ｈチミジン摂取よりもマイトジェンへの単核細胞応答の運動学に関するより一層の情報を与える。

１．４よりも高い活性化されたＬｅｕ−３ａ＋　：活性化されたＬｅｕ−２ａ十の比は、ＰＨＡ　（＞４００）に対する高い刺激指数（この後、ＳＩとして言及する）と相互関係した。１つの被検体からの細胞は８のＳＩ及び約１，０の比を有し、そしてこれは、比を計算するために１８時間で抗原決定基陽性単核細胞上でのＩＬ−２受容体の発現を測定することによって、７２時間で決定されたＳＩを用いて測定される場合、単核細胞の増殖能力を予測することができることを示唆した。この関係は、第■表に要約される。

被検体Ｄ・：活性化された　１　６８　７５　８４　５３５Ｌｅａ　−４＋” 活性化された　７　７４　７９　９２Ｌｅｕ−３ａ＋被検体Ｎ：＋　ＰＨＡとの培養の時間。

本　前もって調節された最少密度以上のＩＬ−２受容体を発現する抗原決定基陽性細胞の％。

木本　１８時間で、活性化されたＬｅｕ−３ａ＋　：活性化されたＬｅｕ−２ａ十細胞の比を、それぞれのサンプルのために決定した。

上記から、抗原決定基陽性単核細胞上でのＩＬ−２受容体の発現を試験することによって測定され得る、ＰＨＡにより刺激されたそのような細胞の種々の活性化が存在することが見出される。ＰＨＡ刺激の後、これらの単核細胞上でのＩＬ− ２受容体の発現の分析により、単核白血球免疫システムにおける細胞活性化の運動力学を理解することができる。

例４この例は、Ｔ　’Ｊンバ球サすクラス上でのＩＬ−２受容体の発現と比較してのリンパ球クラス上でのＩＬ−２受容体の発現の分析を示す。正常な供与体及び肝臓移植者からの末梢血液単核白血球のサンプルを、密度勾配遠心分離を用いて単離し、ＰＨＡと共に１８時間培養し、そして“詳細な説明”に記載されているようにしてモノクローナル抗体と共にインキュベートした。それぞれの個人からのサンプルのアリコートを、抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥ、抗−Ｌｅｕ　−４−ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥ。

抗−Ｌｅｕ−３ａ−ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＨ１又は抗−Ｌｅｕ　−２ａ　−ＦＩＴＣ及び抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ。

ＣＡ）のいづれかと共にインキュベートした。マウス−１ｇＧ　＋−ＰＥ、又はマウス−１ｇＧ＋　ＦＩＴＣ及びマウス−１ｇＧ　＋　−ＰＥ　（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）と共にインキュベートされたアリコートは、非特異的結合を決定するために対照として作用した。“詳細な説明”に記載されているようにして構成されたＥＰＩＣ３−Ｖ流動細胞螢光測定器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）を用いて、それぞれのアリコートからの細胞に基づいて４種のパラメーターデータを集めた。前方への及び直角の光の散乱パラメーターを分析し、細胞が実質的にリンパ球を同定する対象の光の散乱領域に存在するかいづれかを決定した。２種のモノクローナル抗体と共にインキュベートされたアリコートについてのグリーン及びレッド螢光データの分析を、“詳細な説明” に記載のようにして行なった。抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＨのみと共にインキュベートされたアリコートについての螢光データの分析を、同様にして行なった。但し、ＩＬ２Ｒ発現の最少量を、マウス−１ｇＧ、−ＰＥのみと共にインキュベートされたアリコートにより得られる螢光からの単純な１つのパラメーター（レッド螢光）減法を用いて決定した。

レッド螢光データは、′活性化された”リンパ球の数に関係する。第１３図に関しては、これは、ＩＬ−２受容体が、単核細胞のサンプルがＰＨＡと共に１８時間培養された後、第２図におけるのと同様にして同定されたリンパ球上に測定されるヒストグラムである。そのレッド螢光度は、モノクローナル抗体により細胞に結合される励起された螢元口、たとえば抗−ＩＬ２Ｒ−ＰＣの数に関係する。

この図は、正常な被検体からのアリコートから得られた。

この研究の結果は、第１表に要約される。

第１表正常　４９　６１　６５　９本１つのパラメーター減法により決定される場合、最少密度以上のＩＬ−２受容体を発現するリンパ球の％。

木本前もって調節された最少密度以上のＩＬ−２受容体を発現する抗原決定基陽性リンパ球の％。

ＩＬ−２受容体を発現するリンパ球の％は、ＩＬ−２受容体を発現する精選したＴ　ＩＪンバ球サブクラスの％に必ずしも相当しない。単にリンパ球として同定される細胞上でのＩＬ−２受容体の発現を測定することによって測定され得ない、ＰＨＡと共に培養されたＴリンパ球サブクラスの特異的な活性化が存在する。

しかしながら、それは、そのようなサブクラス上でのＩＬ−２受容体の発現を試験することによって決この例は、ＰＨＡと共に１８時間培養した後、特定の単核細胞サブクラス上での活性化抗原の発現の分析を示す。この分析は、既知の臨床アッセイに相互関係するが、しかしながら、ＰＨＡとの７２時間の培養の後の３Ｈチミジン摂取は、単核白血球免疫システムの免疫調節状態に関するより完全な情報を付与する。

正常な個人及び肝臓移植患者からの末梢血液のサンプルを、密度勾配遠心分離を用いて単離し、ＰＨＡと共に１８時間培養し、モノクローナル抗体と共にインキュベートし、４種のパラメーターデータを得、そして“詳細な説明”に記載されるようにして分析した。

次の結果が得られた：正　常　行なわれな　１１０，０１３　７１　３０　８かった患者Ａ　拒絶しなイ２９．７０６　６０　３７　１１患者Ａ　拒　絶　２１１．８６７　７３　３９　２６患者Ａ０　拒　絶　１７０．９５３　６６　１０　３９患者Ａ　拒　絶　４５．１７２　８７　５２　５９本前もって調節された最少密度以上のＩＬ−２受容体を発現する抗原決定基陽性リンパ球の％。

本末このサンプルは、患者が免疫抑制薬物投与を受けた後、約２時間抜採取された。

この研究から、本発明のアッセイは、２４時間以内に単核白血球免疫システムの免疫調節状態に関するより詳細な情報を得るために、刺激された単核細胞の４種のパラメーターデータ分析を用いる。ＰＨＡとの１８時間の培養の後、リンパ球サブクラスの活性化が、これらのサブクラス上でのＩＬ−２受容体活性化抗原の発現の程度を決定することによって測定される。３Ｈチミジン摂取は、ＰＨＡとの７２時間の培養の後、決定される。第■表の結果は、活性化されたＬｅｕ−２ａ＋と拒絶反応及び高密度のＩＬ−２受容体を発現する活性化されたＬｅｕ　− ３ａ＋の％と拒絶反応のエピソードの間の免疫抑制治療の急性効果との相互関係を示す。この情報は、３Ｈチミジン摂取アツセイよりも、変えられた免疫調節状態とより一層容易に相互関係することができる。

このアッセイの上記態様に関して論じられたデータ発生及び分析を、次の装置を用いて行なうことができる。第１４図は、それぞれの細胞についての４種のデータパラメーターを測定し、そしてこの４種のパラメーターデータを分析し、単核白血球免疫システムの免疫調節状態の決定を行なうために、本発明の原理に従って使用され得る装置の様式化された機能的及び構造的代表物である。この装置は、単核白血球のサブクラス上での活性化抗原の発現の正確且つ再現可能な測定を得るために設計されている。

第１４図に示されるように、装置は、２種の主要な相互関係する成分及びインターフェイスモジュールから成る。第１戊グ・　すなわち流動細胞螢光測定器（この後Ｆ　ＣＦ　１，１として言及する）の一般的設計は従来技術において既知であり、そしてここで手短に記載される。

本発明の方法に従って単離され、標準の刺激により培養され、そして特異的なモノクローナル抗体と共にインキュベートされているサンプルのアリコートを、分析のために機械吸入口９７に受ける。サンプル細胞は、流動システム１０５、たとえば流動チャンバー及びチャネル１０６を通して検出領域１０４に流れ、ここでそれぞれの細胞が焦点レンズシステム１０２を通してレーザー１００からのレーザー光により発光される。当業界で既知であるように、細胞サンプル流は、単一の細胞が一定の時間で検出領域において発光されるであろうことを確保するために、流動性流体シース内で積層形態で行なわれる。

液体懸濁液中の細胞は、検出領域を通して早い速度（たとえば２５００個の細胞７秒）で通される。光は、前方への光の散乱光センサー１１１（たとえば光ダイオード及び増幅器）及び直角の光の散乱収集レンズ１０７に散乱される。前記直角の光の散乱収集レンズは、細胞サンプル流の方向及びレーザー光の軸の両者に対して直角に設定される。前方への及び直角に散乱された光は、円錐形の半角が２０°であるように集められる。

ＦＬＳ光センサーにより発生される電子シグナル（この後、データシグナルとして言及する）は、マイクロコンピュータ−システム１４０からの調節シグナルにより調整され得るインターフェイス１３０内の調節器１３２（たとえば増幅器のための増幅調節）により調節される。

レンズ１０７により集められる光は分裂し、そしてビームスプリッタ−及びフィルター１０９のシリーズにより濾過される。

ビームスプリッタ−及びフィルターの組合せの例は“詳細な。

説明”に記載され、そして例として本明細書に反復されるが、しかし本発明の請求の範囲を限定するものではない。４８８ｎｍ以下の波長の光は４８８ｎｍの二色性スプリッターにより反射され、そしてインターフェイス１３０において調節器１３３（たとえば光増幅管のための適用される高電圧の調節器）により調節される光センサ−１１５（たとえば関連する予備増幅器を有する光増幅管）に入いる。この例においては、この光センサーは、直角の光の散乱を検出するために使用される。

４８８ｎｍの大きな波長の光は４８８ｎｍの二色性スプリッターを通過し、そして直角の軸にそって進む。その光は、５１５ｎｍの干渉用ロングパスフィルター及び５６０ｎｍの二色性スプリッターを通過する。５６０ｎｍ以上の波長の光は５９０ｎｍのロンズバスフィルターに反射され、そしてインターフェイス１３０における調節器１３４により調節される光センサ−１１８に入いる。

５６０ｎｍ以下の波長の光は、５６０ｎｍの二色性スプリッターにより５２５ｎｍバンドのバスフィルターに通過し、そしてインターフェイス１３０における調節器１３５により調節される光センサ−１２０に入いる。この例においては、光センサ−１１８は、レッド螢光を検出するために使用され、そして光センサ−１２０は、グリーン螢光を検出するために使用される。それぞれの光センサーは、電子のアウトプットシグナル、すなわちデータシグナルを供給する。光センサー調節器１３３．１３４．１３５は、マイクロコンピュータ−システム１４０からの調節シグナルにより修飾され得る。

光センサー調節器の他に、インターフェイスは、他のデータシグナルプロセッシング要素、たとえばパルス検出器又は積分器を含み、そしてこれらは、続くプロセッシングのために適切な特徴のデータシグナルを産生ずるために、当業者の能力に従って使用され得る。インターフェイス１３０はまた、マイクロコンピュータ−システム１４０に供給されるデータシ。

グナルを増幅するだめの増幅器１３６．１３７及び１３８も含む。好ましい態様においては、これらは対数増幅器である。インターフェイスは、レーザー１００及び流動チャンバー及びチャネル１０６を調節するために、調節シグナルライン１６０、たとえばＦＣＦＭへの調節シグナルラインを含む。すべての重要な調節及びデータシグナルプロセッシング要素を含むことによって、インターフェイスは、装置の維持及び調節を容易にする。

マイクロコンピュータ−システム１４０は、中心のプロセッシング単位、記憶、オペレーターインターフェイスのための端末機、データ乱積装置、データシグナルライン１５０上での入って来るデータシグナルのためのＡからＤへの転換機、調節シグナルライン１６０上での出て行く調節シグナルのためのＤからＡへの転換機及びデータシグナルを分析し、そしてＦＣＦＭ９３により行なわれた測定の正確性及び再現性を確保するだめのソフトウェア−から成る。そのシステムのソフトウェア−は、次の機能を行なうためのルーチンを含む：分析に関する限界範囲内でのそれぞれの細胞についての４種のパラメーターデータの蓄積、それぞれ細胞のクラスを決定するための光の散乱データパラメーターの分析、種々の螢光団の発光スペクトルのオーバーラツプのためのそれぞれの細胞の螢光データパラメーターの補正、特定のクラスのそれぞれの細胞のサブクラス及び活性化抗原密度を決定するだめの前記補正された螢光データパラメーターの分析、免疫調節状態の決定を行なうためのそれぞれのサブクラスのための活性化の程度の分析、報告アウトプット、ＦＣＦλ）調節器、オペレーターインターフェイス及び統合／操作システム。

調節器システムのルーチンは、他のソフトウェア−ルーチン及びシステムの全体の操作（たとえば蓄積装置からのデータの蓄積及び補正を含む）の正しい統合を確保する。それは実質的に、当業界で既知であるようなディスク操作システム（本発明の方法及び装置に関する修飾を有する）である。その調節器システムのルーチンは、分析されるべき患者のサンプルのアリコートに関するデータ（これは患者についての臨床データを含む）を受け入れるために装置のオペレーターに通じる。

蓄積ルーチンは、細胞の光の散乱パラメーターがオペレーターにより設定された限界範囲内に存在するかいづれかを決定するために入って来るデータシグナルを処理し、そしてその細胞のための４種のパラメーターデータを蓄積するであろう。

光の散乱分析ルーチンは、あるクラスを同定する前もって調節された対象の領域を用いて、蓄積されるそれぞれの細胞のためのクラスを決定するであろう。好ましい態様においては、前方への及び直角の光の散乱が、クラス決定を行なうために使用される。細胞がオペレーターが特定したクラスに存在することを決定される場合、追加の分析が補正ルーチン及び螢光分析ルーチンにより行なわれる。

光の散乱分析ルーチンにより示されるように特定のクラスにおけるこれらの細胞に関しては、補正ルーチンが、モノクローナル抗体に結合された螢光団の発光スペクトルのオーバーラツプのために細胞の螢光データパラメーターを訂正する。

好ましい態様においては、％が前もって設定され、そして“詳細な説明”に記載される反復方法により決定される。次に、補正された螢光パラメーターデータは、螢光分析ルーチンに通される。他の態様においては、補正ルーチンは、従来の技術で行なわれて来たように、ハードウェアーにより満たされ得る。

螢光分析機は、光の散乱分析ルーチンにより示されるように、特定のクラスのすべての細胞についての補正された螢光パラメーターデータを収集する。このルーチンは、サブクラスを同定し、サブクラス内の細胞及び活性化されたサブクラス内の細胞を列挙する。この収集されたデータは、累積するデータとして言及され、そしてヒストグラムにより表わされ得る。“詳細な説明”に記載されるような好ましい態様においては、細胞上に抗原決定基を示す螢光の量のヒストグラムが得られる。得られる曲線の正の傾きに対する接線のＸ切片を表わす、ヒストグラム上のチャネル数は、多くの特定のサブクラスとして定められる細胞のために必要な最少密度として使用される。類似する方法を用いて、得られる曲線の負の傾きから最大の抗原決定基密度を決定することができ、他方、最っとも高い測定できる密度で設定された省略値を使用することもできる。次に累積データは、抗原決定基のために陽性であり、そしてサブクラスに割り当てられ得る細胞を列挙するだめに、これらの密度境界を用いて分析される。“詳細な説明”に記載されるような反復方法により決定された細胞活性化を示すチャネル数を用いて、サブクラスに属する活性化された細胞を列挙する。また、範囲は、サブクラスに属し、そしてその範囲内で活性化抗原の発現を有する細胞が列挙され得るように特定され得る。螢光分析機はまた、活性化により抗原決定基調節の程度をモニターし、又は既知の密度の２種の特異的抗原決定基により細胞を列挙することができる。

本発明の範囲内での他の手段は、別々の異なった抗原決定基を同定するために使用されるべく第３波長の螢光に基づく情報を伝えるデータシグナルを有する追加の直角に配置された光センサーである。この手段は、当業において既知であるような、追加の光センサーに関連するいづれか他のシグナルプロセッシング要素のために、関連する焦点レンズシステム及び遅延回路を有する追加のレーザーを含むことができる。

免疫調節状態を評価するためにそれぞれのサブクラスのための活性化の程度の分析は、統計的な分析器ルーチンにより行なわれる。その統計的な分析器ルーチンは、クラス、サブクラスにおける細胞の量、サブクラスにおける活性化された細胞の量及び他の決定要因、たとえばある範囲内で活性化抗原を発現するサブクラスの細胞の量に関する螢光分析ルーチンからの情報を受ける。その統計的な分析器ルーチンは、活性化のレベル、たとえば活性化されるサブクラスの％、高密度で活性化抗原を発現するサブクラスにおける活性化された細胞の％、活性化されたサブクラスの割合、これらの決定因子の組合せ、等（例示のためには、上記例を参照のこと）を決定するためにこの情報を用いる。

報告アウトブッチトーチンは、統計的分析器ルーチンにより決定されるような免疫調節状態の評価についての報告をもたらす。その報告は、臨床医によりさらに評価するために分析される報告に類似する、正常な個人又は患者についての平均結果を含むことができる。

ＦＣＦＭ９８により行なわれた測定及び従ってその装置によりもたらされる結果の正確性及び再現性を確保するために、球体の表面に結合された螢光口の予定された量を有する均一に形状化された対照球体がその装置により分析され得る。これらの球体についての４種のパラメーターデータの値が前もって決定されている。従って、光の散乱及び螢光分析ルーチンが、対照球体のサンプルのアリコートに対するデータを収集することができる。それぞれのパラメーターについての平均値は、この累積する４種のパラメーターデータから決定され、そしてＦＣＦＭ調節ルーチンに送られ得る。ＦＣＦＭ調節ルーチンは、これらの値と前もって決定された値とを比較する。ＦＣＦＭ９８及び光センサー調節器の調整は、正確且つ再現可能な測定が行なわれるように対照シグナルをもたらすことによって行なわれ得る。これは、しばしば、前もって決定された値からの有意な偏差が存在しないまで、対照球体を再使用する反復方法を包含する。これは、患者のサンプルを処理するために使用されるべき前もって調節された対象の領域の確立を促進する。

既知の濃度で細胞のアリコート中に対照球体を含むことによって、細胞に対するデータが収集されている間、これらの球体の分析が流動システムクロッグ検出を助けることができる。

ＦＣＦＭ調節ルーチンはまた、システム調節器ルーチンの指示によってＦ　ＣＦ　Ｆ、１９８の操作を調節する。

本発明の装置の適用は、上記例を包含するが、しかしこれだけには限定されない。この装置は、アッセイの結果の正確性、再現性及び適切な時期を確保し、そしてこれらは臨床的診断及び治療決定過程を助けるために必要である。また、流動システムにおけるクロッグを検出する能力は、臨床サンプルの最少の損失の確保を助ける。

第１４図の略図は単に、本発明の原理の機能的な観点の代表であり、そして当業者の能力に従って、多くの他の態様で具体化され得ることは理解されるべきである。

間隔（こおけるリンパ％＝　６４．１９全体＝　１０１３２ＦＩＧ、　２ＡＦＩＧ、　４２２１ｇｇ＋００００しＧＦＦＩＧ、１３５１２７９４８補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成１年２月１０日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０１９４　ｇ２、発明の名称単核白血球免疫システムの免疫調節状態の自動的評価のための方法及び装置３、特許出願人住所　アメリカ合衆国、イリノイ６０６１４゜シカゴ、エヌ、ディトン２２４５氏名　アンダーソン、ジェフリー、イー。

４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、？ｉｉｉ正書の提出年月日１９８８年８月２９日６、添付書類の目録補正書の翻訳文　１通補正された請求の範囲１、標準刺激により培養された単核細胞のサンプルからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づくデータを生成し、そして分析することによって免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ、細胞サブクラスにより影響される場合、測定できる細胞活性化の進展を可能にするために十分な時間、標準の刺激により前記単核細胞のサンプルを培養し；Ｃ８精選した単核細胞サブクラス及び細胞活性化を示す前記サンプルの個々の細胞に基づくデータを生成し；ｄ、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞の量及び前記精選した単核細胞のサブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するために前記データを分析し；ｅ、免疫システムの免疫調節状態を評価するために前記細胞の量及び前記活性化された細胞の量の分析から、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。

２、　ヘルパー／インすューサーエリ２３球サブクラスのメンバーが存在する場合、単核細胞サブクラスを表わす個々の細胞上の前記データが個々の細胞を同定する請求の範囲第１項記載の方法。

３、サプレッサー／細胞毒性１９７８球サブクラスのメンバーが存在する場合、単核細胞サブクラスを表わす個々の細抱土の前記データが個々の細胞を同定する請求の範囲第１項記載の方法。

４、細胞活性を示す個々の細胞上の前記データが活性化抗】を表わす個々の細胞を同定する請求の範囲第１項記載の方法。

５、前記データの分析が、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を限定するために必要な、あらかじめ調節された最少量以上の活性化を有する請求の範囲第１項記載の方法。

６、前記データの分析が、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、一定のあらかじめ調節された範囲内で多量の活性化を有する請求の範囲第１項記載の方法。

７、前記免疫システムが単核のリンパ球免疫システムである請求の範囲第１項記載の方法。

８、標準刺激により培養された単核細胞サンプルからの精選した単核細胞のサブクラスにおける活性化された細胞に基づく流動細胞螢光測定データを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ、単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；Ｃ０精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基及び精選した細胞表面活性化抗原を同定するために螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に前記サンプルをインキュベートし；ｄ、精選した単核細胞サブクラス及び細胞活性化を示す前記サンプルの個々の細胞に基づく流動細胞螢光測定データを生成し；ｅ、精選した単核細胞サブクラスにおける細胞の量及び精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するために前記流動細胞螢光測定データを分析し；ｆ、単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するために前記細胞の量及び前記活性化された細胞の量の分析から、精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。

９、前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第８項記載の方法。

１０、前記サンプルを標準刺激により培養し、ここで前記培養を約２４時間以内で終結せしめる請求の範囲第８項記載の方法。

１１、前記サンプルを、約１８時間、ＰＨＡと共に培養する請求の範囲第８項記載の方法。

１２、前記螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体が、Ｌｅｎ −３ａの抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第８項記載の方法。

１３、前記螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体が、Ｌｅｎ −２ａ抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第８項記載の方法。

１４、前記螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体が、Ｌｅｎ −４抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第８項記載の方法。

１５、前記螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体が、インターロイキン−２受容体活性化抗原に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第８項記載の方法。

１６、前記流動細胞螢光測定データが光の散乱及び螢光測定値を含む請求の範囲第８項記載の方法。

１７、前記流動細胞螢光測定データの分析は、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定することであり、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を限定するために必要な前もって調節された最少量以上の活性化を有する請求の範囲第８項記載の方法。

１８、前記流動細胞螢光測定データの分析は、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定することであり、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が一定の前もって調節された範囲内で多量の活性化を有する請求の範囲第８項記載の方法。

１９、前記流動細胞螢光測定データが、螢光団結合のモノクローナル抗体の非特異的結合のために調整される請求の範囲第８項記載の方法。

２０、刺激された単核細胞の１又は複数のアリコートからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ、単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；Ｃ０精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、刺激された単核細胞の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｄ、流動細胞螢光測定技法を用いて、前記刺激された単核細胞の１又は複数のアリコートから個々の単核細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し：ｅ、前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な前記個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、前記刺激された単核細胞のそれぞれ１又は複数の前記アリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｆ、前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する前記刺激された単核細胞の蛍を決定するために前記刺激された単核細胞のそれぞれ１又は複数の前記アリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、それによって前記精選した単核細胞サブクラスを数的に限定し；ｇ、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するために前記刺激された単核細胞のそれぞれ１又は複数の前記アリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を限定するために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し：ｈ、前記サンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれ前記１又は複数のアリコートのための前記刺激された単核細胞の量及び前記活性化された細胞の量の分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。

２１６前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第２０項記載の方法。

２２、サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第２０項記載の方法。

２３、サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第２０項記載の方法。

２４、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第２０項記載の方法。

２５、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第２０項記載の方法。

２６、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体が１ｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第２０項記載の方法。

２７、前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第２０項記載の方法。

２８、前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第２０項記載の方法。

２９、前記第４螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第２０項記載の方法。

３０、前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第２０項記載の方法。

３１、前記単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第２０項記載の方法。

３２、刺激された単核細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウス−１ｇＧ＋対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウス−１ｇＧ　＋対照モノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２０項記載の方法。

３３、第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２０項記載の方法。

３４、第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２０項記載の方法。

３５、第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２０項記載の方法。

３６、標準刺激により培養された単核細胞の１又は複数のアリコートからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ、単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；Ｃ０精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、前記サンプルからの細胞の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｄ、流動細胞螢光測定技法を用いて、それぞれの細胞のアリコートからの個々の細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し；ｅ、前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、それぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｆ、前記最少密度以上の抗原決定基を発現を有する単核細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積パラメーターデータを分析し：ｇ、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのために４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化されろ場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を限定するために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｈ、前記サンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれの細胞のアリコートのための前記単核細胞の量及び前記活性化された細胞の量の分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。

３７、前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第３６項記載の方法。

３８、サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第３６項記載の方法。

３９、サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第３６項記載の方法。

４０、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第３６項記載の方法。

４１、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第３６項記載の方法。

４２、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第３６項記載の方法。

４３、前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第３６項記載の方法。

４４、前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエＩＪ　ｌ−ＩＪンである請求の範囲第３６項記載の方法。

４５、前記第１螢光団がフィコエＩＪ　）　”Ｊンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第３６項記載の方法。

４６、前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第３６項記載の方法。

４７、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前もって調整された対象の光の散乱領域を用いて精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第３６項記載の方法。

４８、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前記サンプルを培養する前に得られた細胞のアリコートのために流動細胞螢光測定技法を用いて、生成された累積する、前への及び直角の光の散乱データの分析に基づいて調整された対象の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第３６項記載の方法。

４９、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第３６項記載の方法。

５０、細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結台のマウス−１ｇＧ＋対照モ対照モノクローナル共前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結台のマウス−１ｇＧ＋対照モ対照モノクローナル共にインキュベートする請求の範囲第３６項記載の方法。

５１、第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結台のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結台のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３６項記載の方法。

５２、第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結台のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結台のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３６項記載の方法。

５３、第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結台のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結台のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３６項記載の方法。

５４、標準刺激により培養された単核細胞の１又は複数のアリコートから精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ、前記サンプルを別々の細胞部分に分け；Ｃ８精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結台のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結台のモノクローナル抗体と共に、第１の細胞部分の１又は複数のアリコートをインキュベートシ：ｄ、単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、第２の細胞部分を標準刺激により培養し：ｅ、精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結台のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結台のモノクローナル抗体と共に、前記第２の細胞部分の１又は複数のアリコートをインキュベートし：ｆ、流動細胞螢光測定技法を用いて、それぞれの細胞のアリコートから個々の細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し；ｇ、前記単核精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の細胞をみなすために必要な個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、それぞれ細胞のアリコート、のための４種のパラメーターデータを分析し：ｈ、前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する単核細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、；ｉ、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を限定するために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｊ、前記サンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれの細胞のアリコートのための前記単核細胞の量及び前記活性化された細胞の量の分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。

５５、前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第５４項記載の方法。

５６、サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第５４項記載の方法。

５７、サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第５４項記載の方法。

５８、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第５４項記載の方法。

５９、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第５４項記載の方法。

６０、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第５４項記載の方法。

６１、前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第５４項記載の方法。

６２、前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第５４項記載の方法。

６３、前記第１螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第５４項記載の方法。

６４、前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第５４項記載の方法。

６５、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前もって調整された対象の光の散乱領域を用いて精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第５４項記載の方法。

６６、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前記サンプルを培養する前に得られた細胞のアリコートのために流動細胞螢光測定技法を用いて、生成された累積する、前への及び直角の光の散乱データの分析に基づいて調整された対象の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第５４項記載の方法。

６７、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第５４項記載の方法。

６８、細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウス−１ｇＧ＋対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウス−１ｇＧ　＋対照モノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５４項記載の方法。

６９、第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５４項記載の方法。

７０、第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５４項記載の方法。

７１、第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５４項記載の方法。

７２、患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態に対する効果を評価し、そしてモニターするための臨床方法であって：標準の刺激により培養された末梢単核細胞のサンプルからの精選した単核細胞サブクラス上の活性化抗原の発現を流動細胞螢光測定技法を用いて測定することを含んで成る方法。

７３、標準の刺激により培養された単核細胞の１又は複数のアリコートからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態に対する効果を評価し、そしてモニターするための臨庫方法であって：ａ、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ、単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；Ｃ０精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結台のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結台のモノクローナル抗体と共に、前記サンプルからの細胞の１又は複数のアリコートをインキュベートし：ｄ、流動細胞螢光測定技法を用いて、それぞれの細胞のアリコートからの個々の細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し：ｅ、前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な前記個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、それぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｆ、前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する単核細胞の量を決定するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｇ、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を限定するために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｈ、前記患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれの細胞のアリコートのだめの前記単核細胞の量及び前記活性化された細胞の量の分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。

７４、前記患者が免疫媒介障害を有する請求の範囲第７３項記載の方法。

７５、前記患者が免疫媒介障害、すなわちＡＩＤＳを有する請求の範囲第７３項記載の方法。

７６、前記患者が免疫媒介障害、すなわち全身性紅斑性狼癒を有する請求の範囲第７３項記載の方法。

７７、前記患者が免疫媒介障害、すなわち多発性硬化症を有する請求の範囲第７３項記載の方法。

７８、前記患者が器官の移植を受けている請求の範囲第７３項記載の方法。

７９、前記患者が悪性を有する請求の範囲第７３項記載の方法。

８０、前記患者が自己免疫疾患を有する請求の範囲第７３項記載の方法。

８１、前記患者が免疫抑制薬物適用を受けている請求の範囲第７３項記載の方法。

８２、前記患者がシクロスポリンを受けている請求の範囲第７３項記載の方法。

８３、前記患者がグルココルチコイドを受けている請求の範囲第７３項記載の方法。

８４、前記患者が免疫強化薬物適用を受けている請求の範囲第７３項記載の方法。

８５、前記患者が、前記末梢単核細胞を単離する前、約２４時間以内に免疫調節薬物を投与される請求の範囲第７３項記載の方法。

８６、前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第７３項記載の方法。

８７、サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第７３項記載の方法。

８８、サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第７３項記載の方法。

８９、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第７３項記載の方法。

９０、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第７３項記載の方法。

９１、前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第７３項記載の方法。

９２、前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結台のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第７３項記載の方法。

９３、前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第７３項記載の方法。

９４、前記第１螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第７３項記載の方法。

９５、前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第７３項記載の方法。

９６、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前もって調整された対象の光の散乱領域を用いて精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第７３項記載の方法。

９７、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前記サンプルを培養する前に得られた細胞のアリコートのために流動細胞螢光測定技法を用いて、生成された累積する、前への及び直角の光の散乱データの分析に基づいて調整された対象の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第７３項記載の方法。

９８、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第７３項記載の方法。

９９、細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウス−ＩｇＧ　＋対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウス−１ｇＧ＋対照モ対照モノクローナル共にインキュベートする請求の範囲第７３項記載の方法。

１００、第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７３項記載の方法。

１０１、第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７３項記載の方法。

１０２、第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７３項記載の方法。

１０３、標準の刺激により培養され、そして精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされた、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための装置であって：ａ、前記サンプルの細胞を急速且つ実質的に一度に検出領域に通過せしめるための流動手段；ｂ、前記検出領域を通過する前記第１及び第２螢光団の螢光活性を刺激するための手段；Ｃ０細胞形態を表わす少なくとも１つの予定された方向における前記検出領域からの光の散乱を検出するための感光性手段；ｄ、前記精選した細胞サブクラスを表わす、前記検出領域における前記第４螢光団からの螢光を検知するための感光性手段；ｅ、前記活性化抗原を表わす、前記検出領域における前記第２螢光団からの螢光を検知するための感光性手段：及びｆ、前記精選した細胞サブクラスにおける細胞の量及び精選した最少密度以上の活性化抗原を発現する細胞の量を決定するために前記感光性手段に連結される手段を含んで成る装置。

１０４、標準の刺激により培養され、そして精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされた、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための装置であって：ａ、前記サンプルの細胞を急速且つ実質的に一度に一定の領域に通過せしめるための細胞螢光測定流動手段；ｂ、前記一定の領域における前記第１及び第２螢光団の螢光活性を刺激するためのレーザ一手段；ｃ、ｉｌの予定された方向における前記一定の領域からの光の散乱を検出するための第」の感光性手段；ｄ、第２の予定された方向における前記一定の領域からの光の散乱を検出するための第２の感光性手段；ｅ、前記一定の領域における前記第１の螢光団からの螢光を検知するための第３の感光性手段；ｆ、前記一定の領域における前記第２の螢光団からの螢光を検知するための第４の感光性手段；ｇ、前記光の散乱パラメーターに基づいて細胞クラスを決定するために前記第１及び第２の感光性手段に連結される手段；及びり、前記精選した細胞サブクラスにおける細胞の量及び前もって調節された最少密度以上の活性化抗原を発現する細胞の量を決定するために前記第３及び第４の感光性手段に連結される手段を含んで成る装置。

１０５、前記分析されるべきサンプルが予定された光の散乱及び螢光測定値を有する対照球体を含み、そして前記装置が予定された測定値からの前記対照球体の実際の光の散乱及び螢光測定値のずれの大きさを最少にするために感光性手段を定期的に調整するための手段を含む請求の範囲第１０４項記載の装置。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．標準刺激により培養された単核細胞のサンプルからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づくデータを生成し、そして分析することによって免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ．末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ．精選した単核細胞サブクラス及び細胞活性化を示す前記サンプルの個々の細胞に基づくデータを生成し；ｃ．精選した単核細胞サブクラスにおける細胞の量及び精選した単核細胞のサブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するために前記データを分析し；ｄ．免疫システムの免疫調節状態を評価するために前記データの分析から、精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。
２．サブクラスの細胞の相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを、標準刺激により培養する請求の範囲第１項記載の方法。
３．ヘルパー／インデューサーＴリンパ球サブクラスのメンバーが存在する場合、単核細胞サブクラスを表わす個々の細胞上の前記データが個々の細胞を同定する請求の範囲第１項記載の方法。
４．サプレッサー／細胞毒性Ｔリンパ球サブクラスのメンバーが存在する場合、単核細胞サブクラスを表わす個々の細胞上の前記データが個々の細胞を同定する請求の範囲第１項記載の方法。
５．細胞活性を示す個々の細胞上の前記データが活性化抗原を表わす個々の細胞を同定する請求の範囲第１項記載の方法。
６．前記データの分析が、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を適切にするために必要な、あらかじめ調節された最少量以上の活性化を有する請求の範囲第１項記載の方法。
７．前記データの分析が、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、一定のあらかじめ調節された範囲内で多量の活性化を有する請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記免疫システムが単核のリンパ球免度システムである請求の範囲第１項記載の方法。
９．標準刺激により培養された単核細胞サンプルからの精選した単核細胞のサブクラスにおける活性化された細胞に基づく流動細胞螢光測定データを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ．末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ．単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；ｃ．精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基及び精選した細胞表面活性化抗原を同定するために螢光測定的に区別できる螢光団接合のモノクローナル抗体と共に前記サンプルをインキュベートし；ｄ．精選した単核細胞サブクラス及び細胞活性化を示す前記サンプルの個々の細胞に基づく流動細胞螢光測定データを生成し；ｅ．精選した単核細胞サブクラスにおける細胞の量及び精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するために前記流動細胞螢光測定データを分析し；ｆ．単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するために前記流動細胞螢光測定データの分析から、精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。
１０．前記標準刺激がＰＨＡによってである請求の範囲第９項記載の方法。
１１．前記サンプルを標準刺激により培養し、ここで前記培養を約２４時間以内で終結せしめる請求の範囲第９項記載の方法。
１２．前記サンプルを、約１８時間、ＰＨＡと共に培養する請求の範囲第９項記載の方法。
１３．前記螢光測定的に区別できる螢光団接合のモノクローナル抗体が、Ｌｅｕ −３ａ抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第９項記載の方法。
１４．前記螢光測定的に区別できる螢光団接合のモノクローナル抗体が、Ｌｅｕ −２ａ抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第９項記載の方法。
１５．前記螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体が、Ｌｅｕ −４抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第９項記載の方法。
１６．前記螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体が、インターロイキン−２受容体活性化抗原に結合するモノクローナル抗体を含む請求の範囲第９項記載の方法。
１７．前記流動細胞螢光測定データが光の散乱及び螢光測定値を含む請求の範囲第９項記載の方法。
１８．前記流動細胞螢光測定データの分析は、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定することであり、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を適切にするために必要な前もって調節された最少量以上の活性化を有する請求の範囲第９項記載の方法。
１９．前記流動細胞螢光測定データの分析は、前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定することであり、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が一定の前もって調節された範囲内で多量の活性化を有する請求の範囲第９項記載の方法。
２０．前記流動細胞螢光測定データが、螢光団結合のモノクローナル抗体の非特異的結合のために調整される請求の範囲第９項記載の方法。
２１．刺激された単核細胞の１又は複数のアリコートからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ．末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ．単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性化の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；ｃ．精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、刺激された単核細胞の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｄ．流動細胞螢光測定技法を用いて、前記刺激された単核細胞の１又は複数のアリコートから個々の単核細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し；ｅ．前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な前記個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、前記刺激された単核細胞のそれぞれ１又は複数の前記アリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｆ．前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する前記刺激された単核細胞の量を決定するために前記刺激された単核細胞のそれぞれ１又は複数の前記アリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、それによって前記精選した単核細胞サブクラスを数的に限定し；ｇ．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するために前記刺激された単核細胞のそれぞれ１又は複数の前記アリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を適切にするために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｈ．前記サンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれ前記１又は複数のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。
２２．前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第２１項記載の方法。
２３．サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第２１項記載の方法。
２４．サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第２１項記載の方法。
２５．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第２１項記載の方法。
２６．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第２１項記載の方法。
２７．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第２１項記載の方法。
２８．前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第２１項記載の方法。
２９．前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第２１項記載の方法。
３０．前記第１螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第２１項記載の方法。
３１．前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第２１項記載の方法。
３２．前記単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第２１項記載の方法。
３３．刺激された単核細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２１項記載の方法。
３４．第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２１項記載の方法。
３５．第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコ−トを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２１項記載の方法。
３６．第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第２１項記載の方法。
３７．標準刺激により培養された単核細胞の１又は複数のアリコートから精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ．末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ．単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；ｃ．精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、前記サンプルからの細胞の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｄ．流動細胞螢光測定技法を用いて、それぞれの細胞のアリコートからの個々の細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し；ｅ．前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、それぞれ細胞のアリコ−トのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｆ．前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する単核細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｇ．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を適切にするために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｈ、前記サンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。
３８．前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第３７項記載の方法。
３９．サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第３７項記載の方法。
４０．サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第３７項記載の方法。
４１．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第３７項記載の方法。
４２．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第３７項記載の方法。
４３．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第３７項記載の方法。
４４．前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第３７項記載の方法。
４５．前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第３７項記載の方法。
４６．前記第１螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第３７項記載の方法。
４７．前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第３７項記載の方法。
４８．それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前もって調整された対象の光の散乱領域を用いて精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第３７項記載の方法。
４９．それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前記サンプルを培養する前に得られた細胞のアリコートのために流動細胞螢光測定技法を用いて、生成された累積する、前への及び直角の光の散乱データの分析に基づいて調整された対象の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第３７項記載の方法。
５０．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第３７項記載の方法。
５１．細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３７項記載の方法。
５２．第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３７項記載の方法。
５３．第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３７項記載の方法。
５４．第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第３７項記載の方法。
５５．標準刺激により培養された単核細胞の１又は複数のアリコートから精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための方法であって：ａ．末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ．前記サンプルを別々の細胞部分に分け；ｃ．精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、第１の細胞部分の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｄ．単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、第２の細胞部分を標準刺激により培養し；ｅ．精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、前記第２の細胞部分の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｆ．流動細胞螢光測定技法を用いて、それぞれの細胞のアリコートからの個々の細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し；ｇ．前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、それぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｈ．前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する単核細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｉ．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するためにそれぞれ細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を適切にするために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｊ．前記サンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。
５６．前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第５５項記載の方法。
５７．サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第５５項記載の方法。
５８．サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第５５項記載の方法。
５９．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第５５項記載の方法。
６０．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第５５項記載の方法。
６１．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第５５項記載の方法。
６２．前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第５５項記載の方法。
６３．前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第５５項記載の方法。
６４．前記第１螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第５５項記載の方法。
６５．前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２螢光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第５５項記載の方法。
６６．それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータ分析は、前もって調整された対象の光の散乱領域を用いて精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第５５項記載の方法。
６７．それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前記サンプルを培養する前に得られた細胞のアリコートのために流動細胞螢光測定技法を用いて、生成された累積する、前への及び直角の光の散乱データの分析に基づいて調整された対象の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第５５項記載の方法。
６８．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第５５項記載の方法。
６９．細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５５項記載の方法。
７０．第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５５項記載の方法。
７１．第アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５５項記載の方法。
７２．第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第５５項記載の方法。
７３．患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態に対する効果を評価し、そしてモニターするための臨床方法であって：標準の刺激により培養された末梢単核細胞のサンプルからの精選した単核細胞サブクラス上の活性化抗原の発現を流動細胞螢光測定技法を用いて測定することを含んで成る方法。
７４．標準の刺激により培養された単核細胞の１又は複数のアリコートからの精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞に基づく４種の累積するパラメーターデータを生成し、そして分析することによって患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態に対する効果を評価し、そしてモニターするための臨床方法であって：ａ．末梢単核細胞から実質的に成るサンプルを単離し；ｂ．単核細胞サブクラスの相互作用により影響される場合、測定できる細胞活性の進展を可能にするために十分な時間、前記サンプルを標準刺激により培養し；ｃ．精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のモノクローナル抗体と共に、前記サンプルからの細胞の１又は複数のアリコートをインキュベートし；ｄ．流動細胞螢光測定技法を用いて、それぞれの細胞のアリコートからの個々の細胞に基づく４種のパラメーターデータを生成し；ｅ．前記精選した単核細胞サブクラスのメンバーとして前記個々の単核細胞をみなすために必要な前記個々の単核細胞上に最少密度の抗原決定基の発現を決定するために、それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｆ．前記最少密度以上の抗原決定基の発現を有する単核細胞の量を決定するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し；ｇ．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を決定するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータを分析し、ここで前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞が、活性化される場合、前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞を適切にするために必要な前もって調整された最少密度以上の活性化抗原の発現を有し；ｈ．前記患者の単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するためにそれぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析から前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞活性化の程度を決定することを含んで成る方法。
７５．前記愚者が免疫媒介障害を有する請求の範囲第７４項記載の方法。
７６．前記患者が免疫媒介障害、すなわちＡＩＤＳを有する請求の範囲第７４項記載の方法。
７７．前記患者が免疫媒介障害、すなわち全身性紅斑性狼瘡を有する請求の範囲第７４項記載の方法。
７８．前記患者が免疫媒介障害、すなわち多発性硬化症を有する請求の範囲第７４項記載の方法。
７９．前記患者が器官の移植を受けている請求の範囲第７４項記載の方法。
８０．前記患者が悪性を有する請求の範囲第７４項記載の方法。
８１．前記患者が自己免疫疾患を有する請求の範囲第７４項記載の方法。
８２．前記患者が免疫抑制薬物適用を受けている請求の範囲第７４項記載の方法。
８３．前記患者がシクロスポリンを受けている請求の範囲第７４項記載の方法。
８４．前記患者がグルココルチコイドを受けている請求の範囲第７４項記載の方法。
８５．前記患者が免疫強化薬物適用を受けている請求の範囲第７４項記載の方法。
８６．前記患者が、前記末梢単核細胞を単離する前、約２４時間以内に免疫調節薬物を投与される請求の範囲第７４項記載の方法。
８７．前記標準刺激がＰＨＡである請求の範囲第７４項記載の方法。
８８．サンプルを標準刺激により培養し、ここで該培養が約２４時間以内で終結される請求の範囲第７４項記載の方法。
８９．サンプルをＰＨＡと共に約１８時間、培養する請求の範囲第７４項記載の方法。
９０．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−３ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第７４項記載の方法。
９１．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−２ａ抗原決定基に結合する請求の範囲第７４項記載の方法。
９２．前記精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がＬｅｕ−４抗原決定基に結合する請求の範囲第７４項記載の方法。
９３．前記精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な螢光団結合のモノクローナル抗体がインターロイキン−２受容体活性化抗原に結合する請求の範囲第７４項記載の方法。
９４．前記第１螢光団がフルオレセインイソチオシアネートであり、そして前記第２螢光団がフィコエリトリンである請求の範囲第７４項記載の方法。
９５．前記第１螢光団がフィコエリトリンであり、そして前記第２螢光団がフルオレセインイソチオシアネートである請求の範囲第７４項記載の方法。
９６．前記４種のパラメーターデータを、前への光の散乱、直角の光の散乱、第１螢光団の螢光及び第２蛋光団の螢光の測定から生成する請求の範囲第７４項記載の方法。
９７．それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前もって調整された対象の光の散乱領域を用いて精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第７４項記載の方法。
９８．それぞれの細胞のアリコートのための４種の累積するパラメーターデータの分析は、前記サンプルを培養する前に得られた細胞のアリコートのために流動細胞螢光測定技法を用いて、生成された累積する、前への及び直角の光の散乱データの分析に基づいて調整された対象の光の散乱領域を用いて、精選した単核細胞クラスの細胞を同定する請求の範囲第７４項記載の方法。
９９．前記精選した単核細胞サブクラスにおける活性化された細胞の量を、一定の前もって調整された特定の密度範囲内に活性化抗原の発現を有する前記精選した単核細胞サブクラスにおける細胞として定義する請求の範囲第７４項記載の方法。
１００．細胞のアリコートを、前記単核細胞の非特異的結合を定量化するために、前記第１の螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体及び前記第２の螢光測定的に区別できる螢光団結合のマウスーＩｇＧ１対照モノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７４項記載の方法。
１０１．第１アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７４項記載の方法。
１０２．第１アリコートを、Ｌｅｕ−２ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７４項記載の方法。
１０３．第１アリコートを、Ｌｅｕ−４抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第１の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして第２アリコートを、Ｌｅｕ−３ａ抗原に結合する、精選した単核細胞サブクラスに対して特異的な前記第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートする請求の範囲第７４項記載の方法。
１０４．標準の刺激により培養され、そして精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされた、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための装置であって：ａ．前記サンプルの細胞を急速且つ実質的に一度に検出ゾーンに通過せしめるための流動手段；ｂ．前記検出ゾーンを通過する前記第１及び第２螢光団の螢光活性を刺激するための手段；ｃ．細胞形態を表わす少なくとも１つの予定された方向における前記検出ゾーンからの光の散乱を検出するための感光性手段；ｄ．前記精選した細胞サブクラスを表わす、前記検出ゾーンにおける前記第１螢光団からの螢光を検知するための感光性手段；ｅ．前記活性化抗原を表わす、前記検出ゾーンにおける前記第２の螢光団からの螢光を検知するための感光性手段；及びｆ．前記精選した細胞サブクラスにおける細胞の量及び精選した最少密度以上の活性化抗原を発現する細胞の量を決定するために前記感光性手段に連結される手段を含んで成る装置。
１０５．標準の刺激により培養され、そして精選した単核細胞サブクラスの抗原決定基に対して特異的な第１の螢光団結合のモノクローナル抗体及び精選した細胞表面活性化抗原に対して特異的な第２の螢光団結合のモノクローナル抗体と共にインキュベートされた、末梢単核細胞から実質的に成るサンプルの単核白血球免疫システムの免疫調節状態を評価するための装置であって：ａ．前記サンプルの細胞を急速且つ実質的に一度に一定の領域に通過せしめるための細胞螢光測定流動手段；ｂ．前記一定の領域における前記第１及び第２螢光団の螢光活性を刺激するためのレーザー手段；ｃ．第１の予定された方向における前記一定の領域からの光の散乱を検出するための第１の感光性手段；ｄ．第２の予定された方向における前記一定の領域からの光の散乱を検出するための第２の感光性手段；ｅ．前記一定の領域における前記第１の螢光団からの螢光を検知するための第３の感光性手段；ｆ．前記一定の領域における前記第２の螢光団からの螢光を検知するための第４の感光性手段；ｇ．前記光の散乱パラメーターに基づいて細胞クラスを決定するために前記第１及び第２の感光性手段に連結される手段；及びｈ．前記精選した細胞サブクラスにおける細胞の量及び前もって調整された最少密度以上の活性化抗原を発現する細胞の量を決定するために前記第３及び第４の感光性手段に連結される手段を含んで成る装置。
１０６．前記分析されるべきサンプルが予定された光の散乱及び螢光測定値を有する対照球体を含み、そして前記装置が予定された測定値からの前記対照球体の実際の光の散乱及び螢光測定値のずれの大きさを最少にするために感光性手段を定期的に調整するための手段を含む請求の範囲第１０５項記載の装置。