JPH0244253A

JPH0244253A - アポリポプロテインａ−ｉの測定法

Info

Publication number: JPH0244253A
Application number: JP19337288A
Authority: JP
Inventors: Noriko Oshima; 大島　則子; Norio Hagi; 規男萩
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1988-08-04
Filing date: 1988-08-04
Publication date: 1990-02-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕コレステロール、トリグリセリド等の血中脂質は、アポ
リポプロテイン（以下、アポ蛋白とする）に表面を覆わ
れた微小粒子、すなわち血清リボ蛋白を形成することで
、血清に可溶化されている。

近年、血清リボ蛋白代謝におけるアポ蛋白の役割の重要
性が明らかにされ、高脂血症の診断や病態の解析にあた
って、アポ蛋白を測定することの必要性が次第に認識さ
れるようになってきた。

本発明は、アポリポプロテインＡ−１（以下、アポＡ−
１とする）の＃ｊ定法に関するものである。

アポＡ−１はＨＤＬ　（高比重リボ蛋白）の主要アポ蛋
白である。アポＡ−１濃度はＨＤＬ、８度を反映してい
ると考えられ、これが低値の場合には、ＨＤＬの低下、
動脈硬化の危険因子の増大が示唆される。また、脂質代
謝異常症や肝疾患時における有意な濃度の変化が報告さ
れている。

〔従来の技術〕

アポＡ−１の測定には次のような方法が知られている。

■−元放射状免疫拡散法（以下、５ＲＩＤ法とする） ■電気免疫拡散法しかし、これらの方法では、結果の判定までに時間を要
したり、多数のサンプルを同時に扱うのが困難で自動化
が不可能であったり、また、抗血清が多量に必要であっ
たりする。

本発明者らは、アポＡ−１に対するモノクローナル抗体
を用いて、サンドイツチ法による酵素免疫測定を試みた
が、反応性は非常に小さかった。

また、競争法によるラジオイムノアッセイでは、熱処理
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｌｌｐｆｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、ｖｏｌ、Ｌ７゜（１９７０）　、Ｐ２Ｏ〜３７）あ
るいは、ｔｗｅｅｎ２０の添加（１３１ｏｃ旧５ｌｃａ
　ｅｔ　Ｂｌｏｐｈｙｓｌｃａ　Ａｃ’ｔａ、６２０（
１９８０）、Ｐ４４７〜４５３）により反応性が向上し
、測定できると報告されているが、サンドイツチ法では
このような処理は有効ではなかった。

〔発明が解決しようとする３題〕本発明の目的は、これらの方法よりも、簡便にかつ短時
間でアポＡ−１を測定する方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明者らは上
記課題について鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達し
た。

即ち本発明は、血清又は血漿と第四級アンモニウム化合
物である界面活性剤を混和し、一定の時間放置した後、
免疫測定を行うことを特徴とするアポＡ−１の測定法で
ある。

用いる界面活性剤は、第四級アンモニウム化合物である
。例えば、ベンザルコニウムクロライド。

ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド
、メチルベンゼトニウムクロライド、ジメチルジオクタ
デシルアンモニウムブロマイド、メチルミックストリア
ルキルアンモニウムクロライドなどがあげられる。特に
、ベンザルコニウムクロライド、ベンジルジメチルヘキ
サデシルアンモニウムクロライド、メチルベンゼトニウ
ムクロライドが好ましい。これらは、ベンゼン環と大き
なアルキル基という大きな官能基が二つついた四級アミ
ンである点で一致する。

本発明では、界面活性剤と血清又は血漿とを混和した後
、一定の時間放置する。このとき、ｌｉ！！街液を用い
て各濃度を適宜調整する。界面活性剤の濃度は、放置す
る時間との兼ね合いによるが、最終濃度０．０１％〜０
．１％となるようにすればよい。血清又は血漿の濃度も
、放置する時間との兼ね合いによるが、最終的に１０〜
１００倍に希釈された状態で放置されればよい。血清又
は血漿が潰すぎると界面活性剤との反応効率が悪くなり
、又、薄すぎるとＡｌ１定に不都合を生じてしまうから
である。

以上のような条件で血清または血漿と界面活性剤を混和
し、２０〜５６℃好ましくは２５〜３７℃で放置する。

放置時間は０．５〜７２時間好ましくは１〜２４時間で
ある。

次に、免疫測定を行う。免疫測定法として例えば比濁法
、サンドイツチ法などがあげられる。用いる抗体はポリ
クローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル
抗体を用いる。これらは、通常の免疫法、ケーラーとミ
ルスタインの細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ、２５Ｂ、（１
９７５）、４９５　）によって得ることができ、また市
販品を用いてもよい。

サンドイツチ法を行う場合には、好ましくは第１抗体を
固定化するが、固定化の方法は、公知の方法を採用でき
る。抗体を固定化するものとしては、例えばガラス、ポ
リスチレン、ポリエチレン。

ポリ塩化ビニル、アガロース、セルロース、メタアクリ
レート、金属等を用いたビーズやマイクロタイタープレ
ートなどが好ましく利用される。

また、第２抗体を標識化する方法や手段、その検出方法
や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方法や手
段により測定することができる。

標識剤としては、酵素を用いる方法（ＥＩＡ）では、パ
ーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、又はアルカリフォスファターゼ等の酵
素が、放射性物質を用いる方法（ＲＩ　Ａ）では、　　
Ｉ、　　”Ｈ等が、蛍光物質を用いる方法（ＦＩＡ）で
は、フルオレッセイン・インチオシアネートなどが通常
使用されるが、その他のものであってもよい。中でも酵
素を用いる方法は放射性物質を使用する方法と比べ、取
り扱いが容品、簡便であるため好ましいものである。

その酵素活性をＭ１定するための基質として、例えば、
西洋ワサビパーオキシダーゼの基質としては、２．２゛
−アジノジー〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸
〕ニアンモニウム塩（以下、ＡＢＴＳとする）−ＨＯ５
−アミノサリチル酸２２′ −ＨＯｏ−フェニレンジアミン−Ｈ２０２２２。

等が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、０−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が、グ
ルコースオキシダーゼの基質としては、グルコース−ル
ミノール−フェリシアン化鉄塩等が、アルカリフォスフ
ァターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート等が用いられる。

このような試薬を用いて免疫測定を行うが、界面活性剤
が抗原抗体反応を阻害するため、反応時には界面活性剤
濃度を０，０２％以下好ましくは０．００５％以下とす
る必要がある。そのために、測定時に緩衝液で希釈した
り、あるいは何らかの方法で界面活性剤を取り除いたり
する。

以上のような方法によって、血清又は血漿中のアポＡ−
１を測定することができる。

これは界面活性剤によって血清又は血漿中のＨＤＬの状
態が変化し、アポＡ−１の抗原決定部位がＨＤＬ上に露
出したことにより、モノクローナル抗体であっても血清
又は血漿中のアポＡ−１が認識できるようになったと考
えられる。

〔発明の効果〕

以上の説明から明らかなように、本発明によれば、簡便
にかつ短時間でアポＡ−１を測定できる。

〔実施例〕

本発明をさらに詳細に説明するために実施例をあげるが
、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない
。

（実施例１）ヒト血清をベンザルコニウムクロライド０．０５％を含
むＰＢＳ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，５
，０，１５Ｍ塩化カリウム含有）に２０倍希釈し、２５
℃でθ時間、、１．５時間、６時間、２４時間放置した
後、ＰＢＳで１０倍希釈した。

アポＡ−１に対するモノクローナル抗体（ケンブリッジ
・メディカル・ダイアグノスティック社製；以下、ＣＭ
Ｄ社製とする）を吸着させたマイクロタイタープレート
に、先に調製した試料２０μｍ及びＰＢＳ３００μｍを
添加し、２５℃で１１１′１間反応させた後、溶液を除
去してからＰＢＳＴ（０，０５％のＴｗｅｅｎ２Ｑを含
むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオ
キシダーゼで樟識化したアポＡ−１に対するモノクロー
ナル抗体（ＣＭＤ社製、固相化したモノクローナル抗体
とは別のりａ−ンのもの）を３００μｍ添加し、２５℃
で１時間反応させた後、溶液を除去してからＰＢＳＴで
３回洗浄した。さらに、ＡＢＴＳ　　Ｈ２０２を基質と
して添加し、２５℃で１５分間反応させた後、シュウ酸
溶液を加えて反応を停止させた。その後、その４１５ｎ
ｍの吸光度をＭ１定した。結果を表１に示す。

（比較例１）実施例１と同様にして、ただしヒト血清をベンザルコニ
ウムクロライドを含まないＰＢＳで処理して、測定を行
った。結果を表１に示す。

（実施例２．比較例２）実施例１と同様にして、ただし、表２に記載のように各
界面活性剤を用いて血清を処理し、測定した。また、比
較例２として界面活性剤無添加のＰＢＳを用いて処理し
、測定した。結果を表２に示す。

表２ＭＢＣ：メチルベンゼトニウムクロライＤＤＡＢ；ジメ
チルジオクタデシルアンモニウムブロマイドＭＭＡＣ：メチルミックストリアルキルアンモニウムク
ロライドド（実施例３．比較例３）高脂血症患者血清をベンザルコニウムクロライド０．０
５％を含むＰＢＳに２０倍希釈して、２５℃で２０時間
放置後、実施例１と同様な方法でアポＡ−１を測定した
。ただし、放置後サンプルをＰＢＳで２０倍希釈した。

比較例３として、界面活性剤を含まないＰＢＳで同様に
処理し、測定した。

また、実施例３と比較例３のアポＡ−１濃度を５ＲＩＤ
法（第−化学薬品社！２）で測定し、そのＨ１関を調べ
た。

結果を第１図に示す。縦軸はＥＩＡによる吸光度を示す
。横軸は５ＲＩＤ法によるアポＡ−１６反を示す。黒丸
は実施例３の、白丸は比較例３の結果を示したものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３と比較例３において、５ＲＩＤ法に
よるアポＡ−１ａ度とＥＩＡによる吸光度との関係を示
した図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）血清又は血漿と第四級アンモニウム化合物である
界面活性剤を混和し、一定の時間放置した後、免疫測定
を行うことを特徴とするアポリポプロテインＡ−Ｉの測
定法。
（２）免疫測定法として、アポリポプロテインＡ−Ｉを
認識する抗体で、［１］固定化されている第１抗体と、［２］標識剤で標識されている第２抗体を使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）モノクローナル抗体を使用する特許請求の範囲第
１項又は第２項記載の方法。