JPH0216983A - 有機的に組織された機能体系を構成するタンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び発現方法 - Google Patents
有機的に組織された機能体系を構成するタンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び発現方法Info
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- JPH0216983A JPH0216983A JP18532488A JP18532488A JPH0216983A JP H0216983 A JPH0216983 A JP H0216983A JP 18532488 A JP18532488 A JP 18532488A JP 18532488 A JP18532488 A JP 18532488A JP H0216983 A JPH0216983 A JP H0216983A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、有機的に組織された機能体系（６ｄｉ−ｆｉ
ｃｅｓ ｆｏｎｃｔｒｏｎｎｅｌｓ ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ）を構成するタンパク質をコードする遺伝子のクロー
ニング及び発現方法に係る。
ｃｅｓ ｆｏｎｃｔｒｏｎｎｅｌｓ ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ）を構成するタンパク質をコードする遺伝子のクロー
ニング及び発現方法に係る。
他の遺伝子により特定されるタンパク質との相互作用の
結果として作用するか又は抑制される活性を有するタン
パク質をコードする活性遺伝子は、非常に多い。これら
の多タンパク系は多くの場合、同一の生物に由来する相
同系（同種）である。場合によっては非相同系（異種）
のこともあり、異なる生物に由来するが互いに相互作用
をするタンパク質により形成される。
結果として作用するか又は抑制される活性を有するタン
パク質をコードする活性遺伝子は、非常に多い。これら
の多タンパク系は多くの場合、同一の生物に由来する相
同系（同種）である。場合によっては非相同系（異種）
のこともあり、異なる生物に由来するが互いに相互作用
をするタンパク質により形成される。
従来知られている主要なりローニング方法は、クローニ
ング後に検出される単独の外来単位又は一連の連続単位
の組み込みを可能にする。しかしながらこの方法は、機
能的関連性（類似性、ｐａｒｅｎｔ６）は有するが、染
色体中の起源の位置に関連性かないばかりか起源となっ
た生物の類縁関係もないような複数の遺伝子単位のクロ
ーニングには使用されない。
ング後に検出される単独の外来単位又は一連の連続単位
の組み込みを可能にする。しかしながらこの方法は、機
能的関連性（類似性、ｐａｒｅｎｔ６）は有するが、染
色体中の起源の位置に関連性かないばかりか起源となっ
た生物の類縁関係もないような複数の遺伝子単位のクロ
ーニングには使用されない。
１つの複製単位に起源の異なる複数の遺伝子を同時に配
置する例は確かに種々のものが存在している。例えば、
クローニングプラスミド上で抗生物質耐性遺伝子と共に
遺伝子をクローニングする場合である。しかしながら、
これらは該当遺伝子間に全く機能的関連性がない偶発的
な結合の例である。また、所与の生物に元来存在する機
能的なつながりを有するオペロンも存在している。同一
の複製単位上でクローニングした２つの異なる遺伝子、
即ち一方が他方の発現を可能にする制御遺伝子であるよ
うな２つの遺伝子を結合することも提案されている。こ
の結合によると、クローン化遺伝子の条件イτ１発現を
得ることが可能であり、また、毒性によるいくつかの制
限をなくすことも可能である。一般に、温度のような物
理的パラメーターにより、又は培地中に任意に添加する
ことが可能な３尋物質の存在により制御可能なリアレッ
サーと同時にクローニングする場合がある。この場合、
遺伝子の結合は同時にクローン化した遺伝子の産物の活
性における関連性には何ら対応しない。
置する例は確かに種々のものが存在している。例えば、
クローニングプラスミド上で抗生物質耐性遺伝子と共に
遺伝子をクローニングする場合である。しかしながら、
これらは該当遺伝子間に全く機能的関連性がない偶発的
な結合の例である。また、所与の生物に元来存在する機
能的なつながりを有するオペロンも存在している。同一
の複製単位上でクローニングした２つの異なる遺伝子、
即ち一方が他方の発現を可能にする制御遺伝子であるよ
うな２つの遺伝子を結合することも提案されている。こ
の結合によると、クローン化遺伝子の条件イτ１発現を
得ることが可能であり、また、毒性によるいくつかの制
限をなくすことも可能である。一般に、温度のような物
理的パラメーターにより、又は培地中に任意に添加する
ことが可能な３尋物質の存在により制御可能なリアレッ
サーと同時にクローニングする場合がある。この場合、
遺伝子の結合は同時にクローン化した遺伝子の産物の活
性における関連性には何ら対応しない。
更に留意ずべき点として、遺伝子のクローニング方法に
おいては、一般に、発現生成物を顕現化できるように十
分な量の該生成物を得る必要がある。
おいては、一般に、発現生成物を顕現化できるように十
分な量の該生成物を得る必要がある。
更に、発現生成物が有毒であることが判っている場合、
遺伝子をクローニングすることは困難又は不可能であり
得る。
遺伝子をクローニングすることは困難又は不可能であり
得る。
本発明の目的は、これらの問題を少なくとも部分的に解
消し、遺伝子の直接クローニング又は多タンパク系の同
時発現を可能にする従来提案されている方法を改良する
ことである。
消し、遺伝子の直接クローニング又は多タンパク系の同
時発現を可能にする従来提案されている方法を改良する
ことである。
本発明の目的はより特定的には、該当生物中に先存の遺
伝子構成としては存在していない機能的結合により、一
連の異なるタンパク質を同時に産生ずることが可能な方
法を提供することである。
伝子構成としては存在していない機能的結合により、一
連の異なるタンパク質を同時に産生ずることが可能な方
法を提供することである。
本発明のクローニング及び発現方法は、−少なくとも１
個の指示遺伝子と少なくとも１個の顕現させるべき遺伝
子との２個以上の外来遺伝子から構成されるか又はそれ
らを含むＤＮＡフラグメントを導入することにより、外
来ＤＮ八を取り込み且つ発現することが可能な受容性微
生物株の細胞を形質転換させ、ただし、該遺伝子は場合
によって指示遺伝子及び顕現させるべき遺伝子として相
とが可能であり、該指示遺伝子は顕現すべき遺伝子によ
り発現されるタンパク質の生物活性の検出相同系及びば
あいによっては非相同系で、例えば物理化学的、生化学
的、微生物学的又は放射免疫的手段を使用することによ
り所望のタンパク質の生物活性を検出し、 遺伝子の特徴的性質を利用することにより該タンパク質
をコードする遺伝子を単離することを特徴とする。
個の指示遺伝子と少なくとも１個の顕現させるべき遺伝
子との２個以上の外来遺伝子から構成されるか又はそれ
らを含むＤＮＡフラグメントを導入することにより、外
来ＤＮ八を取り込み且つ発現することが可能な受容性微
生物株の細胞を形質転換させ、ただし、該遺伝子は場合
によって指示遺伝子及び顕現させるべき遺伝子として相
とが可能であり、該指示遺伝子は顕現すべき遺伝子によ
り発現されるタンパク質の生物活性の検出相同系及びば
あいによっては非相同系で、例えば物理化学的、生化学
的、微生物学的又は放射免疫的手段を使用することによ
り所望のタンパク質の生物活性を検出し、 遺伝子の特徴的性質を利用することにより該タンパク質
をコードする遺伝子を単離することを特徴とする。
この方法を使用すると、発現を可能にする生物の内部に
人工的な機能アセンブリが構成されることが認められよ
う。
人工的な機能アセンブリが構成されることが認められよ
う。
指示遺伝子と顕現化される遺伝子は対称的な役割を担っ
ており、そのクローニングと発現によって、複数のサブ
ユニットが同時に発現されたときに初めて現れる生物活
性を有する多数のサブユニットをもったタンパク質の間
の関係を知ることができる。
ており、そのクローニングと発現によって、複数のサブ
ユニットが同時に発現されたときに初めて現れる生物活
性を有する多数のサブユニットをもったタンパク質の間
の関係を知ることができる。
本発明の一過様によると、上記方法は、機能アセンブリ
の所与のタンパク質サブユニットをコードする遺伝子を
、この遺伝子を包み得るいろいろなりＮ＾フラグメント
から単離するための手段を提供する。
の所与のタンパク質サブユニットをコードする遺伝子を
、この遺伝子を包み得るいろいろなりＮ＾フラグメント
から単離するための手段を提供する。
従って本発明は、遺伝子の分子特徴付け、即ちその発現
を可能にする。
を可能にする。
別の態様によると、本発明は顕現化された遺伝子により
、又は同時に指示遺伝子及び顕現化された遺伝子により
発現されるタンパク質、あるいは導入された外来遺伝子
により発現されるタンパク質の相互作用によって形成さ
れるタンパク質を、有利にも種々の受容性生物細胞内で
大量に産生ずる手段を提供する。
、又は同時に指示遺伝子及び顕現化された遺伝子により
発現されるタンパク質、あるいは導入された外来遺伝子
により発現されるタンパク質の相互作用によって形成さ
れるタンパク質を、有利にも種々の受容性生物細胞内で
大量に産生ずる手段を提供する。
本発明の方法によって得られる産物なども本発明の範囲
内に入る。特に、本発明は、クローン化されたヌクレオ
チド配列及び発現されたタンパク質に係り、これらのタ
ンパク質はその間で発揮される協同特性を特徴とする。
内に入る。特に、本発明は、クローン化されたヌクレオ
チド配列及び発現されたタンパク質に係り、これらのタ
ンパク質はその間で発揮される協同特性を特徴とする。
外来ＯＮ八を取り込み且つ発現することが可能であるな
ら、多数の受容性株が本発明を実施するのに適当である
。特に、共通の遺伝子コードを有する株を使用する。
ら、多数の受容性株が本発明を実施するのに適当である
。特に、共通の遺伝子コードを有する株を使用する。
例えば細菌株、酵母、真核細胞が挙げられる。
好ましくは、使用される細菌株は制限マイナス（ｒｅｓ
ｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍｏｉｎｓ）の形質を有しており、
従って、制限マイナスの中間株を予め介在させずに本発
明の方法を直接使用することが可能である。
ｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍｏｉｎｓ）の形質を有しており、
従って、制限マイナスの中間株を予め介在させずに本発
明の方法を直接使用することが可能である。
所与のタンパク質の産生を検出できるように、これらの
株は有利には発現すべきタンパク質と類似の活性を有す
るタンパク質の合成を特定する遺伝子中に、高率で安定
且つ不可逆の欠失を有して＝１１ いる。
株は有利には発現すべきタンパク質と類似の活性を有す
るタンパク質の合成を特定する遺伝子中に、高率で安定
且つ不可逆の欠失を有して＝１１ いる。
一例として、相同部分を含まない細菌中における真核性
多重タンパク質のクローニング及び発現がある。例えば
、細菌における機能性イムノグロブリン又はヘモグロビ
ンの発現である。本発明の一変形例によると、導入され
る遺伝子は非相同系に含まれる遺伝子である。この変形
例は真核タンパク質の存在に依存する活性を有する細菌
毒性のクローニング及び発現を例にとって後述する。
多重タンパク質のクローニング及び発現がある。例えば
、細菌における機能性イムノグロブリン又はヘモグロビ
ンの発現である。本発明の一変形例によると、導入され
る遺伝子は非相同系に含まれる遺伝子である。この変形
例は真核タンパク質の存在に依存する活性を有する細菌
毒性のクローニング及び発現を例にとって後述する。
本発明によると、好ましくは多タンパク体系の各種の単
位をコードする遺伝子の連続クローニングを実施する。
位をコードする遺伝子の連続クローニングを実施する。
この実施ａ様によると、好ましくは夫々指示遺伝子及び
顕現化すべき遺伝子を含む異なるレプリコンにより担持
されるＤＮＡフラグメントを受容性細胞に連続的に導入
する。
顕現化すべき遺伝子を含む異なるレプリコンにより担持
されるＤＮＡフラグメントを受容性細胞に連続的に導入
する。
これらのレプリコンは好ましくは相互に適合性である。
発現の定址を可能にするためには、好ましくは複数の遺
伝子に同時に作用する制御を使用する。
伝子に同時に作用する制御を使用する。
例えばλバクテリオファージの感熱性リプレッサーを担
持するプラスミド（ｐＤＩＡ ９２０５）と、このリプ
レッサーにより制御されるプロモータを担持する別の非
適合性の群のプラスミド（ｐＤＩＡ３２３７、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７（
１９８６） １９３−１９７参照）との結合（ｌみ合わ
せ）を使用する。大腸菌で有効なこの型の制御は有利に
はイムノグロブリンのような二重体タンパク質の発現を
可能にする。
持するプラスミド（ｐＤＩＡ ９２０５）と、このリプ
レッサーにより制御されるプロモータを担持する別の非
適合性の群のプラスミド（ｐＤＩＡ３２３７、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７（
１９８６） １９３−１９７参照）との結合（ｌみ合わ
せ）を使用する。大腸菌で有効なこの型の制御は有利に
はイムノグロブリンのような二重体タンパク質の発現を
可能にする。
従って、有利なことに、本発明は細菌中に多重の真核タ
ンパク質を発現することが可能である。
ンパク質を発現することが可能である。
変形例において、受容性細胞の形質転換はただ１種のレ
プリコンを使用することにより実施され、その後のクロ
ーニングは導入された最初の遺伝子のｌｌ！能保存を可
能にするようなレプリコン上の部位で実施される。
プリコンを使用することにより実施され、その後のクロ
ーニングは導入された最初の遺伝子のｌｌ！能保存を可
能にするようなレプリコン上の部位で実施される。
レプリコンは有利にはベクターとして一般に使用可能な
プラスミド、コスミド及びバクテリオファージから選択
される。受容性細胞の染色体も同様に使用できる。
プラスミド、コスミド及びバクテリオファージから選択
される。受容性細胞の染色体も同様に使用できる。
大腸菌におけるクローニングに適当なプラスミドは、レ
プリコンｃｏｌＥ１（Ｉｎｃ、ＱＩｒｆ）、ｐＡｃＹｃ
１８４（Ｉｎｃ。
プリコンｃｏｌＥ１（Ｉｎｃ、ＱＩｒｆ）、ｐＡｃＹｃ
１８４（Ｉｎｃ。
Ｐ１５＾群）又はｐＤＩ＾１３（Ｉｎｃ−群、ＦＥＭＳ
ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ中の上記文
献参照）の誘導体を含む。
ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ中の上記文
献参照）の誘導体を含む。
受容ＩＩＩ胞中に発現されるタンパク質の間の相互作用
によって現れる生物活性の検出は、有利には物理化学的
手段、生化学的（酵素的）手段、微生物学的手段（増殖
試＠）により実施される。更に、分光分析法、適当な培
地上での増殖による生物活性の出現の検討による代謝物
質の産生の定量が挙げられる。
によって現れる生物活性の検出は、有利には物理化学的
手段、生化学的（酵素的）手段、微生物学的手段（増殖
試＠）により実施される。更に、分光分析法、適当な培
地上での増殖による生物活性の出現の検討による代謝物
質の産生の定量が挙げられる。
所望のタンパク質をコードする遺伝子は、抗生物質又は
とルレント微生物に対する耐性、あるいは原株が増殖で
きないような培地での増殖能力、あるいは他のあらゆる
微生物学的徴候のような遺伝子の特徴的性質を使用する
ことにより単離される。
とルレント微生物に対する耐性、あるいは原株が増殖で
きないような培地での増殖能力、あるいは他のあらゆる
微生物学的徴候のような遺伝子の特徴的性質を使用する
ことにより単離される。
本発明の他の主要な適用は、例えば特にワクチン成分と
して使用可能な毒性生成物を例えば他のタンパク質との
相互作用により生成し得るタンパク質をコードする遺伝
子のクローニングである。
して使用可能な毒性生成物を例えば他のタンパク質との
相互作用により生成し得るタンパク質をコードする遺伝
子のクローニングである。
微生物中でこれらのタンパク質が大量に産生されると非
常に有利である。
常に有利である。
本発明のこの態様を、アデニル酸シクラーゼをコードす
る百日咳菌Ｌ」至り」且ｓｉｓ、の遺伝子のクローニン
グ、及び毒性タンパク質の産生により説明する。
る百日咳菌Ｌ」至り」且ｓｉｓ、の遺伝子のクローニン
グ、及び毒性タンパク質の産生により説明する。
百日咳の原因細菌である７エの高い病
原性は公知である。この細菌の病原形質に含まれる要素
のうちで、主要な現象は感染細胞によるサイクリック＾
ＨＰ（即ちｃＡＭＰ）の顕著な産生であると思われる。
のうちで、主要な現象は感染細胞によるサイクリック＾
ＨＰ（即ちｃＡＭＰ）の顕著な産生であると思われる。
この産生はし」二戸、ｕｓｓｉｓ−により産生されるア
デニル酸シクラーゼの活性化メカニズムに宿主のタンパ
ク質であるカルモジュリンを介入させる。
デニル酸シクラーゼの活性化メカニズムに宿主のタンパ
ク質であるカルモジュリンを介入させる。
従ってこの場合、異なる生物の遺伝子により夫々特定さ
れるカルモジュリン及びアデニル酸シクラーゼの２つの
サブユニットがら形成されるタンパク系が問題となる。
れるカルモジュリン及びアデニル酸シクラーゼの２つの
サブユニットがら形成されるタンパク系が問題となる。
本発明に従ってこれらの２つのサブユニットの相互作用
を使用すると、常法によるクローニングの困難性がよく
知られているアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子
を単層することができる。
を使用すると、常法によるクローニングの困難性がよく
知られているアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子
を単層することができる。
本発明のストラテジーによると、カルモジュリンをコー
ドする指示遺伝子を含むレプリコン八を細胞に導入し、
次にレプリコンＢ内の７２の全ＤＮＡのフラグメントを
該細胞に導入する。
ドする指示遺伝子を含むレプリコン八を細胞に導入し、
次にレプリコンＢ内の７２の全ＤＮＡのフラグメントを
該細胞に導入する。
レプリコン＾及びＢは有利には上記のものから選択され
、受容性の細胞はより特定的には大腸菌のような細菌細
胞である。
、受容性の細胞はより特定的には大腸菌のような細菌細
胞である。
もつとも、単一のクローニングベクターを使用してもよ
いことは自明であり、指示遺伝子を担持するレプリコン
八を使用して、顕現化すべき遺伝子をスクリーニングに
よりクローニングしてもよい。
いことは自明であり、指示遺伝子を担持するレプリコン
八を使用して、顕現化すべき遺伝子をスクリーニングに
よりクローニングしてもよい。
Ｂ、ｅｒＬｕＳＳｉＳの全ＤＮへのフラグメントのスク
リーニングによると、例えばマルトース培地上の呈色ｔ
７Ｃ＠を用いてアデニル酸シクラーゼを欠失する受容性
株におＣフるカルモジュリンによるアデニル酸シクラー
ゼの活性化によるｃＡＭＰの産生を顕現化することによ
り、アデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を単離す
ることが可能である。
リーニングによると、例えばマルトース培地上の呈色ｔ
７Ｃ＠を用いてアデニル酸シクラーゼを欠失する受容性
株におＣフるカルモジュリンによるアデニル酸シクラー
ゼの活性化によるｃＡＭＰの産生を顕現化することによ
り、アデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を単離す
ることが可能である。
本発明は更に、第２ａ図〜第２ｆ図に示す配列を有する
アデニル酸シクラーゼの遺伝子の溶血活性に関連するク
ローン化ＤＮＡフラグメントにも係る。
アデニル酸シクラーゼの遺伝子の溶血活性に関連するク
ローン化ＤＮＡフラグメントにも係る。
ＤＮＡフラグメントの触媒部分は、ＢａｍＨＩ制限部位
に対応するＯ位置と２０５０位置との間に配置されたヌ
クレオチド配列からなる。
に対応するＯ位置と２０５０位置との間に配置されたヌ
クレオチド配列からなる。
第２図中、まずカルモジュリン結合部位である触媒部位
があり、その後にこのタンパク質の溶血活性に相当する
部分がある。
があり、その後にこのタンパク質の溶血活性に相当する
部分がある。
自明のことであるが、このような配列から生成されるプ
ローブがアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子の存在を認識する能力に関して特徴
的且つ明確な応答を与えるのであるなら、当該ヌクレオ
チド配列の塩基は遺伝子における順序と異なる順序でも
よく、及び／又は場合によってこれらの塩基を別の塩基
に代えてもよい。
ローブがアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子の存在を認識する能力に関して特徴
的且つ明確な応答を与えるのであるなら、当該ヌクレオ
チド配列の塩基は遺伝子における順序と異なる順序でも
よく、及び／又は場合によってこれらの塩基を別の塩基
に代えてもよい。
対応するＲＮＡの酵素的逆転写又は化学的合成によって
得られるような第２ａ〜第２ｆ図の配列の運頷のヌクレ
オチド配列とハイブリダイズ可能な全ヌクレオチド配列
も本発明の範囲に含まれる。
得られるような第２ａ〜第２ｆ図の配列の運頷のヌクレ
オチド配列とハイブリダイズ可能な全ヌクレオチド配列
も本発明の範囲に含まれる。
本発明は更に、第２ａ図〜第２ｆ図に示すアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列にも係る。
をコードするヌクレオチド配列にも係る。
本発明は更に、このアミノ酸配列の全部又は−部、一般
にアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質に対し
て誘導された抗体との間に免疫複合体を形成することが
可能なアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質に
も係る。
にアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質に対し
て誘導された抗体との間に免疫複合体を形成することが
可能なアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質に
も係る。
また、本発明のタンパク質に対して形成されたポリクロ
ーナル抗体、及びこのタンパク質を特異的に認識するこ
とが可能なモノクローナル抗体も本発明の範囲に含まれ
る。
ーナル抗体、及びこのタンパク質を特異的に認識するこ
とが可能なモノクローナル抗体も本発明の範囲に含まれ
る。
異なる起源の遺伝子によりコードされるタンパク質の協
同性に基づく本発明のクローニング及び発現方法によっ
て、種々の生物のカルモジュリンの遺伝子をｒｉｌ、！
することも可能になり、さらに、宿主＃Ｉ胞、特に細菌
細胞内で産生されたし」旦１］−３ＳＩＳのアデニル酸
シクラーゼのｉｎ ｖｉｖｏ活性化を達成することも可
能になる。
同性に基づく本発明のクローニング及び発現方法によっ
て、種々の生物のカルモジュリンの遺伝子をｒｉｌ、！
することも可能になり、さらに、宿主＃Ｉ胞、特に細菌
細胞内で産生されたし」旦１］−３ＳＩＳのアデニル酸
シクラーゼのｉｎ ｖｉｖｏ活性化を達成することも可
能になる。
本発明のこの態様は、マウスの脳カルモジュリンの遺伝
子のクローニングによって例示される。
子のクローニングによって例示される。
まず、アデニル酸シクラーゼを発現しない受容性細胞に
、脳のｃＤＮＡフラグメントを含有するレブリコン＾１
を導入し、ついで、レプリコン旧にＢ、ｅｒＬｕｓｓｉ
ｓのアデニル酸シクラーゼの遺伝子を導入する。スクリ
ーニングにより、７ユによって産生されたアデニル酸シ
クラーゼを活性化することができるタンパク質をコード
する遺伝子を単離する。
、脳のｃＤＮＡフラグメントを含有するレブリコン＾１
を導入し、ついで、レプリコン旧にＢ、ｅｒＬｕｓｓｉ
ｓのアデニル酸シクラーゼの遺伝子を導入する。スクリ
ーニングにより、７ユによって産生されたアデニル酸シ
クラーゼを活性化することができるタンパク質をコード
する遺伝子を単離する。
本発明の他の特徴及び利点は、第１図及び第２ａ〜２ｆ
図を参考にＢＪｅ ｒ ｔ ｕ ｓ ｓ ｉ ｓのアデ
ニル酸シクラーゼをコードする遺伝子のクローニングに
関する以下の実施例から明らかになろう。
図を参考にＢＪｅ ｒ ｔ ｕ ｓ ｓ ｉ ｓのアデ
ニル酸シクラーゼをコードする遺伝子のクローニングに
関する以下の実施例から明らかになろう。
丸１匝
１７大腸菌の３Ｎのｑ見＼＃Ｉ限−株、即ち、５ａ＋Ｎ
までの外因性サイクリックＡＭＰ（即ちｃＡＭｒ’）に
耐性であり且つ０．５ｎ＋Ｈの外因性ｃＡＭｒ’を容易
に検出することが可能なコントロールの制限マイナス株
、５０、Ｈの外因性ｃＡＭＰを検出することができ且つ
ｃＡＭＰに対する感度が１ｍＭを越える所謂低レベルの
制限マイナス株、 ３ｍＭのｃＡＭＰを検出することができ且つ少なくと＼ も３０ｍＭのこのヌクレオチドに耐性である所謂耐性株 の構築。
までの外因性サイクリックＡＭＰ（即ちｃＡＭｒ’）に
耐性であり且つ０．５ｎ＋Ｈの外因性ｃＡＭｒ’を容易
に検出することが可能なコントロールの制限マイナス株
、５０、Ｈの外因性ｃＡＭＰを検出することができ且つ
ｃＡＭＰに対する感度が１ｍＭを越える所謂低レベルの
制限マイナス株、 ３ｍＭのｃＡＭＰを検出することができ且つ少なくと＼ も３０ｍＭのこのヌクレオチドに耐性である所謂耐性株 の構築。
これらの株は、ＭａｎｉａｔｉｓによりＣｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇｌｌｎｒｂｏｒ Ｎ、Ｙ、、 ｐ、３５２−３
５５中に記載されている従来方法により容易に形質転換
可能である（１１ＩｇのｐＨ８３２２に対して少なくと
も１０６の形質転換ｍ胞）。
ｒｉｎｇｌｌｎｒｂｏｒ Ｎ、Ｙ、、 ｐ、３５２−３
５５中に記載されている従来方法により容易に形質転換
可能である（１１ＩｇのｐＨ８３２２に対して少なくと
も１０６の形質転換ｍ胞）。
これらの株は有利には数世代にわたって培養できるよう
に安定化される。
に安定化される。
「サイクリックＡＭＰの産生Ｊの形質の検出は、フル１
−−スのような所定の炭素源の発酵を示す呈色試験によ
り実施される。す」−の形質は、Ｍｅｃｉｌｌｉｎａｍ
、又はホスホマイシン（ｐｈｏｓｐｈｏｍｙｃｉｎｅ）
のような抗生物質、あるいはビルレントなλバクテリオ
ファージに対する以下のような突然変位様の公知、の耐
性を利用することにより、容易に選択できる。
−−スのような所定の炭素源の発酵を示す呈色試験によ
り実施される。す」−の形質は、Ｍｅｃｉｌｌｉｎａｍ
、又はホスホマイシン（ｐｈｏｓｐｈｏｍｙｃｉｎｅ）
のような抗生物質、あるいはビルレントなλバクテリオ
ファージに対する以下のような突然変位様の公知、の耐
性を利用することにより、容易に選択できる。
最初の株で飽和した培養物１００−を、１０倍の数のビ
ルレントなλバクテリオファージの存在下で、大腸菌に
対する最小致死濃度の抗生物質を加えたＭａｃ Ｃｏｎ
ｋｅｙ Ｍａｌｔａｓｅ （Ｍｉｌｌｅｒ １９７２）
培地を収容するペトリ皿に接種した。この抗生物質は、
実際にアデニル酸シクラーゼ（ｅｌｍ）又はサイクリッ
クＡＭＰのレセプター（虹且）を欠失する突然変異株（
即ち、それぞれ、ｃｙａ−又はｃｒｐ−）を有効に選択
することが可能であり、ｑ工又はυ１株はピルレントな
λファージに耐性であり、マルトースを発酵しないので
、Ｍａｃ Ｃｏｎｋｅｙ培地で白色のコロニーの形態
で現れる。
ルレントなλバクテリオファージの存在下で、大腸菌に
対する最小致死濃度の抗生物質を加えたＭａｃ Ｃｏｎ
ｋｅｙ Ｍａｌｔａｓｅ （Ｍｉｌｌｅｒ １９７２）
培地を収容するペトリ皿に接種した。この抗生物質は、
実際にアデニル酸シクラーゼ（ｅｌｍ）又はサイクリッ
クＡＭＰのレセプター（虹且）を欠失する突然変異株（
即ち、それぞれ、ｃｙａ−又はｃｒｐ−）を有効に選択
することが可能であり、ｑ工又はυ１株はピルレントな
λファージに耐性であり、マルトースを発酵しないので
、Ｍａｃ Ｃｏｎｋｅｙ培地で白色のコロニーの形態
で現れる。
これらの突然変異株はｃＡＭＰの存在下でマルｌ−−ス
上での増殖能力を回復すること及びグルコースで 上４増殖できること（これによってホスホトランスフェ
ラーゼの系（ホスホエノールビルベ−１・に依存する系
：ｐｔｓ）のいくつかの突然変異株が除かれる）を確認
することにより、前記の突然変異株が実際にｇａ型であ
ることを確かめると好適である。
上での増殖能力を回復すること及びグルコースで 上４増殖できること（これによってホスホトランスフェ
ラーゼの系（ホスホエノールビルベ−１・に依存する系
：ｐｔｓ）のいくつかの突然変異株が除かれる）を確認
することにより、前記の突然変異株が実際にｇａ型であ
ることを確かめると好適である。
所謂低レベルの突然変異株を得るためには、予め単離し
た五突然変異株の培養物１００ ｕ １を使用し、０．
４％のマルト−ス及び５０１ＩＭのｃ Ａ Ｍ Ｐの存
在下で合成培地Ｍ６３（Ｍｉｌｌｅｒ、 １９７２ Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ ＮＹ、、 ｐ
、３５２−３５５）上で増殖させる。次に出現したコロ
ニーを同−培地上で３回繰り返して単離した後、ｃＡＮ
Ｐを欠いた同−培地上における増殖不能性を試験する。
た五突然変異株の培養物１００ ｕ １を使用し、０．
４％のマルト−ス及び５０１ＩＭのｃ Ａ Ｍ Ｐの存
在下で合成培地Ｍ６３（Ｍｉｌｌｅｒ、 １９７２ Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ ＮＹ、、 ｐ
、３５２−３５５）上で増殖させる。次に出現したコロ
ニーを同−培地上で３回繰り返して単離した後、ｃＡＮ
Ｐを欠いた同−培地上における増殖不能性を試験する。
更に、一般に原株よりも高いｃＡＭＰ感受性を確認する
。
。
所謂高レベルの当然変異株を得るためには、ＬＢ培地（
旧ｌ １ｅｒの上記文献参照）上でｃＡＭＰ濃度を増加
することにより連続段階を進める。得られた突然変異株
のうち、多数のものはｃＡＭＰに非感受性になってもは
やその存在を検出することができない突然変異株証且で
ある。従って、各段階（一般に１２ｍＭ及び３０ｍＭの
２段階で十分である）で細菌がＭｃ Ｃｏｎｋｅｙマル
トース培地」二にｃＡＭＰの不在下では白色、３ｍＭの
ｃＡＨＰの存在下では赤色のコロニーを形成することを
確めるのがよい。得られる細菌は一般にｃＡＭＰの存在
にやや依存し、耐性形質を安定的に維持するためには少
なくとも３ｍＨに等しい濃度のｃＡＭＰの存在下で予備
培養物中で増殖させると好適である。
旧ｌ １ｅｒの上記文献参照）上でｃＡＭＰ濃度を増加
することにより連続段階を進める。得られた突然変異株
のうち、多数のものはｃＡＭＰに非感受性になってもは
やその存在を検出することができない突然変異株証且で
ある。従って、各段階（一般に１２ｍＭ及び３０ｍＭの
２段階で十分である）で細菌がＭｃ Ｃｏｎｋｅｙマル
トース培地」二にｃＡＭＰの不在下では白色、３ｍＭの
ｃＡＨＰの存在下では赤色のコロニーを形成することを
確めるのがよい。得られる細菌は一般にｃＡＭＰの存在
にやや依存し、耐性形質を安定的に維持するためには少
なくとも３ｍＨに等しい濃度のｃＡＭＰの存在下で予備
培養物中で増殖させると好適である。
２７株の形質転換
次に、非適合性Ｃｏ１Ｅ１群のプラスミドρＶＵＣ−１
のようにカルモジュリンの合成を規定する遺伝子を担持
しており、且つアンピシリン耐性遺伝子を担持するプラ
スミドにより、これらの株を形質転換する６ 次に、各種の方法（例えば制限酵素ＥｃｏＲｌ及びＳａ
ｕ［ｌａによる部分的消化、音波処理とそれに続くＥｃ
ｏＲｌ ｒリンカ−」の添加）で断片化したし」ヱｒｔ
ｕｓ−伽の全ＤＮＡを含むベクターを３種の株に導入す
る。
のようにカルモジュリンの合成を規定する遺伝子を担持
しており、且つアンピシリン耐性遺伝子を担持するプラ
スミドにより、これらの株を形質転換する６ 次に、各種の方法（例えば制限酵素ＥｃｏＲｌ及びＳａ
ｕ［ｌａによる部分的消化、音波処理とそれに続くＥｃ
ｏＲｌ ｒリンカ−」の添加）で断片化したし」ヱｒｔ
ｕｓ−伽の全ＤＮＡを含むベクターを３種の株に導入す
る。
し１リコンＣｏ１Ｅｒを有する他の１ラスミドの非適合
性により生じる問題（上記記載参照）により、酵素５ａ
ｕＩｌｌａにより部分的に切断されたし１μ」且すユー
ｉｓの全ＤＮＡフラグメントのクローニングを、適合性
ベクターｐＡｃＹｃ１８４の単一のＢａｍ！１１部位で
実施した。受容性株を形質転換し、Ｍｅ Ｃｏｎｋｅｙ
ＭａｌＬｏｓｅ培地に接種した。マルトースを発酵す
る数個のクローンを単離した。その後、これらのクロー
ンはサイクリックＡＭＰを産生ずることが判明した。更
に、産生株から抽出したプラスミドを、プラスミドｐｖ
ｌＪｃ−１を含まないか又は含む株中に形質転換により
取り込んだ。前者の場合、クローンはＭｃＣｏｎｋｅｙ
マルト−ス培地上で白色であり、後者の場合は赤色であ
る。このことから、クローニングを可能にしたのはカル
モジュリンの合成を可能にするプラスミドの存在である
ことが確認される。
性により生じる問題（上記記載参照）により、酵素５ａ
ｕＩｌｌａにより部分的に切断されたし１μ」且すユー
ｉｓの全ＤＮＡフラグメントのクローニングを、適合性
ベクターｐＡｃＹｃ１８４の単一のＢａｍ！１１部位で
実施した。受容性株を形質転換し、Ｍｅ Ｃｏｎｋｅｙ
ＭａｌＬｏｓｅ培地に接種した。マルトースを発酵す
る数個のクローンを単離した。その後、これらのクロー
ンはサイクリックＡＭＰを産生ずることが判明した。更
に、産生株から抽出したプラスミドを、プラスミドｐｖ
ｌＪｃ−１を含まないか又は含む株中に形質転換により
取り込んだ。前者の場合、クローンはＭｃＣｏｎｋｅｙ
マルト−ス培地上で白色であり、後者の場合は赤色であ
る。このことから、クローニングを可能にしたのはカル
モジュリンの合成を可能にするプラスミドの存在である
ことが確認される。
３／ ｃＡＭＰの検出
低レベル株を使用してｃＡＭＰの存在を次のように検ｌ
Ｂシた。１０″藺の低レベル、ｌｌｌ５をＨｃ Ｃｏｎ
ｋｅｙＭａｌｔｏｓｅ培地に接種し、特にサイクリック
ＡＭＰのレセプターをコードする遺伝子を欠失する大腸
菌虹ニー株、及びプラスミドｐＶＵｃ−１（Ｃｒａｉｇ
他、１９８７ 。
Ｂシた。１０″藺の低レベル、ｌｌｌ５をＨｃ Ｃｏｎ
ｋｅｙＭａｌｔｏｓｅ培地に接種し、特にサイクリック
ＡＭＰのレセプターをコードする遺伝子を欠失する大腸
菌虹ニー株、及びプラスミドｐＶＵｃ−１（Ｃｒａｉｇ
他、１９８７ 。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅＩｌｌ、 ２６２．３２７８−
８４）を含有する株、及びし」旦υ、ｕｓｓｉｓ工のア
デニル酸シクラーゼの遺伝子を含むと推定されるプラス
ミドを含有する株を含む各種のクローンを複製した。株
は３７℃で２０時間インキュベーＩ〜した。次に、呈色
を観察した処、株す」−は白色であり、採りｌ゛は赤色
であり、株ニー（（Ｊ！’）は少なくとも直径１０ｍｍ
の赤い量（ハロー）状であり、この場合、合成されたｃ
ＡＭＩ’が拡散し、低レベル指示様によるマルトースの
発酵を可能にしたことがわかる。プラスミドｐＶｔｌｃ
−１の存在下でＦＬｗα」且［」−のアデニル酸シクラ
ーゼの推定遺伝子を含む各種の株で同一の結果が得られ
た。
８４）を含有する株、及びし」旦υ、ｕｓｓｉｓ工のア
デニル酸シクラーゼの遺伝子を含むと推定されるプラス
ミドを含有する株を含む各種のクローンを複製した。株
は３７℃で２０時間インキュベーＩ〜した。次に、呈色
を観察した処、株す」−は白色であり、採りｌ゛は赤色
であり、株ニー（（Ｊ！’）は少なくとも直径１０ｍｍ
の赤い量（ハロー）状であり、この場合、合成されたｃ
ＡＭＩ’が拡散し、低レベル指示様によるマルトースの
発酵を可能にしたことがわかる。プラスミドｐＶｔｌｃ
−１の存在下でＦＬｗα」且［」−のアデニル酸シクラ
ーゼの推定遺伝子を含む各種の株で同一の結果が得られ
た。
この結果から明らかなように、これらの細菌はｃＡＭＰ
を大量に産生ずる。更に、ｐＶＵｃ〜１及びｎ−ｔｕｓ
ｓｉｓのシクラーゼ遺伝子を有するプラスミドを含むサ
イクリックＡＭＰのレセプターを欠失する株ｅｌ−では
マルＩ・−スの異化の結果がマイナスであったことから
、最終的な確認が得られた。
を大量に産生ずる。更に、ｐＶＵｃ〜１及びｎ−ｔｕｓ
ｓｉｓのシクラーゼ遺伝子を有するプラスミドを含むサ
イクリックＡＭＰのレセプターを欠失する株ｅｌ−では
マルＩ・−スの異化の結果がマイナスであったことから
、最終的な確認が得られた。
１９８７年７月２１日イ寸け゛でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｃｓ）に第ドロ
ア８号で寄託された大腸菌株ＴＰ６１０ ｐＤＩ＾７が
ら単離したＬｅｒ［１１ｓｓｉｓのアデニル酸シクラー
ゼの遺伝子の活性部分を含むＤＮＡフラグメントの特徴
を第１図及び第２ａ〜２ｆ図に示す。
ｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｃｓ）に第ドロ
ア８号で寄託された大腸菌株ＴＰ６１０ ｐＤＩ＾７が
ら単離したＬｅｒ［１１ｓｓｉｓのアデニル酸シクラー
ゼの遺伝子の活性部分を含むＤＮＡフラグメントの特徴
を第１図及び第２ａ〜２ｆ図に示す。
（以を一余白）
＝２７−
【ｌ■１ マウス脳カルモジコリンを］−ドＪる遺伝子
のクローニング 胞Ｊ３よび増殖培地 大腸菌Ｃ６００Ｓ［８，ＴＰ６１０．制限 株（６）の
ｃｙａ溝１体を使用づる。細菌をＬＢ富化培地又はＭ’
６３１ｉ１小培地■上で培養刃る。マルトースを１％含
′＠ツるＨａＣＣｏｎｋｅｙ寒天プレートを利用するこ
とにより砂糖の醗酵を誘発することができる能力、おＪ
：びβガラク］・シダーゼの発現を考慮してスクリーニ
ングを実施する。抗生物質の濃度は、クロラムフェニコ
ールが３０ｓ ／ ｍＲ、アンピシリンが１００ｐ９／
ｄである。プラスミドｐＤＩへ５ （Ｇｌａｓｃｒら
、Ｎｏ ｌ ＱＣＵａｒ Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｏｙ
（１９８８）、 ２（１）、 ｐ、１９−３０＞を用い
、ＭａｎｉａｔｉＳら■に従ってＴＰ６１０株を形質転
換する。その結果、この株はｃＡＨＰを合成することが
できなくなる。この形質転換株を宿主として用いて、マ
ウス脳のＣＤＮＡフラグメントをクローニングする。
のクローニング 胞Ｊ３よび増殖培地 大腸菌Ｃ６００Ｓ［８，ＴＰ６１０．制限 株（６）の
ｃｙａ溝１体を使用づる。細菌をＬＢ富化培地又はＭ’
６３１ｉ１小培地■上で培養刃る。マルトースを１％含
′＠ツるＨａＣＣｏｎｋｅｙ寒天プレートを利用するこ
とにより砂糖の醗酵を誘発することができる能力、おＪ
：びβガラク］・シダーゼの発現を考慮してスクリーニ
ングを実施する。抗生物質の濃度は、クロラムフェニコ
ールが３０ｓ ／ ｍＲ、アンピシリンが１００ｐ９／
ｄである。プラスミドｐＤＩへ５ （Ｇｌａｓｃｒら
、Ｎｏ ｌ ＱＣＵａｒ Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｏｙ
（１９８８）、 ２（１）、 ｐ、１９−３０＞を用い
、ＭａｎｉａｔｉＳら■に従ってＴＰ６１０株を形質転
換する。その結果、この株はｃＡＨＰを合成することが
できなくなる。この形質転換株を宿主として用いて、マ
ウス脳のＣＤＮＡフラグメントをクローニングする。
ｃＤＮ八パへ の −〇Ｎ八 のＯＮ八へ
列を解析づるためにＨ１３ｔｇ１３１１３℃ジ（７）中
のサブクローンを使用する。ザイクロンシステム（ＩＢ
Ｉ）を用いて一方向性の欠失を生じさせる。
列を解析づるためにＨ１３ｔｇ１３１１３℃ジ（７）中
のサブクローンを使用する。ザイクロンシステム（ＩＢ
Ｉ）を用いて一方向性の欠失を生じさせる。
ＩＮＮ＾配列は、アルファ Ｓ ３５ｄＡＴＰ （八ｍ
ｅｒｓｈａｍ ）およびｄＧＴＰ（７）代わりに７−ジ
アザ−ｄＧＴＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、ジ
デオキシヌクレオチド法（０によって決定づ−る。この
方法によるとポリアクリルアミド中でのＧＣに富む領域
の分解能が向−［する。
ｅｒｓｈａｍ ）およびｄＧＴＰ（７）代わりに７−ジ
アザ−ｄＧＴＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、ジ
デオキシヌクレオチド法（０によって決定づ−る。この
方法によるとポリアクリルアミド中でのＧＣに富む領域
の分解能が向−［する。
ｃａｐｕｔらの一次一アダブター過程Ｑ０を利用して、
マウス脳ポリ（△）”ＲＮ八からオリゴ（ｄＴ）もった
ｃＤＮＡバンクを調製する。
マウス脳ポリ（△）”ＲＮ八からオリゴ（ｄＴ）もった
ｃＤＮＡバンクを調製する。
Ｐｓｔｌを使用し、かつターミナルトランスフェラーゼ
を用いてｄＧ末端を固定することによってプラスミド９
１１ Ｃ−９を直線化づる。
を用いてｄＧ末端を固定することによってプラスミド９
１１ Ｃ−９を直線化づる。
１Ｆ４られた分子をＢａｍＨＩで消化づる。ポリサッカ
ライド、特に５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂという商標
で市販されているアガロースを通して濾過することによ
り、ＢａｍＨｒによる切断で生じた小さいフラグメント
を除去する。
ライド、特に５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂという商標
で市販されているアガロースを通して濾過することによ
り、ＢａｍＨｒによる切断で生じた小さいフラグメント
を除去する。
特異的なオリゴヌクレオヂドプローブ（ａｍｏｒｃ（３
）と共に逆転写酵素を使用して、ｍＲＮＡマ］・リック
スからｃＤＮＡを生成する。
）と共に逆転写酵素を使用して、ｍＲＮＡマ］・リック
スからｃＤＮＡを生成する。
残ったｍＲＮＡをアルカリ加水分解によって除去し、タ
ーミナルトランスフエラ〜ゼを用いてｃＤＮＡにｄＣを
付ける。ｃＤＮへの５゛末端をアダプターすなわち一次
生成物と相補的な別の合成オリゴヌクレオヂドとのハイ
ブリダイゼーションにＪ：ってＢａｍ１ｌｌ接着末端に
変換する。次に、短鎖ｃＤＮＡをベクターに再連結して
環状分子を生成する。プローブとしてベクターの末端（
ｄＧ）を用い、またＴＩ ＯＮ静ｊＣリメラーゼを使用
して短鎖領域を修復する。
ーミナルトランスフエラ〜ゼを用いてｃＤＮＡにｄＣを
付ける。ｃＤＮへの５゛末端をアダプターすなわち一次
生成物と相補的な別の合成オリゴヌクレオヂドとのハイ
ブリダイゼーションにＪ：ってＢａｍ１ｌｌ接着末端に
変換する。次に、短鎖ｃＤＮＡをベクターに再連結して
環状分子を生成する。プローブとしてベクターの末端（
ｄＧ）を用い、またＴＩ ＯＮ静ｊＣリメラーゼを使用
して短鎖領域を修復する。
この組換えＤＮＡプラスミドを用いて、受容能力の高い
細菌（ＨＣ１０６１，プラスミドＤＮＡ １ ｇ当たす
１０ ＣＦ Ｕ 陸形質転換する。７″′″：’ｚｌ
Ｊ）（７）存在下での増殖能によって形質転換体を選択
する。
細菌（ＨＣ１０６１，プラスミドＤＮＡ １ ｇ当たす
１０ ＣＦ Ｕ 陸形質転換する。７″′″：’ｚｌ
Ｊ）（７）存在下での増殖能によって形質転換体を選択
する。
単離［Ｌ／ ／こクローンのひとつｐＯＩ八７へを精製
し、そのＤＮＡ配列を分析する。確認のために、ｐＤｒ
Ａ５またはｐＤＴ八７へを生成する細菌がマルトースの
醗酵を誘発する能力またはβ−ガラクトシダーゼ活性を
発現でる能）ｊを失うことを確かめる。これらの細菌は
、同一の細菌中にｐＤＩ八５へｐＤＩＡ７０が一緒に存
在すると上記の性質を回復する。
し、そのＤＮＡ配列を分析する。確認のために、ｐＤｒ
Ａ５またはｐＤＴ八７へを生成する細菌がマルトースの
醗酵を誘発する能力またはβ−ガラクトシダーゼ活性を
発現でる能）ｊを失うことを確かめる。これらの細菌は
、同一の細菌中にｐＤＩ八５へｐＤＩＡ７０が一緒に存
在すると上記の性質を回復する。
ラットのカルモジュリンの遺伝子による場合と比較する
と、これらふたつの遺伝子間には高い相同性がひ存する
。このことは、プラスミドＤＤＩＡ７０中でり［１−ン
化されたｃＤＮＡがマウスのカルモジュリンを］−ドし
ていることを示唆している。
と、これらふたつの遺伝子間には高い相同性がひ存する
。このことは、プラスミドＤＤＩＡ７０中でり［１−ン
化されたｃＤＮＡがマウスのカルモジュリンを］−ドし
ていることを示唆している。
このマウス脳カルモジコリンのｃＤＮＡのクローニング
方法は、多数の成分を有する別の遺伝子系をスクリーニ
ングまたは選択１−るのにも使用可能である。したがっ
て、特に、本発明は、顕現化できる酵素活性のカルモジ
ュリンによる活性化に干渉し得るファクターを検出覆る
手段を提供づる。
方法は、多数の成分を有する別の遺伝子系をスクリーニ
ングまたは選択１−るのにも使用可能である。したがっ
て、特に、本発明は、顕現化できる酵素活性のカルモジ
ュリンによる活性化に干渉し得るファクターを検出覆る
手段を提供づる。
（以下余白）
以」二の実施例により、遺伝子のクローニング、及び受
容細胞中におけるそれらの発現生成物及び発現されたタ
ンパク質の相互作用によって形成される生成物の産生の
一般方法を説明した。
容細胞中におけるそれらの発現生成物及び発現されたタ
ンパク質の相互作用によって形成される生成物の産生の
一般方法を説明した。
従って、この方法は特に次の用途に適用される。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎＬｈｒａｃｉｓのアデニル酸シ
クラーゼ毒素の遺伝子のクローニング及びこの毒素の産
生。
クラーゼ毒素の遺伝子のクローニング及びこの毒素の産
生。
−カルモジュリンの遺伝子、又はアデニル酸シクラーゼ
の活性サブユニツ１〜Ｇの遺伝子、又はＲａｓ型の腫瘍
遺伝子を含むクローンを使用することにより、真核性ア
デニル酸シクラーゼ遺伝子のクローニング、及びこれら
のシクラーゼの産生。
の活性サブユニツ１〜Ｇの遺伝子、又はＲａｓ型の腫瘍
遺伝子を含むクローンを使用することにより、真核性ア
デニル酸シクラーゼ遺伝子のクローニング、及びこれら
のシクラーゼの産生。
生成物がカルモジュリンにより変調される遺伝子のクロ
ーニング。
ーニング。
ベクタ一対によるオリゴマー性タンパク質、例えばイム
ノグロブリン又はホルモンの産生。
ノグロブリン又はホルモンの産生。
レセプター、標識可能な酵素のアクチベータ、又はその
逆をコードする遺伝子のクローニング、及びこれらのタ
ンパク質の産生。
逆をコードする遺伝子のクローニング、及びこれらのタ
ンパク質の産生。
毒性酵素（例えばプロテアーゼ／アンチプロテアーゼ）
をコードする遺伝子のクローニング、及びこれらの酵素
の産生。この場合、クローニングはインヒビターの産生
条件下（例えば従来システム中）で実施され、毒性の出
現によりインヒビターの合成の抑制後に該当するクロー
ンが顕現化される。
をコードする遺伝子のクローニング、及びこれらの酵素
の産生。この場合、クローニングはインヒビターの産生
条件下（例えば従来システム中）で実施され、毒性の出
現によりインヒビターの合成の抑制後に該当するクロー
ンが顕現化される。
遺伝子が既に公知である標識可能な活性インヒビターを
コードする遺伝子のクローニング、及びこれらのインヒ
ビターの産生。
コードする遺伝子のクローニング、及びこれらのインヒ
ビターの産生。
分泌に補助的なタンパク質の存在を必要とする分泌型タ
ンパク質の産生。
ンパク質の産生。
１１え１
（１） Ｄｅ Ｒｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ、 ＦＥＮＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７（２
） Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ、Ｙ、、 ｐ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７（２
） Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ、Ｙ、、 ｐ。
（３） Ｍｉｌｌｅｒ、 １９７２． Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｙ、Ｙ。
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｙ、Ｙ。
（４）Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｔ ａｌ、１９８７．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８５．２４：（５） ５ｔ
ｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ、 １９７６、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１３： １４
７１−１４７５ （６） Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ、 １９８３． Ｇ
ｅｎｅ ２６：９ｌ−９９（７） Ｓａｎｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、 １９７７、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７４： ５４６３−５４６７ （８） Ｃａｐｕｔ ｅｔ ａｌ、 １９８６． ＰＮ
ＡＳ、 ｖｏｌ、 ８３． ｐ、１６７０−７４
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８５．２４：（５） ５ｔ
ｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ、 １９７６、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１３： １４
７１−１４７５ （６） Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ、 １９８３． Ｇ
ｅｎｅ ２６：９ｌ−９９（７） Ｓａｎｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、 １９７７、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７４： ５４６３−５４６７ （８） Ｃａｐｕｔ ｅｔ ａｌ、 １９８６． ＰＮ
ＡＳ、 ｖｏｌ、 ８３． ｐ、１６７０−７４
第１図は大腸菌でクローニングしたＬ」二戸」互５ｉｓ
−のアデニル酸シクラーゼの遺伝子の活性部分の制限地
図を示し、第２ａ図〜第２ｆ図は触媒領域に対応する遺
伝子部分のＤＮＡフラグメントの配列を示す。 ３５２−３５５． １９８２
−のアデニル酸シクラーゼの遺伝子の活性部分の制限地
図を示し、第２ａ図〜第２ｆ図は触媒領域に対応する遺
伝子部分のＤＮＡフラグメントの配列を示す。 ３５２−３５５． １９８２
Claims (16)
- （１）機能的関連性を有するタンパク質をコードする遺
伝子のクローニング及び発現方法であって、少なくとも
１個の指示遺伝子と少なくとも１個の顕現させるべき遺
伝子との２個以上の外来遺伝子から構成されるか又はそ
れらを含むＤＮＡフラグメントを導入することにより、
外来ＤＮＡを取り込み、且つこれを発現することが可能
な受容性微生物株の細胞を形質転換させ（該遺伝子は、
場合によって指示遺伝子及び顕現させるべき遺伝子とし
て相互交換可能であり、且つ有機的に組織された機能体
系を構成するタンパク質を受容細胞中で発現することが
可能であり、該指示遺伝子は、顕現させるべき遺伝子に
より発現されるタンパク質の生物活性の検出を可能にす
るタンパク質を発現することが可能であり、該生物活性
は前記タンパク質問の相互作用に起因する）、 例えば物理化学的、生化学的、微生物学的又は放射免疫
的手段を使用することにより所望のタンパク質の生物活
性を検出し、 場合によっては、遺伝子の特徴的性質を利用することに
より該タンパク質をコードする遺伝子を単離する ことを特徴とする方法。 - （２）受容性の株が細菌株、酵母又は真核細胞であるこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。 - （３）受容性の細菌細胞が制限マイナスの形質を有する
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - （４）導入される外来遺伝子が相同系に含まれることを
特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - （５）導入される外来遺伝子が非相同系に含まれること
を特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - （６）多タンパク体系の種々の単位をコードする遺伝子
の連続的クローニングを、好ましくはこれらの異なる遺
伝子を有する異なるレプリコンを使用することにより実
施することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記
載の方法。 - （７）ただ１種のレプリコンを使用することを特徴とす
る請求項１から５のいずれかに記載の方法。 - （８）百日咳菌（￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥）のアデ
ニル酸シクラーゼをコードする遺伝子のクローニング方
法であって、 相互に異なる２つのレプリコンＡ及びＢ、即ちカルモジ
ュリンをコードする遺伝子を有するレプリコンＡ、及び
￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥の全ＤＮＡのフラグメント
のレプリコンＢにより、微生物細胞、特に細菌細胞を形
質転換させ、 ＤＮＡフラグメントの１つによりコードされ、カルモジ
ュリンの存在下で活性化されたアデニル酸シクラーゼに
より生成されるサイクリックＡＭＰの生物活性を呈色試
験により検出することにより、ＤＮＡフラグメントをス
クリーニングし、 アデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を単離する ことを特徴とする方法。 - （９）請求項８に記載の方法のアデニル酸シクラーゼの
産生への適用。 - （１０）アデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質
を発現することが可能な遺伝子とハイブリダイズする能
力を有することを特徴とするアデニル酸シクラーゼの少
なくとも一部をコードするヌクレオチド配列。 - （１１）第２ａ図から第２ｆ図の配列から形成されるプ
ローブとハイブリダイズすることが可能であることを特
徴とするヌクレオチド配列。 - （１２）第２ａ図から第２ｆ図に示すアミノ酸配列をコ
ードすることを特徴とするヌクレオチド配列。 - （１３）アデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質
に対する抗体との間に免疫複合体を形成することが可能
であることを特徴とするアデニル酸シクラーゼ活性を有
するタンパク質。 - （１４）第２ａ図から第２ｆ図に示すアミノ酸配列を含
むことを特徴とする請求項１３に記載のタンパク質。 - （１５）カルモジュリンをコードする遺伝子のクローニ
ング方法であって、 相互に異なる２つのレプリコンＡ及びＢ、即ち脳のｃＤ
ＮＡバンクのｃＤＮＡフラグメントを有するレプリコン
Ａ１、及び百日咳菌（￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥）の
アデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を有するレプ
リコンＢ１により、微生物細胞、特に細菌細胞を形質転
換させ、 ＤＮＡフラグメントの１つによりコードされたカルモジ
ュリンの存在下で活性化されたアデニル酸シクラーゼに
より生成されるサイクリックＡＭＰの生物活性を呈色試
験により検出することにより、ＤＮＡフラグメントをス
クリーニングし、 カルモジュリンをコードする遺伝子を単離することを特
徴とする方法。 - （１６）請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施
することによって得られる産物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8710614A FR2621597B1 (fr) | 1987-07-24 | 1987-07-24 | Procede de clonage et d'expression de genes codant pour des proteines constituant des edifices fonctionnels organises |
| FR8710614 | 1987-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0216983A true JPH0216983A (ja) | 1990-01-19 |
Family
ID=9353594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18532488A Pending JPH0216983A (ja) | 1987-07-24 | 1988-07-25 | 有機的に組織された機能体系を構成するタンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び発現方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0301954A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0216983A (ja) |
| DK (1) | DK416488A (ja) |
| FR (1) | FR2621597B1 (ja) |
| PT (1) | PT88098B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2646776B1 (fr) | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
| FR2653781B1 (fr) * | 1989-10-31 | 1992-02-07 | Pasteur Institut | Procede de synthese de derives d'adenosine phosphate et derives obtenus. |
| US5521066A (en) * | 1993-09-13 | 1996-05-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Periplasmic membrane-bound system for detecting protein-protein interactions |
| CA2188950C (en) * | 1994-04-26 | 2001-07-03 | James R. Broach | Functional expression of mammalian adenylyl cyclase in yeast |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5017477A (en) * | 1985-10-25 | 1991-05-21 | Biotechnica International, Inc. | Enhancing DNA sequencies derived from the sacQ gene |
| FR2590483B1 (fr) * | 1985-11-22 | 1988-12-09 | Pasteur Institut | Antigenes purifies ayant des proprietes vaccinantes contre b. pertussis, moyens notamment adns recombinants pour les produire et compositions de vaccins les contenant |
-
1987
- 1987-07-24 FR FR8710614A patent/FR2621597B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-07-25 PT PT8809888A patent/PT88098B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-07-25 JP JP18532488A patent/JPH0216983A/ja active Pending
- 1988-07-25 EP EP88401935A patent/EP0301954A3/fr not_active Withdrawn
- 1988-07-25 DK DK416488A patent/DK416488A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0301954A3 (fr) | 1989-02-08 |
| FR2621597A1 (fr) | 1989-04-14 |
| PT88098B (pt) | 1995-03-01 |
| EP0301954A2 (fr) | 1989-02-01 |
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