JPH02196800A - 細胞毒性物質複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫原として胃低分化型腺癌由来細胞株（Ｍ
ＫＮ−４５）を用いて作成されたハイブリドーマが産生
ずる特定の特性を有するモノクローナル抗体またはその
フラグメントと、リシンＡ鎖とを結合させてなる癌細胞
への集積性の優れた細胞毒性物質複合体に関する。

〔従来技術〕

各種の制癌剤を全身的に投与し、癌細胞を死滅させるこ
とは通常の方法である。この場合、制癌剤が全身的に分
布するため、効果を発揮するに十分な癌組織白濃度を得
るためには大量投与せざるを得ないのが現状である。

ところが、制癌効果が発現する投与量と副作用が発現す
る投与量が近接していることが多く、制癌効果が期待さ
れるにもかかわらず、副作用の発現により投与を中止せ
ざるを得ないことになり、不幸な結果となることが多い
。これを防止するためには、換言すれば、副作用発現を
最小限に抑え、制癌作用を発現させるためには、癌細胞
に制癌剤、細胞障害性物質あるいは細胞毒性物質を特異
的に集積させることが必須である。

このために、癌細胞に親和性の高い物質を運搬体とし、
制癌剤、細胞障害性物質あるいは細胞毒性物質を高濃度
に局所に運搬させるという考え方が注目を集めている。

このような運搬体として、免疫グロブリン、癌特異抗体
、フィブロネクチン、リポソーム、脂肪乳剤などが考え
られている。

ところで、このような運搬体として癌特異抗体を用いる
場合、治療を目的とする癌細胞に含まれる抗原に対して
特異的な抗体を使用しなければ特異的な集積を生じない
。

そこでこうした条件に適する癌特異抗体の一つとしてモ
ノクローナル抗体（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５
Ｂ　、ｐｐ、４９５、（１９７５）参照〕が考えられる
。

即ち、癌細胞上の癌特異抗原または癌関連抗原を特異的
に認識するモノクローナル抗体を得、これを細胞毒性物
質の運搬体とすることにより、正常組織にはダメージを
最小限に抑え、癌細胞のみを特異的に攻撃できるものと
期待される。

〔発明が解決しようとする課題〕

特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノクローナル
抗体としては、各種のものが知られている。

そこで、本発明者らは、特異性の高い好適な運搬体とし
て、胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を免疫
原として作成されたノ＼イブリドーマが産出する特定の
特性を有するモノクローナル抗体（特開昭６１−１６７
６９９号公報中に記ｔａ）を選択した。

即ち、この癌細胞に非常に特異性の高いモノクローナル
抗体を運搬体として用いることにより、現在使用されて
いる制癌剤の効果を上げることのみならず、一般には毒
性が強く単独では制癌剤として使用できない細胞毒性物
質をも制癌剤として使用可能となることを見い出だし、
本発明を完成したもので、本発明はそれ単独では制癌効
果よりも毒性が優先する毒素をこのモノクローナル抗体
を運搬体として用いることにより、従来制癌剤として用
いることが不可能であった毒素を、全身投与可能とした
制癌作用物質を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、 ■免疫原として胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４
５）を用いて作成されたハイブリドーマが産生ずる、 ■Ｉｇ：クラス：ＩｇＣｚ（に）、 ■癌細胞との反応性：食道癌（ＴＥ−３）　、肺癌（Ｐ
Ｃ−３）　、胃癌（ＭＫＮ−４５）　、胃癌（ＫＡＴＯ
−ｍ）　、肝癌（ＨＥ　Ｋ）細胞に対して陽性を示す、 以上［１］〜［３］の特性を有するモノクローナル抗体
またはそのフラグメントと、細胞毒性物質であるリシン
Ａ鎖とを結合させてなる細胞毒性物質複合体である。

モノクローナル抗体 本発明で用いられるモノクローナル抗体は、前記［１］
〜［３］の特性を有するものであれば、特に制限されな
い。また、当該モノクローナル抗体のフラグメントとし
ては、たとえば、Ｆ（ａｂ−）２、Ｆａｂ−Ｆａｂなど
が使用される。

本発明で使用されるモノクローナル抗体を調製する方法
としては、公知の手法、例えば、細胞融合法、形質転換
法等を用いればよく、具体的には特開昭６１−１６７６
９９号公報の明細書に開示されている方法が例示される
。また、遺伝子工学的手法により得られたものでもよい
。さらに、キメラ化手法により得られるキメラ抗体であ
ってもよい。

リシンＡ鎖 リシンＡ鎖は公知物質であり、その製法とともに特開昭
５５−４９３２１号公報等で開示されている。

複合体の調製 リシンＡ鎖と抗体の結合方法自体などは公知であり、生
物学的特性を保持し、標的とする細胞内で遊離するよう
な働きを有するものであれば特に限定されない。具体的
には、 （１）　Ｓ　Ｈ基の活性化剤を用いてリシンＡ鎖と抗体
の間にジスルフィド結合を形成させる方法（特開昭５５
−４９３２１号公報参照）； （２フラグメント中に少なくとも１個のＳ−スルホ基（
−５−ＳＯ３−）又は活性ジスルフィド基を有する抗腫
瘍免疫グロブリンの実質的なフラグメントＦａｂと、フ
ラグメント中に少なくとも１個のチオール基（−Ｓ　Ｈ
）を有するリシンのサブユニットＡを反応させることを
特徴とする方法；（３）フラグメント中に少なくとも１
個のチオール基を有する抗腫瘍免疫グロブリンの実質的
なフラグメントＦａｂと、フラグメント中に少なくとも
１個のチオール基を有するリジンのサブユニットＡを、
チオール基と反応しうる官能基を少なくとも２個有する
化合物（架橋剤）を用いて結合することを特徴とする方
法（特開昭５６−１６４１８号公報参照）； （４）免疫グロブリン又はそのフラグメント中の１〜１
０個のアミノ基とマレイミド化合物を反応させ、次いで
得られた生成物と、分子中に少なくとも１個のチオール
基を有するリシンのサブユニットＡを反応させることを
特徴とする方法（特開昭５７−６４６１７号公報参照）
； （５）直接または介在基を介して結合した少なくとも１
つの遊離チオール基を有し、場合に応じて修飾されてい
るりシンＡ鎖と、そのリシンＡ鎖の遊離チオールと結合
してチオールエーテルまたはジスルフィド結合を形成し
うる原子団を有する抗体またはその断片とを室温にて水
溶液中で反応させることを特徴とする方法、もしくは、
直接または介在基を介して結合した少なくとも１つの遊
離チオール基を有し、場合に応じて修飾されている抗体
またはその断片と、その抗体またはその断片の遊離チオ
ールと結合してチオールエーテルまたはジスルフィド結
合を形成しうる原子団を有するリシンＡ鎖とを室温にて
水溶液中で反応させることを特徴とする方法（特開昭６
１−１２６３０号公報参照）等が例示される。

本発明複合体はヒトを始めとする哺乳動物の癌に対して
有効であり、本発明の複合体に結合せしめた細胞毒性物
質に応じた細胞毒性が発揮される。

本発明の複合体はたとえば静脈内投与、点滴静注される
。当該複合体は製薬上許容される賦形剤、希釈剤等、例
えば注射用蒸留水、生理食塩液等を使用して、例えば注
射剤、点滴剤として製剤化される。本発明複合体の投与
量は、投与対象の種類、症状、体重、年齢等に応じて変
わりうるちのであり、例えば胃癌の治療においては、１
０ｍｇ〜１０．の本発明複合体を適当な溶媒０．５〜５
ｏｏ１１！に溶解し、１日１回または数回に分けて投与
される。

〔発明の効果〕

本発明複合体は、癌細胞に効率よく集積するので、正常
細胞に対する毒性を低く抑えることができる。従って、
その治療係数（効果を現す投与量／毒性を現す投与量）
が高く、ヒトの制癌剤として有用なものである。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例等を挙げる
が、本発明はこれらによって何ら限定されるものではな
い。

参考例１（モノクローナル抗体の調製）免疫原として胃
低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を用い、特開
昭６１−１６７６９９号公報に記載された方法に準じて
、モノクローナル抗体を調製した。この抗体は表１およ
び表２に示すような性状を有していた。

なお、表１中、反応性はＣＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応性を示し
、＋は反応陽性と判定される測定検体の程度で示した。

−は陰性を示した。ＣＥＬ　Ｉ　ＳＡ法におけるＯＤ　
　　値は、 −　：　０．０５未満 ＋　：　０．１以上０．４未満 である。

（以下余白） 表１ ヒト由来株化癌細胞に対する反応性 表２（性状） 参考Ｎ２（リシンＡ鎖の調製） 特開昭５５−４９３２１号公報に記載された方法に準じ
てリシンＡ鎖を調製した。このリシンＡ鎖は分子量ａｏ
、ｏｏｏ±３００、等電点約７．５、ＳＨ基はリジンＡ
鎖１分子当り約１当量であった。

実施例１ 抗体溶液（２ｍｇ　／　ｘｉ、１００ａ＋Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ７，５含１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１）　１０１）
ｆに修飾剤５ＰＤＰ［３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル］溶液
（１ｍｇ／ｌ！ジメチルホルムアミド）４００μｇを添
加し、２５℃にて３０分間攪拌した。この反応液を１０
Ｏｎ＋Ｍリン酸緩衝液９Ｈ７，５含１５（１ｗＮ　Ｎ　
ａ　Ｃ１に対し透析を行い（４℃×２０時間）修飾抗体
を得た。ここで得られた修飾抗体をｌＯｈＭリン酸緩衝
液ｐＨ７，５で希釈し抗体濃度が１　ｍｇ　ｌ　１１１
となるよう調製した。

この抗体溶液２０１！に２１！のリシンＡ溶液（ｌｏｍ
ｇ／１１，５ｎＭ酢酸緩衝液ｐ）１５．５含１５０ｍＭ
　Ｎ　ａ　ＣＪ　。

１ｍＭＥＤＴＡ）を添加し２５℃で２時間反応を行い粗
すシンへ−抗体複合体を得た。

粗すシンＡ−抗体複合体中に含まれる未反応リシンＡ及
び未反応抗体を除去するためＰＢＳで平衡化した５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌＳ−２００カラムクロマトグラフイーを行
い精製リシンＡ−抗体複合体を得た。

実施例２ Ｆａｂの活性化 Ｆａｂ溶液（２，０ｍｇ　／　１１．１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ８，０）５１！に１００倍モルのＤＴＮＢ　［
５，５″−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）］を加
え室温（２５℃）で、２時間反応した。この反応液を１
０ｍＭリン酸緩衝波緩衝液、ｏに対し透析（４℃Ｘ２０
時間）ＬＤＴＮＢ修飾Ｆａｂを得た。吸光度法により測
定した結果、Ｆａｂ１モル当り１モルのチオニトロ安息
香酸が導入されていた。

このＤＴＮＢ修飾Ｆａｂを限外濾過膜（ａａ＋１ｃｏｎ
ＹＭＩＯ）を用い２　ｍｇ　／　ＩＩ　（１００ａ＋Ｍ
リン酸緩衝液１）Ｈ７，５含１５ｈＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１１
）となるように濃縮を行いリジンＡとの複合体調製に用
いた。

複合体の調製 ＤＴＮＢ修飾Ｆ　ａ　ｂ　（２１１ｇ／ｆｆｆ）　５ｉ
Ｆｆに３１１のりシンＡ　（１０ｍｇ　／　１１１．５
ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，５含１５０ｍＭ　Ｎａ　ＣＲ，
１ｍＭＥＤＴＡ）を添加し２５℃で２時間反応を行い粗
すシンＡ−Ｆａｂ複合体を得た。粗すシンＡ−Ｆａｂ、
複合体中に含まれる未反応リシンＡ及びＦａｂをＰＢＳ
で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラムクロ
マトグラフイーを行い精製リジンＡ−Ｆａｂ複合体を得
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］免疫原として胃低分化型腺癌由来細胞株（
   ＭＫＮ−４５）を用いて作成されたハイブリドーマが産
   生する、 ［２］Ｉｇクラス：ＩｇＧｌ（ｋ）、 ［３］癌細胞との反応性：食道癌（ＴＥ−３）、肺癌（
   ＰＣ−３）、胃癌（ＭＫＮ−４５）、胃癌（ＫＡＴＯ−
   III）、肝癌（ＨＥＫ）細胞に対して陽性を示す、 以上［１］〜［３］の特性を有するモノクローナル抗体
   またはそのフラグメントと、リシンＡ鎖とを結合させて
   なる細胞毒性物質複合体。