JPH02179476A - フルクトサミンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血清・血漿中のフルクトサミンの効率的な測
定法に関する。

（従来の技術） フルクトサミンは、現在糖尿病診断のマーカとしてグリ
コヘモグロビンと同様、大変注目されており、最近その
検査が急速に増えてきた。

グリコヘモグロビンが、過去２力月間の血糖状態を反映
すると言われるが、フルクトサミンは過去１〜２週間の
血糖状態を反映すると言われる。

現在フルクトサミンの測定法として、血清中の蛋白質が
グルコースと結合して生ずるケトアミン（フルクトサミ
ン）が、弱アルカリ溶液中でテトラゾリウム塩を還元し
て生じるホルマザン発色を利用して測定する方法がよく
用いられている。

この方法はシスティンやグルタチン等のＳＲ化合物、ア
スコルビン酸等の還元性物質の影響をうける点が非常に
問題とされている。特に、アスコルビン酸による影響が
大きく、アスコルビン酸を加えただけでも強く発色する
。アスコルビン酸の影響を避けるために、通常、アスコ
ルビン酸の発色を終わらせた後、測定ポイントを２点選
んでその吸光度差をもって測定されている。しかし、ア
スコルビン酸の発色が完結するまで１０〜１５分かかり
、さらにブランク値が高いレベルから測定しなければな
らず、正確な測定が難しい上、最近の測定時間の短い自
動分析装置にはのりにくいという問題があった。それで
、アスコルビン酸を消去するためにアスコルビン酸オキ
シダーゼを用いる方法が報告されているが、消去後も徐
々に発色してしまうという問題があった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者は、Ｃｕ”、Ｆｅ”、Ｃｏ”、Ｍｎ”Ｑ　ｅ　
４　＊等の酸化性金属イオン及び／又はその錯体を用い
ることによって、より効果的かつ迅速にアスコルビン酸
及びシスティン、グルタチオン等のＳＨ化合物等を消去
することができることを見出し本発明を完成したもので
ある。

本発明は、Ｃｕ”、Ｆｅ’・、Ｃｏ”、Ｍｎ３・。

Ｃｅ”等の酸化性金属イオン及び／又はその錯体のアス
コルビン酸及びシスティン、グルタチオン等のＳＨ化合
物等に対する酸化力を利用してフルクトサミンを測定す
ることによ゛って、アスコルビン酸及びシスティン、グ
ルタチオン等のＳＨ化合物等の還元性物質を迅速に消去
するとともに２試薬に分けて１０〜１５分待たずに短時
間でＲａｔｅ　　Ａｓ５ａｙを可能とした測定法を提供
することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 、テトラゾリウム塩を用いてフルクトサミンを定量する
方法において、酸化性金属及び／又はその錯体を加える
ことによってフルクトサミンを測定するようにしたもの
である。

本発明方法において、アスコルビン酸オキシダーゼと組
み合わせて酸化性金属及び／又は錯体を加えるようにす
ることもできる。従来から、アスコルビン酸を消去する
場合、アスコルビン酸オキシダーゼを用いる例があるが
、アスコルビン酸オキシダーゼを用いてもまだ充分にア
スコルビン酸を消去することはできなかった。アスコル
ビン酸オキシダーゼで処理する際、酸化性金属又はその
錯体を組み合わせることによってより効果的にアスコル
ビン酸の障害を防ぐことができる。

本発明方法で用いられる金属イオンの錯体としては、ニ
トリロ三酢酸（ＮＴＡ）、、エチレンジアミンニ酢酸（
ＥＤＤＡ）、エチレンジアミンニブロビオン酸（ＥＤＤ
Ｐ）、　　ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（
ＥＤＴＡ−ＯＨ）、　　ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅ
ｔｈｙｌ　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）　、グリコールエーテ
ルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、　ヒドロキシエチル
イミノニ酢酸（ＨＩ　ＤＡ）　、　　イミノニ酢酸（Ｉ
ＤＡ）、　ニトリロニ酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ）、
　　ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、エチレンジア
ミンスルホン酸（ＥＤＳ）。

グルコン酸エチレンジアミン、ジヒドロキシエチルグリ
シン（Ｂｉｃｉｎ）、　　トランス−シクロヘキサンジ
アミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等との錯体をあげることが
できる。

これらの例示した化合物に限らず金属イオンと錯体を形
成しうるちのであれば、本発明方法に有効に用いること
ができることは勿論である。

（実施例） 以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明する
。

実施例１ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液・・・・・　１００ｍＭ、ｐＨ１０，５硫酸
銅・・・・・・・・・・・・・０，１ｍＭ第２試薬： 炭酸緩衝液・・・・　ｌｏｏｍＭ、ｐＨ１ｏ、５ＮＴＢ
　・・・・・・・・・・・１，２５ｍＭ第１試薬１ｄに
検体を５０ｕｌ加え、３７°Ｃ５分間反応させたのち、
第２試薬０．２５０ｄ加え、３７°Ｃで反応させる。５
４０　ｎｍで１分間あたりの吸光度変化（八Ｅ／ｍ１ｎ
）を測定する。

アスコルビン酸の無添加検体を対照とし、アスコルビン
酸２０■／ｄ１添加した検体と比較し、アスコルビン酸
添加による干渉の影響度を比較例１及び実施例１につい
て検討した。その結果を第１表に示した。第１表から、
本発明においてはアスコルビン酸の影響が比較例１に比
べて大きく回避されたことがわかった。

また、第２試薬添加後の反応の経時変化を記録し、第１
図に示した。この結果、硫酸銅の添加によりアスコルビ
ン酸の干渉を抑え、かつ短時間で測定できることが確認
された。

比較例１ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液・・・・・　１００ｍＭ、ｐＨ１０，５第２
試薬： 炭酸＃ｙｉ衝液・・・・・　ｆｏｏｍＭ、、ｐＨ１０，
５ＮＴＢ　　・・・・・・・・・・・・１．２５ｍＭ（
ＮＴＢ：ニトロブルーテトラゾリウム）第１試薬１ｄに
検体を５０μｌ加え、３７℃５分間反応させたのち、第
２試薬０．２５０ｍ１加え、３７°Ｃで反応させる。５
４０ｎｍで１分間あたりの吸光度変化（ΔＥ／ｍ１ｎ）
を測定する。

アスコルビン酸の無添加検体を対照とし、アスコルビン
酸２０Ｉｌ１ｇ／ｄ１添加した検体と比較し、アスコル
ビン酸添加による干渉の影響度を比較例１及び実施例１
について検討した＝その結果を第１表に示した。

また、第２試薬添加後の反応の経時変化を記録し、第２
図に示した。

（以下余白〕 第１表 実施例２ 試薬の組成 第１試薬ニ リン酸緩衝液　　　　　　１０ｍＭ、ｐＨ７，０ＡＯＤ
　　　　　　　・・・・・・・・５Ｕ／・（ＡＯＤ：ア
スコルビン酸オキシダーゼ）第２試薬： 炭酸緩衝液・・・・＝・＝　１００　ｍＭ、　Ｐ　Ｈ１
０、５ＮＴＢ　　・・　　　・・・・・・・・１，２５
ｍＭ硫酸銅・・・・・・・・・・・・・０．４ｍＭ第１
試薬１−に検体５０μｉ加え、３７℃５分間反応させた
後、第２試薬０．２５０ｄ加え、３７℃で反応させた。

５４０ｎｍで１分間あたりの吸光度変化（八Ｅ／ｍ１ｎ
）を測定し、第３図に示した。

比較例２ 試薬の組成 第１試薬ニ リン酸緩衝液・・・・・・１０ｍＭ、ｐＨ７，０ＡＯＤ
・・・・・・・・・・・・・・・５Ｕ７’ｒｌ第２試薬
： 炭酸緩衝液・・・・ｌｏＯｍＭ、ｐＨ１０，５ＮＴＢ・
・・・・・・・・・・・・１．２５ｍＭ実施例２と同様
の手順で吸光度変化（ΔＥ　／　ｍ１ｎ）を測定し、第
４図に示した。

実施例２及び比較例２の測定結果から、硫酸銅の添加に
より、アスコルビン酸の干渉を抑え、かつ短時間で測定
できることが確認できた。

実施例３ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液・・・・・１００ｍＭ、ｐＨ１０，５ＮＴＡ
・Ｆｅ・・・・・・・・・・・・・・１ｍＭ第２試薬： 炭酸緩衝液・・・・・１００ｍＭ、ｐＨ１０，５ＮＴＢ
・・・・・・・・・１．２５ｍＭ第１試薬ｔｇに検体を
５０μ２加え、３７°Ｃ５分間反応させたのち、第２試
薬０．２５０ｄ加え、３７°Ｃで反応させるｅ　５４０
ｎｍで１分間あたりの吸光度変化（ΔＥ／ｍ１ｎ）を測
定する。

アスコルビン酸の無添加検体を対照とし、アスコルビン
酸２０■／ａ添加した検体と比較し、アスコルビン酸添
加による干渉の影響度を検討した、その結果を第２表に
示した。

また、第２試薬添加後の反応の経時変化を記録し、第５
図に示した。

この結果、本発明ではアスコルビン酸の影響をほとんど
受けず、かつ短時間で測定できることがほとんど受けず
、かつ短時間で測定できることが確認された。

第２表 容易にしたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の吸光度変化の測定結果を示すグラフ
、第２図は比較例１の吸光度変化の測定結果を示すグラ
フ、第３図は実施例２の吸光度変化の測定結果を示すグ
ラフ、第４図は比較例２の吸光度変化の測定結果を示す
グラフ及び第５図は実施例３の吸光度変化の測定結果を
示すグラフである。 （発明の効果）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）テトラゾリウム塩を用いてフルクトサミンを定量
   する方法において、酸化性金属及び／又はその錯体を加
   えることによって測定することを特徴とするフルクトサ
   ミンの測定法。
2. （２）アスコルビン酸オキシダーゼと組み合わせて酸化
   性金属及び／又は錯体を加えることを特徴とする請求項
   （１）記載のフルクトサミンの測定法。