JPH0220298A - アルツハイマー病の診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト患者におけるアルツハイマー病（Ａｌｚ
ｈｅｉｍｅｒ　　Ｄｉｓｅａｓｅ）の診断に関する。本
発明、さらに、この病気を発生する症候前の（ｐ　ｒ　
ｅ　ｓ　ｙｍｐ　ｔ　ｏｍａ　ｔ　ｉ　ｃ）個体の素因
を評価することにに関する。さらに詳しくは、本発明は
、アルツハイマー病に関係する遺伝子の変更を検出する
核酸プローブに関する。

アルツハイマー病は、特異的神経学的病変によって特徴
づけられる、中枢神経系の漸進的退化性の病気である。

多くの神経の細胞質は、神経細線維のもつれ（Ｎ　Ｆ　
Ｔ）の蓄積を含有し、これは対になった螺旋状フィラメ
ント（ＰＩＦ）から構成されている。神経細線維のもつ
れは、アミロイドのプラクのコア（ｐｌａｑｕｅ　　ｃ
ｏｒｅｓ）中の細胞外凝集体およびコンゴフィリック（
ｃ　ｏ　ｎ　ｇｏｐｈｉｌｉｃ）血管障害の脳血管の病
変において見いだされるアミロイドと構造的に異なるタ
ンバク質を含有する。同様なアミロイドの病変は、この
ような病理学的状態において、ダウン症候群、ゲルスト
マンーストレウスラーーシェイン力＝（Ｇｅｒｓｔｍａ
ｎｎ−３ｔｒａｅｕｓｓｌｅｒ−３ｃｈｅｉｎｋｅｒ）
症候群、クール−において、およびタレウラフェルト−
ジャコブ（Ｃｒｅ、ｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病
をもつ患者の大部分において起こる。

遺伝子の成分は、４世代の１ｏÅ以上の構成員が７０オ
前にアルツハイマー病の痴呆を発生した、家系図の大規
模な研究によって示される。このような場合において、
異常な遺伝子は常染色体優性として伝えられるように思
われる。アルツハイマー病のほとんどの場合は８０才を
越える人々において起こり、そして８５才を越えるコー
カーサス人の３０５まではこの病気を有すると計算され
た。

アルツハイマー病は現在米国において２百万人の老人に
影響を及ぼしていると推定される。この疾患は通常遅く
開始するので、影響を受けた個体の数は老人の人口の数
が増加するにつれて大きくなり続ける。米国において６
５才を越える人の数は現在２５ｘｌＯ’人以−Ｆであり
、そしてこの数は２０２５年までに２倍を越えるであろ
う。

アルツハイマー病の患者の大脳皮質における主な生化学
的症候の１つは、アイイドのプラクのコア（Ａ　Ｐ　Ｃ
）タンパク質として知られているタンパク質のプラクお
よび血管の蓄積の出現である。

このタンパク質は、相対的分子量４，５００の不溶性の
高度に凝集性の小さいポリペプチドである。

ＡＰＣは４０〜４２アミノ酸を有すると理解されてきて
おり、そして現在長さ４０アミノ酸であると信じられて
いる。このポリペプチドは、また、トリソミーをもつ比
較的平をとった個体の脳中に析出する（ダウン症候群）
。カング（Ｋ　ａ　ｎ　ｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、３２５．７３１−７３６．１９８７は、アイイ
ドタンパク質が神経由来であり、そしてより大きい前駆
体タンパク質の一部分であることを提案している。この
前駆体を同定するために、ＡＰＣタンパク質の遺伝情報
を指定する全長の相補的ＤＮＡクローンを分離し、そし
て配列決定した。推定された前駆体は、６９５残基から
成り、そしてグリコジル化細胞表面受容体に特徴的な面
を含有する。このｃＤＮＡ配列は、染色体２１中のその
遺伝子の局在化と緒に、アルツハイマー病および老年の
ダウン症候群において蓄積した脳アミロイドは、細胞表
面の受容体の異常な異化によって、あるいはそのｍＲＮ
Ａの異常な合成または処理によって引き起こされる。脳
における遺伝子の発現のパターンを決定するために、Ａ
ＰＣのｃＤＮＡをマウスの神経系の組織区画に交雑させ
た。アミロイド前駆体タンパク質ｍＲＮＡは、中枢神経
系および末梢神経系において検出された。

アルツハイマー病の早期のかつ正確な診断のための手段
は、痴呆の研究の進歩に大きい衝撃を有するであろう。

アルツハイマー病のための末梢の生化学的マーカーは発
見されてきていないので、この疾患の明確な診断は、組
織学的確証が脳のバイオプシーまたは剖検の実施によっ
て得られる場合にのみ、可能となる。アルツハイマー病
は本質的に処置不可能であるという事実にかかわらず、
アルツハイマー病の症候をもつ個体が実際にこの病気を
有する否かを知ることは有意な価値がであるであろう。

ある数の処置可能な状態は、アルツハイマー病をもつ患
者において見いだされるものに類似する症候によって特
徴づけられる。このような処置可能な状態は、脳腫瘍、
甲状腺および他の内分泌の機能障害、ψ病、感染、ビタ
ミンおよび有機物の欠乏、代謝疾患、認識されない損傷
、および投薬の副作用である。医学的文献は、医師に、
完全な検査、医学的履歴を実施し、そして処置不可能な
アルツハイマー病の状態を診断する前に可逆的な疾患を
除外するための試験をすすめている。

本発明は、このような個体における正常ＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡにおける変更の存在の決定に基づいて、症候をも
つ個体におけるアルツハイマー病を診断し、あるいは症
候前の個体におけるこの病気を発生する素因を評価する
方法を提供する。問題の遺伝子部域は、ｐｒｅＡＰｃ遺
伝子のＡＰＣ解読配列の末端において、あるいは対応す
るｍ　ＲＮＡの正常配列において、現れる２４塩基対の
配列である。核酸交雑技術を使用して、このような２４
塩基の配列における変更の存在または特異的変更の存在
は検出可能であり、そしてアルツハイマー病の診断を促
進する。

本発明によれば、アルツハイマー病に関係があるＡＰＣ
タンパク質の産生は、ペプチドのカルボキシ末端をエン
コードする遺伝子の部域における突然変異の結果である
。その部域におけるフレームシフト突然変異は、ｐｒｅ
ＡＰＣ遺伝子におけるＡＰＣタンパク質解読部域の末端
に隣接して、２つの翻訳停止シグナルを導入こととして
見られる。さらに、強い翻訳開始部位はＡＰＣタンパク
質解読配列の直前の遺伝子の部域に見られるので、密接
に隣接したフレームシフトの導入はＡＰＣタンパク質対
応する前駆体タンパク質のちょうどその部域の反復した
翻訳を生ずる。これはアルツハイマー病で侵された患者
におけるＡＰＣタンパク質の過剰産生を説明するであろ
う。

ｐｒｅＡＰＣ遺伝子の既知の配列から、正常配列は、変
更された場合、フレームシフト突然変異を導入し、次の
２４塩基の配列・ ５’　　ＧＧＣＧＧＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＣＡＴＡＧＣ
Ｇ　　ＡＣＡ　　ＧＴＱ　　３’ を有意なりＮＡ−末鎖として（以後正常センス配列と呼
ぶ）を構成し、そして ５”　ＣＡＣＴＧＴ　　ＣＧＣＴＡＴ　　ＧＡＣＡＡＣ
ＡＣＣＧＣＣ３’ をアンチセンスストランド（以後正常アンチエセンス配
列と呼ぶ）を構成する。相補的ｍＲＮＡ配列は、５’　
　　ＧＧＣＧＧＵ　　ＧＵＵ　　ＧＵＣＡＵＡ　　ＧＣ
Ｇ　　ＡＣＡ　　ＧＵＱ　　３’　であり、以後正常相
補的ＲＮＡ配列と呼ぶ。これらの正常なりＮＡおよびＲ
ＮＡ配列のいずれかの配列における変更の検出を可能と
する交雑技術は、本発明に適用可能である。

第１図は、ＡＰＣタンパク質の遺伝情報を指定する部域
を包含するｐｒｅＡＰＣ遺伝子配列の一部分を示す。以
後の記載は、このような解読配列の末端における２４塩
基の配列中のフレームシフト突然変異の翻訳効果を説明
する。

第２図は、ＡＰＣタンパク質のための解読配列の直後の
停止コドンを発生させる＋１および一２フレームシフト
を示す。

ｐｒｅＡＰＣｃＤＮＡのクローンのＤＮＡ配列の分析［
カンノ（Ｋ　ａ　ｎ　ｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、３２５．７３３−７３６．１９８７］、および突
然変異した薬物抵抗性遺伝子でトランスフェクションし
た細胞におけるタンパク質合成の研究からの情報［トマ
ス（Ｔｈｏｍａｓ）およびカペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ
）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４．３４−３
８．１９８６］に基づいて、本発明はｐｒｅＡＰＣｍＲ
ＮＡからのＡＰＣタンパク質の合成を、遺伝子のＡＰＣ
解読部分におけるフレームシフト突然変異として見る。

このフレームシフトは、オリゴヌクレオチドのプローブ
によって検出可能であり、アルツハイマー病についての
症候の前および後の診断試験を提供する。

ペプチドのカルボキシ末端をエンコードする遺伝子の部
域における突然変異は、ＡＰＣタンパク質を産生させる
であろう。その部域における−１または＋２のフレーム
シフトは、ＡＰＣタンパク質の末端に対してちょうど３
′に２つの翻訳停止シグナルを導入する。第１図は、２
つの停止コドンがこのような突然変異の結果導入される
方法を明らかにする。各対の上の線は、メツセンジャＲ
ＮＡにおける三文字コドンであり、そして下の線はアミ
ノ酸配列である。Ａｓｐ番号１はＡＰＣタンパク質の第
１アミノ酸であり、そしてＶａ１番号４０は現在ＡＰＣ
の最後のアミノ酸と考えられる。ｐｒｅＡＰＣｍＲＮＡ
からのＡＰＣの産生は、ＡＰＣ解読部域の末端またはそ
の付近において、翻訳停止コドンをｐｒｅＡＰＣリーデ
ィングフレーム中に動かすという作用を有する、小さい
欠失または挿入突然変異を含む。ＡＰＣの合成における
翻訳の潜在的ターミネータ−である、２つのフレーム外
の停止コドンは、下線をほどこしよびＵＧＡをリーディ
ングフレームに入れる単の塩基の欠失の可能な部位は、
下のケース（ｃａｓｅ）の文字ａおよびｂで示されてい
る；同一の作用を有する２つの塩基の挿入の可能な部位
は、下のケースの文字すで示されている。第２図は、ｐ
ｒｅＡＰＣｍＲＮＡ中に早熟停止コドンを導入する、第
１図に示す、ａ、ｂおよびＣに相当する、特異的フレー
ムシフト突然変異を示す。

前述した状態は、ＡＰＣタンパク質のＣ−末端に相当す
るｐ　ｒ　ｅＡＰＣ遺伝子の末端におけるｍＲＮＡ翻訳
の停止を説明するであろう。Ｅ、ｃ。

１ｉおよび培養した哺乳動物細胞の両者についての研究
［ヨハンセン（Ｊｏｈａｎｓｅｎ）ら、ブロシーデイン
ダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８１，７６９８７７０２
．１９８４ｉリウ（Ｌ　ｉ　ｕ）ら、ネイチャ（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、３０９．８２−８５．１９８４；トマス（Ｔ
ｈｏｍａｓ）およびカペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈ　ｉ）　
、ネイチャ　　（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４．３１−３８
．１９８６］　は、翻訳停止のとき、リポソームが付近
のＡＵＧについて前後に走査し、そしてその点における
翻訳を再開できることを示唆している。ＡＰＣタンパク
質の直前に強い開始部位か存在するので（第１図）、フ
レームソフトの導入はＡＰＣタンパク質をちょうどエン
コードする前駆体の部域の反復した翻訳を生ずる。

したがって、ＡＰＣのカルボキシ末端の遺伝情報を指定
するｐ　ｒ　ｅＡＰＣ遺伝子配列の部分またはその付近
における−１または＋２タイプのフレムシフト突然変異
の効果は、１つまたは２つにインフレーム翻訳停止シグ
ナルの導入であり、ここで一方はＡＰＣのアミノ酸４１
においてであり、そして他方はアミノ酸４４においてで
あろう。これらの停止の付近におけるｐｒｅＡＰＣｍＲ
ＮＡのリポソームの走査は、停止シグナルより約１２５
ヌクレオチドだけ上流にあるＡＵＧを同定するであろう
。このメチオニンのＡＵＧコドンは、アミロイドのプラ
クのコアタンパク質のＮ−末端アミノ酸のためのコドン
よりすぐ前に存在するトリプレットである。真核生物の
タンパク質合成は、通常、タンパク質から引き続いて除
去されるメチオニンで開始されるので、本発明は、３．
４ｋｂのｍＲＮＡにおける大きいオープンリーディング
フレーム内からのＡＰＣ産生の「フレームシフト停止−
再開」を包含する。

さらに、Ｍｅｔコドンのヌクレオチド配列の関係ＡＡＧ
　　ＡＵＧ　　Ｇ）はコザク（Ｋｏｚａｋ）［細胞（Ｃ
ｅｌ＋）、４４．２８３−２９２．１９８６］従い最も
好適な真核生物の翻訳開始部位を構成することが知られ
ており、彼は最適な関係が位置−３にＡおよび位置＋４
にＧを有することを発見した。この状態は問題のＡＴＪ
Ｇにおいて満たされ、そして事実ｐｒｅＡＰＣ遺伝子の
開始コドンにおいて満たされない。

前述のフレームシフト突然変異が起こると考えられるｐ
ｒｅＡＰＣ遺伝子の部分は、カング（Ｋａｎｇ）ら、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２５．７３３−７３６．
１９８７によって発表され１ま たｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１８９７および１９２１
の間である。番号１９２１は一１フレームのナンセンス
トリプレットの対の下流の構成員の第３位置であり、そ
してこの点を越えた挿入または欠失は既知のＡＰＣタン
パク質より長いポリペプチドの発現を生ずるであろう。

番号１８９７はＡＰＣタンパク質のアミノ酸３７の第１
位置であり、これはタンパク質配列の結果が不明瞭であ
った、６つのカルボキシ末端アミノ酸の第１である；番
号３７より上流のアミノ酸配列は明瞭であり、そして正
常脳ｐｒｅＡＰＣｃＤＮＡ配列から逆翻訳されたアミノ
酸配列と完全に一致する。

したがって、診断的意味をもつｐｒｅＡＰＣ解読配列中
の変更は、グリシン３７で開始しそして位置４３におけ
るコドンで終わる、２４塩基の配列中に現れるであろう
（参照、第１図）。正常のセンスおよびアンチセンスＤ
ＮＡ配列、および相補的ｍＲＮＡ配列の組成は、上に記
載した通りである。したがって、本発明は、正常アンチ
センスＤＮＡ配列、すなわち、 ５’　　　　ＣＡＣＴＧＴ　　　ＣＧＣＴＡＴ　　　Ｇ
ＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣ３’ またはその正常相補的センス配列またはその正常相補的
ＲＮＡ配列（翻訳されたｍＲＮＡ配列）中の変更の存在
を決定する工程からなる。

核酸交雑の分野において明らかなように、ある数の異な
るアプローチおよび方法を、問題の２４塩基の配列中の
変更の決定に適用することができる。配列中の特定の突
然変異の存在または配列のいずれかの突然変異の存在を
決定する技術は、本発明に適用することができる。

ＡＰＣの過剰産生の原因となる突然変異のＤＮＡまたは
ＲＮＡの試料を単にかつ正確にスクリーニングだめの特
に好ましいアプローチは、正常の個体からのＤＮＡと交
雑する正常ｐｒｅＡＰｃ遺伝子プローブが、塩基対塩基
で試料中の相補的配列と完全にアニールし、こうして、
ある種の核酸消化酵素の作用に対して不感受性であると
いう原理に基づく。他方において、試料中にｐｒｅＡＰ
Ｃ遺伝子の突然変異のアレルが存在する場合、プローブ
は不完全に交雑し、プローブをヌクレアーゼ酵素による
検出可能な程度の消化に対して感受性とする、不一致の
塩基対を残すであろう。

アルツハイマー病は優性遺伝子の作用の結果であると理
解されるので、正常アレルの存在下に突然変異したアレ
ルの存在を区別できる、分析手順を応用することが必要
である。受容的遺伝疾患の場合におけるように、使用す
る技術が存在するすべてのアレルが検出されることを保
証しない限り、正常アレルの存在について試料を分析す
ることは考えられない。したがって、一般に、突然変異
したアレルの検出に集中することが好ましい。なぜなら
、このようなアレルの存在は優性の効果かへテロ接合ま
たはホモ接合のいずれの個体においてであるかを示すか
らである。

正常遺伝子配列中の突然変異を検出する直接のアプロー
チは、正常遺伝子配列を表す、プローブ、通常オリゴヌ
クレオチドのグローブを使用して、挿入または欠失突然
変異のために、プローブと不完全相同性である配列がＤ
ＮＡまたはメツセンジャＲＮＡの試料中に存在かどうか
決定する。このアプローチは、特定の突然変異の知識を
必要とせず、そしてまた、多数の非常に類似するプロー
ブを含むよりも感受性であろう。

このような方法において、患者からの試料のＤＮＡまた
はＲＮＡを一本鎖の形態で取り、すなわち、二本鎖ＤＮ
Ａは適当にかつ普通に変性されるが、これに対してｍＲ
ＮＡはすでに一本鎖の形態で存在し、そして４つの配列
の１つまたは組み合わせからなるオリゴヌクレオチドの
プローブと交雑する：正常センスまたはアンチセンスＤ
ＮＡ配列または２つの対応するＲＮＡ配列。その後、得
られる雑種を不完全な相同性について分析する。

このような方法におけるプローブは、好ましくは、正常
センスまたはアンチセンスＤＮＡ配列または対応するＲ
ＮＡ配列の正確に２４塩基の配列から成るが、約３０ま
たは約５０までのヌクレオチド長さであり、そして使用
すべき分析法と合致するヌクレオチド含量をもつことが
できる。逆に、プローブは交雑に選択した分析法を使用
する不完全】６ な相同性ついての精確な分析に要求されるのと同一に少
ないヌクレオチドから成ることができるが、ただし２４
塩基の配列中の突然変異部域がプロービングされること
を条件とし、例えば、約１０以上、好ましくは１２、よ
り好ましくは１７〜１９以上の塩基であることができる
。不完全な相同性を遺伝性アルツハイマー病の診断の目
的に検出できる方法は、次のものを包含する＝　（１）
−末鎖の特異的ヌクレアーゼ、例えば、ＳＬヌクレアー
ゼまたはヤエナリヌクレアーゼに暴露することによる標
識プローブと試料ＤＮＡとの間の雑種の分析、（２）完
全なおよび不完全なりＮＡ雑種の示差熱溶融、（３）標
識プローブと試料ＤＮＡとの間の雑種のヌクレアーゼ分
析、および（４）問題のゲノム配列を表す核酸の直接配
列決定。

アルツハイマー病についての遺伝的症候前または素因の
試験のためのＤＮＡ試料は、体の組織から得ることがで
きる。なぜなら、遺伝した突然変異はすべての細胞核中
に存在するからである。しかしながら、試料は最小の侵
略的方法、例えば、白血球ＤＮＡのために数ｍＱの血液
の収集によって得ることが好ましいであろう。

（１）核酸の分析 ＤＮＡ試料中の変更したＡＰＣ配列についての最も簡単
なかつ最も感受性のアッセイは、次のものである：　（
１）試料ＤＮＡを変性し、次いで末端標識正常遺伝子の
オリゴヌクレオチドのプローブと交雑させ；（ｉｉ）こ
の混合物をヌクレアーゼで処理して、交雑しなかったグ
ローブを破壊し、かつ部分的に交雑したプローブを、試
料ＤＮＡとのできるだけ少量の単一の塩基対の不一致が
存在する点において切り；次いで（ｉｉｉ）この混合物
を変性し、そして高い分解能のアクリルアミドゲルの電
気泳動またはＨＰＬＣにかけて標識したプローブを分析
する。

完全に交雑した正常遺伝子のプローブは、ヌクレアーゼ
消化に対して不感受性であり、そして２４ヌクレオチド
長さを保持するであろう；交雑しなかったプローブは酵
素によって分解し、そして標識はモノヌクレオチド中に
存在するであろう：遺伝子の突然変異体アレルに不完全
に交雑したプローブは、プローブの結合に沿って存在す
る場合でも、不一致の点において切断され、そしてこれ
は、例えば、末端標識されら要素の電気泳動の移動度の
シフトにおいて反映されるであろう。正常ＤＮＡを包含
する交雑／ヌクレアーゼ処理の放射性生成物は２４マー
であるが、１つの正常遺伝子および１つのアルツハイマ
ー病のアレルをもつ個体からのＤＮＡを包含する手順の
生成物は２４マーであり、そして多少より短い長さのオ
リゴヌクレオチドは、プローブの５′標識末端と不一致
を生ずる突然変異の精確な部位との間の距離を反映する
であろう。

（２）示差的溶融（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｍｅｌｔｉ
ｎｇ） （１）オリゴヌクレオチドおよびゲノムＤＮＡ中の相補
的配列を包含する、完全に一致した雑種と、（ｉｉ）１
または２以上の塩基対が不適切に一致した雑種とを、（
ｉ）および（１１）が分解する温度を比較することによ
って、区別することが可能である。完全に一致した雑種
は、多少の塩基が不対であるもよりも熱安定性であり、
そしてこれは前者のより高いＴｍ（溶融曲線の中点）に
おいて反映される。主として、アルツハイマー病のオリ
ゴヌクレオチドのプローブと正常個体からのＤＮＡとの
間の雑種の溶融曲線は、オリゴヌクレオチドのグローブ
とアルツハイマー病のアレルを有する個体からＤＮＡと
の間の雑種の溶融曲線と区別することができるであろう
。しかしながら、ペテロ接合体が病気を発現するという
事実は、雑種の半分が正常のプロフィルをもって溶融し
、そしてこれは示差的溶融に基づくアッセイの感度を制
限しうろことを意味する。

（３）メツセンジャーＲＮＡ試料の家族の欠失（ｆａｍ
ｉｌｉａｌ　　ｄｅｆｅｃｔ）についてのスクリーニン
グ ＡＰＣ産生の下に横たわる配列の変更についての探索に
おけるＤＮＡの分析の別法は、細胞２〇− 質ＲＮＡ中のｐｒｅＡＰＣｍＲＮＡへのオリゴヌクレオ
チドのプローブの交雑である。このアプローチは、入手
容易な細胞、例えば、白血球がｐｒｅＡＰＣｍＲＮＡを
発現することを要求する。なぜなら、ＲＮＡのために神
経物質を得ることは実際的ではないと思われるからであ
る。これに関して、ｐ　ｒ　ｅＡＰＣ遺伝子は多くの種
類の組織において発現され、そして脳においてはそれほ
ど発現というすぐれた証拠が存在する。ｐｒｅＡＰＣ遺
伝子それ自体よりも突然変異についてｐｒｅＡＰＣｍＲ
ＮＡを検査することにおいて興味ある理由は、ｐｒｅＡ
ＰＣｍＲＮＡの早期の翻訳停止および脳におけるＡＰＣ
の蓄積を引き起こす突然変異が、ＲＮＡレベルで遺伝的
に指令されたＤＮＡ処理の欠陥、例えば、異常なきり継
ぎによって導入されるということが、また、考えられる
ことにある。

ｐｒｅＡＰＣｍＲＮＡのこのような遺伝的作用は、ｐｒ
ｅＡＰＣ遺伝子それ自体において必ずしも検出可能であ
る必要はない。オリゴヌクレオチドのプローブを使用す
るｍＲＮＡの検査の手順は、ＤＮＡ分析、とくにヌクレ
アーゼ感受性分析についてと本質的に同一である。

標識したプローブを使用するが、標識は普通に知られて
いるものであるか、あるいは以後この分野において開発
されるものであることができる。

通常な標識は放射性同位元素、蛍光体、化学光体、また
は特異的結合可能な配位子、例えば、適当に標識した抗
体んたは他の結合性タンパク質、例えば、アビジンによ
って検出可能であるハプテンまたはビオチンである。

正常配列と同一の核酸をプロービングするための別法は
、２４塩基の配列中の特異的突然変異について分析する
ことである。再び、種々の技術は当業者にとって明らか
であろう。突然変異の部位の知識に依存して、個体の可
能な突然変異アレルを表す、２４までの異なるプローブ
をイエスまたはノーＤＮＡ交雑アッセイにおいて使用し
て、部域を正常と異なる塩基対ついて走査することがで
きる。もちろん、特定の突然変異を同定するために単一
のみのプローブを必要するだけである。このアプローチ
において使用するオリゴヌクレオチドのプローブは、少
なくともＩＯのヌクレオチドから本質的に成り、その塩
基配列は２４塩基の正常配列またはその相補的ＤＮＡま
たはＲＮＡ配列中に突然変異を有するｐｒｅＡＰＣ遺伝
子のＤＮＡ配列と相同性である。このプローブは分析技
術によって最適化されたまたは可能とされた長さを有し
、そして成熟した２４塩基の配列それ自体から本質的に
成ることができる。

（４）直接核酸配列決定 核酸の配列の情報を得るための前の間接のアプローチに
対する別法は、標準の配列決定プロトコルを使用して、
関連する遺伝子部域を生体外で増幅し、そして増幅した
核酸を直接配列決定することである。増幅は種々の方法
、例えば、原核細胞のベクター中のサブクローニングま
たはポリメラーゼ鎖の反応の実施によって達成すること
ができる。

次の実施例によって本発明を説明するが、これらの実施
例は限定を意図しない。

裏簾を 域１８９７−１９２１の正常遺伝子のヌクレオチド配列
は、 ５’　　　ＧＧＣＧＧＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＣＡＴＡＧ
ＣＧ　　ＡＣＡ　　ＧＴＱ　　３’　　　　（＃ｌ）で
あり、モして相補的配列は、 ３’　　ＣＣＧ　　ＣＣＡ　　ＣＡＡ　　ＣＡＧ　　Ｔ
ＡＴＣＧＣＴＧＴ　　ＣＡＣ５’　　　　（＃２）であ
る。（＃ｌ）または（＃２）のいずれも化学的に合成し
たオリゴヌクレオチドのプローブの好ましい組成である
。標識するため、プローブは３２Ｐでポリヌクレオチド
キナーゼを使用して末端で標識するかＷａｌｌｉｃｅ、
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｓｙｍ
ｐ、Ｂｉｏｌ、、５１．２５７−２６１　１９８６）か
、あるいはプローブを合成し、そして同位元素でプライ
マー延長反応において標識する（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ
ら、ＢｉｏＴｅｃｈ、５．３８−４３．１９８７）する
ことができるであろう。プローブは、また、非同位元素
的に標識することができるであろう（Ｊａｂｌｏｎｓｋ
ｉら、Ｎｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、１４．６１１
５−６１２８．１９８６）。

２、試料ＤＮＡの調製：　ＤＮＡは白血球から最も容易
に入手可能であり、そして数ｍＱ以下の血液は分析ため
に十分なりＮＡを提供する。ＤＮＡを組織から標準の手
順、例えば、細胞の洗浄剤の溶解、および酵素の消化に
よるタンパク質の除去および／または有機溶媒によるリ
ゼイトの処理によって抽出される（ＲａｅおよびＦｒａ
ｎｋｅ。

Ｃｈｒｍｏｓｏｍａ　　３９．４４３−４５６．１９７
２）。ＤＮＡを抽出液の水性相からエタノール沈澱によ
って回収し、次いで水またはトリス−ＥＤＴＡ溶液中に
溶解する。

３、試料ＤＮＡの変性、プローブの添加、およびアニー
ル：約５μｇの試料ＤＮＡを約５０ｎｇの標識したオリ
ゴヌクレオチドのプローブと２０Ｐｇの体積のＨ，Ｏ中
で混合し、５分間沸騰させて試料ＤＮＡを変成し、次い
でｌＯμＱの０．１モルのトリス、ｐＨ８，３モルのＮ
ａＣｌを添加する。この混合物を５０°Ｃにおいて交雑
のため２時間インキュベーションする。

４、ヌクレアーゼによる処理：交雑しないプローブを完
全に分解し、かつグローブと試料との間の塩基対の不一
致の部位において切断により、部分的に交雑したグロー
ブの長さを調節するために、核酸試料の間の相同性の部
域をマツピングする、次の１つの手順を使用する（Ｋｏ
ｈｏｒｎおよびＲａｅ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８０．３２６５−３２６８．１９８３）：　（
１）交雑物を３０ミリモルのＮａ０Ａｃ、５ミリモルの
Ｚｎ５Ｏ，、ｐＨ９，５中で２５０μＱに希釈し、（ｉ
　１）５０〜３００Ｕ（７）Ｓ、ヌクレアーゼを添加し
、そして反応混合物を室温において１時間インキュベー
ションＬ、（ｉｉｉ）５０μＱの０．５モルのトリス、
ｐＨ９，５，０゜１モルのＥＤＴＡの添加により消化を
停止し、そして、担体として２０ｐｇのＥ、ｃｏｌｉ　
　ｔＲＮＡの添加後、生存する核酸をエタノール中で沈
澱させる。

５、ゲル電気泳動または薄層クロマトグラフィは、変性
して交雑グローブの解放後、ヌクレアーゼ処理のプロフ
ィルを表示する：例えば、沈澱物を３〜５μａのＯ，１
モルのＮａＯＨ，１ミリモルのＥＤＴＡ中に懸濁させた
後、薄い２０％の変性アクリルアミドゲルの電気泳動の
ため、等しい体積の８０％のホルムアミド、０．０３％
のブロモフェノールブルー、０．０３％のキシレンシア
ツールを添加し、完全な長さのプローブ士より短い長さ
のプローブ分子を探す： ホモ接合　へテロ接合体　ホモ接合 疋虜　　　八Ｄ　　　　　ＡＤ ２４マー　　＋　　　　十 く２４マー−＋十 ６、放射性プローブの艶は、オートラジオグラフィーま
たはシンチレーション分光光度測定によって実施するこ
とができる。非同位元素的に標識したプローブは、例え
ば、比色または化学光によって検出することができる。

ＲＮＡ中の突然変異停止コドンの位置は前述したのと同
一の部域に必然的に存在するであろうので、試料ＤＮＡ
をプロービングするために使用したのと同一のオリゴヌ
クレオチドを使用して試料ｍＲＮＡをプロービングする
（しかしながら、オリゴ＃２のみ、それは−木調ＲＮＡ
に対して相同性であるものであるので）。

２、試料ＲＮＡの調製：　ＲＮＡは白血球から最も容易
に入手可能であり、そして数ｍα以下の血液は分析ため
に十分なＲＮＡを提供する。ＲＮＡを組織から標準の手
順、例えば、細胞の洗浄剤の溶解、および酵素の消化に
よるＤＮＡおよびタンパク質の除去および有機溶媒によ
るリゼイトの処理によって抽出される（Ｍｉ＋ｒｔｉｆ
およびＲａ６％　Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ’１．Ａｃａｄ、
Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、、１３．３２２１−３２３９．１９
８５）。

ＲＮＡを抽出液の水性相からエタノール沈澱によって回
収し、次いで水中に再溶解する。

３、プローブの添加、およびアニール：交雑のため、Ｒ
ＮＡ　（一般に、約３μｇ）および標識したオリゴヌク
レオチドのプローブ（一般に、約５０、ＯＯＯｃｐｍ）
を３０μαの４０％のホルムアミド、４ｘｓｓｃ、３３
ミリモルのＮ　ａ　２ＨＰＯ、−Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏい　ｐ
Ｈ７，０中で一緒にし、そして３７°Ｃにおいて少なく
とも８時間インキユベションする。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１個体のＤＮＡまたはＲＮＡの試料中の、正常ＤＮＡ
塩基配列 ５’　　ＣＡＣＴＧＴ　　ＣＧＣＴＡＴ　　ＧＡＣＡＡ
ＣＡＣＣＧＣＣ３’ またはその正常相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列における
変更の存在を決定する工程からなることを特徴とする、
個体におけるアルツハイマー病またはアルツハイマー病
を発生させる素因を診断する方法。

２、前記個体はアルツハイマー病の症候前をもち、そし
て前記正常ＤＮＡ塩基配列またはその正常相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡ配列中の変更の存在は、前記個体か前記病
気を発生ずるであろうという危険を示す上記第１項記載
の方法。

３、前記正常配列中の変更の存在は、前記個体から試料
のＤＮＡまたはＲＮ　Ａを一本鎖の形態で取り、前記−
木調の試料のＤＮＡまたはＲＮＡを前記ＤＮＡ塩基配列 ５″　ＣＡＣＴＧＴ　　ＣＧＣＴＡＴ　　ＧＡＣＡＡＣ
ＡＣＣＧＣＣ３’ またはその対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれらの相
補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチ
ドのプローブと交雑させ、そして得られる雑種を不完全
な相同性について分析することによって決定する、上記
第１項記載の方法。

４、前記オリゴヌクレオチドのプローブは、５０より少
ないヌクレオチドから成り、そして２４ヌクレオチドの
ＤＮＡ塩基配列 ５″　　ＣＡＣＴＧＴ　　ＣＧＣＴＡＴ　　ＧＡＣＡＡ
ＣＡＣＣＧＣＣ３’ またはその対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれらの相
補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む、上記第３項記載の
方法。

５、前記オリゴヌクレオチドのプローブは３０より少な
いヌクレオチドから本質的に成る上記第４項記載の方法
。

６、前記オリゴヌクレオチ１へのプローブは前記２４ヌ
クレオチド塩基配列のみから本質的に成る上記第４項記
載の方法。

７、前記得られる雑種における不完全な相同性は、前記
外種を一本鎖特異的ヌクレアーゼに暴露し、そして雑種
の断片の存在または不存在を検出することによって決定
する、」二記第３項記載の方法。

８、前記正常配列における変更の存在は、前記個体から
試料のＤＮＡまたはＲＮＡを一本鎖の形態て取り、前記
−木調の試料のＤＮＡまたはＲＮＡをオリゴヌクレオチ
ドのプローブと交雑させ、前記オリゴヌクレオチドのプ
ローブは、前記正常ＤＮＡ塩基配列またはその相補的Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ配列中に突然変異を有するｐｒｅＡＰ
Ｃ遺伝子のＤＮＡ配列と相同性の少なくとも１０ヌクレ
オチドの塩基配列を有し、そして得られる雑種を完全な
相同性について分析することによって決定する、上記第
１項記載の方法。

９　前記オリゴヌクレオチドのプローブは、前記正常Ｄ
ＮＡ塩基配列またはその相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列
の突然変異した形態の塩基配列に対応する２４までのヌ
クレオチドから本質的に成る、上記第８項記載の方法。

１０、試料はゲノムＤＮＡである上記第１項記載の方法
。

１１、試料はｍＲＮＡである上記第１項記載の方法。

１２．５０より少ないヌクレオチドから本質的に成り、
そして２４ヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列 ５’　　　ＣＡＣＴＧＴ　　　ＣＧＣＴＡＴ　　　ＧＡ
ＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣ３″ またはその対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれらの相
補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むことを特徴とする、
アルツハイマー病またはアルツハイマー病を発生させる
素因の診断において使用するだめのオリゴヌクレオチド
のプローブ。

１．３．３０より少ないヌクレオチドから本質的に成る
上記第１２項記載のプローブ。

１４、前記２４ヌクレオチド塩基配列のみから本質的に
成る上記第１２項記載のプローブ。

１５、標識をさらに含む上記第１２項記載のプローブ。

１６、前記標識は放射性同位元素、蛍光体、化学光体、
または特異的結合可能な配位子である上記第１５項記載
のプローブ。

１７、少なくとも１０ヌクレオチドから本質的に成り、
その塩基配列は２４ヌクレオチド配列５″　　ＣＡＣＴ
ＧＴ　　ＣＧＣＴＡＴ　　ＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣ３
’ またはその相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列中に突然変異
を有するｐｒｅＡＰＣ遺伝子のＤＮＡ配列と相同性であ
ることを特徴とする、アルツハイマー病またはアルツハ
イマー病を発生させる素因の診断において使用するため
のオリゴヌクレオチドのプローブ。

１８、前記突然変異したＤＮＡ配列またはその相補的Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ配列の塩基配列に対応する２４までの
ヌクレオチドから本質的に成る、上記第１７項記載のグ
ローブ。

１９、標識をさらに含む上記第１７項記載のグローブ。

２０、前記標識は放射性同位元素、蛍光体、化学光体、
または特異的結合可能な配位子である上記第１７項記載
のプローブ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＡＰＣタンパク質の遺伝情報を指定する部域
を包含するｐ　ｒ　ｅＡＰＣ遺伝子配列の部分を示す。 第２図は、ＡＰＣタンパク質のための解読配列の直後の
停止コドンを発生させる＋１および一２フレームシフト
を示す。 ＧＡＡ　　ＧＵＧ　　ＡＡＧ　　ＡυＧＭｅセ ＧＡＵ　　ＧＣＡ　　ＧＡＡ　　ＵＵＣＣＧＡ　　ＣＡ
Ｄ　　ＧＡＣＵＣＡ　ＧＧＡ　　ＬＩＡｔ）ＧＡＡＡｓ
ｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　？ｈｅＡｒｇ　Ｈｌｓ　Ａｓｐ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇ１＊Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　
ＧＩＬＩ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　
　Ａｓｎ入ＡＡ　　ＧＧＬＩ　　ＧＣＡ　　ＡＬＩＣＡ
Ｕ（Ｊ　　ＧＧＡ　　ＣＵＣ八ＬＩＧ　　ｆＬｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｇｉｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅ
ｔ　’ＧＵＧ　　Ａ（ＩＣＧＩＪＣＡｔＪＣＡＣＣ１ｊ
ＬＩＧ　ＧＬ！Ｇ　　ＡＬＩＧ　ＣＯＧ八ＡＧ　　ＡＡ
Ｇ　　ＡＡ八 第１ 図 ４σ 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、個体のＤＮＡまたはＲＮＡの試料中の、正常ＤＮＡ
   塩基配列 【遺伝子配列があります】 またはその正常相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列における
   変更の存在を決定する工程からなることを特徴とする、
   個体におけるアルツハイマー病またはアルツハイマー病
   を発生させる素因を診断する方法。 ２、５０より少ないヌクレオチドから本質的に成り、そ
   して２４ヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列【遺伝子配列が
   あります】 またはその対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれらの相
   補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むことを特徴とする、
   アルツハイマー病またはアルツハイマー病を発生させる
   素因の診断において使用するためのオリゴヌクレオチド
   のプローブ。