JPH02433A - ポリペプチド、ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ラットカルシウムおよびリン脂質依存性蛋白
質リン酸化酵素（蛋白質リン酸化酵素ＣあるいはＣ−キ
ナーゼと略称することもある。）およびその製造のため
の組み換えＤＮＡ技術に関する。

従来の技術 生体の多彩な機能発揮や適応現象には、細胞の生長因子
、ホルモンあるいは神経伝達物質など多種類の生理活性
物質の関与が知られている。これらの細胞外シグナルは
、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）　、サイクリックＧ
　Ｍ　Ｐ　（ｃ　Ｇ　Ｍ　Ｐ　）、シアシールグリセロ
ール（ＤＧ）、カルシウム（Ｃａ”）などの細胞内伝達
物質を通じて発揮される。特にＤＧは細胞機能の活性化
を引き起す多くのホルモンや神経伝達物質によって細胞
膜のイノシトール燐脂質が分解された結果生じることが
判明している。このＤＧがカルシウムの存在下にＣ−キ
ナーゼを活性化し、この酵素による細胞内各種蛋白質の
リン酸化反応が種々の細胞機能の活性化や細胞増殖をも
たらすと考えられている。つまりＣ−キナーゼは外界シ
グナルの主要な情報伝達機構の一つにおいて重要な役割
を担っている酵素である。

ラット大脳より精製された該酵素は等電点がｐＨ５，６
の酸性蛋白質であり、分子量は約７７．０００である。

またこの酵素は疎水性の部分と親水性の部分とからなる
単一ペプチドからできており、疎水性部分を介して細胞
膜に結合し、ＩＩ！ｉ４水性部分に活性中心が存在する
。Ｃ−キナーゼは通常不活性型であり、カルシウムとフ
ォスファチジールセリンおよびＤＧの王者によって活性
化される。またリン酸供与体はＡＴＰであることがわか
っている。

このようにＣ−キナーゼは蛋白質リン酸化酵素の一つと
して蛋白質のリン酸化を通じて細胞外シグナルの細胞内
伝達を行うことから、細胞外シグナルの受容伝達機構の
研究には欠くことのできない酵素であり、その試薬とし
ての価値は非常に高い。また、本酵素は発ガンプロモー
ターであるフォルボールエステルにより直接活性化され
る。フォルボールエステルは発ガン過程の促進を引き起
こすだけではなく、細胞分裂や分化、酵素の誘導。

脂質の代謝昂進など多くの生物反応に深く関与している
ことが知られている。これらのことは細胞膜受容伝達機
構の異常が成因となる種々の病的細胞やガン細胞におい
て、Ｃ−キナーゼが重要な指標酵素となる可能性が高く
、Ｃ−キナーゼに対する抗体などが診断剤や検査薬とし
て用いられることが考えられる。

このようなＣキナーゼの遺伝子構造については、最近の
相補鎖ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）クローニングの結果より、
少なくとも４種類（α、βＩ、β■。

γ）の分子構造が存在することが明らかにされ、その塩
基配列およびアミノ酸配列が明らかにされている。α型
、β■型、β■型およびγ型については、特願昭６２−
１５７４９５号明細書および図面を、またγ型について
は、セル（Ｃｅｌｌ）第４６巻第４９１頁（１９８６年
）を参照されたい。

しかしながら、それら以外にも他の亜型が存在する可能
性も示されており、Ｃキナーゼの酵素群としての実体は
完全には明らかにされていない。

発明が解決しようとする課題 上記のように、Ｃキナーゼには分子多様性が存在し、そ
の全体像は不明な点が多い、従って、試薬や検査薬とし
て例えば、その分子亜型のそれぞれについて、それをコ
ードする遺伝子を同定し。

その蛋白質を遺伝子組み換え技術によって生産する方法
が望まれていた。

課題を　　するための 一般に、ヒトにより近い動物の蛋白質は、そのアミノ酸
配列においてヒトと非常に高い相同性があり、アミノ酸
の異なっている部分も、その大部分はコドンのｏｎｅ　
ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎによって導びかれるもの
である。従って、ラット等の動物のＣキナーゼ亜型のｃ
ＤＮＡを得れば、ヒトのそれを得ることは容易であると
考えられる。そこで本発明者等は、まずラットを材料と
して、Ｃキナーゼの新しい亜型の遺伝子を検索すること
を試みた。

その結果、新たに３種のＣキナーゼのｃＤＮＡを分離す
ることに成功した。

本発明は（１）第１図に示されたアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドであるラットＣキナーゼ（δ）（Ｉ　）
　；同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もし
くは上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の
活性を有するポリペプチド。

（２）ラットＣキナーゼ（δ）をコードする第１図で示
された塩基配列を含有する組み換えＤＮＡ（ＩＩ）　、
　　（３）　ＤＮＡ　（１１）を含有するベクターで形
質転換された形質転換体および、（４）ＤＮＡ　（ｌ　
を含有するベクターで形質転換された形質転換体を培地
に培養し、培養中にラットＣキナーゼ（δ）を生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする該酵素の製造
法に関するものである。

また本発明は、（５）第２図に示されたアミノ酸配列を
含有するポリペプチドであるラットＣキナーゼ（ｔ）（
ｍ）；同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；も
しくは上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一
の活性を有するポリペプチド、（６）ラットＣキナーゼ
（Ｅ）をコードする第２図で示された塩基配列を含有す
る組み換えＤＮＡ　（ｒＶ）　、　　（７）　ＤＮＡ　
（ＩＶ）を含有するベクターで形質転換された形質転換
体および、（８）ＤＮＡ　（ｒＶ）を含有するベクター
で形質転換された形質転換体を培地に培養し、培養中に
ラットＣキナーゼ（ε）を生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする該酵素の製造法に関するものであ
る。

更に、本発明は（９）第６図に示されたアミノ酸配列を
含有するポリペプチドであるラットＣキナーゼ（ζ）（
Ｖ）；同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；も
しくは上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一
の活性を有するポリペプチド、（１０）ラットＣキナー
ゼ（ζ）をコードする第６図で示された塩基配列を含有
する組み換えＤＮＡ　（ＶＩ）　、　　（１１）　ＤＮ
Ａ　（ＩＶ）を含有するベクターで形質転換された形質
転換体および、（１２）ＤＮＡ　（ｒＶ）を含有するベ
クターで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養中にラットＣキナーゼ（ζ）を生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする該酵素の製造法に関するも
のである。

本発明方法におけるラットＣ−キナーゼ蛋白質のポリペ
プチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
発現型ベクターは、例えば、（イ）ラットＣ−キナーゼ
をコードするＲＮＡを分離し、 （ロ）該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を
、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、 （ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ニ）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換し。

（ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばラットｃＤＮＡをプロ−ブとして用い
たコロニーハイブリダイゼーション法、により目的とす
るＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、 （へ）そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、 （ト）該クローン化ＤＮＡをビークル中のプロモーター
の下流に連結する。ことにより製造することができる。

ラットＣ−キナーゼをコードするＲＮＡは１種々のラッ
トＣ−キナーゼ産生細胞、例えばラット脳由来細胞から
得ることができる。

ラットＣ−キナーゼ産生細胞からＲＮＡを調製する方法
としては、グアニジンチオシアネート法（Ｊ、Ｍ、、Ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎ　ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８．５２９４（１９７９））な
どが挙げられる。

このようにして得られたＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて、例えばＨｏＯｋａｙａｍａらの方法〔モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌａｃ
ｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
）　２，１６１（１９８２）および同誌３Ｌ２８０（１
９８３））に従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡ
をプラスミドに組み込む。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のＰＢ　Ｒ３２２Ｃジーン（ｇｅｎｅ）、２．９
５（１９７７））、ｐＢ　Ｒ３２ＳＣジーン４す２１（
１９７８））、ｐＵ　Ｃｌ２（ジーン、月１．，２５９
（１９８２）］、ｐＵｃ１３（ジーン、１９，２５９（
１９８２））　、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ（バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーヨ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＧｏ＋ｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ）、１１２，６７８（１９８３））などが挙げられ
るが、その他のものであっても、宿主内で複製保持され
るものであれば、いずれをも用いることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリン
グ−ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）　ｒ第２３
９頁（１９ｇ２）に記載の方法などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリキア（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　）属菌。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１
（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）６０゜１６０（１９６８）
）、Ｍ２Ｏ３（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、（
Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９
３０９（１９８１））。

ＪＡ２２１Ｃジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ））、１２０５１７（１９７８））、　
ＨＢＩＯＩ（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー環１４５９（１９６９））、　Ｃ６００［ジェネ
ティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、逼ト４４０（１９
５４））などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ　Ｉ　
１１４（ジーン。

２４．２５５（１９８３）〕、〕２０７−２ＩＣジャー
ナルオブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５．８７（１９８４）
）などが挙げられる。

形質転換する方法としては、たとえばＴ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ）　、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２４９頁（１９８
２）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウ
ムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げられ
る。

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の方
法、例えばコロニー・ハイブリダイゼーション法〔ジー
ン、±６３（１９８０））およびＤＮＡ塩基配列決定法
〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）７４，５６０（
１９７７）、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎ＋
」ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９゜３
０９（１９８１））を用い、求めるクローンを選出する
。

このようにして、クローン化されたラットＣ−キナーゼ
をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを有するベクタ
ーを保持する微生物が得られる。

次に、該微生物からプラスミドを単離する。

該単離法としては、アルカリ法［Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｍｂｏ
ｉｍら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ＋　（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１．１５
１３（１９７９））などが挙げられる。

上記クローン化されたラットＣ−キナーゼをコードする
塩基配列を含有するＤＮＡを有するプラスミドはそのま
ま、または所望により制限酵素で切り出す。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢ　Ｒ３２２，ｐＢ　Ｒ３２５，ｐＵｃ１２．　ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来プラスミド（例、　ｐＵＢｌｌ
ｏ、　ｐＴ　Ｐ　５　、ｐｃ１９４）、酵母由来プラス
ミド（例、ＰＳＨ１９、ｐｓＨ１５）、あるいはλファ
ージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、
ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられ
る。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい、さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する０本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、Ｑａａプロモーター　ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター　ＱｐＰプロ
モーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、５
ＰＯＩプロモーター５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプ
ロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨ○５プ
ロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい、とりわけ宿主がエ
シェリキア属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターま
たはλＰＬプロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたＤＮＡ　（ＩＩ）、（ＩＶ）
または（ＶＩ）を含有するベクターを用いて、形質転換
体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツ力ロマイセスセレビシ
アエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｅｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　Ａ　Ｈ２２Ｒ−、ＮＡ　８７−１１Ａ、ＤＫＤ
−５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７゜Ｖｅ
ｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。

マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、６９，２１１０　（１９７２）やジ
ーン、１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従
って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネテイックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
　、１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ）、
７５．１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行な
われる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばケイロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２，４５６　（１９７３）に記
載の方法に従って行なわれる。

このようにして、　ＤＮＡ　（Ｉｆ）　、　　（ＩＶ）
または（ＶＩ）を含有するベクターで形質転換された形
質転換体が得られる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉。

ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカーペプトン、カゼ
イン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機
または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウ
ム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが
挙げられる。

また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては。

例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地（Ｍｉｎ
ｅｒ、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジエネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
εｘｐａｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１−４３３゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２）が好ましい、ここに必要に
よりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば
３β−インドリル　アクリル酸のような薬剤を加えるこ
とができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常的１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により１通気や撹拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常的３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂｕｒｋｈ。

１ｄｅｒ）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、　
　ら、「プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　７７、４５０５（１９８０））が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい。培養は通常的２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際。

培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血際を含
むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１２２
゜５０１　（１９５２））、　ＤＭＥＭ培地〔ケイロロ
ジー（ｖｉｒ。

−１ｏｇｙ）　、８，３９６　（１９５９））　、　Ｒ
Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・ア
メリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊ
ｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉ
ｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１９９，５１９　
（１９６７））、　１９９培地〔プロシージング・オブ
・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メ
ディスン（Ｐｒｏ−ｃｅａｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５
ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　７３．１　（１９５０））など
が挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培
養は通常的３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からラットＣ−キナーゼ蛋白を分離精製する
には１例えば下記の方法により行なうことができる。

ラットＣ−キナーゼ蛋白を培養菌体あるいは細胞から抽
出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは
細胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を
含む緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／また
は凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、
遠心分離によりラットＣ−キナーゼ蛋白を得る方法など
が適宜用い得る。

上記上澄液からラットＣ−キナーゼ蛋白を精製するには
、自体公知の分離・精製法を適切に組み合おせて行なう
ことができる。これらの公知の分離、Ｍ製法としては、
塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法
、限外ろ過法、ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体ク
ロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法１等
電点電気泳動法などの等重点の差を利用する方法などが
挙げられる。

本発明の遺伝子組み換え技術によって得られたラットＣ
−キナーゼ蛋白の一例として、例えば第１図、第２図ま
たは第３図におけるアミノ酸配列で示されるポリペプチ
ドを含有する蛋白質を挙げることができる。該ポリペプ
チドはそのＮ末端にＭｓｔを有していてもよい。

かくして生成するラットＣ−キナーゼの活性は公知の蛋
白質リン酸化などにより測定することができる。

本発明のＤＮＡで遺伝子感染または形質転換したＩＢＩ
ｍでは１本来わずかのラットＣ−キナーゼしか合成され
ない、あるいは全く合成されない各種細胞においても大
量のラットＣ−キナーゼを産生せしめることができ、ラ
ットＣ−キナーゼ生産を有利に導くことができる。

本発明のラットＣ−キナーゼ蛋白をコードする遺伝子を
含有する発現型プラスミドは、これを各種細胞に１人す
ることにより該細胞にラットＣ−キナーゼを産生させる
ことができるため、ラットＣ−キナーゼを大量に取得す
ることができる。ここに製造されるラットＣ−キナーゼ
は、試薬としてまた抗体を調製しその抗体と共に診断・
検査薬として用いることができる。たとえば本発明のＣ
−キナーゼは、細胞膜受容伝達機構などの研究用試薬、
細胞膜受容伝達機構の異常が原因となる疾病（例：腫瘍
）に対する診断・検査薬、あるいはこれらの疾病に対す
る予防・治療薬のスクリーニング用試薬として用いるこ
とができる。たとえば、１回の診断・検査に約０．００
１〜１０μｇのＣ−キナーゼが用いられる。

以上、ラットＣ−キナーゼのクローニング、形質転換体
の製造、形質転換体を用いたラットＣ−キナーゼ蛋白の
製造及びその有用性等について詳細に述べた・ 本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ　Ｂ　Ｃｏｍ
＋ｗｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏ
ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。

またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｄＡ、ＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デ
オキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣ：ＴＰ：デ
オキシシチジン三リン酸ＡＴＰ　　：アデノシン三リン
酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇ：Ｇｌｙ　　ニゲリシン Ａ：Ａｌａ　　：アラニン Ｖ：Ｖａｌ　　：バリン Ｌ：Ｌｅｕ　　：ロイシン ｒ：Ｉｌａ　　：イソロイシン Ｓ：ｓｅｒ　　：セリン Ｔ：Ｔｈｒ：スレオニン Ｃ：Ｃｙｓ　　ニジスティン Ｍ：Ｍｅｔ　　：メチオニン Ｅ：Ｇｌｕ　　：グルタミン酸 Ｄ：Ａｓｐ　　：アスパラギン酸 に：１．、ｙｇ　　：リジン Ｒ：Ａｒｇ　　：アルギニン Ｈ：Ｈｉｓ　　：ヒスチジン Ｆ：Ｐｈｅ　　：フェニールアラニン Ｙ：Ｔｙｒ：チロシン Ｗ：Ｔｒｐ　　ニトリブトファン Ｐ：Ｐｒｏ　　ニブロリン Ｎ：Ａｓｎ　　：アスパラギン Ｑ：Ｇｌｎ　　：グルタミン 実施例および発明の効果 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

後述の実施例２（１）で得られた形質転換体エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＯ１
／ｐＴＢ８０１、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１／ｐＴＢ８０
３およびＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１／ｐＴＢ８０４は昭和６
２年９月２４日から財団法人発酵研究所（ＩＦ○）に受
託番号ＩＦ○１４６５２．　Ｉ　Ｆ○１４６５３、　Ｉ
　Ｆ○１４６５４としてそれぞれ寄託され、またこれら
微生物は昭和６２年１０月３日に通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　
　Ｐ−９６３３，ＦＥＲＭＰ−９６３４，ＦＥＲＭ　　
Ｐ−９６３５としてそれぞれ寄託されている。

後述の実施例３（２）で得られた形質転換体エシェリヒ
ア・コリ　ＤＨＬ／ｐＴＢ　９４９は、昭和６３年９月
１５日からＩＦｏに受託番号ＩＦ０１４７８７として、
昭和６３年９月２９日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１０３０４として。

それぞれ寄託されている。

実施例１ （１）ラットｆＱ　ｍ　ＲＮ　Ａ由来のｃＤ’ＮＡライ
ブラリーの作製 ラット脳よりＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法
（Ｃｈｉｒｇｗｉｍら、［バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ）　Ｊ　１８．５２９４．１９７
８］を用いて抽出した。このＲＮＡよりポリ（Ａ）ＲＮ
ＡをオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーに
より精製した（　ＡｖｉｖとＬａｄａｒ、　ｒプロシー
ジング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ
ｓＡ）　６９．１４０８　（１９７２））　−このポリ
（Ａ）ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを、Ｗ
ａｔＳＯｎとＪａｃｋｓｏｎ　　の方法（Ｗａｔｓｏｎ
、Ｃ０Ｊ、ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｊ、Ｆ、、ＤＮ
Ａクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（Ｄ
　Ｎ　Ａ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ、０
ｘｆｏｒｄ、　ｐ７９，１９８５）に従って、λファー
ジベクターλｇｔｌｏ　（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ。

■、ら、Ｄ　Ｎ　Ａクローニング・ア・プラクティカル
・アプローチ＋ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、ｐ
４９．１９８５）を用いて作成した。１０Ｍｇのポリ（
Ａ）ＲＮＡより出発して、約１．５　Ｘ　１０’個のク
ローンよりなる大腸菌Ｃ６００、Ｈｆ　ＱＡ　（Ｈｕｙ
ｎｈ　Ｔ、Ｖら、同上）を宿主としたｃＤＮＡライブラ
リーを得ることができた。

（２）ラットＣキナーゼ亜型ｃＤＮＡを含むファージの
単離とそのＤＮＡ塩素配列の決定上記ファージｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａライブラリーを大腸菌Ｃ６００、ＨｆＱＡを宿主
として、軟寒天プレート上に、約Ｉ　Ｘ　１０’　クロ
ーンずつ、１０枚まき。

これを、２枚づつのニトロセルロースフィルター（ミリ
ボア社、　ＨＡＴＦ　フィルター）上に移した後、０．
５Ｎ　　ＮａＯＨ溶液でとかし露出変性したファージＤ
ＮＡをフィルター上に乾燥固定した。（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｐ３２０，１９８２）、一方、既に公知のラットＣキナ
ーゼ（α）、（β■）および（γ）のｃＤＮＡを含むプ
ラスミドＤＮＡｐＴＢ６５３．ｐＴＢ７５５およびｐＴ
Ｂ７５６より制限＃素ＥｃｏＲ夏切断によりＣＤＮＡ部
分を分取し、これを等量づつ混合した後、ニックトラン
スレーション法により３２Ｐ　標識し、プローブとした
。標識したプローブと、ＤＮＡを固定した一組のフィル
ターを、標識プローブを含む、５ＸＳＳＰＥ（０，９Ｍ
Ｎ　ａ　ＣＱ　５０ＩＩ＋Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，４）　、　５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）、５０％　ホ
ルムアミド、　５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　０．１
＠　ＳＤＳ、ＬＯＯｐｇ／ｒｘａ変性サケ精子ＤＮＡ溶
液１０　ｍ　Ｑ中で４２℃。

１６時間会合反応を行い、反応後、フィルターを２ｘＳ
ＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム）　、　０．１％ＳＤＳ溶液中で
室温で３０分ずつ２回０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
溶液中で、６８℃で３０分２回洗浄した。また、もう−
組のフィルターをプローブを含む２０％ホルムアミド、
５×Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　、　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ
、　０．１％ＳＤＳ、１１００７ｚ　／　ｍ　Ｑ変性サ
ケ精子ＤＮＡ溶液１０ｍＱ中で４２℃１６時間行い、反
応後、フィルターを２ＸＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳ溶液で室温で３０分３回、さらに５５℃
で３０分ずつ２回洗浄した（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ　ら
、［モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐｐ３０９．１９８２
］　。

洗浄した２組のフィルターよりラジオオートグラムをと
り、２０％ホルムアミド溶液中で会合反応を行った場合
のみにプローブと反応するクローンを検索した。この結
果、３種類のラットＣキナーゼ亜型　ｃＤＮＡが得られ
、これらをλＣＫＲδ５（Ｃキナーゼδ）、λＣＫＲｐ
４１（ＣキナーゼＥ）λＣＫＲζ３　（Ｃキナーゼζ）
と名付けた。

さらに、それぞれのＣＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキ
シヌクレチオド合成鎖停止法（Ｍｅｓｓｉｎｇら。

「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ５ｅｒｃｈ）Ｊ９，３０９．（１９
８１））によって決定した。

第１図ないし第３図にラットＣキナーゼδ、εおよびこ
の塩基配列の一部を含む塩基配列、およびそれらから予
想されるアミノ酸配列を示した。

それぞれの得られた塩基配列により予想されるアミノ酸
配列について、既知のラットＣキナーゼα。

βＩ、β■、γ型のそれと比較すると、極めて高い相同
性が認められることから、新しく得られたδ、ε、ζ型
はいずれもＣキナーゼ亜型の一つであると考えられた。

実施例２ （１）ラットＣキナーゼδ、εおよびζ型ｃＤＮＡの動
物細胞での発現用プラスミドの構築：λＣＫＲδ５．λ
ＣＫＲε４１およびλＣＫＲζ３を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で分解し、それぞれ約２．９ｋｂ、２．８ｋｂおよび１
．８ｋｂのｃＤＮＡ部分を分離した。一方、公知の動物
細胞発現用プラスミドｐＴＢ６５２（小野らサイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　２３６　。

１１１６　（１９８７））をＥｃｏＲＩで分解し、これ
と上記ｃＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し動物
細胞発現用プラスミドｐＴＢ８０１（δ型）ｐＴＢ８０
３（δ型）およびｐＴＢ８０４（ζ型の一部を含む）を
構築した。これらプラスミドを用い大腸菌形質転換体Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｄｌｌ　ｒ　／ｐＴＢ８０１　（ＩＦＯ１
４６５２，ＦＥＲＮ　Ｐ−９６３３）、　　Ｅ、ｃｏｌ
ｉＤＨＩ　　／Ｐ丁Ｂ８０３　　（ＩＦＯ１４６５３，
ＦＥＲＭＰ−９６３４）およびＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨＴ　
／ｐＴＢ８０４　（ＩＦＯ１４６５４、ＦＥＲＭ　Ｐ−
９６３５）をそれぞれ得た。

（２）ラットＣキナーゼδおよびε型ｃＤＮＡの動物細
胞での発現： 上記発現用プラスミドｐＴＢ８０１またはｐＴＢ８０３
を５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．１１１６　（１９８７）に
記載された方法により、サルＣＯ５−７細胞に感染させ
た後、細胞質分画を得た。この細胞質分画を３倍量の２
０ｍＭ　Ｔｒｉ　ｓ　　ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）　０
．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、　１０　ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール（緩衝液Ａ）で希釈した後、ＴＳＫＤＥＡＥ−
５ＰＷカラムにのせた。緩衝液Ａでカラムを洗浄した後
、〇−０，６ＭのＮ　ａ　Ｃｌを含む、緩衝液Ａの直線
濃度勾配法により、Ｃキナーゼ活性を溶出させた。第５
図にこの時の溶出パターンを示した。第５図から、ｐＴ
Ｂ８０１またはｐＴＢ８０３感染細胞由来画分は、それ
ぞれＣキナーゼ活性を有していることが分かる。

実施例３ （１）ラットＣキナーゼζｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含むファー
ジの単離とそのＤＮＡ塩基配列の決定 実施例１（１）に記載したファージｃＤＮＡライブラリ
ーを大腸菌Ｃ６００，Ｈｆ　ＱＡを宿主として軟寒天プ
レート上に、約ｌＸｌ０’クローンずつ１０枚まき、こ
れをニトロセルロースフィルター（ミリポア社、ＨＡＴ
Ｆフィルター）上に移した後、０．５Ｎ　ＮａＯＨ溶液
でとかし露出変性したファージＤＮＡをフィルター上に
乾燥固定した。

方、実施例２（１）に記載したラットＣキナーゼζｃＤ
ＮＡの一部を含むプラスミドｐＴＢ８０４より制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＣｆ１ａＩ切断により、約０．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を分取し、これをニックトランスレーショ
ン法により、３Ｚｐ標識し、プローブとした。標識した
プローブとＤＮＡを固定したフィルターを、標識プロー
ブを含む、５ＸＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、　　５
　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００
μｇ／＋ｎＱ変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ｍ　Ｑ中で４
２℃、１６時間会合反応を行い、反応後、フィルターを
２ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で３０分ずつ
２回、０．２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，１％ＳＤＳ溶液中
で６８℃、３０分２回洗浄した。このフィルターよりオ
ートラジオグラムをとり、プローブと反応するクローン
を検索した。この結果、λＣＫＲＬζ５およびλＣＫＲ
Ｌζ８と名づけだ２組のファージクローンを得た。それ
ぞれのｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチ
ド鎖停止法によって決定した。第６図にラットＣキナー
ゼこの塩基配列、および、それから推測されるアミノ酸
配列を示した。

（２）ラットＣキナーゼζｃＤＮＡの動物細胞での発現 上記ファージλＣＫＲＬζ８ｃＤＮＡよりＥｃｏＲＩお
よびＣＱａｒ消化により０．８５ｋｂ　　ｃＤＮＡ断片
を、λＣＫＲζ３よりＥｃｏＲＩおよびＣＱａｌ消化に
より１．４ｋｂ　　ｃＤＮＡ断片をそれぞれ分取した。

これらｃＤＮＡ断片を混合した後、公知の動物細胞発現
用ベクタープラスミドｐＴＢ７０１［小野ら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　７６３．６９２７（１９８８）
　）のＥｃｏＲ１部位に挿入しプラスミドｐＴＢ９４９
を構築した。このプラスミドを用い大腸菌ε、ｃｏｌｉ
ＤＨ１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリＤ
Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　９４９　（ＩＦＯ１４７８７、Ｆ
ＥＲＮ　Ｐ−１０３０４）を得た。

ラットＣキナーゼζ型発現用プラスミドｐＴＢ９４９を
ジャーナルオブザバイオロジカルケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、　２６３．６９２７　（１
９８８）に記載された方法により、サルＣＯ３−７細胞
に感染させた後、細胞質分画を得た。この細胞質分画を
３倍量の２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　　（ｐ
　Ｈ７，５）　。

０．５ｍＭ　　ＥＧＴＡ、１０ｍＭ　　２−メルカプト
エタノール（緩衝液Ａ）で希釈した後、ＴＳＫ　　ＤＥ
ＡＥ−５ＰＷカラムにのせた。緩衝液Ａでカラムを洗浄
した後、０〜０．６Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱを含む緩衝液Ａの
直線濃度勾配法によりＣキナーゼ活性画分を溶出させた
。第７図は、この時の溶出パターンを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はラットＣキナーゼδの塩基配列と予想されるア
ミノ酸配列を示し、第２図はラットＣキナーゼεの塩基
配列と予想されるアミノ酸配列を示し、第３図はラット
Ｃキナーゼこの塩基配列の一部を含む塩基配列と予想さ
れるアミノ酸配列を示す。 第４図はラットＣキナーゼα、βｌ、βＨ２γ。 δ、ε、このＣ末端領域のアミノ酸配列を比較して示し
た図である。 第５図は感染細胞または非感染細胞由来の細胞質画分の
ＴＳＫ　　ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグラフイー
におけるラットＣキナーゼで活性の挙動を示している。 　ａ）非感染細胞由来、ｂ）ｐＴＢ８０１感染細胞由来
、ｃ）ｐＴＢ　８０３感染細胞由来、ｄ）ラット脳可溶
性画分由来のものに関する。 第６図はラットＣキナーゼこの塩基配列と、それから推
測されるアミノ酸配列を示す。 第７図は、感染細胞または非感染細胞由来の細胞質分画
（７）ＴＳＫ　　ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグラ
フイーにおけるラットＣキナーゼ活性の挙動を示してい
る。ａ）　ｐＴＢ　９４９　　感染細胞由来、ｂ）非感
染細胞由来のものを示す。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示されたアミノ酸配列を含有するポリペ
   プチドであるラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）； 同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは 上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性
   を有するポリペプチド。
2. （２）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）をコードする
   塩基配列を含有する組み換えＤＮＡ。
3. （３）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）が、請求項１
   記載のポリペプチドである請求項２記載のＤＮＡ。
4. （４）第１図に示された塩基配列を含有する請求項２記
   載のＤＮＡ。
5. （５）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）をコードする
   塩基配列を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質転
   換された形質転換体。
6. （６）請求項５記載の形質転換体を培地に培養し、培養
   物中にラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）を生成蓄積せ
   しめ、これを採取することを特徴とする該酵素の製造法
   。
7. （７）第２図に示されたアミノ酸配列を含有するポリペ
   プチドであるラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）； 同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは 上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性
   を有するポリペプチド。
8. （８）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）をコードする
   塩基配列を含有する組み換えＤＮＡ。
9. （９）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）が、請求項７
   記載のポリペプチドである請求項８記載のＤＮＡ。
10. （１０）第２図に示された塩基配列を含有する請求項８
    記載のＤＮＡ。
11. （１１）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）をコードす
    る塩基配列を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質
    転換された形質転換体。
12. （１２）請求項１１記載の形質転換体を培地に培養し、
    培養物中にラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）を生成蓄
    積せしめ、これを採取することを特徴とする該酵素の製
    造法。
13. （１３）第６図に示されたアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドであるラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）； 同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは 上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性
    を有するポリペプチド。
14. （１４）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）をコードす
    る塩基配列を含有する組み換えＤＮＡ。
15. （１５）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）が、請求項
    １３記載のポリペプチドである請求項１４記載のＤＮＡ
    。
16. （１６）第６図に示された塩基配列を含有する請求項１
    ４記載のＤＮＡ。
17. （１７）ラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）をコードす
    る塩基配列を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質
    転換された形質転換体。
18. （１８）請求項１７記載の形質転換体を培地に培養し、
    培養物中にラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）を生成蓄
    積せしめ、これを採取することを特徴とする該酵素の製
    造法。