JPH0238599B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は特異な生理活性を示す新規ソマトスタ
チン類似体を製造し、これを提供することに関す
る。更に詳しくは、本発明は下記式（）で表わ
される９個のアミノ酸より構成される新規ペプタ
イドを提供することに関するものである： ちなみに、上出の各構成アミノ酸を表わす記号
は世界の生化学界で共通して用いられているもの
である。 式： で示される構成アミノ酸が14個のソマトスタチン
は、羊の視床下部の抽出物より1973年に初めて分
離されたテトラデカペプタイドであつて、成長ホ
ルモン（GH）の分泌を抑制する性質を有し、医
薬として臨床的にも用いられていることは周知の
通りである。 そして、現在まで世界各国において、このソマ
トスタチンの構成アミノ酸の一部を取り去つた
り、置換したソマトスタチン類似体を合成し、新
たな生理活性を期待する試みがなされ、本発明者
らも先にソマトスタチンの作用発現の活性部位の
一部と目される第８位のＬ型トリプトフアン
（Trp⁸で表わし、以下この例に倣う）をＤ型に
し、Cys^3,14間の化学的に不安定なＳ―Ｓ結合をα
―アミノスペリン酸を置換することによつてＣ―
Ｃ結合に変えて安定化し、更にソマトスタチン作
用発現に必須ではないと考えられているAla¹お
よびGly²を取り除いた下記式で表わされる所
謂（デス―Ala¹，Gly²）―（Ｄ―Trp⁸，Ｄ―
Asu^3,14）―ソマトスタチンと称するウンデカペ
プタイドを合成して生理活性を確め： 特願昭53―133055号（米国特許第4261885号、特
公昭58―19669号）をもつて特許出願を行つた。 本発明の式化合物は上記式化合物より
Lys⁴およびAsn⁵を取り除いたものに相当するも
のである。 本発明の式化合物は、構成アミノ酸がソマト
スタチンに比しては５個、式化合物に比しては
３個少ないにもかかわらず、ソマトスタチン及び
式化合物とほぼ同等の薬効を有する。そしてこ
のように構成アミノ酸を少なくできることは、工
業的な製造が格段に安易になることを意味する。
従つて、本発明は、ソマトスタチン類似体を工業
的に有利かつ安価に提供することができる点が多
大の意義を有する。 本発明のペプタイドは一般ペプタイド合成の常
法に従つて製造されるが、次にその具体例の一を
示す： なお、以下の製造例においては簡便のため、次
の符号を用いることにする。 AcOH：酢酸 Boc ：ｔ―ブトキシカルボニル Bzl ：ベンジル Cbz（ｏ―Cl）：ｏ―クロロベンジルオキシカル
ボニル CHA ：シクロヘキシルアミン Cl―Ac：クロルアセチル DCHA：ジシクロヘキシルアミン DMF ：ジメチルホルムアミド HOBT：１―ヒドロキシベンゾトリアゾール MeOH：メチルアルコール OBzl：ベンジルエステル ONp ：ｐ―ニトロフエニルエステル OEt ：エチルエステル OSu ：Ｎ―ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ル TFA ：トリフルオロ酢酸 THF ：テトラヒドロフラン WSC ：Ｎ―エチル―Ｎ―ジメチルアミノプ
ロピル―カルボジイミド 製造例 (1) Boc―Phe―Phe―NHNH₂の製造 Boc―Phe―Phe―OEt（本発明者らにより特開
昭55―59152号公報の第30区以下に製造開示済）
10ｇをDMF―MeOH（１：３）混液100mlに溶か
して泡水ヒドラジン（80％）40mlを加えて室温で
15時間反応させる。析出する不溶物を過剰の水に
懸濁して濾取する。フイルター上で水、MeOH
およびエーテルで順次洗つた後、DMF―水の系
で再沈澱させて目的物7.8ｇ（80.7％）を得る。 融点187―188℃〔α〕²⁵D―19.9（Ｃ 1.65、
DMF）。 元素分析〔C₂₃H₃₀O₄N₄として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 64.76 7.10 13.14 測定値 64.30 7.20 12.98 (2) Boc―Phe―Phe―Ｄ―Trp―Lys［Cbz（ｏ−
Cl）］―Thr（Bzl）―Phe―Thr（Bzl）―Ser
（Bzl）―Ｄ―Asu―OBzlの製造 Boc―Ｄ―Trp―Lys［Cbz（ｏ−Cl）］―Thr
（Bzl）―Phe―Thr（Bzl）―Ser（Bzl）―Ｄ―
Asu―OBzl（本発明者らにより特開昭55―59152
号公報の第28，29区に製法開示済）3.14ｇをジメ
チルスルフイド３ml、エタンジチオール１mlを含
むTFA30mlに溶かして室温で45分間処理した後、
過剰のTFAを減圧で溜去する。残渣にエーテル
を加えて生ずる沈澱を濾取し、苛性ソーダ上デシ
ケーター中で減圧乾燥する。このものをDMF5ml
に溶かし、トリエチルアミンで中和して−10℃以
下に冷却する。一方前項(1)で製したBoc―Phe―
Phe―NHNH₂ 1.0ｇをDMF5mlに溶かし−20℃
以下に冷却しながら5.5N塩酸／ジオキサン1.9ml
を加え、イソアミルニトリツト0.42mlを加える。
−15℃で30分間反応させた後、同温度に保ちなが
らトリエチルアミンで中和する。この溶液に前述
のDMF溶液を加えて−５℃で48時間反応させる。
反応後、これに大量の水を加えて生ずる沈澱を濾
取し、冷MeOHで洗浄後、DMF／EtOH―エー
テルより再沈澱させて目的物3.24ｇ（87.6％）を
得る。 融点174―176℃。〔α〕²⁵D―20.5（Ｃ 1.2、
DMF）。 元素分析〔C₁₀₄H₁₂₀O₁₉N₁₁Cl・2H₂Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 65.74 6.59 8.11 実定値 65.45 6.66 8.50 アミノ酸分析値 Lys1.05(1)；The2.04(2)；Ser0.91(1)； Asu1.04(1)；Phe3.00(3)；Trp0.89(1)＊ ＊分光学的に測定 (3) の製造（環化工程及び） 前項(2)で製した化合物0.8ｇをエタンジチオ
ール0.1ml、ジメチルスルフイド1.5mlを含む
TFA15mlに溶かし室温で30分間処理する。過
剰の酸を減圧で溜去後、残渣を冷却下でDMF
に溶かしトリエチルアミンで中和する。このも
のに過剰の水を加えて生成する沈澱を濾取す
る。水、MeOH、エーテルで洗つた後、五酸
化リン上でデシケーター中減圧乾燥する。この
ものをDMF35mlに溶かして水溶性カルボジイ
ミド塩酸塩0.87ｇを加えて環化反応を行う。48
時間後に反応混液に大量の水を加えて析出する
沈澱を濾取する。水、冷MeOH、エーテルで
洗つた後にエタノール／エーテル―ｎ―ヘキサ
ンの系で再沈澱させて目的物0.57ｇ（76％）を
得る。 前項(2)で製した化合物0.8ｇを乾燥ピリジン
10mlに溶かしてTFA―ONp1.0ｇを加え50℃で
３時間反応させてエステル交換によりＤ―Asu
残基のω位のカルボン酸をONp化する。反応
後ピリジンを減圧下で溜去し、残渣にエーテル
を加え生ずる沈澱を濾取する。このをエーテル
で洗浄後、DMF―エーテルより再沈澱させる。
五酸化リン上デシケーター中で減圧乾燥後、こ
のものをTFA5mlに溶かして室温で45分間処理
する。過剰の酸を減圧で溜去後、残渣を
DMF10mlに溶かしてピリジン200mlに滴下しな
がら加える。50℃で24時間反応させることによ
り環化させる。減圧濃縮してピリジンを溜去し
て残渣に0.5N塩酸を加えて生成する沈澱を水
及びエーテルで洗う。このものをDMF―エー
テルから再結晶させて目的物0.60ｇ（80％）を
得る。 (4) の製造（保護基の離脱） 前項(3)で製した環化合物0.57ｇをアニソール１
mlとエタンジチオール0.1mlの存在下に無水フツ
化水素10mlに溶かして０℃で60分間処理する。過
剰のフツ化水素を溜去後残渣をエーテルで洗つて
苛性ソーダ上デシケーター中で乾燥して淡黄色粉
末を得る。このものを５％AcOHに溶かしてダウ
エツクス１×２（２×10cm、酢酸型、商標名）カ
ラムを通し、溶出液を凍結乾燥して目的物の酢酸
塩363mgを得る。このものを2NAcOHに溶かして
セフアデツクスLH―20（商標名）を充填したカ
ラム（3.5×100cm）上に注入し、2NAcOHで溶
出し、溶出液の活性画分を凍結乾燥する。更にセ
フアデツクスＧ―25（商標名）のカラム（2.5×45
cm）を用いて分配クロマトグラフイーによつて精
製する。展開溶媒はｎ―ブタノール：酢酸：水＝
４：１：５の系を用いる。溶出液の活性画分を濃
縮して有機溶媒を溜去し、残渣を凍結乾燥する。
このものを再度2NAcOHを用いてセフアデツク
スLH―20を充填したカラム（２×100cm）を通
し、溶出される活性画分を凍結乾燥することによ
り目的物24.5mgを得る。 本品の物理化学的性状 アミノ酸分析値 Lys1.00(1)；Thr1.84(2)；Ser0.89(1)； Asu0.97(1)；Phe3.00(3)；Trp0.92(1)＊ ＊分光学的に測定 〔α〕²⁰D―31.5（C0.82、１％AcOH） 濾紙電気泳動：｛PH1.9 PH4.8｝1500V，60分 薄層クロマトグラフイー： ｎ―ブタノール：AcOH：水（４：１：
５、上層）Rf 0.70 ｎ―ブタノール：AcOH：水：ピリジン
（30：６：24：20）Rf 0.85 上記の両者において単一スポツトを有する。 薬理学的性質 本発明のペプタイド化合物の、ソマトスタチン
との比較における生物学的活性の特徴は次の実験
成積により示される： 〔方法〕 体重200〜250ｇのSD系雄性ラツトをペントバ
ルビタール50mg／Kg（体重）投与の麻酔下、頚動
脈よりカテーテルを挿入し、アルギニンを３ｇ／
Kg（体重）／時間の割合で60分間注入し、同時に
本発明化合物のヒトに対する暫定的基準投与量
（以下“基礎投与量”と称す。）を4μｇ／Kg（体
重）／時間として、それぞれ基礎投与量、その10
倍量及びその100倍量を30分間持続注入した。対
照として生理的食塩水を注入し、それぞれ０、
15、30、45および60分毎に１mlずつ採血し、その
都度あらかじめ用意した赤血球の生理的食塩水洗
浄液を１mlずつ注入し実験を行つた。血糖はグル
コースオキシダーゼ法で、インスリンとグルカゴ
ンは二抗体法で、そして成長ホルモン（GH）は
ポリエチレングリコールによる一抗体法で測定し
た。また、ガストリンはチヤーコールによる一抗
体法で測定した。 〔結果〕 (1) 本発明化合物の血糖に及ぼす影響 アルギニン注入開始30分後の生理的食塩水投与
群の血糖は60分まで漸増し、148±9.8mg／dl（標
準誤差）に達した。本発明化合物注入群では基礎
投与量およびその10倍量投与のものでは抑制しな
いが、基礎投与量×100倍量投与のものでは15お
よび60分において40〜50mg／dl程度血糖を抑制し
た（図面第１図参照）。 (2) 本発明化合物のインスリン分泌に及ぼす影響 血中インスリンは対照の生理的食塩水投与群で
は最高900μU／mlまで増加したが、本発明化合物
投与群ではいずれの投与量でも有意差を認めず、
本品のインスリン分泌抑制作用はみられなかつた
（図面第１図参照）。 (3) 本発明化合物のグルカゴン分泌に及ぼす影響 血中グルカゴンは本品の基礎投与量の100倍量
投与群において15分および30分で対照群の30〜40
％抑制をみた（図面第２図参照）。第１図でみら
れた基礎投与量の100倍量投与群における血糖の
抑制効果は、グルカゴン分泌抑制の結果と考えら
れる。 (4) 本発明化合物のガストリン分泌に対する影響 対照群ではアルギニン注入により血中ガストリ
ンは漸増し、60分では106±14.5pg／mlに達した。
本発明化合物の注入では、15分および30分で基礎
投与量の10倍量および100倍量の投与群ではほぼ
完全にアルギニンによるガストリン分泌は抑制さ
れ、特に基礎投与量の100倍量投与群では注入中
止後15分後でも有意の抑制がみられ、一部持続作
用が認められた（図面第２図参照）。 (5) 本発明化合物の成長ホルモン（GH）分泌に
及ぼす影響 血中GHはアルギニン注入により、対照群で
は15分で頂値29±7.0mg／mlを示し、以後漸減
した。本発明化合物の基礎投与量の10倍量投与
群で15分、100倍量投与群で15分および30分の
GH分泌を完全に抑制した（図面第３図参照）。 (6) 各種ホルモン分泌抑制に対するソマトスタチ
ン（SS）と本発明化合物の影響の比較 アルギニン注入時の各種ホルモン分泌に対する
SSおよび本発明化合物の抑制度（％）を下表に
示す。

【表】

〔結論〕

(1) 本発明化合物は40μｇ／Kg（体重）／時間量
の持続注入によりアルギニン刺激に対するガス
トリン、GH分泌を完全に抑制した。この際グ
ルカゴン、インスリン分泌の有意の抑制はみら
れなかつた。 (2) 本発明化合物は400μｇ／Kg（体重）／時間
量の持続注入によりアルギニン刺激に対するガ
ストリン、GH分泌を完全に抑制し、またグル
カゴン抗体（IRG）分泌も47％抑制し、血糖降
下作用を示した。 (3) 本発明化合物は上記いずれの注入量によつて
も血中インスリン値に影響を与えず、この点で
インスリン分泌は抑制しない特異性の高いソマ
トスタチン類似体であると認められる。 (4) 本発明化合物は400μｇ／Kg（体重）／時間
量投与において、ガストリン分泌の抑制が投与
中止後15分後にもみられ、一部持続作用も有す
ると考えられる。 以上の点より、本発明化合物はガストリンおよ
びGHの分泌を抑制するが、他のホルモン特にイ
ンスリン分泌は抑制しない特徴を有し、ストレス
性潰瘍および出血性胃炎などによる消化管出血へ
の臨床的応用が期待されるものである。 本発明化合物の急性毒性値（LD₅₀）としては、
マウス体重１Kg当り５mgを投与して死亡例をみな
かつたので、安全性は極めて高いものと評価され
る。 本発明化合物の臨床的応用は今後の開発により
確立されるべきものであるが、一応患者の体重１
Kg当り本品４mgを１時間を要して腸管外投与する
ことを基準的治療用投与量とし、症状に応じて適
宜増減して用いることが推奨され、投与剤型とし
ては生理食塩水に単独または他剤と併合して溶か
して腸管外注入することのほか、舌下錠等の錠剤
や鼻孔内噴霧剤等として利用することができる。 製剤例１ 注射液 本発明化合物 4.0ｇ 食 塩 90ｇ 注射用蒸留水 適 量 上記溶液を無菌的に１ml容のアンプルに充填す
る。 製剤例２ 舌下錠 本発明化合物 40ｇ 結晶セルロース 320ｇ 白糖 69ｇ マンニトール 23ｇ 香 料 適 宜 上記処方により常法通り直径５mm、重量45mgの
素錠10000錠を製する。

【図面の簡単な説明】

第１図ａはアルギニン刺激（３ｇ／Kg（体
重）／時間投与）ラツトにおける本発明化合物注
入による血中グルコースの消長図、第１図ｂは同
血中インスリンの消長図。縦軸はそれぞれグルコ
ース量（mg／dl）およびインスリン量（μU／ml）
を表わし、横軸は共に時間（分）を表わす。第２
図ａは前同ラツトにおける本発明化合物注入によ
る血中グルカゴン量、第２図ｂは同ガストリン量
の消長図。縦軸はそれぞれグルカゴン量（pg／
ml）、ガストリン量（pg／ml）、横軸は時間（分）
を表わす。第３図は前同ラツトにおける本発明化
合物注入による血中成長ホルモン（GH）の消長
図。縦軸はGH量（mg／ml）、横軸は時間（分）
を表わす。全図に共通して×−−−×は基礎投与
量（4μｇ／Kg（体重）／時間）投与、〇………
〇はその10倍量投与、△―・―・―△はその100
倍量投与：・―――・は対照としての生理食塩水
投与を示す。 図中、Ｐは統計学的手枝による危険率を示し、
＊はＰ＜0.05、＊＊はＰ＜0.01を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記式で表わされるペプタイド化合物：