JPH02249969A - モノクローナル抗体の評価方法及び抗原の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、モノクローナル抗体の評価方法及び抗原の定
量方法に関し、特にサンドイッチ免疫測定に使用するモ
ノクローナル抗体の評価方法及びサンドイッチ酵素免疫
測定法を利用した抗原の定量方法に関する。

（従来の技術） サンドイッチ酵素免疫測定は一般に次のように行われる
。抗体を保持した担体上に未知量の抗原を含む被験液を
加え反応させ（第１反応）１次に酵素で標識した過剰量
の抗体一定量を加えて反応させる（第２反応）。担体上
に保持された酵素のに優れている点から、固相抗体およ
び酵素標識抗体共にモノクローナル抗体が頻繁に使用さ
れている。この２Ｎ類のモノクローナル抗体を用いる場
合、第１反応および第２反応に用いるモノクローナル抗
体が別々の抗原決定基を認識する必要があり、この２種
類のモノクローナル抗体の選択は測定系を組む上で最も
重要である。

一般に、別々の抗原決定基を認識するモノクローナル抗
体を選択するには、実際に測定系を組むことによりモノ
クローナル抗体の選択を行っている。

従来、モノクローナル抗体を選択するためには。

測定系の第２反応で用いる抗体の標識として直接酵素を
結合する方法および放射性同位元素を用いる方法がある
。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、抗体に直接酵素を結合する方法は、酵素
標識抗体の作成手技が煩雑で、酵素標識抗体の収率も低
いため、微蓋で高価な抗体を評価する際、簡夏性、経済
性に大きな問題があった。

また、放射性同位元素を用いる方法は安全性の薇で大き
な問題がある。本発明は、これらの問題を解決するもの
であり、簡便性、経済性及び安全性に優れたモノクロー
ナル抗体の評価方法を提供するものである。

さらに本発明は、前記評価方法と同様の手法を用いて、
簡便性、経済性かつ感度にも優れた抗原の定量方法をも
提供するものである。

（課題を解決するための手段） すなわち本発明は、同一抗原に対する２種のモノクロー
ナル抗体が、互いに別々の抗原決定基を認識しているか
否かを評価する方法において、−方のモノクローナル抗
体を固相担体上に保持し。

抗原を反応させた後、ビオチンを結合した他方のモノク
ローナル抗体と反応させ９次いでアビジン酵素を反応さ
せて、該酵素の酵素活性を測定することを特徴とするモ
ノクローナル抗体の評価方法（以下、第１の発明という
）、並びに同一抗原に対する。互いに別々の抗原決定基
を認識している２種のモノクローナル抗体のうち、一方
のモノクローナル抗体を固相担体上に保持し、未知量の
抗原を含む被験液と混合し、該モノクローナル抗体と抗
原を反応させた後、ビオチンを結合した他方のモノクロ
ーナル抗体を反応させ２次いでアビジン酵素を反応させ
て、該酵素の酵素活性を測定することを特徴とする抗原
の定量方法Ｃ以下、８ｇ２の発明という）に関する。

まず、ｉｌの発明について詳述する。

サンドイッチ免疫測定法等において使用される２種のモ
ノクローナル抗体は、同一抗原に対して互いに別々の抗
原決定基を認識することが重要である。同一抗原に関す
るモノクローナル抗体は。

多数製造され、市販されているが、これらがどのような
抗原決定基を認識しているかは明確でなく。

異穐のモノクローナル抗体であっても上記測定法に利用
できるか否かは不明である。

そこで２本発明においては、２種のモノクローナル抗体
のうち、まず一方のモノクローナル抗体を固相担体上に
保持する。固相担体としては１周知の多数のものが使用
可能であり、またモノクローナル抗体の固相担体上への
結合方法も周知の方法が使用でき、特に制限されない。

次に、抗体を保持した担体と既知濃度の抗原とを公知の
手法９条件を用いて混合し、固相担体上の抗体と抗原を
反応させる。

次イで、ビオチンを結合した他方のモノクローナル抗体
を二次抗体として加える。ここで、抗体のビオチン化は
、公知の方法９例えば「免疫実験操作法Ｘ第３５３９頁
〜第３５４９頁（日本免疫学会編）に記載される方法に
より行うことができる。この方法は、簡便でかつ抗体の
損失が少ないものであり好ましい。

さらに、ビオチンと特異的に反応するアビジンを酵素と
結合させたアビジン酵素を反応させる。

アビジン酵素としては、酵素としてパーオキシダーゼ、
アルカリフォスフェターゼ、β−ガラクトシターゼ等の
酵素とアビジンを結合させたものが種々市販されている
。本発明において、これらの種類は特に制限されるもの
ではないが９例えば西洋わさびパーオキシダーゼとアビ
ジンを結合させたものである。ベクター　ラボラドリー
ス（ＶＥＣＴＯＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＪＥＳ）製ｏホー
ス７デイツシユバーオキシダーゼ　アビジンＤ。

（ＨＯＲ８Ｅ　ＲＡＤＩＳＨＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ　Ａ
ＶＩＤＩＮＤ）等が有用である。

以上のようにして結合させた酵素の活性を測定する。こ
の測定は、酵素の種類により異なり、公知の種々の方法
１例えば比色法、螢光法９発光法等により行うことがで
きる。中でも比色法は簡易な方法で定量できるので好ま
しい。

例えば、パーオキシダーゼを酵素として使用した場合に
、０−フエニルジアミン、ＡＢＴＳ等を反応基質として
加えて発色させ、その一定時間後の特定の波長の吸光度
を測定する。

抗原の濃度をなるべく多く変化させ、上記操作を繰り返
して測定した測定値と、該濃度との間に。

相関関係が生じているか否かを判定する。もし。

良好な相関関係が生じているならば、この実験操作で使
用した２種のモノクローナル抗体は、互いに別々の抗原
決定基を認識し、かつそれが酵素標識、放射線標識等９
種々のサンドイッチ免疫測定に有用であることが理解さ
れる。

第２の発明は、前記第１の発明を利用した抗原の定量方
法に関するものであり、前記第１の発明において選択さ
れた。互いに別々の抗原決定基を認識している２種のモ
ノクローナル抗体を用いて。

既知濃度の抗原の溶液を、未知量の抗原を含む被験液に
変える以外は、前記第１の発明と全く同様の操作によっ
て定量することが可能なものである。

この際に、第１の発明での既知濃度の抗原を用いた測定
値は、第２の発明において定量のための検量線として用
いることができる。この定量方法は。

ビオチン−アビジンを使用するために感度が増嘱され、
感度の良好なサンドイッチ酵素免疫定量法である。

（実施例） 以下１本発明を実施例により詳述するが９本発明はこれ
に限定されるものではない。

なお１本実施例においては、互いに別々の抗原決定基を
認識しているか否かわからない４椎の抗−ヒトアルファ
ーフェトプロティン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体を使
用した。以下、各々、抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ａ、
抗ＡＦ”Ｐモノクローナル抗体Ｂ、抗ＡＦＰモノクロー
ナル抗体Ｃ及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体りとする。

（１）　　ピオチン化抗体の作製 抗ＡＦ′？モノクローナル抗体Ｂｌｆｉを０．ＩＭＮａ
ＨＣＯｓ水溶液（ｐＨ８，４）にｌ＋！１ｇ／ｍｊにな
るように溶解し、これを０．１　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ水溶
液（ｐＨ８，４）に対し一晩透析した。透析後、該溶液
１０容量に対し、　Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド
でビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
を１　ｒｎｇ／ｍｅに希釈した溶液１容量を混合し。

室温で４時間反応させた。

反応後、過剰量のビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドエステルを除去するため、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）に対し透析し、ビオチン化抗ＡＦ”Ｐモ
ノクローナル抗体Ｂを得た。また、抗ＡＦ’Ｐモノクロ
ーナル抗体Ｂを他の抗ＡＦ’Ｐモノクローナル抗体りに
変えた以外は同様の操作を行ってビオチン化抗ＡＦ’Ｐ
モノクローナル抗体りを得り。

（２）モノクローナル抗体の評価 （１）で用いた以外の抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ａ（
１μｇ／艷ＰＢＳ、ＰＢＳ：生理食塩液含有リン酸緩衝
液）をマイクロタイタープレートのウェルに１００μｌ
ずつ分注し、４℃で一晩装置し、固定する。ＰＢＳ−０
，０５重量４　Ｔｗｅｅｎ２０　（ポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテート）で２回洗浄し、１幅牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）溶液２５０μｌを各ウェルに加
え３７℃で１時間静置後、ＰＢＳ−０，０５重量係Ｔｗ
ｅｅｎ　２０で２回洗浄する。既知濃度（０，１，３，
１０，３０，１００，３００及び５００ｎｇ／ｍｇ）の
ＡＦＰ溶液を５０　ｔｘｔ加え、３７℃で１時間靜置後
、　ＰＢＳ　−０，０５４Ｔｗｅｅｎ　２０で２回洗浄
する。次に、先に製造したビオチン化抗ＡＦ’Ｐモノク
ローナル抗体Ｂ（３ｔｔｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）１００μ／
を加え３７℃で１時間靜置後、ＰＢ８−０．０５係Ｔｗ
ｅｅｎ　２０で２回洗浄し、アビジン化ペルオキシダー
ゼ（ホースラデイツシュパーオキシダーゼ、アビジンＤ
、ベクターラボラトリーズ製、１μｇ／ｎｓｇＰＢｓ−
０，０５％　Ｔｗｅｅｎ２０）１００μ／加え３７℃で
１時間静置後、　ＰＢＳ−０，０５４Ｔｗｅｅｎ２０で
２回洗浄した。さらにペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳ溶
液１００μｌを加え室温で５分反応後、１００ｃｃの水
に２ｇのシュウ酸を溶解したシュウ酸溶液を２５μｌ加
え１反応を停止させる。この溶液を、Ｍ’ｌ”Ｐ−２２
マイクロフオトメーター（コロナ電気■製）によって主
波長（局４１５　ｎｍ＋副波長波長２　）　４９２　ｎ
ｍで比色した。得られたデータをもとに抗原濃度と吸光
度の関係をグラフ化し、第１図の■に示して評価した。

また、抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ａを抗ＡＦ’Ｐモノ
クローナル抗体Ｃに変え、前記ビオチン化抗ＡＦＰモノ
クローナル抗体Ｂを前記ビオチン化抗ＡＦＰモノクロー
ナル抗体りに変えた以外は、上記と同様にして実験し得
たグラフを第１図の■に示す。

（３）評価 （２）のグラフの結果から、抗ＡＦＰモノクローナル抗
体Ａと抗ＡＦ’Ｐモノクローナル抗体Ｂとは。

別々の抗原決定基を認識しサンドイッチ免疫測定に有用
であるが、抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｃと抗ＡＦＰモ
ノクローナル抗体りけ、サンドイッチ免疫測定による抗
原の定量に使用できないと評価できる。

（４）従来法との比較 直接抗体に酵素を結合させる方法である二段階グルタル
アルデヒド法による抗体へのペルオキシダ−ゼ標識法（
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　８．１１７５（１
９７１）をフロー図で示せば次のようになる。

↓ ４℃で２４時間放置 ↓ ０．２Ｍリジン溶液１００μｌ加える ４℃で２時間放置 ↓ 生理食塩緩衝液に対し透析 ↓ ペルオキシダーゼ標識抗体＋ペルオキシダーゼ↓ セファデックスＧ−１５０カラムで分画↓ ペルオキシダーゼ標１［、体 本発明のビオチン化法【比較し、二段階グルタルアルデ
ヒド法によるペルオキシダーゼ標識法は。

上記から明らかなように操作が煩雑である。また。

本発明に使用されるビオチン化抗体の収率が９５〜１ｏ
ｏＬ４であるのに対し、二段階グルタルアルデヒド法に
よるペルオキシダーゼｔｍ＊抗体の収率は４０〜６０４
と低い。その他、直接抗体に酵素を結合する方法に、過
ヨウ素酸架橋法およびマレイミド法があるが、これらの
方法は二段階グルタルアルデヒド法同様操作が煩雑で、
標識抗体の収率も４０〜７５憾と低い。

（発明の効果） 本発明により、同一の抗原に対する°２種のモノクロー
ナル抗体が互いに別々の抗原決定基を認識しているか否
かを、より簡［Ｋまた経済性・安全性に優れた方法で確
認し評価できる。また、同様にして、未知濃度の抗原を
良好な感度で定量することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明のモノクローナル抗体の評価方法の実
施例の結果のＡＦ’Ｐ抗原濃度と吸光度の関係を示すグ
ラフである。 、、４Ｘ、！−，，）、＞

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、同一抗原に対する２種のモノクローナル抗体が、互
   いに別々の抗原決定基を認識しているか否かを評価する
   方法において、一方のモノクローナル抗体を固相担体上
   に保持し、抗原を反応させた後、ビオチンを結合した他
   方のモノクローナル抗体と反応させ、次いでアビジン酵
   素を反応させて、該酵素の酵素活性を測定することを特
   徴とするモノクローナル抗体の評価方法。 ２、同一抗原に対する、互いに別々の抗原決定基を認識
   している２種のモノクローナル抗体のうち、一方のモノ
   クローナル抗原体を固相担体上に保持し、未知量の抗原
   を含む被験液と混合し、該モノクローナル抗体と抗原を
   反応させた後、ビオチンを結合した他方のモノクローナ
   ル抗体を反応させ、次いでアビジン酵素を反応させて、
   該酵素の酵素活性を測定することを特徴とする抗原の定
   量方法。