JPH02261552A

JPH02261552A - 陰イオン交換樹脂の製造方法

Info

Publication number: JPH02261552A
Application number: JP1080721A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Inoue; 嘉則井上; Hiroki Kumagai; 熊谷　浩樹
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1990-10-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、クロマ１−管に充填され多糖類が共存してい
る試料中の陰イオンを液体クロマトグラフィー手法（イ
オンクロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量分析
するのに用いて好適な陰イオン交換樹脂（充填剤）を製
造する方法に関する。

〈従来の技術〉一般に、タンパク質等が共存している試料中の陰イオン
を液体クロマトグラフィー手法（イオンクロマトグラフ
ィー手法も含む）を用いて定量分析すると次のような問
題が生じていた。即ち、分離カラム内に充填された陰イ
オン交換ＶＩＪ脂の表面若しくはイオン交換基に試料中
のタンパク質などが吸着し、みかけ上のイオン交換容量
が低下して陰イオンの分離性能が低下したり定量性が低
下することが多かった。また、このようにして吸着した
タンパク質が蓄積することにより上記分離カラムの圧力
が上昇することも多く、このような圧力上昇が生ずると
上記分離カラムの再生は実際上不可能となっていた。こ
のような問題を解決する方法としては、試料からあらか
じめタンパク質を除去する方法、上記分離カラムを頻繁
に洗浄して吸着したタンパク質を除去する方法、及びタ
ンパク質を吸着するプレカラムを備えた切換弁を分離カ
ラムの前に設置してタンパク質を除去する方法などが行
なわれていた。

〈発明が解決しようとする問題点〉黙しながら、試料からあらかじめタンパク質を除去する
方法の場合、第１に試料の前処理に時間がかかること、
第２に除タンパク剤が測定対象イオンの分離に悪影響を
及ぼす可能性があること、第３に沈澱などで除去される
タンパク質の中に目的成分が取りこまれてしまうことな
どの欠点があった。また、分離カラムを頻繁に洗浄して
吸着したタンパク質を除去する方法の場合は、第１に分
析を一旦停止しカラムに移動相と異なる溶媒を流さなけ
ればならず、分析の連続性を維持しなりメンテナンスの
効率確保などの面から好ましいことではないこと、第２
に一旦吸着したタンパク質は簡単に洗い流すことができ
ず結果的にカラムの消耗が早いという欠点があった。タ
ンパク質を吸着するプレカラムを分離カラムの前に設置
してタンパク質を除去する方法は、上述のような欠点が
なく現在では最も優れた方法であるが、装置が複雑なう
えプレカラム（吸着カラム）のメンテナンスが必要とな
るという新たな欠点があった。

本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、そ
の目的は、クロマト管に充填されタンパク質が共存して
いる試料中の陰イオンを液体クロマトグラフィー手法（
イオンクロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量分
析するのに用いて好適な陰イオン交換樹脂（充填剤）を
製造する方法を提供することにある。

く問題点を解決するための手段〉上述のような問題点を解決する本発明の特徴は、陰イオ
ン交換樹脂（充填剤）を製造する方法において、クロマ
ト管に充填されイオンクロマトグラフ用分離カラムや液
体クロマトグラフ用分離カラム等として使用される陰イ
オン交換樹脂を下記（イ）〜（ホ）の工程で製造するこ
とことにある。

（イ）反応方法に合わせて一定の官能基をもつ高分子ゲ
ルを用意する工程。

（ロ）前記高分子ゲルを多糖類が固定化されやすい溶媒
中に分散させる工程。

（ハ）前記分散溶液中に、結合させる多糖類を混合し固
定化させ、反応終了後、前記溶媒で充分洗浄する工程。

（ニ）イオン交換基となる化合物を混合し、一定温度下
で一定時間反応させる工程。

（ホ）前記反応によって生じた樹脂を充分に水で洗浄し
、その後、目的の対イオンに交換する工程。

〈実施例〉以下、本発明について図を用いて詳細に説明する。第１
図は本発明に係わる陰イオン交換樹脂（充填剤）の製造
方法を説明するための工程説明図である。この図におい
て、最初、反応方法に合わせて一定の官能基をもつ高分
子ゲルを用意する。

これは、基材となるものである６例示するならば、エポ
キシ基が３５０μｍ　ｏ　ｌ　／　ｇ導入された粒子径
１２μｍのヒドロキシアルキルメタクリレ−Ｉ・系架嬌
高分子ゲルなどが挙げられる。尚、反応方法に合わせて
一定の官能基を導入しな樹脂を作っても良い。

次に、上記高分子ゲルを多糖類が固定化されやすい溶媒
中に分散させる。例示するならば、上記ヒドロキシアル
キルメタクリレ−１−系架橋高分子ゲルの５ｇ（乾燥重
量）を、３０ｍ１の１％カルボキシメチルセルロースナ
トリウム塩水溶液中に分散させ、４５％ホウフッ化亜鉛
水溶液０，０５ｇを加えて、例えば５０゛Ｃのインキュ
ベータの中で４時間反応させ、反応終了後、純水で充分
洗浄する。

その後、イオン交換基となる化合物を混合し、一定温度
（多糖類の変性・分解を避けるため室温以下が好ましい
）の下で一定時間反応させる０例示するならば、１０％
のトリメチルアミン溶液中に分散させ、３０°Ｃで１０
時間反応させる０反応終了後、反応で生じた樹脂を純水
で充分洗浄し、０．００５Ｍ硫酸水溶液中に分散させ、
３０’Ｃで更に２時間反応させる。

このような反応によって生じた樹脂を充分に水洗し、そ
の後、目的の対イオンに交換する０例示するならば、反
応によって生じた樹脂を１００ｍ１の純水で充分に洗浄
し、その後、０．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液中に分散
させ濾過し、更に、０．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液５
０ｍ１で洗浄した後、純水で充分に洗浄し、０．１Ｍの
塩化ナトリウム水溶液中に分散し１晩放置する。

例示したようにして得られた陰イオン交換樹脂は、６０
μＥｑ／ｆｆｉ／のイオン交換容量を持っていた。また
、この陰イオン交換樹脂は、例えば、内径５．０ｍｍ、
長さ１００ｍｍのステンレス製クロマト管に高圧スラリ
ー充填法を用いて充填し、イオンクロマトグラフや液体
クロマトグラフ用分離カラム等として使用される。

ところで、上記基材としては、比較的親水性の多孔性架
橋高分子ゲルでその表面に一定の官能基を有しているか
、その表面に多糖類が結合できるような官能基を導入で
きる樹脂でなければならない、更に、このような樹脂の
持つ細孔は、樹脂に結合する多糖類や試料中に存在する
タンパク質が浸透できないか若しくは僅かしか浸透でき
ない程度に小さくなければならない、具体的には、下記
（イ）又は（ロ）のような樹脂が望ましい。

（イ）カルボニル基、アミノ基、トシル基、水酸基、又
はエポキシ基などを有するポリメタクリレト樹脂、ポリ
ビニルアルコール樹脂、若しくはポリエーテル樹脂など
。

（ロ）ハロゲン基または水酸基を有し、且つ、上記官能
基および多糖類が化学的に結合できる官能基の導入が可
能なポリメタクリレート樹脂、ポリビニルアルコール樹
脂、若しくはポリエーテル樹脂など。

また、上記表面結合多糖類は、前記基材の官能基と反応
し且つ前記基材の細孔内部には浸透できないような分子
量を持ち使用する移動相中で負の電荷を示すような官能
基を持つ多糖類でなければならない。

更に、上記細孔内部のイオン交換基は、基材細孔内部に
充分浸透できるような低分子量物質で表面に結合した多
糖類と未反応の官能基（必ずしも多糖類を結合させた官
能基と同じでなくとも良い）と反応して陰イオン交換基
となる物質でなければならない、具体的には一般的なア
ルキルアミン類。

エタノールアミンなどのアルカノールアミン類。

ジアミン類、ヒドロキシアルキルアンモニウムなどが該
当する。

第２図は一般的なサブレスト型イオンクロマトグラフ装
置の構成説明図であり、送液ポンプ２ａが駆動すると、
溶離液槽１ａ内の溶離液が、送液ポンプ２ａ→インジ工
クタ３→分離カラム４→サプレッサ５の内室５Ｃ→検出
器６を経由し、廃液槽７ａへと流れる。また、送液ポン
プ２ｂが駆動すると、除去液槽ｌｂ内の除去液が、送液
ポンプ２ｂ→サグレツサ５の外室５ｂを経由し、廃液槽
７ｂへと流れる。このため、サプレッサ５の内室５Ｃに
存在する陽イオンが陽イオン交換膜５ａを介してサプレ
ッサ５の外室５ｂとイオン交換するようになり、結果的
にサプレッサ５の内室５ｃに存在する流体の導電率バッ
クグランドが除去される。尚、分離カラム４．サプレッ
サ５．および検出器６は、恒温槽９内に収納されて一定
温度（例えば４０°Ｃ）に保たれると共に、送液ポンプ
２゜インジェクタ３９分離カラム４．サプレッサ５゜お
よび検出器６が分析装置の筐体１０内に収納されている
ことが多い、このような構成からなるイオンクロマトグ
ラフ装置において、インジェクタ３に一定量注入された
試料に含まれている陰イオンは、分離カラム４で分離さ
れ、その後、サプレッサ５で上述のようにして導電率の
バックグランドが除去されてのち検出器６で検出される
。このようにして検出器６で検出された信号は、表示装
置８（例えば記録計）に導かれクロマトグラムを描くよ
うになっている。

前述のようにして製造した陰イオン交換樹脂を分離カラ
ム４内に充填すると共に次のような実験条件で後述の試
料を分析したところ第３図に示すようなりロマトグラム
が得られた。即ち、４．０ｍＭＮａ２　　　ＣＯｉ　　
　／４．　　０ｍＭＮａＨＣＯ：＋　　　　（ＰＨは１
０．０＞の移動相を使用（流量は２．０ｍｌ／ｍｆｎ、
）ｔ、、恒温槽９の温度４０°Ｃ１試料注入量５０μ！
、検出器６の種類は紫外吸収検出器とし、１５ｐｐｍの
ＮＯ２−イオン、１０ｐｐｍのＢｒ−イオン、及び３０
ｐｐｍのＮｏ３イオンを含む試料を上述のようにして分
析した。

第３図から明らかなように、上記３成分とも良好なピー
ク形状を示し、これら各成分が分離カラム４でほぼ完全
に分離していることが分かる。

同様にして同一の実験条件で、２．０％のアルブミンを
含む試料を分析したところ第４図に示すようなりロマト
グラムが得られた。第４図から明らかなように、紫外吸
収のあるアルブミンは溶媒ピークのところに溶出してお
り、陰イオン類に関しては第３図のクロマトグラムとほ
ぼ同様のタロマドグラムとなることが分かる。なお、第
４図のクロマトグラムも第３図のクロマトグラムと同様
、保持時間、ピーク高さ共に十分な再現性を示すもので
ある。また、アルブミンの回収率は約９２％（リン酸緩
衝液では９６％であった）で、タンパク質分析用のイオ
ン交換樹脂と殆ど変らなかった。

ところで、本発明に係わる製造方法で得られる陰イオン
交換樹脂は第５図のような構造となっている。即ち、陰
イオン交換樹脂Ａの表面にはｐＨ値が約１０のとき負電
荷を有している多糖類Ｂが多数結合している。また、陰
イオン交換樹脂Ａの表面の一部にはクサビ形にモデル化
される細孔Ｄ（実際には複雑な洞窟のような形と言われ
ている）があり、この細孔りには陰イオン交換基Ｃが多
数結合している。このような′！ｆ４造の陰イオン交換
樹脂おいて、試料中のタンパク質Ｐは分子半径が大きい
ため細孔りに入れず、しかも負の電荷を有しているなめ
上記多糖類Ｂによってイオン排除される。また、試料中
の陰イオンＳ−は細孔り内の陰イオン交換基Ｃと陰イオ
ン交換し、試料中の陽イオンＳ＋は上記多糖類Ｂと極め
て弱い陽イオン交換するようになっている。

一方、本発明に係わる製造方法で得られる陰イオン交換
樹脂を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行なうと
き、試料成分が充填剤へ保持される挙動は次のようであ
ると考えられる。試料成分が充填剤へ保持される挙動は
次のようであると考えられる。即ち、充填剤に結合され
た多糖類がカルボキシシル基を有していれば、ｐＨ１０
の干渉液中で解離し負の電荷を帯びている。このとき、
充填剤細孔内部のイオン交換基が４級アンモニウム型で
あれば、この緩衝液中でも解離しており正の電荷を帯び
ている。このような充填剤に低分子陰イオンが近づくと
、上記陰イオン交換樹脂の表面の多糖類の負の電荷によ
りイオン排除されるが、細孔内部の陰イオン交換基の正
電荷のほうが強いため細孔内部に低分子陰イオンが入り
イオン交換吸着される。また、この充填剤に等電点が緩
衝液よりも小さいタンパク質が近づくと、試料タンパク
質もまた負の電荷を帯びているため、上記陰イオン交換
樹脂の表面の負の電荷によりイオン排除を受ける。しか
し、タンパク質は分子量が大きく細孔内部には浸透でき
ず、細孔内のイオン交換基とイオン交換吸着できずに溶
出されてしまう、実際には、若干の疎水的吸着があるな
め、充填剤には若干保持される。低分子陽イオンの場合
は、樹脂表面の多糖類の負の電荷にイオン交換吸着する
が、表面の負電荷は極微量であるため濃度の小さい移動
相でも簡単に樹脂から脱離してしまう、試料中にタンパ
ク質と低分子陰イオンが共存している場合は、上記２つ
の現象が同時におこり、低分子陰イオンだけが充填剤に
保持されて分離されるようになる。

尚、本発明は上述の実施例に限定されることなく種々の
変形が可能であり、例えば上述の実施例におけるカルボ
キシル基を有する表面結合多糖類に代えてスルホン基を
有する表面結合多糖類を用いることもできる。第６図及
び第７図はこのようなスルホン基を有する表面結合多糖
類を用いた場合の実験結果を示す図であり、上記第３図
及び第４図にそれぞれ対応する。第６図から明らかなよ
うに、スルホン基を有する表面結合多糖類を用いた場合
もカルボキシル基を有する表面結合多糖類を用いた場合
と同様、３成分とも良好なピーク形状を示し、これら各
成分が分離カラム４でほぼ完全に分離していることが分
かる。また、第７図から明らかなように、スルホン基を
有する表面結合多糖類を用いた場合もカルボキシル基を
有する表面結合多糖類を用いた場合と同様、紫外吸収の
ある試料中のタンパク質は溶媒ピークのところに溶出し
ており、陰イオン類に関しては第６図のタロマドグラム
とほぼ同様のクロマトグラムとなることが分る。

〈発明の効果〉以上詳しく説明したような本発明の実施例によれば、ク
ロマト管に充填されタンパク質が共存している試料中の
陰イオンを液体クロマトグラフィー手法（イオンクロマ
トグラフィー手法も含む）を用いて定量分析するのに用
いて好適な陰イオン交換樹脂（充填剤）を製造する方法
が実現する。

また、このようにして製造された陰イオン交換樹脂は、
多糖類で基材の表面を被覆したことで、タンパク質など
を含む試料中の低分子陰イオンをタンパク質の影響なし
に測定できるという利点がある。更に、タンパク質など
を含む試料を直接注入でき洗浄などの余分な操作を必要
としないため、分析条件が簡単で測定時間が大幅に減少
するという利点もある。また、試料中のタンパク質など
がカラム充填剤へ吸着することによって引起こされるイ
オン交換容量の見掛は上の減少に起因する保持時間の短
縮という問題も無くなり、結果的に再現姓の良いクロマ
トグラムが得られるという利点もある。更に、試料中の
タンパク質などがカラム充填剤へ吸着することなどによ
るカラム圧力の上昇などに起因するカラム性能の劣化が
なくなりカラムの延命化が図れるという利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係わる陰イオン交換樹脂（充填剤ンの
製造方法を説明するための工程説明図、第２図は一般的
なイオンクロマトグラフ装置の構成説明図、第３図およ
び第４図は本発明実施例を用いて作成したタロマドグラ
ム、第５図は本発明に係わる製造方法で得られる陰イオ
ン交換樹脂の構造図、第６図および第７図は本発明の他
の実施例を用いて作成したタロマドグラムである。１ａ・・・・・・溶離液槽、２ａ、２ｂ・・・・・・送
液ポンプ、３・・・・・・インジェクタ、４・・・・・
・分離カラム、５・・・・・・サプレッサ、６・・・・
・・検出器、７・・・・・・廃液槽、８・・・・・・表
示装置、９・・・・・・恒温槽、１０・・・・・・分析
装置の筐体第図第図ｆｆ１７１ｇ’＋婁１１０ −フ偉乃Ｑ閤　（分）第図第ワ図一−−−−−−−ライ薯特ａｔｒ句（分第図ｐ、４田Ｊ乙Ｐ：タニパ７貿

Claims

【特許請求の範囲】

（１）クロマト管に充填され液体クロマトグラフ用分離
カラムなどとして使用される陰イオン交換樹脂を下記（
イ）乃至（ホ）の工程で製造することを特徴とする陰イ
オン交換樹脂の製造方法。（イ）反応方法に合わせて一定の官能基をもつ高分子ゲ
ルを用意する工程。（ロ）前記高分子ゲルを多糖類が固定化されやすい溶媒
中に分散させる工程。（ハ）前記分散溶液中に、結合させる多糖類を混合し固
定化させ、反応終了後、前記溶媒で充分洗浄する工程。（ニ）イオン交換基となる化合物を混合し、一定温度下
で一定時間反応させる工程。（ホ）前記反応によって生じた樹脂を充分に水で洗浄し
、その後、目的の対イオンに交換する工程。
（２）前記基材は比較的親水性の架橋高分子ゲルで表面
に多糖類と反応性基を有する多糖類が結合できる官能基
を有する樹脂又は表面に多糖類と反応性基を有する多糖
類が導入できる官能基を有する樹脂でなることを特徴と
する請求項（１）記載の陰イオン交換樹脂の製造方法。
（３）前記表面結合多糖類は、前記基材の官能基と反応
し且つ前記基材の細孔内部には浸透できないような分子
半径を持ち使用する移動相中で負の電荷を示すような官
能基（例えばカルボキシル基−ＣＯＯ−やスルホン基−
ＳＯ＿３−など）を持つ多糖類でなることを特徴とする
請求項（１）記載の陰イオン交換樹脂の製造方法。
（４）前記イオン交換基は、前記基材の細孔内部に充分
浸透できスルホン基を有する多糖類と未反応の基材中の
官能基と反応して陰イオン交換基となる物質であること
を特徴とする請求項（１）記載の陰イオン交換樹脂の製
造方法。
（５）前記イオン交換基は、前記基材の細孔内部に充分
浸透できカルボキシル基を有する多糖類と未反応の基材
中の官能基と反応して陰イオン交換基となる物質である
ことを特徴とする請求項（１）記載の陰イオン交換樹脂
の製造方法。