JPH02171188A - ビアラホス耐性遺伝子を保有するｄｎａ鎖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はビアラホス耐性遺伝子に関する。より詳しくは
、本発明はビアラホス耐性遺伝子を植物ゲノム中に組み
込むことによりビアラホスの薬害を回避したビアラホス
耐性植物育種のために有用である。

従来、放線菌は、抗生物質をはじめとする有用物質の生
産菌として微生物工業に於いて広く使用されている最も
重要な微生物である。組換えＤＮＡ技術を放線菌の育種
或いはその遺伝的性質の解明に利用できれば、産業上極
めて価値のある成果が期待できる。特に抗生物質耐性遺
伝子は、組換えＤＮへ技術の活用に必要な宿主−ベクタ
ー系を構築する上で有力な選択的マーカーとなっており
産業上有用である。またビアラホス耐性遺伝子の種々多
様のものを提供することは、遺伝子発現の解明など組換
えＤＮＡ技術の応用面で適用範囲を拡大することにつな
がり産業上有用である。

ビアラホスは放線菌ストレプトミセス・ピリドクロモゲ
ネスＴｊｉ　４９４およびその変異株ＤＳＭ　４１１２
並びにストレプトミセス・バイグロスコピカス５Ｆ−１
２９３（ＡＴＣＣ２１７０５）により産生される抗生物
質であり、その化学名はホスフィノスリシル−アラニル
−アラニンである。ビアラホスは抗菌活性もあるがそれ
よりも強力な殺草活性を有するため非選択性の除草剤と
して広く使用されている。その作用機序はビアラホスが
植物体に吸収された後、加水分解され生成したホスフィ
ノスリシンによってグルタミン合成酵素が阻害され、植
物体内に有害なＮｌ’！３が蓄積することにより植物が
枯死する。ビアラホス耐性遺伝子は、前述したビアラホ
ス産生放線菌［Ｍｏｆｆ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｔ　Ｊ　
２０５　、４２−５０　（１９８６）、特開昭６３−７
１１８３号公報、’Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　
Ｊ　６　。

（９）、２５１９−２５２３（１９８７）　、及びｒＧ
ｅｎｅＪ　Ｌ３，６５−７４（１９８８）］　より、自
己耐性遺伝子としてそれぞれクローニングされている。

これらのビアラホス耐性遺伝子は、いずれもホスフィノ
スリシンをＮ−アセチル化するトランスフェラーゼをコ
ードしている。

本発明のビアラホス耐性遺伝子を保有するＤＮＡ鎖もホ
スフィノスリシンをアセチル化する酵素をコードしてい
るが、その供与国である放線菌ＡＢ２２５３株は、菌学
的にビアラホス産生菌である放線菌ストレプトミセス・
ピリドクロモゲネスＴｉ４９４およびその変異株ＤＳＭ
　４１１２並びにストレプトミセス・バイグロスコピカ
ス５Ｆ−１２９３（ＡＴＣＣ２１７０５）と異っており
、本発明によるビアラホス耐性遺伝子の本体も添付図面
の第２図に示した制限酵素切断地図及び第３図の塩基配
列から判断して、明らかに前述の公知の遺伝子と異なる
。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、本出願人が保存している放線菌であって
放線菌ＡＢ２２５３株と命名した菌がビアラホスの存在
下でも生育でき、すなわちビアラホスに耐性であること
を知見したので、この菌株の細胞はビアラホス耐性遺伝
子を有する可能性があると推測して研究を進めていた。

そして、今回、研究の結果として、この菌株の細胞中の
全ＤＮＡ　（染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを含め
て）を制限酵素Ｂｇｌ■で切断したＤＮＡ断片の混合物
のうちから、ビアラホス耐性遺伝子を内部に保有するＤ
ＮＡ断片を選択的にハイブリットプラスミドに組込み且
つクローニングすることに成功した。

従って、本発明によると、ビアラホスに耐性の放線菌Ａ
３２２５３株に由来の全ＤＮＡを制限酵素ＢｇｆＩＩで
切断して得た分子量約２．８　ｋｂを有するＢｇｊ！Ｉ
Ｉ切断ＤＮＡフラグメントと、ストレプトミセス・リビ
ダンスに由来のｐｌＪ７０３プラスミドＤＮＡを制限酵
素Ｂｇｌ＃で切断して得たＢｇｊｌ！ＩＩ切断ＤＮＡフ
ラグメントとを連結して構築されて且つ添付図面の第１
図の制限酵素地図に示した制限酵素切断サイトを有し且
つ分子量約８．５　ｋｂを有するハイブリットプラスミ
ドｐＢＲＡｌ中における放線菌ＡＢ２２５３株に由来の
分子量約２．８ｋｂのＢｇｌＵ切断ＤＮＡフラグメント
〔添〔添付図面第１図のＢｇｊ！ＩＩ（１）からＢｇｆ
［Ｉ（９）までの領域のｏＮＡ鎖に相当〕である又はこ
れと等価であることを特徴とするビアラホス耐性遺伝子
を内部に保有する。５Ａｔｉが提供される。

また、本発明の一つの実施態様としては、前記のハイブ
リットプラスミドｐＢＲＡｌ中における放線菌ＡＢ２２
５３株に由来の請求項第１項記載の分子量約２．８　ｋ
ｂを有するＢｇｊ！Ｉｆ切断ＤＮＡフラグメント中に存
在し、添付図面の第２図に示したＥｃｏＲＩ　（６）か
らＢｇｊｌ！ＩＩ（９）までの領域における制限酵素切
断サイトを有し、かつ添付図面の第３図に示した塩基配
列を有し、内部にビアラホス耐性遺伝子を保有する分子
量Ｑ、８２３　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｆ　ＩＩ切断
ＤＮＡフラグメントである又はこれと等価であることを
特徴とするＤＮＡ鎖が提供される。

ここでｒ　ＤＮＡフラグメントと等価であるＪ　ＤＮＡ
鎖とは、該ＤＮＡフラグメントの有する塩基配列の中で
ＤＮＡコドンの縮重により該ＤＮＡフラグメント自体の
それと異った塩基配列をもつに至ったが、ジェノタイプ
では同一と認められるＤＮＡ鎖を包含していることを意
味し、特に本発明ではホスフィノスリシンをアセチル化
する酵素をコードするＤＮＡ配列を内部に含むＤＮＡ鎖
である点で本発明の約２．８　ｋｂのＤＮＡ鎖と均等で
あるものを意味する。

本発明者らにより見出されたビアラホス耐性遺伝子は、
下記の性質を存するものである。

（１）　　この遺伝子は、放線菌ＡＢ２２５３株由来の
全ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌｌＵで切断して得られる分子
量約２．８ｋｂのＢｇｊ！ＩＩ切断ＤＮＡフラグメント
中に含有された。

（２）この遺伝子を含む前記の約２．８ｋｂのＤＮＡフ
ラグメントをプラスミドｐＩＪ　７０３　ＯＮＡと連結
して構築されたハイブリットプラスミドｐＢＲＡ１は、
分子量８．５　ｋｂであり、これの制限酵素切断地図は
、添付図面の第１図に示す通りである。

（３）　　この遺伝子は、前記の約２．８　ｋｂのＤＮ
Ａフラグメント内の第１図の矢印で示したＥｃｏＲＩ　
（６）−ＢｇｌＵ（９）の０．８２３　ｋｂの領域に存
在し、第１図の矢印の方向に転写される。

（４）　　この遺伝子が存在する前記の０．８２３１（
ｂの領域のＤＮＡフラグメントの制限酵素切断地図は、
添付図面の第２図に示す通りである。

（５）　　この遺伝子が存在する前記の０．８２３　ｋ
ｂの領域のＤＮＡフラグメントの塩基配列は、添付図面
の第３図に示す通りであり、８２３塩恭が存在する。

（６）この遺伝子は、ホスフィノスリシンをアセチル化
する酵素をコードする。

本発明に用いるビアラホス耐性の放線菌４８２２５３株
の選択は下記の通り行われた。

本発明のビアラホス耐性遺伝子の供与菌＾８２２５３菌
株は次の方法により選択された放線菌４８２２５３株で
ある。すなわち、グルコース１％、Ｌ−アスパラギン０
．２　％、　ＮａＣｌ　　Ｏ，０３χ、Ｍｇ５ｏ、　　
＋　７１ｈ０　０．０５％、Ｋ、ＨＰＯ４０，０５％、
微量元素溶液０．５％（ｖ／ｖ）水ｌｌ中にＺｎｉ　ｚ
　４０ｍｇ、　Ｆｅ（／！　ｓ　−６Ｈｚ０２００■、
ＣｕＣｆ　ｚ　・２Ｈｚ０２０ｍｇ、　ＭｎＣｆ　ｚ　
・４８ｚＯｍｇ、（ＨＮａ）ｉＭＯＪｚ４Ｈ４Ｈｔ０２
０ｍｇ、ＣｏＣｌ　、　・６Ｈｚ０２０ｍｇ、、ＣａＣ
ｌ　ｔ・２Ｈｚ０１００　ｔａｇを含む）、バクトアガ
−１，８％なる組成の培地にビアラホスを５０μｇ／ｍ
ｌになるように加えた培地２０ｍ１を直径９−のプラス
チックシャーレに入れ固化させた寒天培地を選択培地に
用いた。

この培地に、出願人が保存する放線菌の約５ｏ。

株を接種し、２７℃で７日間培養したのち、害菌の生育
状態を調査した。そして選択培地上で生育の可能な菌と
してＡＢ２２５３株を選別した。

本発明の遺伝子の誘導に使用されるビアラホス耐性遺伝
子保持菌としては、その菌体中に分離できる特性を有す
るものが用いられる。このような菌株の例としては、本
発明者らによって冨山県下新用郡の林の土壌より分離さ
れた放線菌４８２２５３株がある。この菌株の菌学的性
状は次に示す通りである。

１）　　ＡＢ２２５３株の形態学的特徴二表１に示す表
１ ２）　ＡＢ２２５３株の培養性状（２７°Ｃ１１４日間
培養）：表２に示す。

表２ ＊：胞子のう、車軸分岐、菌核なと ３）　　ＡＢ２２５３株の生理学的性質：表３に示す。

表　　３ 表４ ４）　　ＡＢ２２５３株の炭素源の資化性（２７°Ｃ，
１４日間培養）二表４に示す。

以上の結果から、ＡＢ２２５３株は形態学的特徴、培養
性状、生理学的性状および炭素源の資化性の点で、放線
菌に属する一菌株と同定した。

この放線菌ＡＢ２２５３株は微工研、すなわち通産省工
業技術院微生物技術研究所に微工研菌寄第１０２７１号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２７１）として寄託しである。

本発明において、ビアラホス耐性遺伝子のクローニング
は下記の通り行われた。

放線菌において有用遺伝子をクローニングする際しばし
ば用いられる宿主−ベクター系を用い、すなわち宿主と
してストレプトミセス・リビダンスを用い、ベクターと
してチオペストレプトン耐性遺伝子とメラニン産生遺伝
子の２つの選択マーカーを有するｐｌＪプラスミド（本
発明ではＢｇｆｌｌ切断サイトを１個所もち且つ分子量
５．７ｋｂをもつプラスミドｐ　Ｉ　Ｊ７０３を用いた
）を用いる系を利用して、放線菌ＡＢ２２５３株の全Ｄ
ＮＡからビアラホス耐性遺伝子をショットガン（ｓｈｏ
ｔ−ｇｕｎ）法によりクローニングした。その結果、ビ
アラホス耐性を獲得した形質転換株より本発明のＤＮＡ
鎖を含む分子量８．５ｋｂのハイブリットプラスミドｐ
ＢＲＡ１を分離することに成功したのである。

次に本発明を実施例について具体的に説明する。

皇族■ ｉ）ハイブリットプラスミドの作成 ビアラホス耐性の放線菌ＡＢ２２５３株（微工研菌寄第
１０２７１号）を、１％グルコース、０．４％ポリペプ
トン（大五栄養化学株式会社製）　、０．４％イースト
エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）　、０．０５％ＭｇＳＯ２？
）１２０．０．１％ＫＪＰＯ４ｏ、ｏｓ％グリシンより
なる組成の培地２５ｍ１を分注した１０〇−容量の坂ロ
フラスコにて２７°Ｃで３日間培養したのち、その培養
液２ｄを、０．４％グリセロール、０．２％ポリペプト
ン（大五栄養化学株式会社製）、０．４％イーストエキ
ス（Ｄｔｆｃｏ）　、０．０５％ＭｇＳＯ４’　７Ｈｚ
Ｏ，０，２％ＫＩＩ２ＨＰＯ４，０，８％ＮａＪＰＯ，
・１２Ｈｚ０　、０．２グリシンよりなる組成の培地１
００ｍ１を分注した５００ｄ容坂ロフラスコに加え、２
７°Ｃでさらに２日間培養し、培養液を３０００回転、
１５分間遠心分離して菌体を集めた０次に、この菌体か
ら両画らの公知の方法（ｒＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
　Ｊ　１０４　、１０８６　１０９４（１９７０）　）
にならって全ＤＮＡを抽出精製し、供与体ＤＮＡとした
。

このように得た供与体ＤＮＡ５μｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　Ｍｇ（／！
　ｚ、ｌＯ抛ＭＮａＣｊ！よりなる組成の緩衝液５０μ
！中で、制限酵素ａｇｆ！、■２０単位と３７°Ｃで２
時間反応させてＤＮＡフラグメントを得た。

一方、ストレプトミセス・リビダンス３工３１（ＡＴＣ
Ｃ３５２８７）の菌体より抽出精製したプラスミドｐｌ
Ｊ７０３ＯＮＡ　　１　ｕ　ｇを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−Ｈ（、ｅ　（ｐｆ１７．４）、１０ｍＭ　ＭｇＣｆ　
ｚ、１００ｍＭ　　ＮａＣｌよりなる組成の緩衝液５０
μｉ中で制限酵素ＢｇｌＩＩ２０単位と３７°Ｃで２時
間反応させてＤＮＡフラグメン［・を得た。この両者の
フラグメントを混合し、３Ｍ　　酢酸ナトリウム溶液（
酢酸でＰＨ５，２に調整）１０μ２を加え、さらに冷エ
タノールを２倍量加えて、−２０’Ｃで一夜装置したの
ち、１０，０００回転で１０分間遠心分離し、ＤＮＡを
沈殿物として回収した。

回収したＤＮＡを減圧下で乾燥し、１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐｉ４７．６）　、１０ｍＭ　　ＮａＣ１
，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　・２Ｎａよりなる組成の緩衝液１
００μ！に溶解した。このＤＮＡ溶液を６８°Ｃで７分
間加熱処理したのち、室温に２時間保置し、６６０ｍＭ
↑ｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，６）、６６ｍＭ　ＭｇＣ
１ｔ１００ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭＡＴＰから
なる緩衝液１０μβとＴ４　ＤＮＡリガーゼ０．５　μ
ｆｆｉ　（３７５単位）とを加え、４°Ｃで一夜、ＤＮ
Ａフラグメントの連結反応を行った。このようにしてプ
ラスミドｐｌＪ７０３のＢｇＥＩＩ切断ＤＮＡフラグメ
ントに、放線菌ＡＢ２２５３株の全ＤＮＡのＢｇｆＩＩ
切断ＤＮＡフラグメントを組み込んだ各種のハイブリッ
トプラスミドの混合物を得た。

ｉｉ）ビアラホス耐性遺伝子の検出とクローニングこの
ようにして得たハイブリットプラスミド混合物を用い、
宿主であるストレプトミセス・リビダンスのプロトプラ
ストを形質転換し、ビアラホス耐性となった形質転換株
を選別して、その菌体からハイブリットプラスミドｐＢ
ＲＡＩを単離することにより本発明のビアラホス耐性遺
伝子を保有する。ＮＡｔｊｆがクローニングされている
。

なお、宿主として用いたストレプトミセス・リビダンス
は、プロトプラストの再生によりプラスミドｐｒＪ７０
２を除去したストレプトミセス・リビダンス３１３１で
あり、昭和６０年に国立予防衛生研究所抗生物質部より
入手したものである（小島らｒＪ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｓ」３８（３）、　３９０−４００）　。

ストレプトミセス・リビダンスの上記プロトプラストの
調製は、下記の通り行った。ストレプトミセス・リビダ
ンスを１％グルコース、０．４％ポリペプトン（大五栄
養化学株式会社製）、０．４％イーストエキス（Ｄｉｆ
ｃｏ社製）、０．０５％　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０，０，
１％に２ＨＰＯ４，０，０５％グリシンよりなる培地２
５ｍ１に接種し、長さ１．５　ｃｍ、直径１印のステン
レス製スプリングを入れて２７°Ｃ１２日間培養後、そ
の培養液２ｄを、１％グルコース、０．３％イーストエ
キスＣＤ１ｆｃｏ社製）０．５％バタトーペプトン（Ｄ
ｉｆｃｏ社製）、０．３％マルトエキス（Ｄｉｆｃｏ社
製）、３４％４％シラ０．１％ＭｇＣｆ□・６８２０　
、０．５％グリシンよりなる組成の培地１００ｍｊ！に
加え、さらに２７°Ｃ，２日間培養した。その培養液５
Ｉｎｉ、より８．０００回転で１０分間遠心分離して菌
体を集め、０．５ｈシｇ１ｍ溶液で洗浄したのち、７０
ｍＭ　　ＮａＣｌ　、　５　ｍＭＭｇＣｌ　ｚ、＋　５
ｍＭ　ＣａＣｊ！　ｚ、０．４Ｍシ！ＩＩＪｉ、２５　
ｍＭＧｏａｄ’ｓ　ＴＥＳバッフｙ−（ｐＨ７，２）よ
りなる組成の緩衝液４ｄに懸濁した。その菌懸濁液に４
０ｍｇ／ｄの卵白リゾチーム溶液を１００μｌ加え、３
０°Ｃで９０分間保温してプロトプラストを形成させた
。プロトプラスト化しない菌体を綿ろ過で除き、３．５
００回転で１０分間の遠心分離により、プロトプラスト
を集めた。集めたプロトプラストを７０ｍＭ　　ＮａＣ
ｊ！、１０ｍＭ　ＭｇＣ’２、２０ｍＭ　ＣａＣｌ２、
０．４Ｍショ糖、２５　ｍＭＧｏａｄ’ｓ　ＴＥＳバッ
フｙ　−（ｐＨ７，２）　よりなる緩衝液（Ｐ畦緩衝液
）で１回洗浄後、同緩衝液に約ｌＸｌ０’個／ｄとなる
ように懸濁した。

二のプロトプラスト懸濁液２５０μ２に、前記（ｉ）項
で得たハイブリットプラスミド混合物の溶液５０μｌと
４０％ポリエチレンゲルコール４．０００（和光純薬株
式会社製）溶液３００μ２を加えて、水中で２分間放置
したのち、前記のＰＷＰ緩衝液を９００１１ｆを加えて
ポリエチレンゲルコールの濃度を下げた。この混合液を
、直径９Ωのプラスチック製シャーレに分注し、固化さ
せた寒天培地（１％グア１／ｌ−ス１０．０５％　ＫＣ
ｌ　、　　０．０１％ＫＪＰＱａ、０．２％ＭｇＣ１ｚ
　・６ＨｚＯ，０，０７％ＣａＣｊ！　ｔ　・２Ｈｚ０
０．１％ポリペプトン（大五栄養化学株式会社製）、０
．４％イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）ｔ　０．０５
％（ｖ／ｖ）微量元素溶液、　２５ｎ＋Ｍ　Ｇｏｏｄ’
ｓ　ＴＥＳ、バッファー（ｐ）１７．２）、　１．８％
バタトアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）に１５０μｌずつ塗布
して、２７°Ｃで１０日間培養し、プロトプラストの再
生及び気中菌糸の形成を行った。

なお微量元素溶液とは、水１１に、ＺｎＣ１□４０■、
ＮｅＣｆ　３　・６Ｈｚ０２００　ｍｇ、ＣｕＣｉｉ　
、　・２Ｈ２０２０ｍｇ。

ＮｅＣ１ｚ　・４Ｈｚ０２０１１１ｇ、（ＮＨ４）４　
ＭＯｔＯｔ４’　４Ｈ２０２０■、ＣｏＣｊ！ｚ・６Ｈ
ｚ０　２０　ｍｇ、　　ＣａＣｆｚ・２ＨＢ０１００■
を含んだ水溶液である。

再生した菌層を、１％グルコース、０．２％Ｌ−アスパ
ラギン、　０．０３％ＮａＣｌ　、　０．０５％ＭｇＳ
Ｏ４７Ｈ，０，０，０５％ＫＪＰＯ４，及び上記した微
量元素溶液０．５％（ｖ／ｖ）、１．８％バクトアガー
よりなる組成物にチオペプチン（チオストレプトンの代
替物）及びビアラホスをそれぞれ１０μｇ／ｄ及び５０
μｇ／Ｉｎｌになるように加えて調製した選択培地にレ
プリカし、２７°Ｃで３日間培養を行ない、生育のよい
クローンの２株を選択した。なお、ビアラホスは除草剤
として市販されるビアラホス水溶剤より抽出精製したも
のを使用した。

得られた２株のビアラホス耐性株より公知の方法（Ｃｈ
ａ　ｔｅｒら、　　ｒｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　
ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙＪ９６．６９（１９８２））にならってプラス
ミドを抽出した。その結果、この２株は、同じ分子量８
．５　ｋｂのプラスミドを持っていた。これら２株から
由来のプラスミドを夫々に、制限酵素ＢｇｆｆｉＩＩで
切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分析した結
果、どちらも、ベクターに用いたｐＩＪ７０３のＤＮＡ
断片に加えて、約２．８　ｋｂのＤＮＡ断片が検出され
た。さらに、前記２株より得たそれぞれのプラスミドを
他の制限酵素（Ｓａｃ　Ｉ　、ｓｐｈ　Ｉ　、　Ｐｓｔ
Ｉなど）で切断したときに生じる断片の大きさがいずれ
も同一であったことから、この２つのプラスミドは同一
のプラスミドであることが判明し、プラスミドｐＢＲＡ
１　と命名した。

このハイブリットプラスミドｐＢＲＡ１を用いて、これ
を再度ストレプトミセス・リビダンスに導入させて形質
転換させた。使用した（ベクター）プラスミドのマーカ
ーであるチオベプチン耐性を基準にして選択された形質
転換株はすべてビアラホス耐性を示した。このようにハ
イブリットプラスミドｐＢＲＡ１を導入されたストレプ
トミセス・リビダンスのビアラホス耐性形質転換株はス
トレプトミセス・リビダンスＬＣ−１（ｐＢＲＡ−１）
と命名し、この菌株は微工研に微工研菌第１０２７２号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２７２）として寄託しである。

上記のことから明らかなように、ハイブリットプラスミ
ドｐＢＲＡ１を導入することによりストレプトミセス・
リビダンスをビアラホス耐性に形質転換させることが可
能であった。この事実は、ハイブリットプラスミドｐＢ
ＲＡｌ内の放線菌ＡＢ２２５３株由来の分子量約２．８
　ｋｂのＤＮＡ鎖には、ビアラホス耐性遺伝子がコード
されていることを示すものである。

（ｉｊ）ビアラホス耐性遺伝子のコード領域の判定ビア
ラホス耐性をになう遺伝子のコード領域は第１図のｐＢ
ＲＡｌの制限酵素切断地図の矢印で示した約０．８　ｋ
ｂのＤＮＡフラグメント中に位置する。このことはプラ
スミドｐＢＩ？Ａ１から作製された２種の欠失プラスミ
ド（Ｓａｃ　Ｉ欠失及びＥｃｏＲＩ欠失）をそれぞれ導
入されて保持するストレプトミセス・リビダンスの形質
転換株のビアラホス耐性を調査することにより確認され
た。それら欠失プラスミド及びそのプラスミドを保持す
るストレプトミセス・リビダンスの作出は以下のように
行った。

ｐＢＲＡｌをＳａｃ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断したのち
、連結酵素Ｔ４リガーゼと反応させ、そのリゲーション
混合液を用いてストレプトミセス・リビダンスを形質転
換させた。得られたチオベブチンに耐性な形質転換株の
なかから、プラスミドｐＢＲＡ１より小さなプラスミド
を保持する株を検索した。すなわち、ｐＢＲＡｌをＳａ
ｃ　Ｉで切断した場合には、０．７　ｋｂのＤＮＡ断片
（第１図のＳａｃ　Ｉ　（８）からＳａｃ　Ｉ　（Ｓ）
の領域）を欠失分子ｆｉ７．８　ｋｂのプラスミドを保
持する形質転換株が得られ、またｐＢＲＡ　１をＥｃｏ
Ｒｌで切断した場合には、０．６　ｋｂの断片（第１図
のＥｃｏＲＩ　（４）からＥｃｏＲＩ　（６）の領域）
を欠失した分子量？、９　ｋｂのプラスミドを保持する
形質転換株が得られる。

これらの形質転換株のうち前者はビアラホス耐性を示さ
ず、一方、後者はビアラホス耐性を示した。このことよ
り、欠失部分である第１図の地図中のＳａｃ　ｒ　（８
）〜Ｓａｃ　Ｉ　（Ｓ）の領域内にはビアラホス耐性遺
伝子のコード領域の少なくとも一部は存在し、ＥｃｏＲ
Ｉ　（４）〜ＥｃｏＲＩ　（６）の領域内にはビアラホ
ス耐性遺伝子のコード領域は存在しないことが明らかと
なり、その結果、ビアラホス耐性遺伝子のコード領域は
前記した第１図中に矢印で示した領域内に位置すること
が推定される。

（ｉｖ　）ビアラホス耐性遺伝子の転写方向と塩基配列
の解析 前記した約０．８　ｋｂのＤＮＡ断片内に存在するビア
ラホス耐性遺伝子は、第１図の矢印の方向に転写される
。このことは、この約０．８　ｋｂのＤＮＡ断片を市販
のプラスミドベクターｐ［Ｉｃ１ＢまたはｐＵｃ１９に
組み込んで大腸菌に導入した際のビアラホス耐性の発現
の様相から確認される。プラスミドベクターｐＵｃ１Ｂ
及びｐＵｃ１９は、いずれも内部にアンピシリン耐性遺
伝子と１ａｃＺ遺伝子の２つの選択マーカーを持ち、そ
の１ａｃＺ遺伝子のプロモーターの下流にマルチプルク
ローニングサイトと呼ばれる外来ＤＮＡの挿入部位があ
る。ベクターｐｕｃ　１Ｂとｐｕｃ　１９とでは、その
マルチプルクローニングサイトの塩基配列が逆向きにな
っており、同じＤＮＡ断片をｆａｃＺ遺伝子のプロモー
ターに対し逆方向に挿入することが可能である。またｆ
ａｃＺ遺伝子のプロモーターは、イソプロピル−β−１
−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）などの誘導物質の存在
下でのみ働くという特徴を持つ、ベクターｐＬＩｃ１Ｂ
およびｐＵｃ１９に上記の約０．８　ｋｂのＤＮＡ断片
を組み込んだハイブリットプラスミドによる大腸菌ＪＭ
１０９株の形質転換株におけるビアラホス耐性は、Ｉ　
ＰＴＧの存在条件で、この約０．８　ｋｂのＤＮＡ断片
のＥｃｏＲＩ側を上流にするように作製されたｐＵｃ１
８由来のハイブリットプラスミドによる形質転換株にお
いてのみ認められた。この結果より、上記の約０．８　
ｋｂのＤＮＡ断片内にビアラホス耐性遺伝子のコード領
域が存在することが再確認されたと同時にビアラホス耐
性遺伝子の転写方向が第１図の矢印の方向であることが
判明した。

この約０．８　ｋｂのＯＮ八へ片の塩基配列を、Ｍ　１
３ａ＋ｐ１８及びｍｐ１９の１本鎖ＤＮＡを利用したジ
デオキシ法で決定した結果を添付図面の第３図に示す。

添付図面の第２図の制限酵素切断地図及び第３図の塩基
配列を、ストレプトミセス・バイグロスコピカスＡＴＣ
Ｃ２１７０５（ｒ↑ｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　Ｊ
　６（９）、　２５１９−２５２３（１９８７））やス
トレプトミセス・ピリドクロモゲネスＤＳＭ４１１２（
前記特開昭６１−７１１８３号公報）から得られたビア
ラホス耐性遺伝子のものと比較することにより、本発明
のビアラホス耐性遺伝子は、公知の遺伝子と異なること
が示される０本発明のビアラホス耐性遺伝子は、ホスフ
ィノスリシンをアセチル化する酵素をコードしている。

このことは、本発明のビアラホス耐性遺伝子を含むハイ
ブリットプラスミドｐＢＲＡ１により宿主を形質転換株
させた菌体より酵素液を調製し、これを補酵素アセチル
ＣｏＡの存在下でホスフィノスリシンと反応させること
によって確認された。

（ｖ）耐性機序 プラスミドベクターｐｌＪ７０３及びハイブリットプラ
スミドｐＢＲ＾１をそれぞれを保持するストレプトミセ
ス・リビダンスを、それぞれ、チオペプチンを５μｇ／
−になるように加えた１％グルコース、０．４％ポリペ
プトン（大五栄養化学株式会社製）、０．４％イースト
エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０５％ＭｇＳＯ４・７
ｔ１．０．０．１％に！ＨＰＯ４よりなる組成の培地２
５ｄに接種し、ステンレス製スプリングを入れて２７°
Ｃで２日間培養後、その培養液２　ａｌｌを０．２％グ
ルコース、１．２％マルトース、０．４％ポリペプトン
（大五栄養化学株式会社製）、０．４％イーストエキス
（Ｄｉｆｃｏ社製）　、０．０５％Ｍｇ５Ｏａ　　・７
Ｈ！００．０５％ＫＪＰＯ１よりなる組成の培地１００
　ｒｎｌに加えて、さらに２７°Ｃ２日間培養した。　
　６．０００回転１０分間遠心分離して菌体を集め、０
．３■／−のジチオスレイトールを含んだ５０ＩＩＩＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で洗浄後、同緩衝液２０ｄ
に懸濁し、氷水中綴音波にて菌体を破砕し、１２，００
０回転で１０分間の遠心分離を行なって、無細胞の酵素
抽出液を得た。

このように調製した酵素抽出液１６０μｌに基質として
２０μｇ７ｍｌビアラホス溶液又はビアラホスの分解産
物で化学合成により得られたＯＬ−ホスフィノスリシン
溶液（２■／ｄ）をそれぞれ２０μｌを加え、さらに５
■／ｄアセチルＣｏＡ　ｍ液を２０μ！加えたものと加
えないものを用意して、３０°Ｃ２時間反応させた。な
お、ＯＬ−ホスフィノスリシンは市販のグルホシネート
液剤より抽出精製したものを使用した。その反応結果を
枯草菌の生育阻止を指標としたペーパーディスク検定で
調べた。

すなわち枯草菌の胞子を含んだＤａνｉｓ寒天培地（０
，２％グルコース、０．１％（ＮＨ４）　ｚｓＯａ　、
０．７％ＫｔＨＰＯ，，０，２％に、ＨＰＯ，，０，０
１％Ｍｇ５Ｏ＜　　・７ＨｚＯ。

０４０５％クエン酸ナトリウム、１．２％バタトアガー
（Ｄｉｆｃｏ社製））の上に、前記の反応液５０μ２を
しみこませた径８鵬のペーパーディスクをのせ、３７゛
Ｃで一夜培養して、枯草菌の生育阻止を観察した。

その結果、プラスミドベクターｐｌＪ７０３を保持する
ストレプトミセス・リビダンスより調製した酵素抽出液
を用いた場合には、いずれの反応条件においても、ＤＬ
−ホスフィノスリシン又はビアラホスによる枯草菌の生
育阻止にほとんど変化が認められなかった。一方ハイブ
リットプラスミドｐＢＲＡ１を保持するストレプトミセ
ス・リビダンスより調製した酵素抽出液を用いた場合は
、ビアラホスを基質とした際には、補酵素アセチルＣｏ
Ａの存在の存無にかかわらず枯草菌の生育阻止に変化は
なかったが、ＤＬ−ホスフィノスリシンを基質とした際
には、アセチルＣｏＡを加えた時に枯草菌の生育阻止の
消失がはっきり認められた。この事実は、ハイブリット
プラスミドｐＢＲＡ１を導入することにより、ホスフィ
ノスリシンをアセチル化によって不活性化する能力をス
トレプトミセス・リビダンスが獲得したことを意味し、
本発明のＤＮＡ鎖に存在するビアラホス耐性遺伝子は、
ホスフィノスリシンのアセチル化酵素をコードしている
ことを示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のビアラホス耐遺伝子を内部に保有す
るＤＮＡ鎖を含有するハイブリットプラスミドｐＢＲＡ
１の制限酵素切断地図である。 第２図は、ビアラホス耐遺伝子のコード領域、すなわち
第１図の矢印の部分のＤＮＡ　８Ｎ域の詳細な制限酵素
切断地図である。 第３図は、ビアラホス耐遺伝子のコード領域、すなわち
第１図の矢印の部分のＤＮＡ　６ｉ域の塩基配列である
。この塩基配列の左上端（上流）が第２図の地図のＥｃ
ｏＲＩ　（６）切断サイトに相当し、右下端（下流）が
第２図の地図のＢｇｆ■（９）切断サイトに相当する。 第１図 散工ＨＩ （βｂ） 手続補正書 （自発） 平成 ２年 ３月１９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビアラホスに耐性放線菌ＡＢ２２５３株に由来の全
   ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIで切断して得た分子量約２．
   ８ｋｂを有するＢｇｌII切断ＤＮＡフラグメントと、ス
   トレプトミセス・リビダンスに由来のｐＩＪ７０３プラ
   スミドＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIで切断して得たＢｇｌ
   II切断ＤＮＡフラグメントとを連結して構築されて且つ
   添付図面の第１図の制限酵素地図に示した制限酵素切断
   サイトを有し且つ分子量約８．５ｋｂを有するハイブリ
   ットプラスミドｐＢＲＡ１中における放線菌ＡＢ２２５
   ３株に由来の分子量約２．８ｋｂのＢｇｌII切断ＤＮＡ
   フラグメント〔添付図面の第１図のＢｇｌII（１）から
   ＢｇｌII（９）までの領域のＤＮＡ鎖に相当〕である又
   はこれと等価であることを特徴とするビアラホス耐性遺
   伝子を内部に保有するＤＮＡ鎖。 ２、請求項第１項記載の分子量約２．８ｋｂを有するＢ
   ｇｌII切断ＤＮＡフラグメント中に存在し、添付図面の
   第２図に示したＥｃｏＲ I （６）からＢｇｌII（９）
   までの領域における制限酵素切断サイトを有し、かつ添
   付図面の第３図に示した塩基配列を有し、内部にビアラ
   ホス耐性遺伝子を保有する分子量０．８２３ｋｂのＥｃ
   ｏＲ I −ＢｇｌII切断ＤＮＡフラグメントである又は
   これと等価であることを特徴とするＤＮＡ鎖。