JPH02269967A - 細胞観察方法及び細胞観察システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞の観察方法及び、該方法を実施するため
の観察システムに関し、さらに詳しくは、細胞の濃度及
び各々の細胞の大きさを画像処理によって計測する細胞
の観察方法及び、該方法を実施するための観察システム
に関する。

〔従来の技術〕

細胞培養の順・不順を判断するうえで、細胞濃度は最も
重要な指標であり、培養中は、経時的に測定する必要が
ある。従来は、人が目視でこれを測定していたが、１回
の測定に長時間を要するため測定頻度に限界があった。

また、測定者が異なると、細胞か夾雑物かの判断基準も
異なってしまう欠点があった。

画像処理を用いて、細胞を認識する方法もいくつか堤唱
されている。最も容易に着想されるのは単なる固定２値
化による認識法である。また、特開閉６２−２０１３３
２公報では、線形空間フィルターを用いる細胞認識法が
開示されている。これは、画像からある領域を切り出し
、細胞の平均的なサイズ及び形状に適合するように設定
した形状の空間フィルターの係数マトリクスによって積
和演算する方法である。この方法によれば、空間フィル
ターのサイズ及び形状と画素の輝度パターンのそれとが
一致する領域で変換後の輝度は最大となるので、２値化
によって、その輝度が最大となった個々の領域を、それ
ぞれ、１個の細胞の占有する領域と認識するものである
。

細胞数を計測する方法については、特開昭６２−２０１
３３２公報では、前記細胞と認識された個々の領域の画
素数の合計を、あらかじめ設定された平均的な１個の細
胞が占有する画素数で除すことによって算出する方法が
示されている。

〔発明が解決しようとする課題］ 画像処理による細胞認識法の従来技術として２種の方法
を示したが、まず、単なる固定２値化による認識法につ
いて、その問題点を説明する。この方法には、背景の輝
度ムラや画像内の夾雑物を排除することが困難という問
題点がある。細胞懸濁液は細胞の死骸、ゴミ、その他の
夾雑物が含まれているのが、ごく通常の状態である。ま
た、背景の輝度ムラも、顕微鏡の光学系において、ラン
プからの光軸のズレやレンズの汚れによって、容易に発
生する。そのような条件下では、単純な固定２値化によ
る認識法は誤認識がひどく、はとんど実用にならない。

次に、特開昭６２−２０１３３２公報に開示された、上
記線形空間フィルターを用いる細胞認識法について、そ
の問題点を説明する。この方法は、上記のように細胞の
平均的なサイズ及び形状に適合するように設定した空間
フィルターのサイズ及び形状と画素の輝度パターンのそ
れとが一致する領域で変換後の輝度は最大となり、２値
化によって前記一致する領域の部分を細胞と認識するも
のであるから、その画素の輝度パターンが空間フィルタ
ーのサイズ及び形状と一致しない背景の輝度ムラや画像
内の夾雑物を細胞としての認識対象から排除することは
可能である。しかし、個々の細胞のサイズ及び形状には
ばらつきがあり、すべての細胞を単一のサイズ及び形状
の空間フィルターで認識することは不可能である。また
、線形空間フィルター処理後の画像では、細胞の原形が
保存されず、個々の細胞の大きさ、形状等を個別に観察
することは、不可能である。

本発明の目的の一つは、原画像における個々の細胞の大
きさ・形状を正確にとらえることのできる細胞観察方法
及び細胞観察システムを提供することにある。

懸濁液内の細胞の大きさは、培養のフェーズによって、
全体が一つの傾向に従って変化する。あらかじめ設定さ
れた平均的な１個の細胞が占有する画素数で、細胞と認
識された個々の領域の画素数の合計を除して細胞の個数
を計測する方法は、細胞の存在する領域内、すなわち、
懸濁液内の細胞が均一に小さい場合及び、均一に大きい
場合には、誤差が大きくなる。

したがって、本発明の別の目的は、個々の細胞の大きさ
の変動によって測定誤差を生じない細胞観察方法及び細
胞観察システムを提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 上記目的を達成するために、本発明の細胞観察方法は、
細胞の存在する領域を撮像した画像をディジタル変換後
、画像メモリに記憶し、この画像に一連の画像処理を加
えて細胞の存在する部分を認識する細胞観察方法におい
て、細胞の一部分を認識する段階と、前記細胞の一部分
として認識した部分の輝度を基準にして、前記細胞の認
識部分を未認識部分へ拡張する段階との２段階を経て、
細胞数及び各々の細胞の大きさを計測することを特徴と
する。

さらに、前記本発明の細胞観察方法の各構成要件の、好
ましい、乃至、具体的態様について述べると、まず、前
記細胞の一部分を認識する段階における前記認識は、細
胞の存在する領域における細胞と細胞以外の部分との輝
度差によって行われるか、線形空間フィルターをもちい
て行われ、前記１個の細胞の一部分の認識する方法の一
つは、前記１個の細胞の一部分の輝度と、前記細胞の一
部分に隣接して存在する低輝度の部分との輝度差によっ
て行われ、その細胞の一部分に隣接して存在する低輝度
の部分との輝度差は、原画像の輝度とその極小値フィル
ター処理後の画像の輝度との減算によって求められる。

また、このような輝度差の値による１個の細胞の一部分
の認識は、輝度差の値を固定２値化処理することによっ
て行われる。

なお、極小値フィルターは非線形空間フィルターの一種
であり、領域内で最小の輝度を領域中央の画素の輝度と
するものである。

なお、線形空間フィルターは、単独では［発明が解決し
ようとする課題］に述べた問題点を有しているが、上記
のように、本願の細胞の一部分を認識する方法として用
いることは可能である。

前記細胞の認識部分を未認識部分へ拡張する段階は、す
でに細胞と認識した細胞の部分に隣接し、輝度差が一定
範囲内である部分を順次、細胞の認識前に含めることに
より行われる。そしてその段階における、すでに細胞と
認識した細胞の部分と、前記細胞の部分に隣接した部分
との輝度差は、細胞と認識した部分を原画像にマスキン
グし極大値フィルターをかけた画像の輝度と、原画像の
輝度との減算によって求められる。

なお、極大値フィルターもまた非線形空間フィルターの
一種であるが、極小値フィルターとは逆に、領域内で最
大の輝度を領域中央の画素の輝度とするものである。

また、細胞の認識部分を未認識部分へ拡張する段階にお
いて生じた誤認識部の除去は、認識前の細胞と細胞以外
の部分を含む原画像の輝度を固定２値化して得た固定２
値化画像と、すでに細胞と認識した細胞の部分に隣接し
、輝度差が一定範囲内である部分の輝度を２値化して得
た２個画像との論理積をとることによって行われる。

そして、前記２つの段階を経て行われる、画像内の細胞
数及び各々・の細胞の大きさの計測は、２値化後の画像
に基づいて行われ、さらに、好ましくは、画像内の細胞
数及び各々の細胞の大きさの計測は、２値化後の画像を
ラベリングし、このラベリングした画像に基づいて行わ
れる。

なお、ラベリングは、２個画像上で、連結して“１”の
値を持っている画素の塊ごとに番号をつける処理である
。

さらに、上記細胞観察方法を実施するための、本発明の
細胞観察システムは、細胞の存在する領域を撮像する撮
像手段と、前記撮像手段によって得られた画像をディジ
タル変換する手段と、ディジタル変換された画像信号を
記憶する画像メモリと、前記画像メモリに記憶された画
像に一連の画像処理を加えて細胞の存在する部分を認識
する細胞認識手段とを具備する細胞観察システムにおい
て、前記細胞認識手段が、前記領域における細胞と細胞
以外の部分との輝度差によって、細胞の一部分を認識し
、前記細胞の一部分として認識した部分の輝度を基準に
して、前記細胞の認識部分を未認識部分へ拡張する手段
からなり、かつ、前記細胞認識手段の認識結果に基づい
て、細胞数及び各々の細胞の大きさを計測する手段を具
備することを特徴とする。

そして、前記撮像手段としては、スライドグラス、血球
盤等のガラス板上の細胞を光学顕微鏡で拡大して撮像す
る手段、カルチャーフラスコで静置培養中の細胞を光学
顕微鏡で拡大して撮像する手段、或いは、培養槽から抜
き出した細胞懸濁液を光学顕微鏡上のフローセルに導き
、像を拡大して撮像する手段等を具備するものを挙げる
ことができる。

本発明の細胞観察システムには、好ましくは、さらに、
計測された細胞数を懸濁液中の細胞濃度に換算するため
の演算回路が付設される。

本発明の細胞観察方法及び細胞観察システムの観察対象
となる細胞としては、動物細胞、植物細胞、微生物、ウ
ィルス等を挙げることができ、これらのうち一種の細胞
、或いは、複数の適当な細胞の組み合わせを観察対象と
することもできる。

〔作　用〕

細胞の一部の認識と、輝度差を利用して細胞全体への認
識領域の拡張をする細胞認識法によって、原画像におけ
る細胞の大きさ・形状を正確にとらえることが可能であ
る。また、ラベリングにより細胞の個数を計測すること
によって、細胞の大きさの差異による影響を排除できる
。逆に、各々の塊の画素数から、各々の細胞の大きさを
計測することも可能である。

［実施例］ 本発明の実施例を、図面を用いて説明する。

第２図は、本発明を動物細胞の観察に適用したシステム
の一例である。光学顕微鏡１１０は、細胞液容器＋２０
に入った動物細胞の像を拡大する。ＴＶカメラ等の撮像
手段１３０は、動物細胞像をアナログ信号に変換して、
画像処理装置１４０に送出する。画像処理装置１４０は
、Ａ／Ｄ変換回路１４１゜画像メモリ１４２、濃淡画像
処理回路１４３、２値化回路１４４、２個画像処理回路
１４５、　ラベリング回路１４６、　特徴量抽出回路１
４７、　数値演算回路１４訳数値メモ１月４９を、内蔵
しているものとする。画像処理装置１４０には、モニタ
ーＴＶ１５０が接続さており、画像処理前の動物細胞画
像や認識結果の２値画像などが映される。また、画像処
理装置１４０には、ＶＤＴターミナル１６０が接続され
ており、認識条件の設定や計測結果の表示が可能である
。画像処理装置１４０には、さらにプリンター１７０が
接続されており、観察結果を記録できる。

次に、第２図及び第３図を用いて、画像処理装置１４０
における処理の流れを説明する。撮像手段１３０からの
信号は、画像処理装置１４０への入力後ただちに、Ａ／
Ｄ変換回路１４１によってディジタル画像信号への変換
工程２００を受ける。−切の画像処理を受けていないこ
の画像信号を画像メモリ１４２に記憶し、細胞認識の工
程において反復して使用する。以降、この画像信号を原
画像と称する。

細胞を認識する工程２１０は、極小値フィルター・極大
値フィルター・減算等の濃淡画像処理回路１４３を用い
る処理及び、２値化回路１４４を用いる処理、２個画像
処理回路１４５を用いた２値画像の論理演算から構成さ
れている。この、細胞を認識する工程２１０については
、詳細をあとでさらに説明する。

ラベリング回路１４６において、認識した細胞に１個ず
つ番号づけしながら、その個数を計測する工程２２０に
かける。求めた細胞数は、１画面分の領域の実際のサイ
ズなど、細胞の観察を開始する曲にあらかじめ人力した
パラメータにしたがって、細胞濃度に換算する。これが
、第３図における工程２３０である。

一方、番号づけの終った細胞は、１個ごとにその大きさ
を計測する工程２４０を、特徴量抽出回路１４７におい
て受ける。細胞の番号と大きさを対応づけ、各々の細胞
の大きさの情報を、大きさレベルごとの頻度分布を求め
る工程２５０や、細胞の大きさの最大値・最小値・平均
環の統計量を求める工程２６０で利用する。

画面内の細胞個数の細胞濃度に換算する工程２３０及び
、細胞の大きさの最大値・最小値・平均環の統計量を求
める工程２６０は、数値演算回路１４８を使用し、その
結果は数値メモリ１４９に記憶する。

次に、第１図を用いそ細胞を認識する工程の詳細を説明
する。この工程は、さらに細胞の一部を認識する工程及
び、認識領域を拡張して細胞の全体像を把握する工程に
分けられる。なお、以下の説明文の末尾の括弧中の工程
番号は、第１図に図示された各工程の番号を示す。

細胞の一部分を認識する工程では、まず、原画像に極小
値フィルターをかけ、原画像から減算した（工程１０〜
２０）。極小値フィルターは、使用した画像処理装置に
常設されている３×３画素のものを用いた。これら２つ
の処理は、輝度差が大きい隣接した２画素がある箇所で
、高輝度側の画素にその輝度差、低輝度側の画素にＯを
、それぞれ新たな輝度として与える効果を持つ。細胞が
撮偉さだ画像にこれらの処理を適用した場合、細胞の周
辺には低輝度な画素が存在するので、細胞の輪郭付近が
高輝度になった濃淡画像が得られた。これを２値化する
と、ドーナツ形ないしは三日月形の２値画像が得られた
く工程３０）。また、小さい細胞の場合には、１度で全
体像を認識できることもあった。

細胞ではない箇所にも、輝度差の大きい隣接した２画素
が発生することがあった。このような居所では、高輝度
側の画素でも一般的な細胞の輝度水準よりは低輝度であ
ることが多く、原画像を直接固定２値化した２値画像と
の論理積をとることによって排除できた（工程４０〜４
５）。

細胞認識工程の後半である認識領域の拡張は、各々の細
胞が輝度差の大きい周辺画素に囲まれ、その中の輝度差
は比較的小さいことを利用して行った。

まず、細胞の一部分が認識された２値画像の細胞の部分
だけを原画像から切りとった（工程５ｏ）。

これは、輝度差が小さいという特徴は細胞の部分だけの
ものではなく、背景の大部分においても近傍の画素との
輝度差は小さいため、細胞の部分だけを選択する必要が
あるからである。

次に、この濃淡画像に極大値フィルターをかけた（工程
６０）。この処理によって、元の細胞認識領域及び、そ
の近傍が正の輝度を持ち、背景の輝度は０の濃淡画像が
得られる。極大値フィルターもまた橿小値フィルターと
同様に、使用した画像処理装置に常設されている３×３
画素のものを用いた。この濃淡画像から原画像を減算す
ると、背景は負、細胞周辺は高輝度、そして細胞は０ま
たは低めの正の輝度を持った濃淡画像が得られる（工程
７０）。これを、０からある闇値までを“ｌ”とする条
件で２値化すると、細胞の部分だけを抽出できる　（工
程８０）。このときの細胞の部分には、元の細胞の部分
に隣接し、輝度差の小さい画素も含まれている。すなわ
ち、１画素分拡張できたということである。

原画像の固定２値化との論理積によって、はみだしの危
険性を一層少なくしたく工程９０）。

以上の細胞認識領域の拡張操作を、拡張が起こらなくな
るまで反復する。反復回数は、５〜７回が目安である。

線形空間フィルターを用いた細胞認識方法と、本発明の
細胞認識方法とを、細胞が撮像された画像の同一の部分
に適用した例を、それぞれ第４図と第５図に示す。黒色
の個所が、認識された部分である。本発明のＬｅａ　３
１＆方法によれば、１つの細胞のより大きな部分を認識
できることがわかる。

また、線形空間フィルターを用いた細胞認識方法と、本
発明の細胞認識方法とによって認識された各細胞をラベ
リングして大きさを求めた後、大きさレベルごとの細胞
数を数え、グラフにした例をそれぞれ第６図と第７図に
示す。線形空間フィルターを用いたものは、大きさの小
さい非細胞の高輝度画素を多く誤認識しており、また認
識できた最大の大きさは、１８画素までであった。

一方、本発明の認識方法によれば、細胞の大きさは最大
４３画素まで認識できており、分布も中程度の大きさで
最頻となっていて、正規分布により近い。

なお、線形空間フィルターによって認識した細胞をラベ
リングして、各個の大きさを求める方法も、請求項８．
９の細胞観察方法の実施例ではある。

本発明の認識方法を用いて多数の画像を処理し、その性
能を目視計測との比較で評価すると、認識率（画像処理
により認識された細胞の個数／目視で計測した細胞個数
）は、７０〜１４０％の水準で、多くの場合１００％前
後となった。

（発明の効果） 上記従来の線形空間フィルターを用いる細胞認識法では
、細胞の平均的なサイズ及び形状に適合するように設定
した空間フィルターのサイズ及び形状と画素の輝度パタ
ーンのそれとが一致する領域の部分を細胞と認識するも
のであるから、サイズ及び形状にはばらつきがある個々
の細胞のすべてを認識することは不可能である。また、
線形空間フィルター処理後の画像では、細胞の原形が保
存されず、個々の細胞の大きさ、形状等を個別に観察す
ることは、不可能である。

また、上記の従来の線形空間フィルターを用いる細胞認
識法では、あらかじめ設定された平均的な１個の細胞が
占有する画素数で、細胞と認識された個々の領域の画素
数の合計を除して細胞の個数を計測するものであるから
、細胞の存在する領域内、すなわち、懸濁液内の細胞が
均一に小さい場合及び、均一に大きい場合には、誤差が
大きくなる。

これに対し、本発明は、細胞と細胞以外の部分の輝度差
を利用して、細胞の一部の認識と細胞全体への認識領域
の拡張をする細胞認識法によって細胞の大きさ・形状を
認識するものであるから、実際の細胞の大きさ・形状を
正確にとらえることが可能である。また、ラベリングに
より細胞の個数を計測することによって、細胞の大きさ
の差異による影響を排除できる。逆に、各々の塊の画素
数から、各々の細胞の大きさを計測することも可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いる細胞認識方法を表わすフローチ
ャート、第２図は本発明の細胞観察システムの構成例を
表わす図、第３図は本発明の細胞観察方法の実施例を表
わす図、第４図は線形空間フィルターによって認識され
た細胞の例を表わす図、第５図は本発明の認識方法によ
って認識された細胞の例を表わす図、第６図は線形空間
フィルターによって認識された細胞の大きさ分布の例を
表わす図、第７図は本発明の認識方法によって認識され
た細胞の大きさ分布の例を表わす図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞の存在する領域を撮像した画像をディジタル変
   換後、画像メモリに記憶し、この画像に一連の画像処理
   を加えて細胞の存在する部分を認識する方法において、
   細胞の一部分を認識する段階と、前記細胞の一部分とし
   て認識した部分の輝度を基準にして、前記細胞の認識部
   分を未認識部分へ拡張する段階との２段階を経て、細胞
   数及び各々の細胞の大きさを計測することを特徴とする
   細胞観察方法。 ２、細胞の一部分を認識する段階における前記認識を、
   細胞の存在する領域における細胞と細胞以外の部分との
   輝度差によって行うことを特徴とする請求項１記載の細
   胞観察方法。 ３、１個の細胞の一部分の認識を、前記１個の細胞の一
   部分の輝度と、前記細胞の一部分に隣接して存在する低
   輝度の部分との輝度差によって行うことを特徴とする請
   求項２記載の細胞観察方法。 ４、細胞の一部分に隣接して存在する低輝度の部分との
   輝度差を、原画像の輝度とその極小値フィルター処理後
   の画像の輝度との減算によって求めることを特徴とする
   請求項３記載の細胞観察方法。 ５、１個の細胞の一部分の認識を、輝度差の値を固定２
   値化処理することによって行うことを特徴とする請求項
   ２乃至請求項４項のいずれかの項記載の細胞観察方法。 ６、細胞の一部分を認識する段階における前記認識を、
   線形空間フィルターを用いて行うことを特徴とする請求
   項１記載の細胞観察方法。 ７、細胞の認識部分を未認識部分へ拡張する段階は、す
   でに細胞と認識した細胞の部分に隣接し、輝度差が一定
   範囲内である部分を順次、細胞の認識部に含めることに
   より行うことを特徴とする請求項１乃至構成６項のいず
   れかの項記載の細胞観察方法。 ８、すでに細胞と認識した細胞の部分と、前記細胞の部
   分に隣接した部分との輝度差を、細胞と認識した部分を
   原画像にマスキングし極大値フィルターをかけた画像の
   輝度と、原画像の輝度との減算によって求めることを特
   徴とする請求項７記載の細胞観察方法。 ９、細胞の認識部分を未認識部分へ拡張する段階におい
   て生じた誤認識部の除去を、認識前の細胞と細胞以外の
   部分を含む原画像の輝度を固定２値化して得た固定２値
   化画像と、すでに細胞と認識した細胞の部分に隣接し、
   輝度差が一定範囲内である部分の輝度を２値化して得た
   ２値画像との論理積をとることによって行うことを特徴
   とする請求項７又は請求項８記載の細胞観察方法。 １０、画像内の細胞数及び各々の細胞の大きさの計測は
   、２値化後の画像に基づいて行うことを特徴とする請求
   項１乃至請求項９のいずれかの項記載の細胞観察方法。 １１、画像内の細胞数及び各々の細胞の大きさの計測は
   、２値化後の画像をラベリングし、このラベリングした
   画像に基づいて行うことを特徴とする請求項１０記載の
   細胞観察方法。 １２、細胞が、動物細胞、植物細胞、微生物、及びウィ
   ルスの何れか、或いは、これらの組み合わせであること
   を特徴とする請求項１乃至請求項１１のいずれかの項記
   載の細胞観察方法。 １３、細胞の存在する領域を撮像する撮像手段と、前記
   撮像手段によって得られた画像をディジタル変換する手
   段と、ディジタル変換された画像信号を記憶する画像メ
   モリと、前記画像メモリに記憶された画像に一連の画像
   処理を加えて細胞の存在する部分を認識する細胞認識手
   段とを具備する細胞観察システムにおいて、前記細胞認
   識手段が、前記領域における細胞と細胞以外の部分との
   輝度差によって、細胞の一部分を認識し、前記細胞の一
   部分として認識した部分の輝度を基準にして、前記細胞
   の認識部分を未認識部分へ拡張する手段からなり、かつ
   、前記細胞認識手段の認識結果に基づいて、細胞数及び
   各々の細胞の大きさを計測する手段を具備することを特
   徴とする細胞観察システム。 １４、撮像手段が、スライドグラス、血球盤等のガラス
   板上の細胞を光学顕微鏡で拡大して撮像する手段を具備
   することを特徴とする請求項１３記載の細胞観察システ
   ム。 １５、撮像手段が、カルチャーフラスコで静置培養中の
   細胞を光学顕微鏡で拡大して撮像する手段を具備するこ
   とを特徴とする請求項１３記載の細胞観察システム。 １６、撮像手段が、培養槽から抜き出した細胞懸濁液を
   光学顕微鏡上のフローセルに導き、像を拡大して撮像す
   る手段を具備することを特徴とする請求項１３記載の細
   胞観察システム。 １７、計測された細胞数を懸濁液中の細胞濃度に換算す
   るための演算回路を付設したことを特徴とする請求項１
   ３乃至請求項１６のいずれかの項記載の細胞観察システ
   ム。 １８、細胞が、動物細胞、植物細胞、微生物、及びウィ
   ルスの何れか、或いは、これらの組み合わせであること
   を特徴とする請求項１３乃至請求項１７のいずれかの項
   記載の細胞観察システム。