SU1119334A1 - 6-Гексадеканоиламино-4-метилумбеллиферил- @ - @ -галактопиранозид в качестве флуорогенного субстрата дл определени активности галактоцереброзид- @ -галактозидазы - Google Patents

Abstract

б-Гексадеканоиламино-А-метил- умбеллиферил- -D- галактопиранойид СНз-(СНг),гОС-НЫ Gal-j3-0 в качестве фпУорогенного субстрата с дл  определени  активности галактоце- S рёброзид-&,-галактозида9ы (КФ 3,2,1, /А

Description

Изобретение относитс  к области органическрй химии и конкретно касаетс  HoiBoro производного 4-метилумбеллиферил- -галактопираноздца, которое обладает свойством флуорогенного субстрата дл  определени  активности галактоцереброэид-.5 -га лактозидаэы (Gal-cer-Р--Gal КФ 3.2,1.46) и может найти применение а диагностике одного из наследственных гликолипидрзов болезни Краббе, развивающейс  при недостаточности указанного фермента. Известно использование в качест ве субстрата дл  определени  актив , ности и специфичности (J Gal природного РН-С -гaлaктoJ-цepeброзид- -галактопиранозида с радиоактивной меткой 1} . Недостатком использовани  природного субстрата  вл етс  дороговизна, слоетшсть получени  и нереальность пр$-1меиени  в насто щее врем  в услови х клиники Из-за отсутстви  дорогосто щего оборудовани , Наиболее близким по структуре к описьтаемому соединению  вл етс  2-г .ексадеканош7амино-4-нйтрофенил-Э -D-галактопиранозид (HNGal), который был использован в качестве -субстрат дл  Определени  актганости Gal-cer- -Gal и предложен дл -диагностики болезни Краббе 2j. Недостатком применени  HNGal  вл етс  низка  специфичность и чувствительность; при определении aKTjroHocTH Gal-cer- fs -Gal использованием в -качестве субстрата NHGal ферментный препарат из лейкоци тов или кожных фибробластов до;шен содержать 0,2-0,6 г белка, т«е, в 10-20 раз Сольще, чем в случае природного субстрата с радиоактивной меткой LI.. Сложность получени  такого большого количества ферментного .препарата крайне затрудн ет применение NHGal как субстрата дл  определени  активности фермента, особенно в случае пренатальной диагностики б лезни Краббе. - , ., Цель изобретени  новое производ . ное 4-метилу беллиферил-{ -D-галактопйраНозида . которое обладает свойством флуорогенного субстрата дл  определени  активности Gal-cer p -Ga и применение которого повышает чувст вительность и специфичность метода . определени  активности фермента. Поставленна  цель достигаетс  6-гексадеканоиламино-4-метш1умбеллиферил-р -D-гапактопиранозидом ai3-(CH2)irOC-HN О О Gal-p-0 обладающим свойством флуорогенного субстрата дл  определени  -активности Gal-cer- -Gal. Способ получени  описываемого соединени  заключаетс -во взаимодействии 4-метилумбеллиферона с солью нитрони , восстановлении полученного 6нитропроизводного до соответствующего амина, ацилировании последнего хлорангидридом пальмитиновой кислоты, гликозилировании продукта ацилиро- . вани  с -бромтетраацетатом В галак- тозы и деацетилировании полученного ацетата галактозвда 2. Пример 1, К суспензии 5 г 4-метилумбеллвферона CD в 50 мл абс. МеСН. при О С и перемешивании добавл ют порци ми 3,7 г тетрафторбората нитрони , перемешивают при О С 30 мин, осадок отфильтровьшают, перекристаллизовйвают из 125 мл смеси EtOH-MeNOj. (1:4). Получают 3 г (60%) 6-нитро-4-метилумбеллиферона СП) т.пл. 257 ,260° С, Т.пл. пробы смешени  с заведомым образцом, полученным по DJ , 257 С. Rf 0,5 (силуфол, ЕСОАс-СНС1з 1:15). К суспензии 5,5 г (II) в 30 мл 25%-ного водного раствора NH) приливают 30 мл насьвденного при 20 С водного раствора дитионита натри , кип т т 15 мин, охлаждают и отфильтровывают осадок. Получают 4,6 г (97%) 6-амино-4-метилумбеллиферона (III), т.пл. 272 С. Согласно 4 , т.пл. 273°С. Ri 0,85 (силуфол, МеОН). К раствору 3,6 г (III) в 90 мл сухого пиридина при перемешивании добавл ют 9 мл хлорангидрвда пальмитиновой кислоты, перемешивают при 20°С 3 ч, приливают 50 мл MeCN, осадок отфильтровьшают, перекристаллизовывают из 75 мл смеси 1:1, получают 8 г (98%)6-гексадеканоиламиНО-4-метилумбеллиферона (IV), т.пл. 131 С. Rf 0,67 (силуфол EtOH-CHCl3 1М). ИК-спектр, см 3390 (NH), 1700 (СО). Максимум флуоресценции 15 нм при )Q,,f, 342 нм. Натриевую соль (IV) получают до , бавлением эквимол рнох-О колт чества EtONaslO мл EtOH к аствору 8 г (IV) в 50 мл сухого ТГФ, концентрируют к отфильтровывают Na-соль, выход 100%, т.пл. 280 С. Максимум флуоресценции А50 нм при 387 нм. УФ-спектр; ,v, 390-нм, е 12840(ТГФ). К суспензии I г Na.ccJiH (IV) в 50 мл сухого ТГФ добавл ют раствор 0,85 г Д-бромтетраа цетата 0-гала1Ктозы в 10 мл смеси ТГФ Ме SO (1:1), Смесь кип т т 22 ч, фильтруют, упаривают , приливают 120 мл воды и экст 5 рагируют 100 мл GHC2,. Экстракт сушат над СаСб. , упаривают, остаток раствор ют в Et.O и фильтруют через 2-х сантиметровьй слой силикагал , фильтрат упаривают. Получают 1,1 г (65%) 6-гексадеканоиламино-4- . -метилумбеллиферил- -D-0-тетраацетилгалактопиранозида (V)r, т.пл., . бЭ.С. R.E 0,65 (силуфол, ClrlCilj-MeOH 9:1) , ИК-спектр,. см: 3420 (КН), 1760 (СО), 1240 (). К раствору 0,4 г (V) в 10 мл абс. MeCN приливают О,12 мл 0,5 М раствора He ОКА в 10 мл абс. МеОН, вьщерживают при 36 ч, осадок отфильтровдаают,30 перекристаллизовывают .из EtOH, Получают 0,18 г (58%) 6-гекс:адеканоиламино-4-метилумбеллиферил- )-галактопи ранозида (HMGal),f,пл, 204-205 С. : Rf 0,24 (силуфол, CHCUj-Me-j CO 1:1), 34 Максимум флуоресценции 413 нм при нм. ГОГР-спектр, Brucker-250, ( CDj) SO, м,д, о ;,2 (алиф, СН.) 1,55 алиф.), 2,3 (аром, СН,) 4,82 дубл., j 8 Гц (сЛ-аном, Н при 40 Ci галактозы , 3,4-3,7 мульт, (Н галактозы ), 6,24, 7,13, 8,43 сингл. (Н аром,). раствор в (СНз).,.г П р им ер 2. Инкубационна  . .j смесь (0,1 мл) содержит 0,25 мг неочИщЁнного таурохолата натри , 15 мкг . олеиновой кислоты, 25 мкл -цитрат-ного буфера (рН 4,5), 55-30 нмоль liMiSal, 30-100 мкг белка ферментного прелара-JQ IM9 ; s; 5 О 20 25 34 , 4 та из лейкоцитов или кожных фибробласТОЕ человека Врем  инкубахщи составл ет 4-6 ч при 37 С, Ферментную реакцию останавливают добавлением 0,7 мл , смеси EtOH-глицкновый буфер (рН ) 5:2, Количество расщепленного HMGal рассчитьшают относительно флуоресценции стандартной концентрации (IV) в смеси EtOH-глици овый буфер (рН 10,5), 5:2, Активность достигает максимума при насыщении HMGal 70 нмоль в пробе , 0,071. В таблице приведены данные по сравнительному определению активности Gal-cer- -Gal и GM(- -галактозидазы (G, , КФ 3,2.1,23 в лейкоцитах и кожных фибробластах в норме при G -ганглиозндозе (недостаточность ) и в случае предполагаемой болезни Краббе с испольаованием в качестве субстратов HMGal, HNGal и 4-метилумбеллиферил- ( -D-галактопиранозида (MGal), Активность ферментов выражена в нмол х расщепленных субстратов за I ч на 1 мг белка. В квадратных скобках число определений} в круглых скобках - пределы колебаний активкостей; И.о. - актитюсть фермента с У1сазанным субстратом не определ етс , использование HMGal в качестве флуорогенного субстрата дл  определенк  активности Gal-cer- -Gal рбесцечивает на пор док более-высокую чувствительность метода, чем его структурный аналог NHGal и более высокую специфичность. j . Соединение по изобретению дает возможность проводить диагностику болезни Краббе и вы вл ть гетерози готньк носителей этого заболевани  по унифицированным методам вы влени  других лизосомньпс болезней накопле«и , при которых недостаточность какото - либо фермента устанавлива-г етс  с помощью субстратов - производиых 4 - метнлумбеллиферо э С-Ч

Активность Gal-cer-)3-Gal и 0„, г p-Gal в культивированных фибробластах. кожи и лейкоцитах человека в норме к при некоторых гликолипидозах

Активность Gal-cer- -Gal

Источник фермента субстраты

HMGal

Активность G;v,| - р -Gal MGal

HNGal

1,05 21 2,07 С2 (0,9-2,2) (1,99-2,14)

0,06 1 0,00 Ш

бе

1,10 53 2.17 t5 (0,61-2,06) (1,68-3,53)

идоз

0,9 С31 1,75 Dl (0,57-1,25)

0,75 W и.о. (0,56-0,89)

308 12 (168-447)

256 01

325 С5Л . (144-584)

4,00 СЗ (2,30-5,04)

96,1 т

(80,8-135,4)

Claims (1)

1. ' б-Гексадеканоиламино-4-метилумбеллиферил- 0 -D- галактопираноэид в качестве флуорогенного субстрата с для определения активности галактоце· CS реброзид-0,-галактозидазы (КФ 3,2,1, 46Ϊ·.,