JPH0248236B2 - Jurishibosannoteiryoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアシルコエンザイムＡシンセターゼ
（以下アシルコエンザイムＡをCoAと略記する）
及びアシルCoAヒドロラーゼを用いる遊離脂肪
酸の定量法に関する。

従来より血清中の遊離脂肪酸の定量法として
は、脂溶性有機溶媒で抽出した遊離脂肪酸をアル
カリで中和滴定する方法、硝酸銅とトリエタノー
ルアミンを作用させて遊離脂肪酸を銅塩となし、
クロロホルムで抽出し、これをジエチルジチオカ
ルバミン酸塩などのキレート剤を作用させて呈色
させる化学的な方法などが試みられていた。又、
最近は酵素法が開発され、それにはアシルCoA
シンセターゼで生成したアデノシンモノホスフエ
ート（以下AMPと略記する）をミオキナーゼお
よびピルビン酸キナーゼの２つのリン酸基転換酵
素を共役させて脂肪酸量に比例してピルビン酸を
生成させる一連の酵素系を用いる方法や、アシル
CoAシンセターゼで生成したアシルCoAをアシ
ルCoAオキシターゼにより過酸化水素を生成さ
せ、色原体を酸化縮合させ比色する方法などが試
みられている。

しかしながら抽出等を行う化学法では有機溶媒
使用による操作の煩雑性、有機酸存在による影
響、滴定による技術的誤差、銅塩の形成、人体へ
の影響など問題点も多く、臨床診断法としては規
準化が極めて困難であつた。酵素法は有機溶媒を
使用する必要がなく操作上容易になつたが、血清
中に存在する遊離脂肪酸量は僅少であるため、サ
ンプル量を多くするか、又は測定系の検出感度を
アツプしなければならない。サンプル量を多くす
るとサンプル中の妨害物質（血清などにはアスコ
ルビン酸、グルタチオンなどの還元物質が存在又
は添加される）の影響を受けやすくなる。又測定
系の検出感度は一般に使用される分光光度法では
分子吸光係数ε＝30〜40cm^-2・μmole^-1程度が限
界で、しかも感度をあげると色原体が不安定にな
らざるを得ない。

そこで本発明者らはこのような欠点のない血清
中の遊離脂肪酸の定量法を見出すべく、種々研究
を重ねた結果、アシルCoAヒドロラーゼを使用
することを見出し本発明に到達した。

すなわち本発明は遊離脂肪酸にアデノシントリ
ホスフエート（以下ATPと略記する）および
CoAの存在下で、アシルCoAシンセターゼ及び
アシルCoAヒドロラーゼを作用させ、アシルコ
エンザイムＡヒドロラーゼの作用により生成する
遊離脂肪酸およびコエンザイムＡをアシルコエン
ザイムＡシンセターゼの基質として反応させるサ
イクリング反応を行ない、次いで生成するAMP
またはピロリン酸の一定時間当りの生成量を測定
することを特徴とする脂肪酸の定量する方法であ
る。

本発明では遊離脂肪酸にATP、CoA及び必要
によりマグネシウムの存在下でアシルCoAシン
セターゼを作用させることにより、アシルCoA、
AMP及びピロリン酸が生成する。生成したアシ
ルCoAは共存しているアシルCoAヒドロラーゼ
により再び元の脂肪酸に戻される。戻された脂肪
酸は再度アシルCoAシンセターゼによりアシル
CoAとなる。この様に遊離脂肪酸とアシルCoA
はATPが存在する限り相互変換することになる。
このサイクリングの際、ATPの分解が平行して
行なわれ、AMP及びピロリン酸が生成する。生
成するAMP及びピロリン酸は遊離脂肪酸量に比
例した生成速度となることを本発明者らは見出し
た。

生成したAMPの測定法としては一般に知られ
ている方法、例えばATPの存在下、ミオキナー
ゼを作用させ、生成したADPをさらにホスホエ
ノールピルビン酸共存下ピルビン酸キナーゼを作
用させ、さらに還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（以下NADHと略記する）の共存
下、乳酸脱水素酵素を作用させることにより、
NADHの340nm付近の吸光度の変化で測定する
方法（H.U.Bergmeyer，Methods of
Enzymatic Analysis.vol4.p2088−2096（1974））
又、AMPデアミナーゼを用いてアンモニアを生
成させ、生成したアンモニアをインドフエノール
法やα−ケトグルタル酸、NADH又はNADPH
の共存下、グルタミン酸脱水素酵素（E.
C.1.4.1.2，E.C.1.4.1.3，E.C.1.4.1.4.）を作用させ、
NADH又はNADPHの340nm付近の吸光度の変
化で測定する方法（特開昭55−96100号公報）な
どがある。

生成したピロリン酸の測定法としては、ピロホ
スフアターゼ（無機）を作用させて、無機リン酸
をモリブデンブルー法にて測定する方法（H.U.
Bergmeyer，Methods of Enzymatic Analysis.
vo14.p2239−2245（1974））又、同じくピロホスフ
アターゼを作用させピルビン酸共存下、ピルビン
酸オキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素
を測定する方法などがある。

AMP及びピロリン酸の測定法は上述したもの
に限定されるものではなく螢光法、発光法、電極
法など物理化学的な測定法ならば適応可応であ
る。

本発明に使用するアシルCoAシンセターゼは
酵素番号E.C.6.2.1.3、E.C.6.2.1.2及びE.C.6.2.1.1の
ことであり、長鎖脂肪酸（炭素数６〜20）にはE.
C.6.2.1.3の酵素がよい。アシルCoAシンセターゼ
は動物、微生物界に広く分布し、特にラツト肝
臓、大腸菌、緑膿菌などに存在することが見出さ
れている。酵素反応は次式に示す通りである。

ATP＋長鎖脂肪酸＋CoAMg⁺⁺ ―――→ AMP ＋ピロリン酸−CoA 至適PHは7.5〜9.0附近にあり、Km（ミハエリス
定数）値は１×10^-4M以下である。

本発明に使用するアシルCoAヒドロラーゼは
酵素番号E.C.3.1.2.2のことであり、動物、酵母、
細菌などに存在するが、特に大腸菌、緑膿菌に多
く存在することが見出されている。酵素反応は次
式に示す通りである。

アシル−CoA＋H₂O→長鎖脂肪酸＋CoA 至適PHは中性ないし微アルカリ性で、Km値は
10^-5M程度である。

遊離脂肪酸を含む試料は生物化学的な物質なら
何れでもよく、特に血清、尿などが利用される。

本発明の反応はまず試料中の遊離脂肪酸に
ATP、CoAおよび必要によりマグネシウムの存
在下、アシルCoAシンセターゼを作用させるこ
とによりアシルCoA、AMP、ピロリン酸を生成
させる（第一反応）。反応温度は10〜45℃程度で
25〜40℃が好ましい。反応PHは6.0〜10.0程度が
好ましい。ATPはその塩でも良く、濃度は0.1〜
1000mM程度で、特に1mM〜50mM程度が好ま
しい。CoAはその塩でも良く、濃度は0.001〜
100mM程度で経済上0.05〜5mM程度が好まし
い。マグネシウムはイオンの状態であれば良く、
濃度は0.01〜100mM程度で、好ましくは１〜
50mM程度である。アシルCoAシンセターゼは反
応時間にもよるが0.01〜10単位／ml程度、好まし
くは0.1〜１単位／mlが良い。

生成したアシルCoAはアシルCoAヒドロラー
ゼにより加水分解を受け、再び元の遊離脂肪酸に
なる（第二反応）。アシルCoAヒドロラーゼは
0.005〜10単位／ml程度で、好ましくは0.05〜1.0
単位／mlが良い。第二反応は第一反応と共役させ
る必要があるので、反応温度、反応PHは第一反応
と同様な条件である。

第一反応及び第二反応の共役系（サイクリン
グ）により生成したAMP又はピロリン酸の一定
時間当たりの生成量を測定する。AMPを測定す
る方法ではAMPデアミナーゼを使用する方法を
述べる。生成したAMPはAMPデアミナーゼによ
りイノシンモノホスフエート（以下IMPと略記
する）とアンモニアに分解される（第三反応）。
AMPデアミナーゼはE.C.3.5.4.6のことで動物組
織や酵母中に存在している。この酵素はAMPに
特異的でアデノシン、アデニン等に使用しない。
反応温度は10〜45℃程度で25〜40℃が好ましい。
反応PHは5.0〜10.0程度で、好ましくはPH6.5〜8.0
附近が良い。AMPデアミナーゼは0.01〜10単
位／ml程度が良く、好ましくは0.1〜１単位／ml
が良い。

次に生成したアンモニアを還元型NADH又は
還元型NADPH、α−ケトグルタル酸の共存下、
グルタメートデヒドロゲナーゼを作用させ、グル
タミン酸に変換させる。その際、還元型NADH
又は還元型NADPHは酸化され340nm付近の吸光
度が変化する（第四反応）。

この変化量にて測定する。

以上の反応は全て同時進行しても良いし、又第
一反応、第二反応を行い、第三反応以下分離して
行つてもよい。同時進行を行う場合は反応速度で
もつてレート・アツセイする。第三反応以下分離
して行なう場合は一旦、何らかの方法で第二反応
までを停止する必要がある。例えば加温する、PH
を変化させる、CoAをSH試薬（Ｎ−エチルマレ
イミド、モノヨード酢酸など）で封鎖する、また
は界面活性剤、蛋白変性剤（重金属、グアニジン
など）を用いるなどの方法があるが、その後の反
応（第三反応以下）に問題がないか検討する必要
がある。したがつて好ましくは同時進行が良い。

本発明はアシルコエンザイムＡヒドロラーゼの
作用により生成する遊離脂肪酸およびコエンザイ
ムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼの基質
として反応させるサイクリング反応を行なう。遊
離脂肪酸とコエンザイムＡの組み合せ物が化学的
に増幅され、他酵素反応系に関与する可能性が少
ない。

本発明はサイクリング法であるため微量定量で
き、従来の測定法の10〜100倍の感度をもち、ラ
ジオイムノアツセイ、エンザイムイムノアツセ
イ、螢光法等の感度に匹敵するほどである。また
生成するAMP及びピロリン酸は遊離脂肪酸量に
比例した生成速度となることから、レートアツセ
イが可能であるため盲検をあえてする必要がなく
短時間で測定でき、妨害物質の影響を受けにくい
紫外部にて測定できるため、自動分析器への導入
は容易である。

以下実施例にて本発明を説明する。

実施例 １ 以下の組成の反応混液及び基質溶液を調製し
た。

反応混液 トリス塩酸緩衝液 PH8.0 100mM NADPH 0.16mM ATP 9mM CoA 0.26mM MgCl₂ 4.5mM α−ケトグルタル酸 3mM アシルCoAシンセターゼ 0.18単位／ml アシルCoAヒドロラーゼ 0.08単位／ml AMPデアミナーゼ 0.4単位／ml グルタメートデヒドロゲナーゼ 10単位／ml 基質溶液 パルミチン酸（１％トリトンX100含む）を加
温及び超音波にて完全に１％トリトンX100に溶
解し、10000μMとする。１％トリトンX100にて
各濃度に希釈する。

反応混液0.99mlをあらかじめ35℃に加温したの
ち、基質溶液10μ（各濃度に希釈）を添加し、
20分後の340nmの吸光度を測定した（O.
Dreaction）。又同操作にて１％トリトンX100溶
液を10μ添加したものを（O.Dblank）とした。
ΔO.D（O.Dblank−O.Dreaction）と基質濃度と
の関係は第１図の様に原点を通る直線となつた。

実施例 ２ 以下の組成の反応混液及び発色液を調製した。

反応混液 トリス塩酸緩衝液 PH7.0 50mM ATP 10mM CoA 0.3mM MgCl₂ 5mM アシルCoAシンセターゼ 0.1単位／ml アシルCoAヒドロラーゼ 0.05単位／ml ピロホスフアターゼ 100単位／ml 発色液 試薬 １％Ｗ／V4−メチルアミノフエノー
ル・硫酸、2.7％重亜硫酸ナトリウム 試薬 2.5％Ｗ／Ｖモリブデン酸アンモニウム 発色混液 蒸留水 80ml、5N硫酸 20ml、試薬
20ml、試薬 20mlを混合する。

反応混液1.00mlをあらかじめ37℃に加温したの
ち、実施例１と同様に調製した基質溶液（各濃度
に希釈）10μを添加し、20分反応させたのち、
発色混液5.0mlを添加することによつて反応を停
止した。10分間室温に放置した後、吸光度580nm
にて測定した（O.Dreaction）。又、同操作にて
１％トリトンX100溶液を基質溶液の代りに用い
たものをO.Dblankとした。

ΔO.D（O.Dreaction−O.Dblank）と基質濃度
との関係は第２図の様になつた。遊離脂肪酸量と
ΔO.Dは明らかに原点を通る直線となつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法により定量したパルミケン
酸の量と吸光度変化との関係を示す。第２図は本
発明方法により定量したパルミケン酸の量と吸光
度変化との関係を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 遊離脂肪酸にアデノシントリホスフエートお
   よびコエンザイムＡの存在下で、アシルコエンザ
   イムＡシンセターゼ及びアシルコエンザイムＡヒ
   ドロラーゼを作用させ、アシルコエンザイムＡヒ
   ドロラーゼの作用により生成する遊離脂肪酸およ
   びコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセ
   ターゼの基質として反応させるサイクリング反応
   を行ない、次いで生成するアデノシンモノホスフ
   エートまたはピロリン酸の一定時間当りの生成量
   を測定することを特徴とする遊離脂肪酸の定量
   法。