JPH0238199B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ エンチーム含有試料を、該エンチームと相互
作用して被監視化合物を形成するエンチーム基質
と共にインキユベートすることを含むエンチー
ム・アツセイ法において、エンチーム基質が式
SX―Ａ―Ｙ―NO2（式中、Ｓは基質残基、Ａは単
環式芳香族核を示し、Ｘは助色団基HXの残基を
示し、Ｙはα―位が置換されていることもあるエ
チレン基を示す）で表わされ、エンチームが該エ
ンチーム基質に作用して被監視化合物HX―Ａ―
Ｙ―NO2（式中、Ｘ、ＡおよびＹは前記と同意
義）を形成するエンチームであり、該化合物が直
接またはアルカリ処理によつて肉眼で識別し得る
可視信号を発生することができる化合物であるこ
とを特徴とするエンチーム・アツセイ法。 ２ エンチームと基質との相互作用で生じる化合
物が式： ｛式中、Ｘは前記と同意義であり、R1，R2，
R3およびR4は各々独立にＨ、OMe、NO2、CH3、
CH＝CR′R″［式中、R'およびR″は各々独立にＨ、
OMe、NO2、CH3、CO2Hまたは不飽和共役基
CH＝CR′R″（式中、R′およびR″は各々独立にＨ、
OMe、NO2、CH3もしくはCO2Hを表わす）を表
わす］またはCO2Hを表わす｝で示される化合物
である第１項記載の方法。 ３ エンチーム含有試料を該エンチームと相互作
用して被監視化合物を形成するエンチーム基質と
共にインキユベートすることを含むエンチームア
ツセイ法に用いるエンチーム基質であつて、該基
質が次式： ［式中、ＲはＨもしくはOMeを示し、S′は CO―CH2―CH3、 CO―（CH2）14―CH3、 PO―（OM）2、 もしくはグリコシル残基を示す（式中、Ｍは
NaまたはＫを示す）］ で表わされるエンチーム基質。 明細書 本発明はエンチーム アツセイ、および特にエ
ンチームの検出ならびに測定用試薬に関する。 生理試料、例えば患者（人）の尿や血清試料中
に或る種のエンチームが存在するか否かはたとえ
ば患者（人）の臓器機能不全に関係する生体
（organism）中の病気または欠陥（deficiencies）
の有用な指標である。例えば「腎移植（kidney
transplant）」患者の尿中に排泄されるエンチー
ム Ｎ―アセチル―β―Ｄ―グルコサミニダーゼ
（NAG）のレベルの増加は移植された腎臓の切迫
した拒絶反応の初期徴候であり、また腎および他
の疾患の一般的な指標でもある。NAGに対する
現今における一般的な臨床アツセイ（clinical
assay）は尿素検体とエンチームの４―メチル―
ウンベリフエリル・グリコシド・基質とのインキ
ユベーシヨンを含み、両者は相互に作用して相当
するウンベリフエロンを解離し、次いでこのウン
ベリフエロンを螢光的に監視する。さらに、ニト
ロフエニル・グリコシド基質、ｐ―ニトロフエニ
ル―２―アセトアミド―２―デオキシ―β―Ｄ―
グルコピラノシドを用いて、エンチームと相互に
作用させ、ｐ―ニトロフエノールを解離させてこ
れを比色的に監視してもよい。しかしながら、こ
れらのアツセイはいずれも複雑な分光光学的装置
の使用を要し、したがつて設備の整つた研究施設
への出入の容易なときの使用にのみ適している。 ここにエンチーム アツセイ試薬を発明した。
この試薬は、場合により複雑な監視装置を使用す
ることなく用いることができる。本発明によれ
ば、エンチーム含有試料を、該エンチームと相互
作用して被監視化合物を形成させるエンチーム基
質と共にインキユベートすることを含むエンチー
ム アツセイ法において、該化合物が式HX―Ａ
―Ｙ―NO2（式中、Ａは単環式芳香族核を示し、
Ｘは助色団基HXの残基を示し、Ｙはα―位が置
換されていることもあるエチレン基を示す）で表
わされる化合物であり、該化合物が直接またはア
ルカリ処理によつて肉眼で識別し得る可視信号を
発生することができることを特徴とするエンチー
ム アツセイ法が提供される。 該試薬は典型的には、基質残基Ｓを含むエンチ
ーム基質部分および式HX―Ａ―Ｙで表わされる
化合物を形成する部分を有する。通常、該試薬は
式Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2で表わされる化合物または
その簡単な前駆体を基質部分を組合せて含有し、
エンチーム基質試薬との相互作用において式HX
―Ａ―Ｙ―NO2（式中、Ｘ、ＡおよびＹは前記と
同意義である）で表わされる化合物を解離する。
一つの態様においては、試薬のエンチーム基質部
分と別の部分は都合のよいことには助色団基の残
基Ｘを介して結合し、該物質は一般式Ｓ―Ｘ―Ａ
―Ｙ―NO2（式中、Ｓは該物質のエンチーム基質
部分を含み、Ｘ、ＡおよびＹは前記と同意義であ
る）で表わされる。この様な試薬はエンチームと
の相互作用において該化合物を解離する。 本発明には、式S′―Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2（式中、
Ａ、ＸおよびＹは前記と同意義であり、S′はプロ
ピオニル、パルミトイル、フオスフエート、ジフ
オスフエート、スルフエートまたはグリコシル残
基を示す）で表わされる化合物および前記アツセ
イ法におけるエンチーム基質試薬としてのその用
途も含まれる。 本発明による前記の方法は、エンチーム基質の
残基部分をアツセイが所望される所定のエンチー
ムに応じて変化させることにより一般のエンチー
ム アツセイに広く適用できる。しかしながら典
型的には本発明でアツセイできるエンチームは異
化作用エンチーム（catabolic enzyme）であり、
これらのエンチームは細胞組織中の巨大分子の破
壊に重大な役割を果たす。例えばアツセイし得る
エンチームはカルボキシレート・エステラーゼお
よびリパーゼ、酸および塩基性ホスフアターゼ、
ホスフオジエステラーゼおよびスルフアターゼを
含み、相当する試薬は適当なカルボキシレート、
ホスフエート、ジホスフエートおよびサルフエー
ト・エステル・エンチーム基質類を含んでいても
よい。また特に、本発明はエンチーム基質の残基
部分Ｓが特徴的にαまたはβ―グルコピラノシ
ル、―ガラクトピラノシルまたは―マンノピラノ
シル置換基のごとき相当するグリコシド炭水化物
置換基であるグリコシダーゼのアツセイに適用で
きる。例えば本発明は、Ｓが２―アセトアミド―
２―デオキシ―Ｂ―Ｄ―グルコピラノシル残基で
あるＮ―アセチル―ｐ―Ｄ―グルコサミニダーゼ
（NAG）のアツセイへの適用が特に適しているこ
とがわかつた。 本発明方法に使用するエンチーム基質の多くは
自体新規であり、これらは本発明の範囲内に含ま
れることが認められるであろう。従つて別の態様
では、本発明は本発明方法に使用するエンチーム
アツセイ試薬を含んでおり、該試薬は式S′―Ｘ
―Ａ―Ｙ―NO2（式中、Ｘ、ＡおよびＹは前記と
同意義であり、S′はプロピオニル、パルミトイ
ル、フオスフエート、ジフオスフエート、スルフ
エートまたはグリコシル残基を表わす）で示され
るエンチーム基質を含有する。 本発明は一般のエンチームの存在に対するアツ
セイおよびその濃度レベルの監視、例えば相当す
る欠陥または病気の診断に用いてもよい。例えば
尿のNAG含量を腎疾患の早期発見に対してアツ
セイしてもよく、また特殊な場合には腎移植患者
中の腎臓拒否反応の早期指標として用いてもよ
い。さらに本発明は例えばある遺伝的な病気
（genetic disorder）の徴候であると思われるエ
ンチームの欠如を測定するために使用してもよ
い。また一般に、本発明の試薬と方法は生物化学
的および医学的な研究に使用するための便利な手
段を提供することもできる。 本発明に使用する試薬は肉眼で容易に識別でき
る色変化を発生し得る。この点に関し、発生した
色は典型的かつ実質的に試料の背景の色彩と異な
る。例えばNAGのアツセイ用試薬のごとき尿の
試料と共に使用するための本発明試薬は尿の背景
の色彩と実質的に異なつた色を発生し得る物質を
典型的に解離する。好ましくは本発明試薬は識別
可能な色、好ましくは赤または青を発色し得る化
合物を解離する。この様な好適な解離化合物は通
常アルカリ条件下で約450から約700までの範囲、
好ましくは約500から約600までの範囲の最大吸収
（λmax）を、特に高い吸光係数（Ｅ）、例えば約
20000以上と共に有している。 一般式S′―Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2で表わされる好ま
しい化合物の内には多くの典型的な着色および染
色化合物が存在することは予想されるであろう
し、また容易に識別し得る可視信号を生ずるに適
した化合物は当該技術分野に精通した技術者にと
つて明らかであろう。しかしながら、好ましくは
基Ａは単環芳香族核、特にベンゼン核を有する。 またグループＹはＡとNO2置換基間に共鳴電
子を移動することができる適宜の不飽和基を有し
ていてもよく、また異項原子を含有する系およ
び／または環化された系を含んでいてもよい。こ
の様に、例えば基Ａがナフチル核の一つの環であ
るベンゼン環を含んでいてもよく該ナフチル核の
他の環が基Ｙを供給してもよい。また基Ｙはアセ
チレン系不飽和基を表わしていてもよい。しかし
ながらより好ましくは基Ｙは芳香族核Ａに関して
共役するエチレン不飽和基、例えばエテニル、ブ
タジエニルまたはヘキサトリエニル置換基を表わ
す。この様に好ましい態様において本発明に使用
するエンチームと相互に作用して式［］： ［式中、S′およびＸは前記と同意義、ｎ＝１、
２または３およびR1，R2，R3およびR4＝Ｈ、
OMe、NO2、CH3、―CH＝CR′R″（式中、R′お
よびR″はR1等と類似の置換基、好ましくはＨま
たはNO2を表わす）またはCO2H］で示される化
合物を与えることができる。 助色団Ｘは適宜の助色団、例えばアミノ基
（NH2）または好ましくは水酸基（OH）であつ
てもよい。 特に好ましい態様において、Ｘはオキシ基（―
Ｏ―）であり、Ａはスチリル基である。本発明に
使用するのに特に好ましい基質はエンチームとの
相互作用において４―ヒドロキシ―ω―ニトロス
チレン化合物、即ち下記の式［］： ［式中、R1，R2，R3およびR4は前記と同意
義］を形成するエンチーム基質を含有するもので
ある。式［］で表わされる化合物は一般に非常
に望ましい顕著な色特性を示すので、該化合物か
ら誘導されるエンチーム基質試薬は本発明に使用
するのに特に好適なものである。式［］の化合
物はｐ―ニトロフエノールの弱い橙黄色に比し、
アルカリ条件において典型的な強い赤色を示し、
かつｐ―ニトロフエノールの最大吸収（λmax：
absorbance maxima：アルカリ条件下で〜400）
より、予想外に著しく高い最大吸収を有すること
が見出された。現在これらの増強された色特性は
下記のごとき酸化工程から得られるラジカル・イ
オンの形成によるものと信じられている。 電子供与性置換基、例えばヒドロキシル置換基
に隣接するアルコキシ基、例えばメトキシの存在
はこのラジカル・イオンの形成を安定化させるよ
うに思われる。このことは特に好ましい試薬の基
礎となる式［］および［］： で示される３―メトキシおよび特に３，５―ジメ
トキシ同族体の色特性によつて確認される。 モノ―メトキシ化合物［］とジ―メトキシ化
合物［］はPH8.8の緩衝液中でそれぞれ506と
530の最大吸収（λmax）および吸収系数（ε）
24600と22300を有し、この条件で満足すべき緋―
赤色の呈色を示す。 本発明による基質としては次の式［Ａ］〜
［Ｅ］で表わされるものが例示される。この場合、
置換基としては式を簡単にするために、４―オキ
シ―ω―ニトロスチリル基を有する基質のみを示
す。従つて該置換基はＸ―Ａ―Ｙ―NO2基で表
わされる他のいずれの置換基によつて書き換えて
もよい。 これらの試薬はそれぞれ［Ａ］エステラーゼま
たはリパーゼ、［Ｂ］酸または塩基性ホスフアタ
ーゼ、［Ｃ］ホスホジエステラーゼ、［Ｄ］アリー
ルスルフアターゼおよび［Ｅ］グリコシダーゼの
アツセイに適した試薬である。式［Ｅ］中、Rz
はグリコシル基、例えばα―またはβ―グルコピ
ラノシル、ガラクトピラノシルまたはマンノピラ
ノシルを示す。 本発明によれば、好ましいニトロスチリル置換
試薬はｐ―ヒドロキシベンズアルデヒド化合物、
例えばｐ―ヒドロキシベンズアルデヒド自体また
はサリチルアルデヒドを出発原料として調製して
もよい。例えば、該ｐ―ヒドロキシベンズアルデ
ヒド化合物を、基質Ｓの残基を与える適当なエン
チーム基質と反応させて得られる対応する基質―
オキシベンズアルデヒド化合物アダクトをニトロ
メチル化処理に付すことによつて調製される。ニ
トロメチル化処理は温和なアルカリ性条件下でお
こなうのが好ましい。本発明に使用する他の試薬
は相当する類似の反応経路によつて調製してもよ
い。 アツセイされてよい試料は流体が便利であり、
例えば血清または尿等の生理流体を含む試料を含
む。他の適当な試料、例えば遺伝的な疾患の研究
に一般に使用されるごとき細胞均等質（cell
homogen―tates）から誘導される試料を含むも
のをアツセイしてもよい。 試薬と試料は一緒にインキユベートする；例え
ば試料と試薬含有溶液を混合し、適当な条件で適
当な時間、相互に作用させる。インキユベーシヨ
ン中採用される温度は好ましくは約30℃以上、約
30℃から約40℃の間であり、この様な条件におけ
るインキユベーシヨン時間は約30分まで、例えば
約10分〜15分から、約30分までで通常十分であ
る。溶液状での試薬の使用に代えて、試薬は例え
ばセルロース粒子、例えば微細晶セルロースのご
とき適当な固形層物質に吸収させた組合せにおい
て使用してよく、これによつて試薬の不溶性また
は貧溶解性から生ずる問題を有利に克服できる。
同時に試薬は多孔性支持体、例えば紙と組合わせ
て、便利な試験紙たは簡単な浸漬試験用デイツ
プ・ステイツクを供給してもよい。この様な適宜
の不活性固形物質または多孔質支持体と組合せた
本発明試薬含有生成物は本発明の範囲に包含され
るものである。 インキユベーシヨンにおいて、該試薬は二次処
理なしで試料中の酵素の存在を示す可視信号、例
えば色を生ずることのできる化合物を解離または
より一般的には形成する。しかしながらしばしば
この化合物は可視信号を発生するための別の処理
を必要としてもよく、この様な処理は典型的には
該化合物生来の可視信号を発現させるための活性
化を含む。この別処理は例えば従来のエンチーム
アツセイ試薬で採用されているジアゾ・カツプ
リング工程のごとき合成または製造化学の工程を
含まない。一般に、この処理は電荷の非局在化を
可能にする塩の形成に導くことのできるアルカリ
処理例えば着色可視信号を有利に発現させる好ま
しい共役不飽和発色団物質のアルカリ処理を含
む。アルカリ処理は解離化合物含有溶液へのアル
カリ添加を含んでいてよく、また好ましくは該化
合物含有溶液を固形層試薬、例えば吸収剤と接触
せしめ、同時に該化合物にアルカリ性の環境を提
供してもよい。例えば該化合物を含有する溶液
を、好ましくは中間色、例えば白色または淡色
で、遊離塩基、例えば（OH-）型にあるアニオ
ン交換物質（anionic exchange material）と接
触させる。例えば、アニオン交換物質はDEAEセ
ルロースまたは類似の淡色アニオン交換物質を遊
離塩基の形で含んでいてもよい。吸収性のアニオ
ン交換物質の使用は特に有利であり、監視を容易
にするために解離された物質を狭いバンド
（band）中に吸収および濃縮する。 したがつて、好ましい態様では本発明方法はエ
ンチーム含有試料を固形層物質、例えば不活性吸
収剤または多孔性支持体と組合せた試薬と共にイ
ンキユベートし、化合物Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2を形
成させ、該化合物含有溶液をこれにアルカリ性の
環境を付与する固形層試薬と接触せしめ、これに
よつて肉眼で容易に識別できる色変化または他の
可視信号を生ぜしめる方法を含む。 好ましい態様の方法を実施するための装置は、
通常は２つの隔室を備えた透過流型装置であり、
この隔室の一つは固形層物質、例えば微細晶セル
ロースと組合わせた試薬を含有するインキユベー
シヨン室であり、他の一つは、該物質例えば、
DEAEセルロースまたは類似物にアルカリ性の環
境を提供する固形層試薬含有可視化室である。こ
の隔室は典型的には例えば適当な連結通路によつ
て相互に連結でき、解離化合物含有液体をインキ
ユベーシヨン室から可視化室に流すことができ
る。しかしながら二つの隔室は、好ましくは相互
に分離できるようにし、例えば必要とされるイン
キユベーシヨン時間、試料をインキユベーシヨン
室に保持させる。二つの隔室間の通路には、必要
なインキユベーシヨン時間経過後、適宜開放また
は取り除いて液体を可視化室、例えば好ましい
DEAEセルロース吸収剤を通過させることのでき
る適当な栓または障壁を設けてもよい。 例えば透過流型装置は相間表面でピボツトによ
つて接触する二つの隔室からなつていてもよく、
この両表面はピボツトから所定の半径の位置に出
口を備え、隔室の相互回転によつて相互の出口を
一致させて隔室間に通路を提供する。また別に、
隔室間の通路は所望により例えばらせんねじ等の
作用により二つの隔室を一緒にすることによつて
破れる薄い障壁で塞いでもよい。 使用される試薬、例えば不活性固形層物質と組
合せて存在する試薬の濃度は所望のごとく、例え
ば監視に必要とされるエンチームの限界濃度と一
致するように変えてもよい。試薬濃度の増加は一
般にエンチームのより低い限界濃度の検出を可能
にする。 さらに解離物質を見えるようにするための固形
層試薬、例えばDEAEセルロースの使用は、狭い
吸収帯中に生ずる色濃度の由に非常に少量の解離
物質の検出を可能にする。この点で２―メトキシ
―４―（β―ニトロエテニル）フエノールの存在
をDEAEセルロースとこの溶液を接触させること
により１〜２×10-6モルの濃度で検出できること
がわかつた。同様に、例えばDEAEセルロース可
視化と組合わせた不活性セルロース固形層上での
適当なNAG検出グリコシド（Ｅ）の３％使用は、
37℃、20分インキユベーシヨン後、約40〜
50nmol／ml尿中NAGの限界濃度を検出し得、一
方、同じ系におけるグリコシド８％含有セルロー
スの使用は限界濃度約20〜30nmol／ml．を与え
ることがわかつた。 両方の系は通常の尿によつて与えられるものと
容易に区別される異常尿に対する巾の広い濃厚な
帯を与える。したがつて、基質の濃度効果および
可視化の容易性に関して、本発明の方法は患者自
身が自宅で適当に調製された透過流型装置を用い
ることによつてうまく行うことができ、また最小
の分析技術しか必要とされないことが容易に理解
されるであろう。例えば患者は単に所要量の新鮮
な尿をインキユベーシヨン室に加え、例えばその
室の側部に示された所要レベルまで加え、標準イ
ンキユベーシヨン時間後（これは通常周囲温度に
よつてきまる）、インキユベーシヨン室と可視化
室を連結してインキユベートされた尿を固形層可
視化試薬中に流す。 解離物質によつて生ずる可視信号、例えば色の
変化は複雑な監視装置に頼る従来使用されていた
方法と比べて、試料中のエンチームの存在を簡単
かつ速く検出する手段を提供する。同様に生ずる
可視信号、例えば色の強度は試料中に存在するエ
ンチームの濃度の大まかな可視指標として便宜的
に使用してもよい。しかしながら、もしより正確
な測定が必要ならば、本発明試薬を分光光学的
に、例えば常套の方法で監視してもよい。例えば
発生する色は通常適当な緩衝剤を用いてPHを8.5
〜9.5に調整した後、比色計を用いて測定しても
よく、またこの様な方法においても、本試薬は従
来の相当する試薬、例えばｐ―ニトロフエノリツ
クおよびｏ―ニトロフエノリツク系物質よりより
適当である。 本発明をさらに本発明エンチーム アツセイ試
薬の調製およびその成分および本発明方法におけ
るその使用に関連する以下の実施例および記載に
おいて実例をあげて記載し、かつ添付図面をもつ
て説明する。 第１図は本発明に使用する透過流型装置の一形
式を表わし、第２図は本発明に使用する透過流型
装置の別の形式を示す。 実施例 １ 対応するグリコシダーゼを検出および測定する
ニトロスチリルグリコシドの製造 ヒドロキシベンズアルデヒドグリコシドの製
造 本発明によるニトロスチリルグリコシドエンチ
ーム基質の製造における最初の段階として適当な
ヒドロキシベンズアルデヒドグリコシドを製造す
る。 適当なグリコピラノシルハライド（70ミリモ
ル）のアセトン（200ml）溶液を適当なｐ―ヒド
ロキシベンズアルデヒド化合物（100ミリモル）
のＭ―水酸化ナトリウム溶液で処理し、得られる
混合物を約16時間撹拌しながら室温に保つた。反
応混合物を次いで生成物が分離するまで水で希釈
した。結晶グリコシド生成物を直接濾去し、非結
晶生成物は通常の方法でクロロホルム抽出によつ
て単離した。 結晶生成物を濾去した後、更に生成物をクロロ
ホルムまたはジクロロメタンで抽出することによ
り母液から回収してよい。 ヒドロキシベンズアルデヒド・グリコシド類の
製造中に得られた結果を以下に示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―α―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―３―メトキシベンズア
ルデヒドが２―アセトアミド―３，４，６―ト
リ―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―α―Ｄ―グ
ルコピラノシルクロリドから55％の収率で得ら
れ、融点220〜221℃（エタノール）、［α］D―
13.5゜（ｃ １、DMSO）であつた。 (b) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）ベンズアルデヒドが同様
に47％の収率で得られ、［α］D―19゜（ｃ １、
CHCl3）であつた。 (c) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―３，５―ジメトキシベ
ンズアルデヒドが同様に15％の収率で得られ、
融点239〜240℃（メタノール）、［α］D＋3.8゜（ｃ
1.2、DMSO）であつた。 (d) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―
メトキシベンズアルデヒドが２，３，４，６―
テトラ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―グルコピラノ
シルブロミドから62％の収率で得られ、融点
135〜136℃（エタノール）、［α］d―24.2゜（ｃ
1.1、CHCl3）であつた。 (e) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ）―３
―メトキシベンズアルデヒドを２，３，４，６
―テトラ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―ガラクトピ
ラノシルブロミドからまず結晶化するシロツプ
として得（47％）、エタノールエーテル―軽油
（light petroleum）からかろうじて再結晶し
た。融点148〜149℃、［α］D―4.4゜（ｃ 1.1、
CHCl3）。 (f) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ）―３―
メトキシベンズアルデヒドを２，３，４，６―
テトラ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―マンノピラノ
シルブロミド（15）から14％の収率でシロツプ
として得た。［α］D＋15.9゜（ｃ 1.4、CHCl3）。 ヒドロキシ―ベンズアルデヒドグリコシドの
Ｏ―脱アセチル化 ニトロスチリルエンチーム基質の製造の次の段
階では、あるヒドロキシ―ベンズアルデヒドグリ
コシドをメタノール性ナトリウムメトキシドで処
理してＯ―脱アセチル化する。アセチル化グリコ
シド（15ミリモル）のメタノール（50〜500ml）
の溶液をＭ―メタノール性ナトリウムメトキシド
（0.5〜２ml）で処理し、溶液を室温で20〜30分
間、あるいはまた薄層クロマトグラフイー測定で
示される反応の完結まで放置した。この溶液を次
いでシリカゲルのパツドを通してナトリウムイオ
ンを除去し、次いで蒸発乾固した。 種々のグリコシドで得た結果を下記に示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―２―デオキシ―β
―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―メトキ
シベンズアルデヒドを反応混合物から90％の収
率で直接結晶化させ、融点199〜200℃（分解）、
［α］D―20゜（ｃ １、DMSO）であつた。 (b) ４―（β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―
３―メトキシベンズアルデヒドを白色粉末とし
て85％の収率で得た。融点188〜190℃、［α］D
＋2.2゜（ｃ 0.7、DMSO）。 (c) ４―（α―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ）
―３―メトキシベンズアルデヒドを白色粉末と
し92％の収率で得た。融点204〜206℃、［α］D
＋4.8゜（ｃ 1.1、DMSO）。 (d) ４―（α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ）―
３―メトキシベンズアルデヒドを64％の収率で
結晶として得た。融点196〜197℃（エタノー
ル）、［α］D＋119.6゜（ｃ １、DMSO）。 ヒドロキシ―ベンズアルデヒドグリコシドの
ニトロメチル化 上で製造したアセチル化および脱アセチル化ヒ
ドロキシ―ベンズアルデヒド・グリコシドの両者
を次いでニチロメチル化して対応するニトロスチ
リル・グリコシドにした。 ニトロメタン（16ml）、アンモニウムアセテー
ト（８ｇ）および酢酸（４ml）を適当なグリコシ
ド（20ミリモル）のエタノール（150〜200ml）撹
拌溶液または懸濁液に加え、混合物を室温で約20
から250時間まで、普通20時間撹拌した。ほとん
どの場合、生成物は反応混合物から分離し、反応
混合物から集めたが、場合により、生成物を水を
加えて沈澱させ、続いて濾過またはクロロホルム
または他の適当な溶媒で抽出した。 あるいはまた、上記の反応混合物を15〜45分還
流させ、同様な収率で、しばしば純度の向上した
生成物を得た。 種々のニトロスチリルグリコシドの製造で得た
結果を以下に示し、用いた方法が方法(A)、即ち室
温方法かまたは方法(B)、即ち還流方法かを示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―３―メトキシ―ω―ニ
トロスチレンを方法(A)で88％、方法(B)で76％で
黄色結晶固体として製造した。融点239〜240
℃、［α］D―6.9゜（ｃ 1.15、DMSO）。 (b) ４―（２―アセトアミド―２―デオキシ―β
―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―メトキ
シ―ω―ニトロスチレンを方法(B)で87％の収率
で淡黄色の固体として製造した。融点200〜
201.5℃（分解）、［α］D―1.4゜（ｃ 0.9、
DMSO）。 (c) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―ω―ニトロスチレンを
方法(B)で非常に淡い黄色の固体として製造し
た。融点258〜259℃、［α］D―14.3゜（ｃ 1.1、
CHCl3）。 (d) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)で96％
の収率でクリーム色の黄色固体として製造し
た。融点192〜194℃、［α］D―12.4゜（ｃ 1.2、
CHCl3）。 (e) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ）―３
―メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)で反
応混合物からジクロロメタンで抽出し、溶離剤
としてエーテル―軽油を用いてシリカゲルカラ
ム上でクロマトグラフイーした後25％の収率で
製造した。融点148〜149℃、［α］D―4.4゜（ｃ
1.1、CHCl3）。 (f) ４―β―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ―３
―メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)で69
％の収率で淡黄色の結晶として製造した。融点
212〜214℃、［α］D＋1.3゜（ｃ 1.5、DMSO）。 (g) ４―（２，３，４，５―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ）―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)によつ
て淡黄色無定形固体として得た。融点131〜132
℃、［α］D―15.7゜（ｃ 0.8、CHCl3）。 ニトロスチリルグリコシドのＯ―脱アセチル
化上で製造したＯ―アセチル化ニトロスチリル
グリコシドを最後に脱アセチル化する。 適当なＯ―アセチル化ニトロスチリルグリコシ
ド（２ミリモル）のメタノール（150ml）撹拌溶
液または懸濁液をＭ―メタノール性ナトリウムメ
トキシド（2.5ml）と処理する。この混合物を室
温で10〜20分間撹拌し、次いでシリカゲルのヴア
ツド（wad）を通してナトリウムイオンを除去す
る。シリカゲルを十分にメタノールで洗浄し、濾
液および洗液を合わせ蒸発乾固する。得られる固
体を次いで少量のエタノールを用いて濾去する。
製造した種々のニトロスチリルグリコシドに対し
て得られた結果を以下に示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―２―デオキシ―β
―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―メトキ
シ―ω―ニトロスチレンを定量的収率で淡黄色
無定形粉末として得、これはいくらかの分解を
生ずることなく満足に再結晶することはできな
かつた。これは融点198〜199℃（分解）、［α］D
―7.8゜（ｃ 1.4、DMSO）であつた。 (b) ４―β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレンを収率77％で黄
色結晶として製造した。融点140〜141℃、［α］
D―8.7゜（ｃ １、DMSO）。 (c) ４―α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレン（23）を無定形
の吸湿性（hydroscopic）の有機固体として得
た。［α］D＋80.1゜（ｃ 0.8、DMSO）。 上で製造したグリコシドは対応するグリコシダ
ーゼの検出および測定に使用するのに適してい
る。これらのグリコシドを含有する反応試剤は本
発明の範囲内であり、本発明方法を用いてよい。
典型的には、グリコシドは適当なエンチームとの
相互作用で、対応するヒドロキシ―ニトロスチリ
ル化合物を離し、容易に識別できる可視信号、通
常赤色の呈色を与える。 不活性な固体相の物質を本発明に従つて上で製
造したグリコシドまたは他のエンチーム基質で含
浸させてよい。たとえば、微晶質のセルロース、
例えばアビセル（Avicell）（登録商標）の必要量
を、上記のように製造したシリカゲルからの溶離
物（eluate）に加え、ロータリーエバポレーター
で蒸発乾固し、得られる固体を乳鉢および乳棒で
微細な粉末に粉砕する。 実施例 ２ 対応するエステラーゼの検出および測定用４―
ヒドロキシ―ω―ニトロスチレンのエステル誘
導体の製造 対応するエステラーゼの検出および測定用本発
明試薬を用いる４―ヒドロキシ―ω―ニトロスチ
レンのエステル誘導体類を製造した。 (1) ４―アセトキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン ヴアニリルアセテート（19.4ｇ、100ミリモル）
を、実施例の部の方法Ａのようにニトロメタ
ン、アンモニウムアセテートおよび酢酸と２〜３
日間反応させた。赤色の反応混合物を次いで水で
希釈し、得られる油層をクロロホルムで抽出し
た。クロロホルム抽出液を乾燥し（MgSO4）、蒸
発乾固し、得られる固体をクロロホルム―エタノ
ールから再結晶してアセテートを得た。融点158
〜162.2℃（20ｇ、17％）。あるいはまた３―メト
キシ―ω―ニトロスチリルアセテートを対応する
ヒドロキシ―ニトロスチレンから製造した。４―
ヒドロキシー３―メトキシ―ω―ニトロスチレン
（15ｇ、0.77ミリモル）を無水酢酸（15ml）に加
え、混合物を1.5時間還流加熱した。混合物を次
いで氷水中に注ぎ、沈澱した固体を濾去し、クロ
ロホルム―エタノールから再結晶しアセテートを
得た（1.7ｇ、93％）。融点163〜165℃で上で製造
したものと一致する。 上記ω―ニトロスチリルアセテートはアセテー
トエステラーゼの検出および測定用本発明試薬お
よび方法に使用するのに適しており、エンチーム
との相互作用で４―ヒドロキシ―３―メトキシ―
ω―ニトロスチレンの解離が起こり、アルカリ性
の条件下、強い赤色呈色を示す。 (2) ４―プロピオニル―３―メトキシ―ω―ニト
ロスチレン ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロス
チレン（3.9ｇ、20ミリモル）を乾燥ピリジン
（15ml）に溶解し、プロピオニルクロリド（2.8
ｇ、約30ミリモル）を加えた。反応混合物は温か
くなり、暗赤色の沈澱が生成した。約５分後、混
合物を氷水中に注ぎ、得られる黄色の沈澱を濾去
し、十分にエタノールで洗浄し、クロロホルム―
エタノールから再結晶しプロピオネートを得た
（4.8ｇ、95％）。融点01〜104.5℃。このプロピオ
ネートは、プロピオネートエステラーゼの検出の
使用に適しており、同様にエンチームとの相互作
用で４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレンの形成が起こる。 (3) ４―（β―ニトロエテニル）―２―メトキシ
フエニルパルミテート ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロス
チレン（5.2ｇ、25ミリモル）をピリジン（20ml）
に溶解し、パルミトイルクロリド（８ｇ、29ミリ
モル）を加える。黄色の固体が直ちに生成し、反
応混合物を次いで約５分間還流加熱し、反応混合
物を氷水中に注ぎ、得られる黄色の固体を濾去す
る。生成物を希（10-4）水酸化ナトリウムと撹拌
して遊離フエノールを除去し、濾去し、水および
エタノールで十分に洗浄し、次いでクロロホルム
―エタノールから再結晶した。融点96―99℃
（9.1ｇ、84％）。この生成物はエンチームとの相
互作用で４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニ
トロスチレンを離し、パルミテートエステラーゼ
の検出および測定に用いるのに適している。 (4) ４―（β―ニトロエテニル）―フエニルパル
ミテート パルミトイルクロリド（3.6ｇ）を乾燥ピリジ
ン（20ml）に加えると、直ちに沈澱した。この混
合物に４―ヒドロキシ―ω―ニトロスチレン
（1.65ｇ、10ミリモル）を加え、混合物を１〜２
分間加熱還流させる。混合物を次いで氷水中に注
ぎ、黄色の無定形の沈澱を濾去する。沈澱のクロ
ロホルムおよびDMSO混合溶液はエステルの種
結晶を与え、このバルク（bulk）を煮沸メチレ
ンクロリドに溶解し、エタノールを加えることに
より結晶化した。すべてのメチレンクロリドを蒸
発させると、エタノール性溶液に結晶の種を入
れ、パルミテートを淡黄かつ色の結晶として得
た。融点83〜84℃（２ｇ、50％）。同様にこの生
成物は、エンチームとの相互作用でやはり４―ヒ
ドロキシ―ω―ニトロスチレンを離し、パルミテ
ートエステラーゼの検出および測定に適してい
る。 (5) ４―（β―ニトロエテニル）―２―メトキシ
―フエニルホスフエート（モノナトリウム塩モ
ノ水和物として） ホスフオリルクロリド（6.2ｇ、40ミリモル）
のピリジン（40ml）中の激しく攪拌した氷冷溶液
に、４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン（7.8ｇ、40ミリモル）のピリジン（20
ml）溶液を45分で滴下した。反応混合物を次いで
水性ピリジン（10％の水を含有する50ml）を滴下
して分解すると、いくらかの固体が分離する。２
Ｍ―水酸化ナトリウム（20ml、40ミリモル）を滴
下すると最初透明な溶液となり、続いて無定形の
モノナトリウム塩が、水加物として分解した
（7.1ｇ、59％）。融点＞250℃。この塩は水に低溶
解度で、ホスフオターゼの検出および測定に適し
ている。 (6) ４―（β―ニトロエテニル）―２―メトキシ
フエニルホスフエート（そのジナトリウム塩と
して） 上記の反応(5)を、分解した反応混合物を苛性ソ
ーダ（６ｇ）の濃水溶液に注ぐ以外は繰返す。生
成物は最初油として分離し、無定形の固体に固化
した（11ｇ、86％）融点＞250℃。これはモノナ
トリウム塩よりも更に水に可溶性であり、沸騰水
に容易に溶解し、多少分解し、冷却すると再沈澱
し淡黄色の固体を与える。ジナトリウム塩の２ミ
リモル溶液は容易に製造できた。 実施例 ３ ヒドロキシ―ω―ニトロスチレン類を製造し、
一般式HX―Ａ―Ｙ―NO2で表わされる化合物の
例であるこれらの化合物の色の性質を測定および
比較する。 用いた一般の製造方法は次の通りである。対応
するヒドロキシベンズアルデヒド（40ミリモル）
をエタノール（200ml）およびアンモニウムアセ
テート（12ｇ）に溶解し、ニトロメタン（32ml）
および酢酸を加えた。反応混合物を室温で一夜撹
拌するか、15〜60分間加熱還流させた。ある場合
には、ω―ニトロスチレンを冷反応混合物から結
晶させるか、水を冷反応混合物に加えて結晶させ
た。結晶性生成物がこれらの方法で単離されない
場合は、生成物をエーテルで抽出し、水で十分洗
浄し、乾燥し（MgSO4）、乾固した。種々のヒド
ロキシ―ω―ニトロスチレン生成物の収率、融点
およびスペクトルの性質を常套の方法で測定し以
下に示すが、スペクトルの性質は、エタノールお
よび以下に示すず、スペクトルの性質は、エタノ
ールおよびPH8.8のトリス緩衝液（TRIS）中の吸
収（λmax）およびPH8.8での吸収係数（ε）によ
つて測定した。 (1) ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン、融点164〜166℃（エタノール）を、
収率75％で得、λmax（エタノール）380、
λmax（TRIS8.8）506、ε20，900であつた。 (2) ４―ヒドロキシ―ω―ニトロスチレン、融点
185〜186℃（水性エタノール）を収率52％で
得、λmax（エタノール）358、λmax
（TRIS8.8）460でε24，627であつた。 (3) ４―ヒドロキシ―３，５―ジメトキシ―ω―
ニトロスチレン、融点184〜186℃（エタノー
ル）を収率72％で得、λmax（エタノール）
385、λmax（TRIS8.8）530でε22，330であつ
た。 (4) ４―ヒドロキシ―３―ニトロ―ω―ニトロス
チレン、融点132〜133℃を収率57％で得、
λmax（エタノール）320、λmax（TRIS8.8）
405でε7，400であつた。 (5) ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―２―ニトロ
―ω―ニトロスチレン、融点188〜189℃（酢酸
水溶液）を収率42％で得、λmax（エタノール）
400、λmax（TRIS8.8）436でε14，000であつ
た。 (6) ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―５―ニトロ
―ω―ニトロスチレン、融点170〜171℃（酢酸
水溶液）を収率67％で得、λmax（エタノール）
334、λmax（TRIS8.8）415でε5，200であつ
た。 (7) ２―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン、融点138〜139℃（水性エタノール）
を収率38％で単離し、λmax（エタノール）
322、λmax（TRIS8.8）492で吸光係数ε7，380
であつた。 ２―メナキシ―４―（α―メチル―β―ニトロ
エテニル）―フエノールを、ヴアニリンをニトロ
メタンの代わりにニトロエタンで処理する前記方
法の変形によつてまた製造した。しかし反応に用
いた条件は前記ニトロメチル化で記載したのと本
質的に同じであつた。α―メチル―β―ニトロエ
ーテルフエノール生成物は収率80％、融点110〜
112℃、λmax（エタノール）368、λmax
（TRIS8.8）475でε13，100であつた。 上で製造したヒドロキシ―ω―ニトロスチレン
は、本発明試薬の容易に識別できる可視信号を与
えることのできる代表的な着色化合物である。特
に好ましい化合物は３―メトキシおよび３，５―
ジメトキシ化合物(1)および(3)で、アルカリ性の状
態で深紅色の呈色を与える。一般にω―ニトロス
チレン化合物はパラニトロフエノールの淡オレン
ジ―黄の呈色［λmax（エタノール）320、λmax
（TRIS8.8）400でε15，000］よりも著しく改良さ
れた色の性質を示し、これはニトロスチリル化合
物とラジカルイオンを形成するためと考えられ
る。このようなラジカルイオンの存在は、ニトロ
スチリル化合物のe.s.r.スペクトルによつて支持
される。たとえば、Ｍナトリウムメトキシドの一
滴を加えた3.5―ジメトキシ化合物(3)のDMSO溶
液は６つのメトキシプロトンに対し0.680ガウス
での計算された分裂が１：６：15：20：15：６：
１の比である７つのシグナルおよび２つの芳香核
プロトンに対し1.74ガウスでの分裂が１：２：１
の比である３つのシグナルを有する強いe.s.r.ス
ペクトルを与え、エチルプロトンにはシグナルは
観察されなかつた。 実施例 ４ 尿中のＮ―アセチルグルコサミニダーゼ
（NAG）の検定 実施例１で製造したNAGの基質である４―
（２―アセトアミド―２―デオキシ―β―Ｄ―グ
ルコピラノシルオキシ）―３―メトキシ―ω―ニ
トロスチレン約３％含有する微晶質のセルロース
100mgを、小さなプラスチツクのサンプルチユー
ブ中で体温で新鮮な尿（１ml）または予め35〜38
℃に加温した貯蔵尿で処理する。チユーブの内容
物を30〜35℃で15〜30分間、たとえば37℃で20分
間インキユベートし、次いで底を綿花でふさいだ
パスツールピペツト中に入れた繊維状DEAEセル
ロース、たとえばワツトマン（Whatman）DE22
（登録商標）の短いカラム（約３×0.6cm）を通し
て抽出濾過させる。尿試料中のNAGの存在は、
DEAEセルロースカラムの上端から約0.5cm下の
クリムソンレツドの帯の顕色によつて示される。
あるときは尿中のウロクローム（urochrom）の
存在によつて広い薄茶色の帯がクリムソンレツド
の帯の上に形成し、腎移植して少数の患者では、
早く移動する茶―ふじ色の帯が多分患者が受けて
いる投薬により観察される。更に、その尿中に低
電解質濃度を有する糖尿病患者または乳児では赤
色帯はDEAEセルロースの先端表面の界面に形成
し、自然に一層広く分散する。この後者の影響は
試薬中に適当量の電解質を入れることにより克服
できる。しかし、すべての場合、赤い帯の幅およ
び強さは尿中のNAGの濃度にほぼ比例する。 セルロース上３％のグリコシドを用いて、正常
な尿（NAG約75nmol／ml）は狭く、弱く、緻密
な赤い帯を与えたが、異常な尿（＞200nmol／ml
NAG）はNAG濃度の増加によつて増強される強
い広い帯を与えた。同じ試験の条件下で、水およ
び煮沸してNAGを破壊した尿は陰性の結果を与
えた。 基本アツセイを一部変更して、３％グリコシド
物質の代わりにセルロース上に８％グリコシドを
用い、約20〜30nmol／mlからのNAG検出限界を
評価した。一部変更した方法において、正常な尿
は上で観察されたよりも更に強い帯を与え、この
ことは使用グリコシド基質の量の変更およびイン
キユベーシヨンの温度および時間に留意すること
により検出限界を選択することが可能であること
を示している。 本発明による透過流型装置の説明 第１図および第２図に関しては、実施例１で製
造したω―ニトロスチリルグリコシドを本発明に
よる透過流型装置に入れてもよい。両方の装置は
円筒形の上部インキユベーシヨン室(1)および下部
可視化室２からなり、両方の場合、下部可視化室
２は綿花または同様な物質の上層４および下層５
間にはさまれた繊維DEAEセルロース（ワツトマ
ンDE22）３を含有している。可視化室２の下端
には排液のための出口６を有し、装置が垂直方向
に立たせておくようにスカートまたは脚７が備え
られている。下部可視化室２の壁は、DEAEセル
ロースおよびその上に吸着した着色帯の何れかを
観察しうるように透明プラスチツクのような透明
物質からなつている。 上部インキユベーシヨン室１には適当な溶媒中
またはセルロースもしくは他の適当な吸収剤に吸
収させた適当量のグリコシド物質（図示せず）、
たとえば３％グリコシド含有微晶質のセルロース
（アビセル）100mgが入つている。インキユベーシ
ヨン室１にはスクリユーキヤツプ８が取付けら
れ、インキユベーシヨン中尿を隔離するための厚
いPVCまたはポリスチレン壁９を有しており、
壁９にはインキユベートするために導入される尿
の量を示すための線１０がマークされている。 線図、第１図および第２図では、上部および下
部隔室１および２にはそれらの間の連絡通路は示
されていない。 第１図については、隔室１および２は二面には
さまれた表面においてピボツトピン１１で一緒に
保持されている。インキユベーシヨン室１の基部
には偏心位置した出口１２を有し、可視化室の上
端にはピボツト１１から出口１２と同じ半径で偏
心位置した入口１３を有している。上部隔室１お
よび下部隔室２の相互の回転は、出口１２および
入口１３を互いに一致させることになり、インキ
ユベートした尿が流れることができる連結した隔
室の通路を与える。使用するには、新鮮な尿を隔
室１に、出口１２および入口１３を互いに一致さ
せずにマーク１０のレベルまで入れる。スクリユ
ーキヤツプ８を適切な位置にまわし尿を普通約15
〜20分であるが周囲の温度に依り所要の時間イン
キユベートする。次いで隔室を相互に回転し、出
口１２および入口１３を互いに合わせ、インキユ
ベートした尿をインキユベート室１から可視化室
２に排出する。尿中にNAGが存在する結果グリ
コシド基質によつて解離された２―メトキシ―４
―（β―ニトロ―エテニル）フエノールは、明る
いスカーレツト赤の帯をDEAEセルロースカラム
３の上端から約0.5cm下に形成させる。 第２図では、隔室１および２は隔室１の底の周
囲のねじ山１６および隔室２の上端から突起して
いる管状延長部１８の内側の周縁のねじ山による
ねじ山のかみ合いによつて一緒に保持されてい
る。隔室１と隔室２の間の通路は隔室１の底から
突起している管状延長部１４によつて与えられ
る。使用に先き立つて通路１４を隔室２の上端の
弱い部分１５を有する接合部によつて閉鎖する。
使用時、尿を隔室１に入れ、第１図の装置のよう
にインキユベートする。ただし、インキユベート
が完了すると、隔室１および隔室２を一緒にまわ
して管状延長部１４を弱い部分１５で破り、イン
キユベートした尿を隔室２に流す。基質から解離
したフエノールを見ることは第１図の装置と同じ
である。 両方の装置は「腎移植」患者が、その自宅で患
者自身が試験することができ、あるいは複雑な監
視装置を用いずに一般的なスクリーニングテスト
を容易に行うことのできる簡単な手段を提供する
ものである。NAG以外の他のエンチームを同様
な手法と装置を用いて検定してもよい。
作用して被監視化合物を形成するエンチーム基質
と共にインキユベートすることを含むエンチー
ム・アツセイ法において、エンチーム基質が式
SX―Ａ―Ｙ―NO2（式中、Ｓは基質残基、Ａは単
環式芳香族核を示し、Ｘは助色団基HXの残基を
示し、Ｙはα―位が置換されていることもあるエ
チレン基を示す）で表わされ、エンチームが該エ
ンチーム基質に作用して被監視化合物HX―Ａ―
Ｙ―NO2（式中、Ｘ、ＡおよびＹは前記と同意
義）を形成するエンチームであり、該化合物が直
接またはアルカリ処理によつて肉眼で識別し得る
可視信号を発生することができる化合物であるこ
とを特徴とするエンチーム・アツセイ法。 ２ エンチームと基質との相互作用で生じる化合
物が式： ｛式中、Ｘは前記と同意義であり、R1，R2，
R3およびR4は各々独立にＨ、OMe、NO2、CH3、
CH＝CR′R″［式中、R'およびR″は各々独立にＨ、
OMe、NO2、CH3、CO2Hまたは不飽和共役基
CH＝CR′R″（式中、R′およびR″は各々独立にＨ、
OMe、NO2、CH3もしくはCO2Hを表わす）を表
わす］またはCO2Hを表わす｝で示される化合物
である第１項記載の方法。 ３ エンチーム含有試料を該エンチームと相互作
用して被監視化合物を形成するエンチーム基質と
共にインキユベートすることを含むエンチームア
ツセイ法に用いるエンチーム基質であつて、該基
質が次式： ［式中、ＲはＨもしくはOMeを示し、S′は CO―CH2―CH3、 CO―（CH2）14―CH3、 PO―（OM）2、 もしくはグリコシル残基を示す（式中、Ｍは
NaまたはＫを示す）］ で表わされるエンチーム基質。 明細書 本発明はエンチーム アツセイ、および特にエ
ンチームの検出ならびに測定用試薬に関する。 生理試料、例えば患者（人）の尿や血清試料中
に或る種のエンチームが存在するか否かはたとえ
ば患者（人）の臓器機能不全に関係する生体
（organism）中の病気または欠陥（deficiencies）
の有用な指標である。例えば「腎移植（kidney
transplant）」患者の尿中に排泄されるエンチー
ム Ｎ―アセチル―β―Ｄ―グルコサミニダーゼ
（NAG）のレベルの増加は移植された腎臓の切迫
した拒絶反応の初期徴候であり、また腎および他
の疾患の一般的な指標でもある。NAGに対する
現今における一般的な臨床アツセイ（clinical
assay）は尿素検体とエンチームの４―メチル―
ウンベリフエリル・グリコシド・基質とのインキ
ユベーシヨンを含み、両者は相互に作用して相当
するウンベリフエロンを解離し、次いでこのウン
ベリフエロンを螢光的に監視する。さらに、ニト
ロフエニル・グリコシド基質、ｐ―ニトロフエニ
ル―２―アセトアミド―２―デオキシ―β―Ｄ―
グルコピラノシドを用いて、エンチームと相互に
作用させ、ｐ―ニトロフエノールを解離させてこ
れを比色的に監視してもよい。しかしながら、こ
れらのアツセイはいずれも複雑な分光光学的装置
の使用を要し、したがつて設備の整つた研究施設
への出入の容易なときの使用にのみ適している。 ここにエンチーム アツセイ試薬を発明した。
この試薬は、場合により複雑な監視装置を使用す
ることなく用いることができる。本発明によれ
ば、エンチーム含有試料を、該エンチームと相互
作用して被監視化合物を形成させるエンチーム基
質と共にインキユベートすることを含むエンチー
ム アツセイ法において、該化合物が式HX―Ａ
―Ｙ―NO2（式中、Ａは単環式芳香族核を示し、
Ｘは助色団基HXの残基を示し、Ｙはα―位が置
換されていることもあるエチレン基を示す）で表
わされる化合物であり、該化合物が直接またはア
ルカリ処理によつて肉眼で識別し得る可視信号を
発生することができることを特徴とするエンチー
ム アツセイ法が提供される。 該試薬は典型的には、基質残基Ｓを含むエンチ
ーム基質部分および式HX―Ａ―Ｙで表わされる
化合物を形成する部分を有する。通常、該試薬は
式Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2で表わされる化合物または
その簡単な前駆体を基質部分を組合せて含有し、
エンチーム基質試薬との相互作用において式HX
―Ａ―Ｙ―NO2（式中、Ｘ、ＡおよびＹは前記と
同意義である）で表わされる化合物を解離する。
一つの態様においては、試薬のエンチーム基質部
分と別の部分は都合のよいことには助色団基の残
基Ｘを介して結合し、該物質は一般式Ｓ―Ｘ―Ａ
―Ｙ―NO2（式中、Ｓは該物質のエンチーム基質
部分を含み、Ｘ、ＡおよびＹは前記と同意義であ
る）で表わされる。この様な試薬はエンチームと
の相互作用において該化合物を解離する。 本発明には、式S′―Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2（式中、
Ａ、ＸおよびＹは前記と同意義であり、S′はプロ
ピオニル、パルミトイル、フオスフエート、ジフ
オスフエート、スルフエートまたはグリコシル残
基を示す）で表わされる化合物および前記アツセ
イ法におけるエンチーム基質試薬としてのその用
途も含まれる。 本発明による前記の方法は、エンチーム基質の
残基部分をアツセイが所望される所定のエンチー
ムに応じて変化させることにより一般のエンチー
ム アツセイに広く適用できる。しかしながら典
型的には本発明でアツセイできるエンチームは異
化作用エンチーム（catabolic enzyme）であり、
これらのエンチームは細胞組織中の巨大分子の破
壊に重大な役割を果たす。例えばアツセイし得る
エンチームはカルボキシレート・エステラーゼお
よびリパーゼ、酸および塩基性ホスフアターゼ、
ホスフオジエステラーゼおよびスルフアターゼを
含み、相当する試薬は適当なカルボキシレート、
ホスフエート、ジホスフエートおよびサルフエー
ト・エステル・エンチーム基質類を含んでいても
よい。また特に、本発明はエンチーム基質の残基
部分Ｓが特徴的にαまたはβ―グルコピラノシ
ル、―ガラクトピラノシルまたは―マンノピラノ
シル置換基のごとき相当するグリコシド炭水化物
置換基であるグリコシダーゼのアツセイに適用で
きる。例えば本発明は、Ｓが２―アセトアミド―
２―デオキシ―Ｂ―Ｄ―グルコピラノシル残基で
あるＮ―アセチル―ｐ―Ｄ―グルコサミニダーゼ
（NAG）のアツセイへの適用が特に適しているこ
とがわかつた。 本発明方法に使用するエンチーム基質の多くは
自体新規であり、これらは本発明の範囲内に含ま
れることが認められるであろう。従つて別の態様
では、本発明は本発明方法に使用するエンチーム
アツセイ試薬を含んでおり、該試薬は式S′―Ｘ
―Ａ―Ｙ―NO2（式中、Ｘ、ＡおよびＹは前記と
同意義であり、S′はプロピオニル、パルミトイ
ル、フオスフエート、ジフオスフエート、スルフ
エートまたはグリコシル残基を表わす）で示され
るエンチーム基質を含有する。 本発明は一般のエンチームの存在に対するアツ
セイおよびその濃度レベルの監視、例えば相当す
る欠陥または病気の診断に用いてもよい。例えば
尿のNAG含量を腎疾患の早期発見に対してアツ
セイしてもよく、また特殊な場合には腎移植患者
中の腎臓拒否反応の早期指標として用いてもよ
い。さらに本発明は例えばある遺伝的な病気
（genetic disorder）の徴候であると思われるエ
ンチームの欠如を測定するために使用してもよ
い。また一般に、本発明の試薬と方法は生物化学
的および医学的な研究に使用するための便利な手
段を提供することもできる。 本発明に使用する試薬は肉眼で容易に識別でき
る色変化を発生し得る。この点に関し、発生した
色は典型的かつ実質的に試料の背景の色彩と異な
る。例えばNAGのアツセイ用試薬のごとき尿の
試料と共に使用するための本発明試薬は尿の背景
の色彩と実質的に異なつた色を発生し得る物質を
典型的に解離する。好ましくは本発明試薬は識別
可能な色、好ましくは赤または青を発色し得る化
合物を解離する。この様な好適な解離化合物は通
常アルカリ条件下で約450から約700までの範囲、
好ましくは約500から約600までの範囲の最大吸収
（λmax）を、特に高い吸光係数（Ｅ）、例えば約
20000以上と共に有している。 一般式S′―Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2で表わされる好ま
しい化合物の内には多くの典型的な着色および染
色化合物が存在することは予想されるであろう
し、また容易に識別し得る可視信号を生ずるに適
した化合物は当該技術分野に精通した技術者にと
つて明らかであろう。しかしながら、好ましくは
基Ａは単環芳香族核、特にベンゼン核を有する。 またグループＹはＡとNO2置換基間に共鳴電
子を移動することができる適宜の不飽和基を有し
ていてもよく、また異項原子を含有する系およ
び／または環化された系を含んでいてもよい。こ
の様に、例えば基Ａがナフチル核の一つの環であ
るベンゼン環を含んでいてもよく該ナフチル核の
他の環が基Ｙを供給してもよい。また基Ｙはアセ
チレン系不飽和基を表わしていてもよい。しかし
ながらより好ましくは基Ｙは芳香族核Ａに関して
共役するエチレン不飽和基、例えばエテニル、ブ
タジエニルまたはヘキサトリエニル置換基を表わ
す。この様に好ましい態様において本発明に使用
するエンチームと相互に作用して式［］： ［式中、S′およびＸは前記と同意義、ｎ＝１、
２または３およびR1，R2，R3およびR4＝Ｈ、
OMe、NO2、CH3、―CH＝CR′R″（式中、R′お
よびR″はR1等と類似の置換基、好ましくはＨま
たはNO2を表わす）またはCO2H］で示される化
合物を与えることができる。 助色団Ｘは適宜の助色団、例えばアミノ基
（NH2）または好ましくは水酸基（OH）であつ
てもよい。 特に好ましい態様において、Ｘはオキシ基（―
Ｏ―）であり、Ａはスチリル基である。本発明に
使用するのに特に好ましい基質はエンチームとの
相互作用において４―ヒドロキシ―ω―ニトロス
チレン化合物、即ち下記の式［］： ［式中、R1，R2，R3およびR4は前記と同意
義］を形成するエンチーム基質を含有するもので
ある。式［］で表わされる化合物は一般に非常
に望ましい顕著な色特性を示すので、該化合物か
ら誘導されるエンチーム基質試薬は本発明に使用
するのに特に好適なものである。式［］の化合
物はｐ―ニトロフエノールの弱い橙黄色に比し、
アルカリ条件において典型的な強い赤色を示し、
かつｐ―ニトロフエノールの最大吸収（λmax：
absorbance maxima：アルカリ条件下で〜400）
より、予想外に著しく高い最大吸収を有すること
が見出された。現在これらの増強された色特性は
下記のごとき酸化工程から得られるラジカル・イ
オンの形成によるものと信じられている。 電子供与性置換基、例えばヒドロキシル置換基
に隣接するアルコキシ基、例えばメトキシの存在
はこのラジカル・イオンの形成を安定化させるよ
うに思われる。このことは特に好ましい試薬の基
礎となる式［］および［］： で示される３―メトキシおよび特に３，５―ジメ
トキシ同族体の色特性によつて確認される。 モノ―メトキシ化合物［］とジ―メトキシ化
合物［］はPH8.8の緩衝液中でそれぞれ506と
530の最大吸収（λmax）および吸収系数（ε）
24600と22300を有し、この条件で満足すべき緋―
赤色の呈色を示す。 本発明による基質としては次の式［Ａ］〜
［Ｅ］で表わされるものが例示される。この場合、
置換基としては式を簡単にするために、４―オキ
シ―ω―ニトロスチリル基を有する基質のみを示
す。従つて該置換基はＸ―Ａ―Ｙ―NO2基で表
わされる他のいずれの置換基によつて書き換えて
もよい。 これらの試薬はそれぞれ［Ａ］エステラーゼま
たはリパーゼ、［Ｂ］酸または塩基性ホスフアタ
ーゼ、［Ｃ］ホスホジエステラーゼ、［Ｄ］アリー
ルスルフアターゼおよび［Ｅ］グリコシダーゼの
アツセイに適した試薬である。式［Ｅ］中、Rz
はグリコシル基、例えばα―またはβ―グルコピ
ラノシル、ガラクトピラノシルまたはマンノピラ
ノシルを示す。 本発明によれば、好ましいニトロスチリル置換
試薬はｐ―ヒドロキシベンズアルデヒド化合物、
例えばｐ―ヒドロキシベンズアルデヒド自体また
はサリチルアルデヒドを出発原料として調製して
もよい。例えば、該ｐ―ヒドロキシベンズアルデ
ヒド化合物を、基質Ｓの残基を与える適当なエン
チーム基質と反応させて得られる対応する基質―
オキシベンズアルデヒド化合物アダクトをニトロ
メチル化処理に付すことによつて調製される。ニ
トロメチル化処理は温和なアルカリ性条件下でお
こなうのが好ましい。本発明に使用する他の試薬
は相当する類似の反応経路によつて調製してもよ
い。 アツセイされてよい試料は流体が便利であり、
例えば血清または尿等の生理流体を含む試料を含
む。他の適当な試料、例えば遺伝的な疾患の研究
に一般に使用されるごとき細胞均等質（cell
homogen―tates）から誘導される試料を含むも
のをアツセイしてもよい。 試薬と試料は一緒にインキユベートする；例え
ば試料と試薬含有溶液を混合し、適当な条件で適
当な時間、相互に作用させる。インキユベーシヨ
ン中採用される温度は好ましくは約30℃以上、約
30℃から約40℃の間であり、この様な条件におけ
るインキユベーシヨン時間は約30分まで、例えば
約10分〜15分から、約30分までで通常十分であ
る。溶液状での試薬の使用に代えて、試薬は例え
ばセルロース粒子、例えば微細晶セルロースのご
とき適当な固形層物質に吸収させた組合せにおい
て使用してよく、これによつて試薬の不溶性また
は貧溶解性から生ずる問題を有利に克服できる。
同時に試薬は多孔性支持体、例えば紙と組合わせ
て、便利な試験紙たは簡単な浸漬試験用デイツ
プ・ステイツクを供給してもよい。この様な適宜
の不活性固形物質または多孔質支持体と組合せた
本発明試薬含有生成物は本発明の範囲に包含され
るものである。 インキユベーシヨンにおいて、該試薬は二次処
理なしで試料中の酵素の存在を示す可視信号、例
えば色を生ずることのできる化合物を解離または
より一般的には形成する。しかしながらしばしば
この化合物は可視信号を発生するための別の処理
を必要としてもよく、この様な処理は典型的には
該化合物生来の可視信号を発現させるための活性
化を含む。この別処理は例えば従来のエンチーム
アツセイ試薬で採用されているジアゾ・カツプ
リング工程のごとき合成または製造化学の工程を
含まない。一般に、この処理は電荷の非局在化を
可能にする塩の形成に導くことのできるアルカリ
処理例えば着色可視信号を有利に発現させる好ま
しい共役不飽和発色団物質のアルカリ処理を含
む。アルカリ処理は解離化合物含有溶液へのアル
カリ添加を含んでいてよく、また好ましくは該化
合物含有溶液を固形層試薬、例えば吸収剤と接触
せしめ、同時に該化合物にアルカリ性の環境を提
供してもよい。例えば該化合物を含有する溶液
を、好ましくは中間色、例えば白色または淡色
で、遊離塩基、例えば（OH-）型にあるアニオ
ン交換物質（anionic exchange material）と接
触させる。例えば、アニオン交換物質はDEAEセ
ルロースまたは類似の淡色アニオン交換物質を遊
離塩基の形で含んでいてもよい。吸収性のアニオ
ン交換物質の使用は特に有利であり、監視を容易
にするために解離された物質を狭いバンド
（band）中に吸収および濃縮する。 したがつて、好ましい態様では本発明方法はエ
ンチーム含有試料を固形層物質、例えば不活性吸
収剤または多孔性支持体と組合せた試薬と共にイ
ンキユベートし、化合物Ｘ―Ａ―Ｙ―NO2を形
成させ、該化合物含有溶液をこれにアルカリ性の
環境を付与する固形層試薬と接触せしめ、これに
よつて肉眼で容易に識別できる色変化または他の
可視信号を生ぜしめる方法を含む。 好ましい態様の方法を実施するための装置は、
通常は２つの隔室を備えた透過流型装置であり、
この隔室の一つは固形層物質、例えば微細晶セル
ロースと組合わせた試薬を含有するインキユベー
シヨン室であり、他の一つは、該物質例えば、
DEAEセルロースまたは類似物にアルカリ性の環
境を提供する固形層試薬含有可視化室である。こ
の隔室は典型的には例えば適当な連結通路によつ
て相互に連結でき、解離化合物含有液体をインキ
ユベーシヨン室から可視化室に流すことができ
る。しかしながら二つの隔室は、好ましくは相互
に分離できるようにし、例えば必要とされるイン
キユベーシヨン時間、試料をインキユベーシヨン
室に保持させる。二つの隔室間の通路には、必要
なインキユベーシヨン時間経過後、適宜開放また
は取り除いて液体を可視化室、例えば好ましい
DEAEセルロース吸収剤を通過させることのでき
る適当な栓または障壁を設けてもよい。 例えば透過流型装置は相間表面でピボツトによ
つて接触する二つの隔室からなつていてもよく、
この両表面はピボツトから所定の半径の位置に出
口を備え、隔室の相互回転によつて相互の出口を
一致させて隔室間に通路を提供する。また別に、
隔室間の通路は所望により例えばらせんねじ等の
作用により二つの隔室を一緒にすることによつて
破れる薄い障壁で塞いでもよい。 使用される試薬、例えば不活性固形層物質と組
合せて存在する試薬の濃度は所望のごとく、例え
ば監視に必要とされるエンチームの限界濃度と一
致するように変えてもよい。試薬濃度の増加は一
般にエンチームのより低い限界濃度の検出を可能
にする。 さらに解離物質を見えるようにするための固形
層試薬、例えばDEAEセルロースの使用は、狭い
吸収帯中に生ずる色濃度の由に非常に少量の解離
物質の検出を可能にする。この点で２―メトキシ
―４―（β―ニトロエテニル）フエノールの存在
をDEAEセルロースとこの溶液を接触させること
により１〜２×10-6モルの濃度で検出できること
がわかつた。同様に、例えばDEAEセルロース可
視化と組合わせた不活性セルロース固形層上での
適当なNAG検出グリコシド（Ｅ）の３％使用は、
37℃、20分インキユベーシヨン後、約40〜
50nmol／ml尿中NAGの限界濃度を検出し得、一
方、同じ系におけるグリコシド８％含有セルロー
スの使用は限界濃度約20〜30nmol／ml．を与え
ることがわかつた。 両方の系は通常の尿によつて与えられるものと
容易に区別される異常尿に対する巾の広い濃厚な
帯を与える。したがつて、基質の濃度効果および
可視化の容易性に関して、本発明の方法は患者自
身が自宅で適当に調製された透過流型装置を用い
ることによつてうまく行うことができ、また最小
の分析技術しか必要とされないことが容易に理解
されるであろう。例えば患者は単に所要量の新鮮
な尿をインキユベーシヨン室に加え、例えばその
室の側部に示された所要レベルまで加え、標準イ
ンキユベーシヨン時間後（これは通常周囲温度に
よつてきまる）、インキユベーシヨン室と可視化
室を連結してインキユベートされた尿を固形層可
視化試薬中に流す。 解離物質によつて生ずる可視信号、例えば色の
変化は複雑な監視装置に頼る従来使用されていた
方法と比べて、試料中のエンチームの存在を簡単
かつ速く検出する手段を提供する。同様に生ずる
可視信号、例えば色の強度は試料中に存在するエ
ンチームの濃度の大まかな可視指標として便宜的
に使用してもよい。しかしながら、もしより正確
な測定が必要ならば、本発明試薬を分光光学的
に、例えば常套の方法で監視してもよい。例えば
発生する色は通常適当な緩衝剤を用いてPHを8.5
〜9.5に調整した後、比色計を用いて測定しても
よく、またこの様な方法においても、本試薬は従
来の相当する試薬、例えばｐ―ニトロフエノリツ
クおよびｏ―ニトロフエノリツク系物質よりより
適当である。 本発明をさらに本発明エンチーム アツセイ試
薬の調製およびその成分および本発明方法におけ
るその使用に関連する以下の実施例および記載に
おいて実例をあげて記載し、かつ添付図面をもつ
て説明する。 第１図は本発明に使用する透過流型装置の一形
式を表わし、第２図は本発明に使用する透過流型
装置の別の形式を示す。 実施例 １ 対応するグリコシダーゼを検出および測定する
ニトロスチリルグリコシドの製造 ヒドロキシベンズアルデヒドグリコシドの製
造 本発明によるニトロスチリルグリコシドエンチ
ーム基質の製造における最初の段階として適当な
ヒドロキシベンズアルデヒドグリコシドを製造す
る。 適当なグリコピラノシルハライド（70ミリモ
ル）のアセトン（200ml）溶液を適当なｐ―ヒド
ロキシベンズアルデヒド化合物（100ミリモル）
のＭ―水酸化ナトリウム溶液で処理し、得られる
混合物を約16時間撹拌しながら室温に保つた。反
応混合物を次いで生成物が分離するまで水で希釈
した。結晶グリコシド生成物を直接濾去し、非結
晶生成物は通常の方法でクロロホルム抽出によつ
て単離した。 結晶生成物を濾去した後、更に生成物をクロロ
ホルムまたはジクロロメタンで抽出することによ
り母液から回収してよい。 ヒドロキシベンズアルデヒド・グリコシド類の
製造中に得られた結果を以下に示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―α―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―３―メトキシベンズア
ルデヒドが２―アセトアミド―３，４，６―ト
リ―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―α―Ｄ―グ
ルコピラノシルクロリドから55％の収率で得ら
れ、融点220〜221℃（エタノール）、［α］D―
13.5゜（ｃ １、DMSO）であつた。 (b) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）ベンズアルデヒドが同様
に47％の収率で得られ、［α］D―19゜（ｃ １、
CHCl3）であつた。 (c) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―３，５―ジメトキシベ
ンズアルデヒドが同様に15％の収率で得られ、
融点239〜240℃（メタノール）、［α］D＋3.8゜（ｃ
1.2、DMSO）であつた。 (d) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―
メトキシベンズアルデヒドが２，３，４，６―
テトラ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―グルコピラノ
シルブロミドから62％の収率で得られ、融点
135〜136℃（エタノール）、［α］d―24.2゜（ｃ
1.1、CHCl3）であつた。 (e) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ）―３
―メトキシベンズアルデヒドを２，３，４，６
―テトラ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―ガラクトピ
ラノシルブロミドからまず結晶化するシロツプ
として得（47％）、エタノールエーテル―軽油
（light petroleum）からかろうじて再結晶し
た。融点148〜149℃、［α］D―4.4゜（ｃ 1.1、
CHCl3）。 (f) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ）―３―
メトキシベンズアルデヒドを２，３，４，６―
テトラ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―マンノピラノ
シルブロミド（15）から14％の収率でシロツプ
として得た。［α］D＋15.9゜（ｃ 1.4、CHCl3）。 ヒドロキシ―ベンズアルデヒドグリコシドの
Ｏ―脱アセチル化 ニトロスチリルエンチーム基質の製造の次の段
階では、あるヒドロキシ―ベンズアルデヒドグリ
コシドをメタノール性ナトリウムメトキシドで処
理してＯ―脱アセチル化する。アセチル化グリコ
シド（15ミリモル）のメタノール（50〜500ml）
の溶液をＭ―メタノール性ナトリウムメトキシド
（0.5〜２ml）で処理し、溶液を室温で20〜30分
間、あるいはまた薄層クロマトグラフイー測定で
示される反応の完結まで放置した。この溶液を次
いでシリカゲルのパツドを通してナトリウムイオ
ンを除去し、次いで蒸発乾固した。 種々のグリコシドで得た結果を下記に示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―２―デオキシ―β
―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―メトキ
シベンズアルデヒドを反応混合物から90％の収
率で直接結晶化させ、融点199〜200℃（分解）、
［α］D―20゜（ｃ １、DMSO）であつた。 (b) ４―（β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―
３―メトキシベンズアルデヒドを白色粉末とし
て85％の収率で得た。融点188〜190℃、［α］D
＋2.2゜（ｃ 0.7、DMSO）。 (c) ４―（α―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ）
―３―メトキシベンズアルデヒドを白色粉末と
し92％の収率で得た。融点204〜206℃、［α］D
＋4.8゜（ｃ 1.1、DMSO）。 (d) ４―（α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ）―
３―メトキシベンズアルデヒドを64％の収率で
結晶として得た。融点196〜197℃（エタノー
ル）、［α］D＋119.6゜（ｃ １、DMSO）。 ヒドロキシ―ベンズアルデヒドグリコシドの
ニトロメチル化 上で製造したアセチル化および脱アセチル化ヒ
ドロキシ―ベンズアルデヒド・グリコシドの両者
を次いでニチロメチル化して対応するニトロスチ
リル・グリコシドにした。 ニトロメタン（16ml）、アンモニウムアセテー
ト（８ｇ）および酢酸（４ml）を適当なグリコシ
ド（20ミリモル）のエタノール（150〜200ml）撹
拌溶液または懸濁液に加え、混合物を室温で約20
から250時間まで、普通20時間撹拌した。ほとん
どの場合、生成物は反応混合物から分離し、反応
混合物から集めたが、場合により、生成物を水を
加えて沈澱させ、続いて濾過またはクロロホルム
または他の適当な溶媒で抽出した。 あるいはまた、上記の反応混合物を15〜45分還
流させ、同様な収率で、しばしば純度の向上した
生成物を得た。 種々のニトロスチリルグリコシドの製造で得た
結果を以下に示し、用いた方法が方法(A)、即ち室
温方法かまたは方法(B)、即ち還流方法かを示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―３―メトキシ―ω―ニ
トロスチレンを方法(A)で88％、方法(B)で76％で
黄色結晶固体として製造した。融点239〜240
℃、［α］D―6.9゜（ｃ 1.15、DMSO）。 (b) ４―（２―アセトアミド―２―デオキシ―β
―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―メトキ
シ―ω―ニトロスチレンを方法(B)で87％の収率
で淡黄色の固体として製造した。融点200〜
201.5℃（分解）、［α］D―1.4゜（ｃ 0.9、
DMSO）。 (c) ４―（２―アセトアミド―３，４，６―トリ
―Ｏ―アセチル―２―デオキシ―β―Ｄ―グル
コピラノシルオキシ）―ω―ニトロスチレンを
方法(B)で非常に淡い黄色の固体として製造し
た。融点258〜259℃、［α］D―14.3゜（ｃ 1.1、
CHCl3）。 (d) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)で96％
の収率でクリーム色の黄色固体として製造し
た。融点192〜194℃、［α］D―12.4゜（ｃ 1.2、
CHCl3）。 (e) ４―（２，３，４，６―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―β―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ）―３
―メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)で反
応混合物からジクロロメタンで抽出し、溶離剤
としてエーテル―軽油を用いてシリカゲルカラ
ム上でクロマトグラフイーした後25％の収率で
製造した。融点148〜149℃、［α］D―4.4゜（ｃ
1.1、CHCl3）。 (f) ４―β―Ｄ―ガラクトピラノシルオキシ―３
―メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)で69
％の収率で淡黄色の結晶として製造した。融点
212〜214℃、［α］D＋1.3゜（ｃ 1.5、DMSO）。 (g) ４―（２，３，４，５―テトラ―Ｏ―アセチ
ル―α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ）―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレンを方法(A)によつ
て淡黄色無定形固体として得た。融点131〜132
℃、［α］D―15.7゜（ｃ 0.8、CHCl3）。 ニトロスチリルグリコシドのＯ―脱アセチル
化上で製造したＯ―アセチル化ニトロスチリル
グリコシドを最後に脱アセチル化する。 適当なＯ―アセチル化ニトロスチリルグリコシ
ド（２ミリモル）のメタノール（150ml）撹拌溶
液または懸濁液をＭ―メタノール性ナトリウムメ
トキシド（2.5ml）と処理する。この混合物を室
温で10〜20分間撹拌し、次いでシリカゲルのヴア
ツド（wad）を通してナトリウムイオンを除去す
る。シリカゲルを十分にメタノールで洗浄し、濾
液および洗液を合わせ蒸発乾固する。得られる固
体を次いで少量のエタノールを用いて濾去する。
製造した種々のニトロスチリルグリコシドに対し
て得られた結果を以下に示す。 (a) ４―（２―アセトアミド―２―デオキシ―β
―Ｄ―グルコピラノシルオキシ）―３―メトキ
シ―ω―ニトロスチレンを定量的収率で淡黄色
無定形粉末として得、これはいくらかの分解を
生ずることなく満足に再結晶することはできな
かつた。これは融点198〜199℃（分解）、［α］D
―7.8゜（ｃ 1.4、DMSO）であつた。 (b) ４―β―Ｄ―グルコピラノシルオキシ―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレンを収率77％で黄
色結晶として製造した。融点140〜141℃、［α］
D―8.7゜（ｃ １、DMSO）。 (c) ４―α―Ｄ―マンノピラノシルオキシ―３―
メトキシ―ω―ニトロスチレン（23）を無定形
の吸湿性（hydroscopic）の有機固体として得
た。［α］D＋80.1゜（ｃ 0.8、DMSO）。 上で製造したグリコシドは対応するグリコシダ
ーゼの検出および測定に使用するのに適してい
る。これらのグリコシドを含有する反応試剤は本
発明の範囲内であり、本発明方法を用いてよい。
典型的には、グリコシドは適当なエンチームとの
相互作用で、対応するヒドロキシ―ニトロスチリ
ル化合物を離し、容易に識別できる可視信号、通
常赤色の呈色を与える。 不活性な固体相の物質を本発明に従つて上で製
造したグリコシドまたは他のエンチーム基質で含
浸させてよい。たとえば、微晶質のセルロース、
例えばアビセル（Avicell）（登録商標）の必要量
を、上記のように製造したシリカゲルからの溶離
物（eluate）に加え、ロータリーエバポレーター
で蒸発乾固し、得られる固体を乳鉢および乳棒で
微細な粉末に粉砕する。 実施例 ２ 対応するエステラーゼの検出および測定用４―
ヒドロキシ―ω―ニトロスチレンのエステル誘
導体の製造 対応するエステラーゼの検出および測定用本発
明試薬を用いる４―ヒドロキシ―ω―ニトロスチ
レンのエステル誘導体類を製造した。 (1) ４―アセトキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン ヴアニリルアセテート（19.4ｇ、100ミリモル）
を、実施例の部の方法Ａのようにニトロメタ
ン、アンモニウムアセテートおよび酢酸と２〜３
日間反応させた。赤色の反応混合物を次いで水で
希釈し、得られる油層をクロロホルムで抽出し
た。クロロホルム抽出液を乾燥し（MgSO4）、蒸
発乾固し、得られる固体をクロロホルム―エタノ
ールから再結晶してアセテートを得た。融点158
〜162.2℃（20ｇ、17％）。あるいはまた３―メト
キシ―ω―ニトロスチリルアセテートを対応する
ヒドロキシ―ニトロスチレンから製造した。４―
ヒドロキシー３―メトキシ―ω―ニトロスチレン
（15ｇ、0.77ミリモル）を無水酢酸（15ml）に加
え、混合物を1.5時間還流加熱した。混合物を次
いで氷水中に注ぎ、沈澱した固体を濾去し、クロ
ロホルム―エタノールから再結晶しアセテートを
得た（1.7ｇ、93％）。融点163〜165℃で上で製造
したものと一致する。 上記ω―ニトロスチリルアセテートはアセテー
トエステラーゼの検出および測定用本発明試薬お
よび方法に使用するのに適しており、エンチーム
との相互作用で４―ヒドロキシ―３―メトキシ―
ω―ニトロスチレンの解離が起こり、アルカリ性
の条件下、強い赤色呈色を示す。 (2) ４―プロピオニル―３―メトキシ―ω―ニト
ロスチレン ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロス
チレン（3.9ｇ、20ミリモル）を乾燥ピリジン
（15ml）に溶解し、プロピオニルクロリド（2.8
ｇ、約30ミリモル）を加えた。反応混合物は温か
くなり、暗赤色の沈澱が生成した。約５分後、混
合物を氷水中に注ぎ、得られる黄色の沈澱を濾去
し、十分にエタノールで洗浄し、クロロホルム―
エタノールから再結晶しプロピオネートを得た
（4.8ｇ、95％）。融点01〜104.5℃。このプロピオ
ネートは、プロピオネートエステラーゼの検出の
使用に適しており、同様にエンチームとの相互作
用で４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレンの形成が起こる。 (3) ４―（β―ニトロエテニル）―２―メトキシ
フエニルパルミテート ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロス
チレン（5.2ｇ、25ミリモル）をピリジン（20ml）
に溶解し、パルミトイルクロリド（８ｇ、29ミリ
モル）を加える。黄色の固体が直ちに生成し、反
応混合物を次いで約５分間還流加熱し、反応混合
物を氷水中に注ぎ、得られる黄色の固体を濾去す
る。生成物を希（10-4）水酸化ナトリウムと撹拌
して遊離フエノールを除去し、濾去し、水および
エタノールで十分に洗浄し、次いでクロロホルム
―エタノールから再結晶した。融点96―99℃
（9.1ｇ、84％）。この生成物はエンチームとの相
互作用で４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニ
トロスチレンを離し、パルミテートエステラーゼ
の検出および測定に用いるのに適している。 (4) ４―（β―ニトロエテニル）―フエニルパル
ミテート パルミトイルクロリド（3.6ｇ）を乾燥ピリジ
ン（20ml）に加えると、直ちに沈澱した。この混
合物に４―ヒドロキシ―ω―ニトロスチレン
（1.65ｇ、10ミリモル）を加え、混合物を１〜２
分間加熱還流させる。混合物を次いで氷水中に注
ぎ、黄色の無定形の沈澱を濾去する。沈澱のクロ
ロホルムおよびDMSO混合溶液はエステルの種
結晶を与え、このバルク（bulk）を煮沸メチレ
ンクロリドに溶解し、エタノールを加えることに
より結晶化した。すべてのメチレンクロリドを蒸
発させると、エタノール性溶液に結晶の種を入
れ、パルミテートを淡黄かつ色の結晶として得
た。融点83〜84℃（２ｇ、50％）。同様にこの生
成物は、エンチームとの相互作用でやはり４―ヒ
ドロキシ―ω―ニトロスチレンを離し、パルミテ
ートエステラーゼの検出および測定に適してい
る。 (5) ４―（β―ニトロエテニル）―２―メトキシ
―フエニルホスフエート（モノナトリウム塩モ
ノ水和物として） ホスフオリルクロリド（6.2ｇ、40ミリモル）
のピリジン（40ml）中の激しく攪拌した氷冷溶液
に、４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン（7.8ｇ、40ミリモル）のピリジン（20
ml）溶液を45分で滴下した。反応混合物を次いで
水性ピリジン（10％の水を含有する50ml）を滴下
して分解すると、いくらかの固体が分離する。２
Ｍ―水酸化ナトリウム（20ml、40ミリモル）を滴
下すると最初透明な溶液となり、続いて無定形の
モノナトリウム塩が、水加物として分解した
（7.1ｇ、59％）。融点＞250℃。この塩は水に低溶
解度で、ホスフオターゼの検出および測定に適し
ている。 (6) ４―（β―ニトロエテニル）―２―メトキシ
フエニルホスフエート（そのジナトリウム塩と
して） 上記の反応(5)を、分解した反応混合物を苛性ソ
ーダ（６ｇ）の濃水溶液に注ぐ以外は繰返す。生
成物は最初油として分離し、無定形の固体に固化
した（11ｇ、86％）融点＞250℃。これはモノナ
トリウム塩よりも更に水に可溶性であり、沸騰水
に容易に溶解し、多少分解し、冷却すると再沈澱
し淡黄色の固体を与える。ジナトリウム塩の２ミ
リモル溶液は容易に製造できた。 実施例 ３ ヒドロキシ―ω―ニトロスチレン類を製造し、
一般式HX―Ａ―Ｙ―NO2で表わされる化合物の
例であるこれらの化合物の色の性質を測定および
比較する。 用いた一般の製造方法は次の通りである。対応
するヒドロキシベンズアルデヒド（40ミリモル）
をエタノール（200ml）およびアンモニウムアセ
テート（12ｇ）に溶解し、ニトロメタン（32ml）
および酢酸を加えた。反応混合物を室温で一夜撹
拌するか、15〜60分間加熱還流させた。ある場合
には、ω―ニトロスチレンを冷反応混合物から結
晶させるか、水を冷反応混合物に加えて結晶させ
た。結晶性生成物がこれらの方法で単離されない
場合は、生成物をエーテルで抽出し、水で十分洗
浄し、乾燥し（MgSO4）、乾固した。種々のヒド
ロキシ―ω―ニトロスチレン生成物の収率、融点
およびスペクトルの性質を常套の方法で測定し以
下に示すが、スペクトルの性質は、エタノールお
よび以下に示すず、スペクトルの性質は、エタノ
ールおよびPH8.8のトリス緩衝液（TRIS）中の吸
収（λmax）およびPH8.8での吸収係数（ε）によ
つて測定した。 (1) ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン、融点164〜166℃（エタノール）を、
収率75％で得、λmax（エタノール）380、
λmax（TRIS8.8）506、ε20，900であつた。 (2) ４―ヒドロキシ―ω―ニトロスチレン、融点
185〜186℃（水性エタノール）を収率52％で
得、λmax（エタノール）358、λmax
（TRIS8.8）460でε24，627であつた。 (3) ４―ヒドロキシ―３，５―ジメトキシ―ω―
ニトロスチレン、融点184〜186℃（エタノー
ル）を収率72％で得、λmax（エタノール）
385、λmax（TRIS8.8）530でε22，330であつ
た。 (4) ４―ヒドロキシ―３―ニトロ―ω―ニトロス
チレン、融点132〜133℃を収率57％で得、
λmax（エタノール）320、λmax（TRIS8.8）
405でε7，400であつた。 (5) ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―２―ニトロ
―ω―ニトロスチレン、融点188〜189℃（酢酸
水溶液）を収率42％で得、λmax（エタノール）
400、λmax（TRIS8.8）436でε14，000であつ
た。 (6) ４―ヒドロキシ―３―メトキシ―５―ニトロ
―ω―ニトロスチレン、融点170〜171℃（酢酸
水溶液）を収率67％で得、λmax（エタノール）
334、λmax（TRIS8.8）415でε5，200であつ
た。 (7) ２―ヒドロキシ―３―メトキシ―ω―ニトロ
スチレン、融点138〜139℃（水性エタノール）
を収率38％で単離し、λmax（エタノール）
322、λmax（TRIS8.8）492で吸光係数ε7，380
であつた。 ２―メナキシ―４―（α―メチル―β―ニトロ
エテニル）―フエノールを、ヴアニリンをニトロ
メタンの代わりにニトロエタンで処理する前記方
法の変形によつてまた製造した。しかし反応に用
いた条件は前記ニトロメチル化で記載したのと本
質的に同じであつた。α―メチル―β―ニトロエ
ーテルフエノール生成物は収率80％、融点110〜
112℃、λmax（エタノール）368、λmax
（TRIS8.8）475でε13，100であつた。 上で製造したヒドロキシ―ω―ニトロスチレン
は、本発明試薬の容易に識別できる可視信号を与
えることのできる代表的な着色化合物である。特
に好ましい化合物は３―メトキシおよび３，５―
ジメトキシ化合物(1)および(3)で、アルカリ性の状
態で深紅色の呈色を与える。一般にω―ニトロス
チレン化合物はパラニトロフエノールの淡オレン
ジ―黄の呈色［λmax（エタノール）320、λmax
（TRIS8.8）400でε15，000］よりも著しく改良さ
れた色の性質を示し、これはニトロスチリル化合
物とラジカルイオンを形成するためと考えられ
る。このようなラジカルイオンの存在は、ニトロ
スチリル化合物のe.s.r.スペクトルによつて支持
される。たとえば、Ｍナトリウムメトキシドの一
滴を加えた3.5―ジメトキシ化合物(3)のDMSO溶
液は６つのメトキシプロトンに対し0.680ガウス
での計算された分裂が１：６：15：20：15：６：
１の比である７つのシグナルおよび２つの芳香核
プロトンに対し1.74ガウスでの分裂が１：２：１
の比である３つのシグナルを有する強いe.s.r.ス
ペクトルを与え、エチルプロトンにはシグナルは
観察されなかつた。 実施例 ４ 尿中のＮ―アセチルグルコサミニダーゼ
（NAG）の検定 実施例１で製造したNAGの基質である４―
（２―アセトアミド―２―デオキシ―β―Ｄ―グ
ルコピラノシルオキシ）―３―メトキシ―ω―ニ
トロスチレン約３％含有する微晶質のセルロース
100mgを、小さなプラスチツクのサンプルチユー
ブ中で体温で新鮮な尿（１ml）または予め35〜38
℃に加温した貯蔵尿で処理する。チユーブの内容
物を30〜35℃で15〜30分間、たとえば37℃で20分
間インキユベートし、次いで底を綿花でふさいだ
パスツールピペツト中に入れた繊維状DEAEセル
ロース、たとえばワツトマン（Whatman）DE22
（登録商標）の短いカラム（約３×0.6cm）を通し
て抽出濾過させる。尿試料中のNAGの存在は、
DEAEセルロースカラムの上端から約0.5cm下の
クリムソンレツドの帯の顕色によつて示される。
あるときは尿中のウロクローム（urochrom）の
存在によつて広い薄茶色の帯がクリムソンレツド
の帯の上に形成し、腎移植して少数の患者では、
早く移動する茶―ふじ色の帯が多分患者が受けて
いる投薬により観察される。更に、その尿中に低
電解質濃度を有する糖尿病患者または乳児では赤
色帯はDEAEセルロースの先端表面の界面に形成
し、自然に一層広く分散する。この後者の影響は
試薬中に適当量の電解質を入れることにより克服
できる。しかし、すべての場合、赤い帯の幅およ
び強さは尿中のNAGの濃度にほぼ比例する。 セルロース上３％のグリコシドを用いて、正常
な尿（NAG約75nmol／ml）は狭く、弱く、緻密
な赤い帯を与えたが、異常な尿（＞200nmol／ml
NAG）はNAG濃度の増加によつて増強される強
い広い帯を与えた。同じ試験の条件下で、水およ
び煮沸してNAGを破壊した尿は陰性の結果を与
えた。 基本アツセイを一部変更して、３％グリコシド
物質の代わりにセルロース上に８％グリコシドを
用い、約20〜30nmol／mlからのNAG検出限界を
評価した。一部変更した方法において、正常な尿
は上で観察されたよりも更に強い帯を与え、この
ことは使用グリコシド基質の量の変更およびイン
キユベーシヨンの温度および時間に留意すること
により検出限界を選択することが可能であること
を示している。 本発明による透過流型装置の説明 第１図および第２図に関しては、実施例１で製
造したω―ニトロスチリルグリコシドを本発明に
よる透過流型装置に入れてもよい。両方の装置は
円筒形の上部インキユベーシヨン室(1)および下部
可視化室２からなり、両方の場合、下部可視化室
２は綿花または同様な物質の上層４および下層５
間にはさまれた繊維DEAEセルロース（ワツトマ
ンDE22）３を含有している。可視化室２の下端
には排液のための出口６を有し、装置が垂直方向
に立たせておくようにスカートまたは脚７が備え
られている。下部可視化室２の壁は、DEAEセル
ロースおよびその上に吸着した着色帯の何れかを
観察しうるように透明プラスチツクのような透明
物質からなつている。 上部インキユベーシヨン室１には適当な溶媒中
またはセルロースもしくは他の適当な吸収剤に吸
収させた適当量のグリコシド物質（図示せず）、
たとえば３％グリコシド含有微晶質のセルロース
（アビセル）100mgが入つている。インキユベーシ
ヨン室１にはスクリユーキヤツプ８が取付けら
れ、インキユベーシヨン中尿を隔離するための厚
いPVCまたはポリスチレン壁９を有しており、
壁９にはインキユベートするために導入される尿
の量を示すための線１０がマークされている。 線図、第１図および第２図では、上部および下
部隔室１および２にはそれらの間の連絡通路は示
されていない。 第１図については、隔室１および２は二面には
さまれた表面においてピボツトピン１１で一緒に
保持されている。インキユベーシヨン室１の基部
には偏心位置した出口１２を有し、可視化室の上
端にはピボツト１１から出口１２と同じ半径で偏
心位置した入口１３を有している。上部隔室１お
よび下部隔室２の相互の回転は、出口１２および
入口１３を互いに一致させることになり、インキ
ユベートした尿が流れることができる連結した隔
室の通路を与える。使用するには、新鮮な尿を隔
室１に、出口１２および入口１３を互いに一致さ
せずにマーク１０のレベルまで入れる。スクリユ
ーキヤツプ８を適切な位置にまわし尿を普通約15
〜20分であるが周囲の温度に依り所要の時間イン
キユベートする。次いで隔室を相互に回転し、出
口１２および入口１３を互いに合わせ、インキユ
ベートした尿をインキユベート室１から可視化室
２に排出する。尿中にNAGが存在する結果グリ
コシド基質によつて解離された２―メトキシ―４
―（β―ニトロ―エテニル）フエノールは、明る
いスカーレツト赤の帯をDEAEセルロースカラム
３の上端から約0.5cm下に形成させる。 第２図では、隔室１および２は隔室１の底の周
囲のねじ山１６および隔室２の上端から突起して
いる管状延長部１８の内側の周縁のねじ山による
ねじ山のかみ合いによつて一緒に保持されてい
る。隔室１と隔室２の間の通路は隔室１の底から
突起している管状延長部１４によつて与えられ
る。使用に先き立つて通路１４を隔室２の上端の
弱い部分１５を有する接合部によつて閉鎖する。
使用時、尿を隔室１に入れ、第１図の装置のよう
にインキユベートする。ただし、インキユベート
が完了すると、隔室１および隔室２を一緒にまわ
して管状延長部１４を弱い部分１５で破り、イン
キユベートした尿を隔室２に流す。基質から解離
したフエノールを見ることは第１図の装置と同じ
である。 両方の装置は「腎移植」患者が、その自宅で患
者自身が試験することができ、あるいは複雑な監
視装置を用いずに一般的なスクリーニングテスト
を容易に行うことのできる簡単な手段を提供する
ものである。NAG以外の他のエンチームを同様
な手法と装置を用いて検定してもよい。
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| US4948561A (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-14 | Eastman Kodak Company | Multiple level filter device and kit containing same |
| US4968486A (en) * | 1989-07-14 | 1990-11-06 | Eastman Kodak Company | Device for absorbing shock to a container |
| GB9107983D0 (en) * | 1991-04-15 | 1991-05-29 | Blake David R | Assays |
| US5416003A (en) * | 1993-04-14 | 1995-05-16 | Litmus Concepts, Inc. | Reporter enzyme release technology: methods of assaying for the presence of aspartic proteases and other hydrolytic enzyme activities |
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