JPH02174700A - Ｄｎａ塩基配列決定方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は改良されたＤＮＡの塩基配列決定方法及び装置
に関する。

〔従来の技術〕

ＤＮＡ塩基配列の決定方法の開発は、分子生物学の研究
の発展や遺伝子工学の成功に大きく寄与してきた。現在
２つの方法が広く利用されており、その１つはマクサム
及びギルバートが開発したマクサム−ギルバート法〔ニ
ー−エム・マクサム（Ａ、、　Ｍ、　Ｍａｘａｔｎ　）
及びダブリュー−ギルバー）　（Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ）
、メソツズ・インＯエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６５巻、第４９９
〜５６０頁（１９８０））であり、もう１つはサンガー
らが開発し〔エフ・サンガー　（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ）
、エフ・ニツクレン（Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ）及びニー
暑アール・クーμソン（んＲｅ　Ｃｏｕｌｓｏｎ）、プ
ロシーデイングズ・オブ・ザーナショナμＱアカデミー
ーオブ・サイエンシイズ自オプ・ザ・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
）第７４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９７７）：１
％メツシングらによって改良されたＭ１５ファージ〔ジ
工−・メツシング（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｑ）　ｓメソツ
ズ・イン・エンザイモロジー　第１０１巻、１２０〜７
８頁（１９１３！５）］を用いたジデオキシ法（鎖ター
ミネイター法）である。マクサム−ギルバート法は３′
−又は５ｒ−末端がＭＺｐ　で標識された１重鎖又は２
重鎖Ｄ　Ｎ　Ａの４種の各塩基に特異的な化学処理を行
い、各塩基の位置でＤ　Ｎ　Ａを選択的に切断させる。

得られた分解産物を電気泳動法によシＤＮＡの１塩基ず
つの長さの違いによって分４し、各バンドに対応する塩
基を同定することで配列を決定する。

一方ジデオキシ法ではＤＮＡ断片ｆｔＭ１３ファージに
クローニングし、これに相補的なりＮＡを合成させると
き、基質としてデオキシリボヌクレオシド−５１−トリ
リン酸（以下ｄＮＴＰ　と略す）以外に４槌の各塩基に
対応する２Ｊ、５１−ジデオキシ同族体（ｄｃｌＮＴＰ
）を存在させる。各ｄｄＮＴＰが取込まれた位置で伸長
反応は停止するために、鎖長の異なるＤＮＡを電気泳動
法によシ分離することでマクサム−ギルバート法ト同様
に配列を決定できる。

〔発明が解決しようとする課題〕

これらのＤＮＡ塩基配列決定方法はそれぞれいくつかの
変法を有するが、いずれも電気泳動法を利用することを
特徴とする。したがって、ＤＮＡ試料の反応、１！気泳
動、電気泳動により得られたゲル上のバンドの解読とい
う複数個の操作が必要であり、煩雑であるばかりでなく
自動化を行うにも不適当である。またＤＮＡ鎖が艮くな
るにつれて、読み取り精度が低下する。

本発明の目的は、前記の欠点のない簡便なりＮ’　Ａ塩
基配列決定方法及び装置を提供することにある。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＤＮＡ塩基
配列決定方法に関する発明でおって、テンプレートとブ
フイマーを含む系より検出に必要な量だけ試料を取出し
、伸長ＤＮＡ鎖の３′位に取込まれる標識ｄＮＴＰの種
類と竜を測定することにより、３′位の塩基配列を決定
すると同時に、検出、決定された種類のｄＮＴＰとＤＮ
Ａポリメラーゼをテンプレートφプツイマー系に加えて
ＤＮＡ鎖を伸長させ、その後、遊離のｄＮ　Ｔ　Ｐを取
除くという工程を繰返すことを特徴とする。

また本発明の第２の発明は、前記第１の発明のＤＮＡ塩
基配列決定方法を利用したＤ　Ｎ　Ａ塩基配列決定装置
に関する発明であって、テンプレートとプフィマーを含
む主反応槽、試料を検出するための検出反応槽、主反応
槽から検出に必要な量の試料を検出反応槽に取出し、３
１位の塩基配列を決定する手段、主反応槽に検出反応槽
での決定に従ってＤＮＡ鎖の伸長に必要な材料を供給す
る手段、及び不要物を取除く手段を包含していることを
特徴とする。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明ではＭ１３ファージ、ｐＵＣ１１８／１１９系ブ
ツヌミドなど１本鎖ＤＮＡを生成することのできるベク
ターを用いて、まず構造解析しようとするＤＮＡを大腸
菌中で一旦クローニングする。次にクローニングによっ
て得られた組換え体１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、この鋳型
ＤＮＡに相補的な短鎖ＤＮＡをプライマーとして結合さ
せる。このとき鋳型Ｄ’ＮＡ及び／又はプライマーを固
相担体に結合させておくのもよい方法である。

固相担体としては種々のものが利用できる。

例えばセルロース、シリカ、ポリスチレン、戸Ｍ、ＣＰ
Ｇ（コントロールトポアグラス）及びそれらの銹導体な
どを用いることができ、これらの多くは市販されている
。結合方法は、直接結合法と間接結合法に分けられる。

直接結合法としては、例えばあらかじめビオチン標識し
ため型ＤＮＡをアビジン結合した固相担体に結合させる
ことによって達成きれる。ビオチン標識法としては市販
の試薬（フォトビオチンなど）が用いられる。アビジン
結合した担体も市販されている。

間接結合法は、固相に結合させたプライマー（ＤＮＡポ
リメヲーゼの反応開始に必要）と鋳型ＤＮＡを水素結合
で結合させる方法であり、例えばジデオキシ法による塩
基配列決定法に用いられるＭ１３ユニバーサルプライマ
ーハＭ１３ファージＤＮＡを鋳型とした場合に水素結合
により鋳型と相補噴を形成することができる。プライマ
ーを固相に結合させる方法は一般的に知られておシ、例
えばプライマーの５′−末端にスペーサーを介して１級
アミンを導入し、このアミンをジスクシニイミジμスベ
Ｖ−）（ＤＳ８）などのクロスリンカ−を介して、固相
担体に導入された活性カルボキシル基やアミンと結合さ
せることができる。プライマーへのアミンの導入法は確
立されており、例えばアブライドバイオシステムズ社か
ら試薬が販売されている。また１吸アミンや活性カルボ
キシル基を導入した固相担体も市販されている（ピアス
社など）。

別の間接法としては、例えばＭ１５ファージＤＮＡのク
ローニングサイトから離れた領域の配列に相補的なりＮ
Ａを固相に結合させておき、これに鋳型ＤＮＡを水素結
合で結合させることができる。この場合には固相に結合
させるＤＮＡはプライマーとしての機能を持たせないた
めに、３′−末端を固相に結合させるのが望ましい。

そのような方法は知られておシ、例えば必要な配列を化
学合成する際にアンモニアによる脱保護の過程で固相と
ＤＮＡの間の切断が起らない方法を採用すればよい。す
なわち１，５−ペンタン−ジオ−μのような両端に１級
水酸基を有するジオールの一方をジメトキシトリチル基
（ＤＭＴｒ）で保護したあと他方をリン酸化し、次いで
固相担体の官能基と結合させる。このようにして得られ
九固相担体はＤＭＴｒを除去した後ＤＮＡの化学合成に
用いることができる。合成されたＤＮＡはアンモニアで
脱保護することによシＤＮＡのすべての保護基が除かれ
るが、ＤＮＡの３７−末端は固相担体と結合した状態で
得られる。

また片方のプライマーのみ５′末端を固相担体に結合さ
せておいて、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＢ）法
によ）シーフェンスベクターに組込まれている挿入ＤＮ
Ａ断片を増：′ｇ：Ｊさせ、熱変性操作でＪａ！！側の
Ｄ　Ｎ　Ａだけを得ることによって、検出感度及び梢度
を向上させることもできる。

以上のようにして、固相へ結合させることもできる鋳型
Ｄ　Ｎ　Ａとプライマーの複合体が得られる。この鋳型
・プライマー複合体を用意しておき、検出に必要な量だ
け取出して標、ｆｉｄＮＴＰとＤＮＡポリメヲーゼ活性
を有する酵素（Ｄ　ＮＡポリメラーゼｌ、フレノウ−フ
ラグメント、Ｔａｑボリメツーゼ、逆転写酵素など）を
加えて反応させることにより、プライマーの５′位に取
込まれる標１−１ａｄＮＴＰの種類と址を測定する。そ
の結果、プライマーの３′位に結合する塩基を決定する
ことができ、同時にテンプＶ−）・プライマー複合体に
おいてＤＮＡ鎖を伸長させるのに必要なｄＮＴＰが判明
する。そこでテンブレ−トφプフィマー複合体にそのｄ
ＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を加えて
反応させた後、未反応のｄＮＴＰを除去する。この操作
、すなわち、テンプレート・プライマー複合体から検出
に必要な量だけ取出し、伸長ＤＮＡ鎖の３′位に取込ま
れる標識ｄＮＴＰの種類と量を測定することにより３１
位の塩基配列を決定し、そのｄＮＴＰとＤＮＡポリメラ
ーゼをテンプレート・プライマー複合体に加えて反応さ
せた後、遊離のｄＮＴＰを除去することを１サイクルと
して、このサイクルを繰返すことによって、伸長鎖の塩
基配列を５′→３′の方向で１塩基ずつ（同じ塩基がｎ
個続いている場合はｎ塩基ずつ）順次決定していくこと
ができる。同じ塩基がｎ個続いている場合は、１個の塩
基が取込まれた場合の取込み量に対する比の値がｎ倍に
なるので、その数を知ることができる。

取込まれた標識ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰ誘導体の同定は、
標識を測定することにより行われる。標識としては、色
素、蛍光色素、紫外部吸収物質、発光性物質、放射性同
位体、　ｄＮＴＰより遊離されるピロリン酸などを利用
することができる。

標識は４種類の塩基に応じて特異な標識（波長、核種な
ど変えたもの）をつけることもできるし、同一の標識を
用いることもできる。同一標識を用いる場合は、４種類
の塩基に対応した反応槽を使って同定することができる
。標識はｄＮＴＰ誘導体から脱離して測定してもよいし
、ｄＮＴＰ誘導体の１まで測定してもよい。標識はその
標識方法に応じて検出される。例えば色素は可視部分光
光度計、蛍光色素は蛍光光度計、紫外部吸収物質は紫外
部分光光度計、発光性物質はｐミノメーター　放射性同
位体はシンチレーション・カウンターによって検出でき
る。また各標識を液体クロマトグツフィーで調べ、その
保持時間の違いで分離したのち上述した機器でその標識
を検出してもよい。

Ｉ識として色素、蛍光色素、若しくは紫外部吸収物質を
用いる場合、これらは高い吸光係数若しくは蛍光収量を
持つことが望ましい。蛍光標識は市販の蛍光検出用ラベ
ル化剤の中から選ぶことができるが、例えばフルオレッ
セインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイ
ソチオシアネート、β−Ｄ−ガラクトシμウンベリフェ
ロン、テキサス・レッド、ＮＢＤクロ’）　）”　（７
−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジ
アゾ−／ｌ／）々どを挙げることができる。

ｄＮＴＰ誘導体は上記目的に合致するものであれば特に
制限はない。

また上述した塩基配列決定方法を用いて、塩基配列決定
装置を作ることができる。塩基配列決定装置は、少なく
ともテンプレートとプライマーを含む主反応槽及び、伸
長ＤＮＡ鎖の３′位に取込まれる標識ｄＮＴＰの種類と
量を測定する検出反応槽からなるが、そのほか必要に応
じてＤＮＡポリメヲーゼ貯留槽、４種のｄＮＴＰの貯留
槽、遊離のｄＮＴＰを除去するための洗浄槽などを有し
ていてもよい。また検出反応槽は１槽でもよいし、各塩
基ごとに４漕あってもよい。

本装置では、まず主反応槽から検出に必要な量の試料を
検出反応槽に取出し、そこで標識ｄＮＴＰとＤＮＡポリ
メラーゼを加えて反応させ、遊離の標識ｄＮＴＰを除去
後取込まれた標識ｄＮＴＰの種類と量を測定する。その
結果から３１位の塩基配列はどの塩基が何個連なってい
るかを決定すると共に、決定された種類のｄＮＴＰとＤ
ＮＡポリメラーゼを主反応槽に加えてＤＮＡ鎖を伸長さ
せ、最後に主反応槽中の遊離のｄＮＴＰを除去すること
で１サイク〜を終了する。このサイクμを繰返すことで
、ＤＮＡ塩基配列を自動的に決定することができる。

なお主起方法の変法として、主反応槽を４槽に分け、各
々にＤＮＡポリメラーゼと種類の異なったｄＮＴＰを入
れておき、テンプレート・プライマー複合体は担体に結
合させておいて、検出結果に応じて相応する主反応槽に
漬けることもできる。この場合テンプレート拳プフィマ
ー複合体は、洗浄後その一部を検出反応槽に移して塩基
配列を調べる。

以下、本発明装置の１例を添付図面に基づいて説明する
。

第２−Ａ図は本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置の１例の
平面図であシ、第２−Ｂ図はその側面図である。第２−
Ａ図及び第２−Ｂ図において、１はｄＧＴＰ人υ主人心
主反応槽ｄＡＴＰ入シ主反応槽、３はｄＴＴＰ入り主反
応槽、４はｄｃＴＰ入シ主入店主反応槽洗浄槽、６はＣ
検出反応槽、７はＡ検出反応槽、８はＴ検出反応槽、９
はＣ検出反応槽、１０は放射性同位体洗浄槽、１１は乾
燥器、１２は赤外線ブンブ、１３は検出装置、１４は中
央制御コンピューター　１５はベーパー・ホルダー移動
装置、１６はベーパー・ホルダー移動用し−μ、１７は
主反応槽上のベーパー・ホルダー　１８は検出装置中の
ベーパー・ホルダー　１９は検出を終了したベーパー・
ホルダー、２０はベーパー・ホルダー移動用レール支持
体、２１は洗浄液貯留槽、２２は洗浄廃液槽、２３は放
射性同位体廃液槽を示している。

なお第２−Ａ図及び第２−Ｂ図は６サイクル目の検出を
終了して、ベーパー・ホルダー１７がｄＡＴＰ入シ主反
応槽２上に来たところを示している。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はそれらに限定されるものではない。

実施例１．取込みの直線性のテスト 表１　各反応液の組成 Ｍ２プフィマー：　　ＣＣＣＡＧＴＣ’ＡＣＧＡＣＧＴ
ＴＭ３プフイマー：　　ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧ（）Ｃ
ＣＡＧＴＭ５プライマー：　　Ｇ’Ｉ’ＴＧＴＡＡＡＡ
Ｃ（）ＡＣＧＧＣＣ注：ノニデットＰ−４０は、ナカラ
イテスク株式会社よシ入手し九上記表１に記載のような
条件で反応液を混合し、６５°Ｃで１０分間保った後、
放冷して室温に戻した（以上の操作を鋳型−プフイマー
の調製という）。次に、下記表２に示したように１ｍＭ
のｄＮＴＰ又は１　ｍＭのｄｄＮＴＰを２ｐＬずつ、逆
転写酵素（２ユニツト／μｔ）を２μを加え、かくはん
した。

表２　　各反応系に添加するｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰ次
に反応液を９μＬずつ２つのチューブに取出し、片方に
は１　ｐＬのｄＡＴＰ　（４０ｏａ１／ｍｍｏｔ、１　
ｏｐｃｉ／ｐｔ）を、もう一方には１　ｐＬの、ｄｄＡ
ＴＰ　（２７０Ｃ１／ｍｍｏｔ、５　ｐｃ１／ｐＬ　）
を加え、５分間３７゛Ｃに保った。反応液から５μｔを
取出し、ＤＥＡＥ８１ベーパーに浸透させ、１０〇−の
５％リン酸酸水素ナナトリウム　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２
Ｈ，Ｏ）溶液で４回洗浄した後、２００−のエタノール
で洗い、ベーパーを乾燥後、取込まれり放射活性をシン
チン−ジョンカウンターで測定した（以下、この洗浄、
及び測定の操作を単に取込み検出操作という）。次にｄ
ＡＴＰ／ｄｄＡＴＰの値を、Ｍ　１３　ｍｐ１８にハイ
ブリダイズするプフイマーの位置、及び反応条件から予
想される、伸長される鎖に含まれるＡの数に対してプロ
ットすると、第１図に示したように直線性が得られた。

すなわち第１図は取込みが予想されるＡの数（横軸）と
取込み量の比（４ＡＴＰ／ｄｄＡＴＰ、縦軸）との関係
を示すグラフである。各数値を表３に示す。

表３ 取込みの直線性のテストの結果 実施例２．ＤＮＡ塩基配列決定装置を用いた塩基配列の
決定 第２−Ａ図及び第２−Ｂ図に、ＤＮＡ塩基配列決定装置
の概要を示した。主反応槽（１〜４）に（ｄ、２５０μ
ＭのｄＮＴＰα１−１１０×逆転写酵素用援所液１ｄ、
逆転写酵素１０００ユニツトからなる全１１０艷の水溶
液が入っておシ、検出反応槽（６〜９）Ｋは”　Ｐ−ｄ
ＮＴＰ　　（４００Ｃ１／ｍｍｏｔ、　　１０　ＣＡ／
ｐＬ　）　１０　ｐｌ、対応する２５ｐＭコーｙｖドｄ
ＮＴＰ　９０　ｐｔ、　１０　Ｘ逆転写酵素用緩衝液１
００μｔ１逆転写酵素１００ユニツＦからなる全量１−
の水溶液が入っており、また洗浄液貯留槽２１には５％
リン酸酸水素ナナトリウム水溶液入っている。なお主反
応槽（１〜４）と検出反応槽（６〜９）は３７℃に保温
されている。乾燥器１１は赤外線ランプ１２でベーパー
を乾燥させ、検出液［１３はシンチレーションカウンタ
ーにより、４枚のベーパーの放射活性を各々測定する。

またベーパー・ホルダー（１７〜１９）はベーパー・ホ
ルダー移：助用し−Ａ／１６に沿って左右に移動するこ
ともできるし、垂直に移動することもできる。中央制御
コンピューター１４は、検出装置１３の結果を入力し、
それに基づいてベーパー・ホルダー（１７〜１９）を水
平方向と垂直方向に移動させかつ適切刃槽のパルプを適
切な時期に開閉することにより、ベーパーをてましい槽
に望ましい時間浸したυ、洗浄したシすることができる
。

以下に本装置を用いたＤＮＡ塩基配列の決定方法につい
て述べる。

Ｍ１３Ｍ３プフィマ−５０ｐｍｏｌ　とＭ１３ｍｐ　１
９５ｓＤＮＡ　５　ｐｍｏｌ及び１０×逆転写酵素用緩
衝液４０　ｐＬを混合し、全量を４００μｔとしだ。こ
れを用いてテンプレート・ブライマーの調製を行い、こ
の溶液１０μＬずつを４０枚の１５１四方のＤＥＡＥ８
１ベーパーに浸透させ、１０個のベーパー９ホルダーに
４枚ずつセットした。右端のベーパー・ホｌレダーを移
動して検出反応槽（６〜９）にベーパーを浸し３７“Ｃ
で５分間反応させた後、そのベーパー・ホルダーを移動
して放射性同位体洗浄槽１０にベーパーを浸した。そこ
に洗浄液貯留槽２１よシ洗浄液を流し、ａ液は放射性同
位体廃液槽２３へ流すことにより、ベーパーに付着して
いる遊離の標識ｄＮＴＰを除去した。次にベーパー・ホ
ルダーを乾燥器１１に移して赤外線ランプ１２でベーパ
ーを乾燥後、検出液［１３に移動してシンチレーション
カウンターで４枚のペーハーニ取込まれたｄＮＴＰの放
射活性を各々測定した。

その結果表４に示したような検出結果を得、Ｇが取込ま
れたことを中央側副コンピューターが判断し、そこから
の指令で残り９個のベーパー・ホルダーを移動してｄＧ
ＴＰ入シ主反応、ｌ’ｌ　１にベーパーを浸し、５７°
Ｃで５分間反応させた。

表４　第１サイクルの検出結果 次にこの９個のベーパー・ホルダーを移動して洗浄槽５
に浸し、洗浄液貯留槽２１より洗浄液を流して虎液は洗
浄廃液槽２２に捨てることで、遊離のｄＧＴＰを除いた
。更に上述した工程と同様に１個のベーパー・ホルダー
を検出反応槽（６〜９）、放射性同位体洗浄槽１０、乾
燥６１１、検出装置１３で処理し、検出結果に応じて残
シのベーパー・ホルダーを正しい主反応槽（１〜４）に
移動してベーパーを反応させた後、洗浄槽５に移して遊
離のｄＮＴＰを除いた。

このサイクルをベーパー・ホルダーがなくなるまで更に
８回繰返した。各サイク〃の検出結果は表５に示した通
りであυ、それから塩基配列はＣ）ＡＡＴＴＣ’ＧＡＧ
ＣＴＣと決定できた。この配列は、報告されているＭ１
３ｍｐ１９のポリリンカーのシーフェンスと完全に一致
した。

表５　各サイクルの検出結果 〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明により、煩雑な電気
泳動を用いないＤＮＡ塩基配列決定方法及びその装置が
提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図は取込みが予想されるＡの数と取込み量の比との
関係を示すグラフ、第２−Ａ図は本発明のＤＮＡ塩基配
列決定装置の１例の平面図、第２−Ｂ図はその側面図で
ある。 １　：　ｄＧＴＰ入シ主反応槽、２　：　ｄＡＴＰ入り
主反応槽、３　：　ｄＴＴＰ入り主反応槽、４　：　ａ
ｃ’ｒｐ入り主反応槽、５：洗浄槽、６：Ｇ検出反応槽
、７：Ａ検出反応槽、８：Ｔ＠出反応啼、９：Ｃ検出反
応槽、１０：放射性同位体洗浄槽、１１：乾燥器、１２
：赤外線ランブ、１３：検出装［，１４：中央制御コン
ピューター　１５：べ一バー・ホルダー移動装置、１６
：ベーパー・ホシダー移動用Ｖ−ル、１７：主反応槽上
のベーパー・ホルダー　１８：検出装置中のベーパー・
ホルダー　１９：検出を終了したベーパー・ホルダー　
２０：ベーパー・ホルダー移動用レール支持体、２１：
洗浄液貯留槽、２２：洗＃発夜槽、２３：放射性同位体
廃液槽

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡ塩基配列を決定する方法において、テンプレ
   ートとプライマーを含む系より検出に必要な量だけ試料
   を取出し、伸長ＤＮＡ鎖の３′位に取込まれる標識デオ
   キシリボヌクレオシド−５′−トリリン酸の種類と量を
   測定することにより、３′位の塩基配列を決定すると同
   時に、検出、決定された種類のデオキシリボヌクレオシ
   ド−５′−トリリン酸とＤＮＡポリメラーゼをテンプレ
   ート・プライマー系に加えてＤＮＡ鎖を伸長させ、その
   後、遊離のデオキシリボヌクレオシド−５′−トリリン
   酸を取除くという工程を繰返すことを特徴とするＤＮＡ
   塩基配列決定方法。 ２、検出手段として、色素、蛍光色素、紫外部吸収物質
   、発光性物質、又は放射性同位体を標識とするデオキシ
   リボヌクレオシド−５′−トリリン酸誘導体を用いた請
   求項１記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 ３、プライマー及び／又はテンプレートＤＮＡを固相担
   体に結合させておいてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせ
   ることからなる請求項１記載のＤＮＡ塩基配列決定方法
   。 ４、片方のプライマーのみ５′末端を固相担体に結合さ
   せておいて、ポリメラーゼ・チェーン反応法によつてＤ
   ＮＡを増幅させ、熱変性を行つて相補鎖を除去した後、
   ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖伸長反応を行わせる
   ことからなる請求項３記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 ５、テンプレートとプライマーを含む主反応槽、試料を
   検出するための検出反応槽、主反応槽から検出に必要な
   量の試料を検出反応槽に取出し、３′位の塩基配列を決
   定する手段、主反応槽に検出反応槽での決定に従つてＤ
   ＮＡ鎖の伸長に必要な材料を供給する手段、及び不要物
   を取除く手段を包含していることを特徴とするＤＮＡ塩
   基配列決定装置。