JPH02150275A - 免疫記憶細胞懸濁液の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は免疫記憶細胞懸濁液の調製方法に関するもので
、とくに感染症および悪性腫瘍の予防や治療に用いて有
効な免疫記憶細胞懸濁液の調製方法、およびこの調製方
法により得られる免疫記憶細胞懸濁液に係わるものであ
る。 ［従来の技術１ 生体がいったんある種の抗原に反応した場合、つぎに同
種の抗原による刺激を受けたときには強い反応を示す、
生体の免疫現象、とくにその獲得免疫現象において、こ
のような作用は免疫記憶として知られており、上記のよ
うな免疫反応は二次免疫応答ないしは既往反応と呼ばれ
ている。 こうした免疫現象は、前回の抗原刺激に対する反応の結
果、当該抗原に反応しうるリン、＜系細胞が過剰に増殖
したことに起因するものである。 これらの細胞は一般にこれを免疫学的記憶細胞と称して
おり、生体のリンパ系や血管系を循環するリンパや血液
中に含まれるリン、＜球の一種である。リンパ球は循環
系から胸腺内に移住して、胸腺中に存在するシモシンと
遭遇することにより成熟し、免疫能力を獲得していわゆ
るＴ細胞（１９７２球）に分化する。これらのＴ細胞は
、これを別称して胸腺依存性細胞あるいは胸腺由来細胞
等ともいうように９個体の肺臓やリンパ節の副皮質中の
後毛細管静脈の周辺、牌ＩＩ白髄の中心動脈等の領域に
特に多く分布しているほか、はぼすべての循環系末梢管
中に存在していることが知られている。 ［発頃１が解決しようとする課題ｌ ［―記のような成熟リンパ球の一種である免疫記ｔに細
胞については、これまでのところ、前記のように免疫学
的記憶細胞としてもっばら概念的に認識されているのみ
であって、そうした細胞自体、あるいは少なくともそれ
を１すっている実体を実際に、すなわちガラス器内に単
離ないし抽出するまでには至っていない、また、そのよ
うな細胞を感染症や悪性＋＋ｉ瘍等の予防や治療等の目
的のために実用化する展望が具体的に示されたことはな
く、またそのための臨床的はもとより実験的な試みがな
されたこともなかった。 １課題を解決するための手段］ 本発明は、細胞性免疫に関係するＴｍ胞に含まれる免疫
記憶細胞のもつもろもろの特徴や属性を効果的に利用す
ることにより該細胞を高効率に分離・精製して得られた
細胞を、新規な組織培養法によりざらに継代培養してそ
の細胞系を確立する。すなわち該細胞のライン化（株化
）を実現することにより、免疫記憶細胞を大量かつ安価
に。 しかも安定して供給することを可能とする免疫記憶細胞
懸角液の調製方法、およびこれにより得られる免疫記憶
細胞９．７１６液を提供することを目的とするものであ
る。 このような目的を達成すべく本発明は、所定の病因体、
すなわち所定のウィルスまたは細菌等の病原体あるいは
癌細胞（本発明においてはこれらを総称して病因体とい
う）に対して免疫感作した個体から採取した細胞群から
得られた免疫記憶細胞懸濁液と、前記個体から採取した
細胞群と同系の正常細胞に放射線を照射して分裂能を抑
制した細胞群と、前記病因体と同種の病因体から採取し
た細胞群に放射線を照射して得た不活化抗原とを含む混
合液をインキュベートすることにより得た細胞を含む細
胞懸濁液をもって免疫記憶細胞懸濁液とすることを特徴
とする免疫記憶細胞懸濁液の調製方法を提供するもので
ある。 さらに本発明においては、前記所定の病因体に対して免
疫感作した個体から採取した細胞群から免疫記憶細胞懸
濁液を得るにあたって、所定の病因体に対して免疫感作
した個体から採取した細胞群から実質的にＴ細胞のみか
らなる細胞集団を分離し、この細胞集団に所定の組織適
合抗原と特異的に反応する抗体を加えて、該細胞集団中
における前記組織適合抗原が陽性の表面抗原活性を示す
細胞と反応させ、この反応の結果形成された抗原抗体複
合体に適宜の補体を結合させることにより、該抗原活性
が陽性の細胞を破壊、除去して。 前記組織適合抗原活性が陰性を示す免疫記憶細胞群のみ
を残留させ、かくて得られた免疫記憶細胞群に該細胞に
特有の表面抗原に対抗する抗体を反応させ、該免疫記憶
細胞群のうち前記表面抗原を有する細胞を分離、採取す
ることとするのが好ましい。 かくて本発明は、所定の病因体に対して免疫感作した個
体から採取した細胞群から実質的にＴ細胞のみからなる
細胞集団を分離し、この細胞集団に所定の組織適合抗原
と特異的に反応する抗体を加えて、該細胞集団中におけ
る′前記組織適合抗原が陽性の表面抗原活性を示す細胞
と反応させ。 この反応の結果形成された抗原抗体複合体に適宜の補体
を結合させることにより、前記組織適合抗原活性が陰性
を示す免疫記憶細胞群のみを残留させ、かくて得られた
免疫記憶細胞群に該細胞に特有の表面抗原に対抗する抗
体を反応させ、該免疫記憶細胞群のうち前記表面抗原を
有する細胞を分離、採取してこれを第１段階の免疫記憶
細胞懸濁液とし、前記個体から採取した細胞群と同系の
正常細胞に放射線を照射して分裂能を抑制した細胞群と
、前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液と、前記病因体と
同種の病因体から採取した細胞群に放射線を照射して得
た不活化抗原とを含む混合液をインキュベートすること
により得た細胞をもってこれを第２段階の免疫記憶細胞
懸濁液とすることを特徴とする免疫記憶細胞懸濁液の調
製方法を提供するものである。 このような本発明による免疫記憶細胞懸濁液の調製方法
においては、前記免疫記憶細胞群のうち前記表面抗原を
有する細胞を分離して採取するにあたっては、抗１ｇＧ
抗体を塗布した表面上の該抗ＩｇＧ抗体層に前記免疫記
憶細胞群を接触・反応させることにより、該免疫記憶細
胞群のうち前記表面抗原を有する細胞を前記表面に付着
させ、しかる後この表面に対して付着性の細胞を採取し
てこれを前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液とするよう
にするのが好ましい。 前記治癒個体としてマウスを使用する場合には、前記所
定の組織適合抗原はこれをＩａ抗旅とし、これと特異的
に反応する抗Ｉａモノクロナール抗体を前記細胞集団に
加えて、該細胞集団中におけるＩａ抗原活性が陽性を示
す細胞との抗原抗体複合体を形成させ、これに前記適宜
の補体を結合させることにより、Ｉａ抗原活性が陽性の
細胞を破壊・除去してＩａ抗原活性が陰性の免疫記憶細
胞のみを残留させ、これらの免疫記憶細胞に前記表面抗
原を抗原としてこれに対抗する抗体を加えて反応させる
ようにすることができる。なお。 周知のようにマウスにおけるＩａ抗原は、ヒトの場合の
組織適合抗原ＨＬＡ−Ｒ（またはＨＬＡ−ＤＲ）に対応
するものである。 さらに本発明は、所定の病因体に対して免疫感作した個
体から採取した細胞群から得られた免疫記憶細胞懸濁液
から培養された実質的にＴ細胞のみからなり、これらの
Ｔ細胞のうちほぼ８８％の細胞が少なくともｌＸ１０３
個の免疫記憶細胞を含むことを特徴とする免疫記憶細胞
懸濁液を提供するものである。 ［作用１ 本発明による免疫記憶細胞懸濁液は、理論的には、現に
知られているあらゆる感染症や悪性腫瘍からの治癒歴を
もつ個体の循環系胸腺依存域から分離、精製、培養する
ことが可能であり、したがって治癒履歴を有する個体を
入手しうるかぎり、どのような細菌性およびウィルス性
の感染症や悪性腫瘍に対しても免疫効果を発揮するもの
である。細菌性およびウィルス性の感染症として菌は２
例えばサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、　　コ
リネバクテリウム菌（Ｃａｒ　ｎｅｂ　ｃｔｅｒｉｕｍ
　、シュードモナス属　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　
、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒ−ｅ　ｌ　Ｉａ）　、
　　連鎖球菌（シリ！１ち匹」且幻す〕、エフトロメリ
ア拳つィルス　（ｅｃｔｒｏｍｅｌｉａ　ｖｉｒｕＳ）
、　　センダイウィルス　（ＨＶ　Ｊ　）等の病原微生
物に起因する感染症が代表的なものである。 さらに本発明による免疫記憶細胞懸濁液は。 それによる免疫機構が抗原抗体反応による免疫のメカニ
ズムとは原理的に別異のものであるため。 従来から行なわれているような、ワクチンを抗原として
用いる感染症予防法にともなう副作用等を招くことは、
理論的にまったくありえないという利点をも有するもの
である４また。前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液から
集めた培養細胞を前述のようにして継代培養を行なうこ
とにより１本発明による免疫記憶細胞懸濁液中の免疫記
憶細胞の細胞系を確立して、該免疫記憶細胞を効率よく
、安定してかつ安価に提供することが可能となる。 ［発明の一般的態様］ 上記のような方法により免疫記憶細胞懸濁液を調製する
ために９本発明においてはまず、適宜の癌または何らか
の細菌性またはウィルス性感染症に対して免疫感作した
履歴をもつ個体（以下。 単に治癒個体という）からリンパ球を含む細胞群を分離
する。このリンパ球を含む細胞群は、これを例えば該治
癒個体の心臓や静脈等から採取した末梢血から抽出する
か、あるいは該個体の肺臓組織から解離して、これらい
ずれかの細胞群をもって出発材料として用いるのが簡便
である。以下の説明では、これら末梢血または肺臓組織
をもって出発材料として用いるものとする。 この出発材料としての末梢血または肺臓組織から分離し
たリンパ球含有細胞群から、Ｔ細胞を選択的に溶出させ
る固相吸着剤を分離手段としてカラムクロマトグラフィ
法等により、該細胞懸渦液中に含まれている細胞群から
体液性免疫をつかさどるＢ細胞等の胞を除去して、はぼ
Ｔ細胞のみからなる細胞集団を含む懸濁液を分別溶出さ
せる。このカラムクロマトグラフィ処理に用いる固相吸
着剤としてはナイロンウールを用いるのが好適である。 ただし、ナイロンクールによる固相吸着剤にはＢ細胞の
みならずマクロファージや白血球等も吸着されるため、
Ｂ細胞自体の吸着効率は相対的に低くなる。したがって
このナイロンクールに対するＢ細胞の吸着効率を高める
ためには。 該ナイロンウールを用いたカラムクロマトグラフィ処理
に先立って、他の固相吸着剤、好ましくはグラスウール
による固相吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィ処理
をあらかじめ行なっておくのがよい、知られているよう
に、グラスウールからなる固相吸着剤に対してはＴ細胞
およびＢ細胞はいずれも付着性が小さいが、マクロファ
ージや白血球の場合は高い付着性を示す、したがって、
このグラスウールを用いたカラムクロマトグラフィ処理
を行なうことにより、あらかじめマクロファージや白血
球等を吸着除去してから、ナイロンウールを用いたカラ
ムクロマトグラフィ処理を行なうことによって、Ｔ細胞
とＢ細胞の分離を高効率に行なうことが可能となる。た
だし、このＴ細胞とＢ細胞の分離は、上述のような固相
吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィのほかに、それ
らの細胞にそれぞれ特有の表面抗原の相違を利用する方
法を採用してもよく、その際、前述のように治癒個体と
してマウスを使用する場合は、Ｔ細胞を識別する表面抗
原としてＴｈｙｌ抗原を用いてＴ細胞とＢ細胞の分離を
行なうことができる。 かくて得られた細胞集団は、上記のようにその大部分が
Ｔ細胞からなるものであるが、しかしながらなおかつ免
疫能力を欠く未成熟リンパ球を少量含んでいる。したが
って次の処理では、当該細胞集団を抗原とする抗原抗体
反応を該細胞集団に経験させることにより、それらの未
成熟リンパ球を除去することとする。 そのためには、所定の組織適合抗原と特異的に反応する
抗体を当該細胞集団に加えて、細胞集団中における該組
織適合抗原が陽性の表面抗原活性を示す細胞と反応させ
る。この抗原抗体反応の結果形成された抗原抗体複合体
に適宜の血清（典型的にはウサギ血清）からなる補体を
結合させることにより、該抗原活性が陽性のリンパ球を
破壊φ除去して、当該組織適合抗原活性が陰性である免
疫記憶細胞のみを残留させる。治癒個体としてマウスを
使用する場合には、前記所定の組織適合抗原をＩａ抗原
とし、このＩａ抗原と特異的に反応する抗Ｉａモノクロ
ナール抗体を前記細胞集団に加えて、該細胞集団中にお
けるＩａａ原活性が陽性の細胞との抗原抗体複合体を形
成させ、これに前記適宜の血清による補体を結合させる
ことにより、Ｉａ抗抗原活性性性リンパ球を破壊φ除去
してＩａａ原活性が陰性の免疫記憶細胞のみを残留させ
るようにする。＃述のようにマウスにおけるＩａ抗原は
、ヒトの場合の組織適合抗［ＨＬＡ−Ｒ（またはＨＬＡ
−ＤＲ）に対応するものである。 上述のような抗原抗体反応および補体結合反応の結果得
られた細胞に、当該免疫記憶細胞に特有の表面抗原を抗
原としてこれに対抗する例えばラット抗体を加えて反応
させ、このラット抗体により該表面抗原を被覆しておく
、このような処理を施した免疫記憶細胞とは別に、適宜
の抗うットＩｇＧ血清を出発材料として抗うットＩｇＧ
抗体を調製し、この抗ＩｇＧ抗体により内表面を塗布し
たガラス器内に上記免疫記憶細胞を懸濁した細胞懸濁液
を入れて反応させる。これにより、前記抗うットＩｇＧ
抗体が前記表面抗原を被覆しているラット抗体に対する
抗体、すなわち当該反応系における抗原として作用して
、抗うットＩｇＧ抗体とラット抗体との間で抗原抗体反
応が発生するるために。 該ラット抗体の被着された細胞が当該ガラス器の内表面
に対して付着することとなる。しかして。 このガラス器の内表面に対して非付着性の細胞。 すなわち前記表面抗原をもたない細胞を除去した後、該
ガラス器の内表面に対して付着性の細胞群のみを採取し
、これらの細胞群を含む細胞懸濁液をもって前記第１段
階の免疫記憶細胞懸濁液とする。なお、前記免疫記憶細
胞の表面抗原としては、　Ｔｈ！■抗原、Ｌマ１１抗原
、　Ｌｙｔ２抗原、　ｔ４ｔ３抗原等が知られている。 上記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液は、前述のようにし
て物理的に分離したＴ細胞のほぼ０．１％に相当するも
のである。後述するところから明らかなように９本発明
者が行なった各種の実験の結果が示すところから、これ
らの細胞の大部分。 すなわち該細胞のうちおよそ８８％の細胞は、前記治癒
個体としてマウスを用いた場合、それらの細胞が最小限
Ｉ　Ｘ　１０３個あれば、実質的に　１００％の確率で
免疫記憶の移入が行なわれることが確認されている。 上述のようにして得た第１段階の免疫記憶細胞懸濁液は
、おおむね下記のような操作を行なうことにより、これ
を効率よく継代培養して前記第２段階の免疫記憶細胞懸
濁液を得ることができる。 すなわち、まず前記治癒個体から採取した細胞群と同系
の正常２倍体細胞を培養し、これらの正常２倍体細胞群
にコバルトガンマ線等の放射線を照射して、その分裂能
を抑制した状態、すなわち分裂・増殖活動をいとなむこ
とはできないが生存はしている状態としておく、他方、
前記病因体と同種の病因体を所定の増殖用培地に懸濁し
、この病因体懸濁液に紫外線またはコバルトガンマ線環
、適宜の放射線を照射することによりこれを不活化して
、これを不活化抗原懸濁液とする。 前述のようにして分離・精製した免疫記憶細胞、すなわ
ち前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液を前記分裂能抑制
状態とした正常２倍体細胞に加える。この混合液に前記
不活化抗原懸濁液を加え、かくて得られた混合懸濁液を
インキュベートする。これらの操作を行なうことにより
、免疫記憶細胞は１通常５日間でその個数がほぼ３倍と
なるような速度で増殖する。このようにして増殖した免
疫記憶細胞を含む懸濁液をもって、前記第２段階の免疫
記憶細胞懸濁液とする。 「作用」 上述のようにして調製した第１段階または第２段階の免
疫記憶細胞懸濁液は、細胞による抗原特異的な免疫機構
すなわち細胞性免疫機構を発現させるものであって、免
疫グロブリンやモノクロナール抗体の産生に寄与するＢ
細胞がつかさどる抗原抗体反応（体液性免疫反応）によ
る免疫のメカニズムとは原理的に別異のものである。し
たがって１本発明による免疫記憶細胞懸濁液は、臨床的
には例えば従来から行なわれているワクチンを抗原とし
て用いる感染症予防法等にともなう副作用を招くことは
、まったくありえない、また２本発明による免疫記憶細
胞懸濁液により得られる免疫効果は、理論的には、治癒
個体が入手しうるかぎりにおいては、現に知られている
あらゆる細菌性およびウィルス性の感染症および悪性腫
瘍の予防や治療に対して有効なものである。 ［実施例１ 次に、このような本発明による免疫記憶細胞含有細胞懸
濁液の調製方法につき、その具体的な実施例を説明する
。

【１］免疫記憶細胞の分離 この実施例においては、癌または細菌性もしくはウィル
ス性感染症から治癒した履歴をもつマウスを前記治癒個
体として用い、この治癒個体としてのマウスの心臓から
末梢血、またはその肺臓組織を採取した。 ＜＜　１−１　＞＞細胞懸濁液の調製 ■出発材料として末梢血を使用する場合は前処理のため
の手順が不要であり、採取した末梢血はこれをただちに
５倍量のハンクス（Ｈａｎｋｓ）圧液に懸濁した。この
混合液を４℃で１５分間２回転数を２０００１腫として
遠心処理を行なうことにより解離した細胞を含む細胞懸
濁液から、白血球の集中している最上層を形成する白血
層（バフフィーコート）を静かに吸い上げて分離した。 ■この白血層画分を同じく５倍量のハンクス圧液に懸濁
し、これに対して上記遠心処理と同じく４℃で１５分間
２回転数を２００Ｏｒｐｍとした遠心処理を施した後、
上清を除去した。かくて得た細胞懸濁液に対して、上記
と同等の条件でさらに２回にわたって遠心処理を行ない
、かつ、その都度、上清を除去した。これら都合三回に
わたる遠心処理により洗浄して得た細胞群を、５％に牛
胎児血清（ＦＳＣ）を含むハンクス氏液中に細胞密度が
４　Ｘ　１０７個／１党となるように懸濁して、これを
もって本実施例における「初期の」細胞懸濁液とした。 ■他方、出発材料として肺臓組織を用いる場合は、まず
前記治癒個体たるマウスの肺臓組織の一部を切取した後
、切取した組織片をステンレス鋼製ストレーナ　（メツ
シュ数＝　Ｔｙｌｅｒ標準スクリーンスケールＮｏ、　
１００）に強く押しつけ、メツシュ孔を通過した細胞を
適当量のハンクス圧液に加えて懸濁した。このようにし
て機械的に解離した膵臓細胞を含む懸濁液に対して、４
℃で１５分間。 回転数を２００Ｏｒｐｍとして遠心処理を施した。 ■しかる後、上記■の洗浄処理の場合と同様の遠心操作
を３回にわたって行ない、これにより得た細胞集団に対
して２５％に牛脂児血清を含むハングス出液を細胞密度
が４　Ｘ　１０７個／ｌａｎとなるように加えて、これ
をもって木実施例における「初期の」細胞懸濁液とした
。 ＜＜　１−２　＞＞　Ｔ細胞の分離 ０以上のようにして末梢血または膵臓組織から得た初期
の細胞懸濁液を、まずガラス管（内径２ｃｍ、長さ１０
ｃｍ）にグラスウール１０グラムを充填したグラスウー
ルカラムに滲み込ませ、５％に牛脂児血清を含むハンク
ス圧液を該カラムの上部に重層した状態で、３７℃で４
５分間インキュベートした。しかる後、カラムの温度を
３７℃に保持しつつ上記溶液を静かにカラムに加えなが
らガラス管下部のコックを開き１分別溶出されてくる細
胞懸濁液を遠心管に集めた。前述のように、Ｔ細胞やＢ
細胞はいずれもグラスウールに対する付着性が小さく、
このため、グラスウールを用いたカラムクロマトグラフ
ィ処理によって、該グラスウールにはＴ細胞やＢ細胞以
外の細胞、とくにマクロファージや白血球等が選択的に
付着残留することとなる。したがって９本処理によって
グラスウールカラムから分別溶出した細胞懸濁液中に含
まれる細胞群は、実質的にＴ細胞およびＢ細胞のみから
なるものである。このようにして採取した細胞懸濁液は
、当初グラスウールカラムに加えた前記初期の細胞懸濁
液中の細胞集団のうち、はぼ３０％を含むものである。 ■つづいて、上記遠心管内に採取した細胞懸濁液を４℃
で１５分間２回転数を２００Ｏｒｐｍとして遠心処理し
た後、上清を除去した。かくて得た細胞群を、５％に牛
脂児血清を含む／＼ンクス氏出液細胞密度が４　Ｘ　１
０７個／１立となるように懸濁し、この細胞懸濁液をガ
ラス管（内径２Ｃ曹、長さ１０ｃ■）にナイロンウール
カラムラム（Ｆｅｎｗａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
社製）を充填したナイロンウールカラムに滲み込ませ、
５％に牛脂児血清を含むハンクス圧液を該カラムの上部
に重層した状態で、再度３７℃で４５分間インキュベー
トした。しかる後、上記■の場合と同様、温度を３７℃
に保持しつつ、上記溶液を静かにカラムに加えながら該
ガラス管下部のコックを開き２分別溶出されてくる細胞
懸濁液を集めた。この溶出細胞懸濁液は、ナイロンウー
ルカラムに加えた細胞懸濁液中の細胞群のうち、はぼ３
３％を含むものであり、したがって初めにグラスウール
カラムに加えた細胞集団のうち、はぼ１０％が回収され
たこととなる。 上述のようにして２段階にわたるカラムクロマトグラフ
ィ処理により得た細胞群は、そのほとんど、すなわち実
験の結果によればおよそ９５％がＴｉＩ４胞であり１本
発明において不要の細胞群は。 その大部分が上記グラスウールカラムまたはナイロンウ
ールカラム内の繊維に吸着されて該カラム中に残留した
こととなる。ただし前述のように。 この段階の細胞群は、なおかつ少量の不要のリンパ球等
を含むものである。 ＜＜　１−３　＞＞　Ｔ細胞の精製 ■これら不要のリンパ球等を除去すべく、前記ナイロン
ウールカラムグロマトグラフイ処理により分別溶出した
細胞懸濁液に対して、まず４℃で１５分間９回転数を２
００Ｏｒｐｍとして遠心処理を施した。この遠心処理に
より得た細胞懸濁液から上清を除去し、その結果得られ
た細胞群を２％に牛脂児血清を含む１９９培地に、その
細胞密度が８　Ｘ　１０７個／謬文となるように懸濁し
た。ついで。 この細胞懸濁液の１量について前記と同等の培地（２％
に牛脂児血清を含む１９９培地、以下同じ）で３０倍に
稀釈した抗Ｉａモノクロナール抗体　（シーダーレーン
ラボラトリーズ＝　ＣｅｄａｒｌａｎｅＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製）の２量と、同じく前記と同等の培地で
２倍に稀釈したウサギ血清の１量を加えて、３７℃で３
０分間反応させた。これにより、当該細胞懸濁液中のＩ
ａ抗原活性が陽性の細胞と抗Ｉａモノクロナール抗体と
の抗原抗体複合体が形成され、この抗原抗体複合体にウ
サギ血清による補体が結合して、Ｉａ抗原活性陽性の細
胞が破壊・除去されてＩａ抗原活性が陰性の免疫記憶細
胞のみが残留することとなる。かくて得られた細胞９、
’ＪＩＡ液に対して、４℃で１５分間１回転数を２００
０ｒｐ層として遠心処理を行なって細胞を集めた。 ■これらの細胞に対して、さらに同等の条件で前記と同
等の培地を用いた遠心処理を３回にわたって行なった後
、前記と同等の培地にその細胞密度が８　Ｘ　１０７個
／膳文となるように懸濁した。 ■この細胞懸濁液とは別にラット抗体を後述する方法に
より調製して、これを前記と同等の培地で５倍に稀釈し
た。このラット抗体と該細胞懸濁液をそれぞれ同量ずつ
加えて、４℃で６０分間反応させた。この処理により、
免疫記憶細胞に特有の抗原に対する抗体としてラット抗
体が該抗原と結合してこれを被覆することとなる。この
ような抗原抗体複合体を有する免疫記憶細胞群を含む細
胞懸濁液に対して、４℃で１５分間１回転数を２０００
ｒＰ腸として遠心処理を行なって細胞を集めた。これら
の細胞群に対して、さらに同等の条件で前記と同等の培
地を用いた遠心処理を３回にわたって行ない、しかる後
、その細胞密度が８　Ｘ　１０’個ｌＩＩ文となるよう
に前記と同等の培地に懸濁した。 ■さらにこの細胞懸濁液とは別に、抗うットＩｇＧヤギ
血清を前記と同等の培地で３０倍に稀釈して、その１０
　ｒａｎをプラスチックシャーレ　（内径１０Ｃｌベク
トン・ディキンスン＝　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ社製）に入れて、これを４℃で一夜放置した後。 余分の抗体を洗浄除去して該シャーレの内面に抗うット
ＩｇＧヤギ抗体を均一に付着・残留させた。 このように抗うットＩｇＧヤギ抗体の液膜を内表面に形
成したシャーレに、上記細胞懸濁液を１０層文人れて４
℃で６０分間、静かに水平に保持した。 ■しかる後、該シャーレを軽く揺ってシャーレの内表面
上の液膜に対する付着性が比較的低い細胞、すなわち前
記免疫記憶細胞に特有の抗原をもたない細胞を除去した
。このシャーレの内表面を１０％に牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地により３回にわたって洗浄し、つ
づいて該培地をシャーレの内表面に対して強く吹きつけ
ることにより、前記付着性が比較的高い細胞を採取して
、これをもって本実施例における第１段階の免疫記憶細
胞懸濁液とした。 以上の操作■〜■により集めた細胞、すなわち上記本実
施例における第１段階の免疫記憶細胞懸濁液に含まれる
免疫記憶細胞は、それらの操作を行なう以前の細胞、す
なわち前記ナイロンウールカラムから溶出した細胞懸濁
液中に含まれていたほぼＴ細胞からなる細胞群のほぼ０
．１％に相当するものである。この０．１％の細胞に対
して本発明者が行なった各種の実験の結果、それらの細
胞のうちおよそ８８％の細胞は下記の特性を宥するもの
であることが確認された。 ０球形の小型リンパ球に属する。 ■記憶細胞特異抗原については陽性の抗原活性を示す。 ■Ｔｈｙ　ｌ抗原、　Ｌｙｔｌ抗原、　Ｌｙｔ２抗原、
　ｔｙｔ３抗原についてはいずれも抗原活性が陽性であ
り、Ｉａ抗原については陰性を示す。 ■この免疫記憶細胞懸濁液を本例において冶癒個体とし
て用いたマウスと同系のマウスに注入した場合、該免疫
記憶細胞懸濁液中に免疫記憶細胞が少なくともｌＸ１０
３個含まれていれば、実質的に　１００％の確率で免疫
記憶の移入が行なわれる。 ■該免疫記憶細胞を移植した個体は、これにコバルトガ
ンマ線を照射した場合、６００レントゲンを照射しても
記憶を失うことはないが、　１１００レントゲンを照射
した場合には記憶を喪失する。このことは、当該細胞が
放射線に対して相当な抵抗力を有する細胞群に属するも
のであることを示すものである。 【２】免疫記憶細胞の培養および細胞系の確立法に、上
述のようにして分離・精製して得られた免疫記憶細胞、
すなわち本実施例における第１段階の免疫記憶細胞懸濁
液に含まれる細胞を培養して、前記第２段階の免疫記憶
細胞を得た。以下、その培養方法につき説明する。なお
、この培養方法は、前記実施例において分離・精製され
た免疫記憶細胞の増殖およびその細胞系の確立（株化）
のみならず２本発明を適用しうる免疫記憶細胞一般の培
養およびライン化に際しても効果的に実施しうるもので
ある。 （（２−１）＞同系正常細胞の培養および処理まず、前
記治癒個体としてマウスを用いる場合は、当該免疫記憶
細胞が由来するマウスと同系のマウスから採取した正常
２倍体細胞をシャーレに培養し、かくて成長した細胞が
シャーレ内においてほぼ単層を形成した時点で、照射線
量を２０００レントゲンとしたコバルトガンマ線を照射
して。 分裂能を抑制した状態とした。 （（２−２）＞不活化抗原懸濁液の調製他方、当該免疫
記憶細胞に記憶されている抗原、すなわち本実施例に用
いた治癒個体が罹病した癌細胞あるいはウィルスまたは
細菌等の病因体を不活化して、その抗原懸濁液を得た。 このためには１例えば該病因体としてウィルスを用いた
場合はその密度がＩ　Ｘ　１０Ｂ個／鵬文となるように
、また病因体として細菌を用いた場合はその密度が１Ｘ
１０７個／ｓｌとなるように、ウィルスまたは細菌を増
殖用培地にそれぞれ懸濁した。このウィルスまたは細菌
の懸濁液に放射照度を３．８Ｘ　１１０３ｅｒ／ｓｅｃ
／ｃｒｎ’として紫外線を５分間照射することにより不
活化し、これをもって不活化抗原懸濁液とした。 上記ウィルスまたは細菌増殖用培地としては、前記ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地に牛胎児血清１０％、炭酸水素す）
　！Ｊ　’ｙ　ム（ＮａＨＣ：ｏ３）　２　ｇ１文、ピ
ルビン酸ナトリウＬ　（Ｎａ００ＣＧＯＣＩ（３）　０
．１１ｇ／Ｊｌ　、イーストオレート０．１％を加えた
ものを用いたが。 所望に応じて適宜他の培地を使用してもよいことはいう
までもない。 また癌等の悪性腫瘍細胞を不活化する場合は、まず治癒
個体から切取した癌の組織片をメスまたはハサミ等を用
いて細切し、　０．０２％にＥＤＴＡ　（エチレンジア
ミン四酢酸）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中で４℃で
６０分間攪拌し、前記ステンレス鋼製ストレーナと同様
のストレーナ　（メツシュ数＝　　Ｔ７１ｅｒスクリー
ンスケールＮｏ、　１００）を用いて濾過した細胞懸濁
液を、４゛Ｃで５分間回転数を７００ないし８００　ｒ
ｐｍとして遠心処理して細胞を集めた。このようにして
集めた細胞を、細胞増殖用培地に２　Ｘ　１０”個／ａ
ｎとなるように懸濁し、この細胞懸濁液に照射線量２０
００レントゲンのコバルトガンマ線を照射することによ
り該懸濁液を不活化して、これをもって不活化抗原懸濁
液とした。 なお、この場合の細胞増殖用培地としては、さきに特定
したウィルスまたは細菌の増殖用培地を用いたが、上記
同様、所望に応じて適宜他の培地を使用してもよいこと
はいうまでもない。 （（２−３）＞免疫記憶細胞の培養 ついで、前述の＜＜　１−３　＞＞における操作■〜■
によって分離した免疫記憶細胞、すなわち本実施例にお
ける第１段階の免疫記憶細胞懸濁液に。 その細胞密度が８　Ｘ　１０５個／鵬文となるように上
記細胞増殖用培地を加えて得た免疫記憶細胞懸濁液の所
定量を、（２−１）＞で述べた処理により分裂能抑制状
態とした正常細胞を含むシャーレに静かに入れた。この
場合の所定量としては１例えばシャーレの内径がｌ０ｃ
ｍ’ならば５ｍｕ、６ｃｒｒｒ’ならば２．５ｍ、Ｑと
した。このようにして得た混合懸濁液に対して、＜（２
−２＞１で述べた処理により調製した不活化抗原懸濁液
を該混合懸濁液と同量加え、これにより得られた混合液
を５％の炭酸ガスを含む雰囲気中において３７℃でイン
キュベートした。かくて培養された細胞を遠心分離によ
り回収し、この初代培養細胞懸濁液をもって２本実施例
における第２段階の免疫記憶細胞懸濁液とした。 上述のようにして得られた第２段階の免疫記憶細胞懸濁
液に対して、前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液に対す
る初代培養に用いた操作と同様の操作を施すことにより
１次世代の免疫記憶細胞を継代培養することができる。 すなわち、前記第２段階の免疫記憶細胞懸濁液に＜＜　
２−３　）＞で述べたようにして、その細胞密度が８　
Ｘ　１０５（１１／ｍ文となるように前記細胞増殖用培
地を加えて、前記分裂能抑制状態とした正常細胞および
前記不活化抗原懸濁液を加えて得られた混合懸濁液を前
記の条件Ｆでインキュベートした後遠心分離することに
より、免疫記憶細胞の培養を集める　このようにして回
収された免疫記憶細胞は、前記第１段階の免疫記憶細胞
懸濁液中に含まれる免疫記憶細胞をもって第１他代の免
疫記憶細胞とし、また前記第２段階の免疫記憶細胞懸濁
液中に含まれる免疫記憶細胞をもって第２世代の免疫記
憶細胞とした場合、第３１±代の免疫記憶細胞となるも
のであり、以下第１四代の免疫記憶細胞から第２世代の
免疫記憶細胞を培養する初代培養と同様の操作を鰻り返
して行なうことにより。 本発明あるいはその他の方法により分離・精製された免
疫記憶細胞の継代培養を効率よく行なうことができる。 この継代培養においては、免疫記憶細胞は５日間でその
個数がほぼ３倍となるような速度で増殖することが実験
により確認されている。このように高い増殖率は２本発
明による免疫記憶細胞懸濁液における免疫記憶細胞の細
胞系を効率よく確立しライン化することが可能であるこ
とを示すものであり、ひいては該免疫記憶細胞を安定１
−で、かつ安価に提供することが可能であることを保証
するものである。 なお、前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液から培養され
た細胞　（第２世代の免疫記憶細胞）は、顕微鏡下での
所見によれば、形態的には全体として略球形で、その大
きさは第１段階の免疫記憶細胞自体にくらべて約３倍程
度であり、かつその核も概して大型となっているが、た
だし膜抗原は当初のものがすべてそのままに保持されて
いるのが観察された。

【３】免疫記憶細胞の罹病予防効果 上述のようにして分離精製した本実施例における第１段
階の免疫記憶細胞、またはこの第１段階の免疫記憶細胞
から増殖させて得た第２段階の免疫記憶細胞を移植した
個体（移植個体）を、当初の治癒個体が罹病した病因体
と同種の病原微生物または癌細胞により攻撃して、該免
疫記憶細胞の罹病予防効果を評価検定した。治癒個体と
してはマウスを用い、また病因体としては癌細胞、サル
モネラ菌、コリネバクリア、シュードモナス菌、ハスッ
レラ菌、連鎖球菌、エクトロメリアφウィルス、センダ
イウィルス（ＨＶ　Ｊ　）を使用した。下表はその結果
を示すものである。 マウス威　　　に ［１’ｉｎｌ；細胞］ 一、ｍ」Ｌｌ １×１０４個 ｌＸｌ０”偏 ６×１０２個 ３　Ｘ　１０２個 ｌ　Ｘ　１０２個

【サルモネラ菌】

１」Ｌ皇ＩＬＪ １×０４個 ｉｘｏ：］個 ６×０２個 ３×０２個 １×０２個

【コリネ八クリア】

ける １−」ルー」Ｌ−盟 １００％ １００％ ７０％ ４２％ ３４％ ■−」Ｌ−」Ｌ−！ １００％ ｌ　Ｏ０％ ６８％ ３４％ ２０％ 稙−稙−１−飽−皇 １×１０４個 Ｉ　Ｘ　１０３個 ６×１０２個 ３×１０２個 １×１０２個

【シュードモナス菌】

１」Ｌｌ」

【１ １　Ｘ　１０４個 ｌＸｌ０：］個 ６×１０２個 ３　Ｘ　１０２個 Ｉ　Ｘ　１０２　（１ 【パスツレラ菌］ ＬＪＬ皇１１ＪＩ ＩＸＩＱ４個 ｔｘｔｏ：］個 ６　Ｘ　１０２個 ３　Ｘ　１０２個 Ｉ　Ｘ　１０２　＠ １−」Ｌ−ＪＬ−釆 １００％ １００％ ４８％ ２６％ １４％ ヱーＪＬＪＬ−里 １００％ ｌ　Ｏ０％ ４１％ ２３％ １１％ 土−ＪＬＪＬ−釆 １００％ １００％ ７８％ ５３％ ３５％ 【連鎖球菌】 務−植一廁一悠二壷 ｌＸ１０４　個 Ｉ　　Ｘ　１０３　　ｍ ６×１０２　個 ３×１０２個 １×１０２個

【エフトロメリア拳つィルス】

隻−並一細一胞−力　　　　１−」１−」Ｌ−釆ｌ　Ｘ
　１０４個　　　　１００％ ｌＸ１０３個　　　　１００％ ６×１０２個　　　　５１％ ３×１０２個　　　　２７％ ｌＸ１０２個　　　　１３％ Ｃセンダイウィルス】 技−植一創一脇一晟　　　　ヱーＪＬＪＬ−ΣｌＸ１０
４（［Ｉ　　　　　　１００％ｌＸ１０３個　　　　１
００％ ６　Ｘ　１０２個　　　　８８％ ３×１０２個　　　　６３％ ヱー　Ｕ−」Ｌ−Ｊ １００％ １００％ ４４％ ３１％ １７％ １　Ｘ　１０２個　　　　２９％ 上の実験結果から明らかなように、上記病因体のいずれ
についても、治癒個体に由来する免疫記憶細胞をｌ　Ｘ
　１０３個以上移植した場合には、該免疫記憶細胞を移
植してない個体（非移植個体）が　１００％の確率で罹
病する量の細菌性またはウィルス性病原体を感染させる
か、またはその非移植個体が１００％の確率で罹病する
量の癌細胞を移植しても、完全にそれらの病原微生物ま
たは癌細胞による発病を抑制しうることが、マウスに関
して実験的に確認されている。 さらに上の実験結果から明らかなように、マウスを治癒
個体とした場合、免疫記憶細胞の移植個数がｌＸ１０３
個以下であっても、対象とする病因体により若干異るが
、６×１０２個の免疫記憶細胞を移植することによりほ
ぼ５０％の確率で、また３Ｘ１（１２個の免疫記憶細胞
を移植することによりほぼ３０％の確率で、それぞれ当
該病因体に起因する病気の発症を予防することが可能で
あることも実験により確認されている。 【４］抗記憶細胞ラうト抗体の調製 ＜＜　１−３　）＞■の処理に用いる前記ラット抗体は
、下記のようにしてこれを調製した。 すなわち、まず前述（＜（１−３）■）のようにして集
めた免疫記憶細胞をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、
この懸濁液に対して適宜の条件で通常の遠心処理を行な
った。これらの操作を３回にわたって繰り返し行なうこ
とによって得られた細胞を洗浄し、最後に得られた細胞
群をその細胞密度が１Ｘ１０Ｂ個ｌＩ１文となるように
上記リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した。かくて得られ
た懸濁液の０．２５ｍ文をウイスタ　（Ｗｉｓｔｅｒ）
系雌ラットの大腿部皮下に投与した。さらに、この最初
の投与を行なった日から１０日目および２０日目に、同
数の細胞を当該雌ラットの大腿部皮下にそれぞれ投与し
た。また最初の投与を行なった日から３０日目および４
０日目に、上記と同様にして、前述のようにして得られ
た細胞群をその細胞密度がｌＸｌ０’個１ｍ文となるよ
うに、前記リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁して、その０
．２５ｍ文を前記ラットの腹腔内に投与した。さらに最
初の投与を行なった日から５０日ないし５５日目に、当
該ラットより全採血した。かくて１匹のラットから５　
ｍ　ｌないし６ｍＭの血清が得られた。 上記の処理とは別に、免疫記憶細胞を採取したマウスと
同系でかつ誕生直後のマウスから膵臓組織の一部を切取
した。この切取した組織片を前記と同等のステンレス鋼
製ストレーナに強く押しつけて、メツシュ孔を通過した
細胞を集めた。このようにして機械的に解離した膵臓細
胞を前記リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、得られた細
胞懸濁液に対して遠心処理を行なった。このような処理
を３回繰り返し、最後に得られた細胞塊に対して約１．
５倍量のラット血清を加えて充分に攪拌した後、水中に
８０分間放散し、この間はぼ１５分おきにさらによく攪
拌した。しかる後、６０分が経過した時点で当該懸濁液
に対して適宜の条件で通常の遠心処理を行ない、かくて
得られた上清に対して上記と同様の操作を施した。こう
した処理を３回にわたって繰り返し、最終的に得られた
Ｌ清をもって目的の抗記憶細胞ラット抗体として、前述
した（（１−３＞）■の処理に用いた、 ［発明の効果１ 本発明による免疫記憶細胞懸濁液は、現に知られている
あらゆる感染症や悪性腫瘍からの治癒歴をもつ個体の循
環系胸腺依存域から分離、精製、培養することが可能で
あり、したがって治癒履歴を有する個体を入手しうるか
ぎり、どのような細菌性およびウィルス性の感染症や悪
性腫瘍に対しても免疫効果を発揮するものである。 さらに１本発明による免疫記憶細胞懸濁液はそれによる
免疫機構が抗原抗体反応による免疫のメカニズムとは原
理的に異るものであるため、従来から行なわれているワ
クチンを抗原として用いる感染症予防法にともなう副作
用等を招くことはまったくありえない、また、前記第１
段階の免疫記憶細胞懸濁液から集めた培養細胞を前述の
ようにして継代培養を行なうことにより、前記第２段階
の免疫記憶細胞懸濁液中に免疫記憶細胞の細胞系を効率
よく確立して、該免疫記憶細胞を安定してかつ安価に提
供しうるようにすることがｒｒｆ能である。 以上９本発明の実施例につき記載してきたが１本発明に
よる方法は、記載の実施例について適宜追加ないし変更
を行なって実施してもよいことはいうまでもない。 出願人　　有限会社ジオリサーチ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）所定の病因体に対して免疫感作した個体から採取
   した細胞群から得られた免疫記憶細胞含有懸濁液と、前
   記個体から採取した細胞群と同系の正常細胞に放射線を
   照射して分裂能を抑制した細胞群と、前記病因体と同種
   の病因体から採取した細胞群に放射線を照射して得た不
   活化抗原とを含む混合液をインキュベートすることによ
   り得た細胞を含む細胞懸濁液をもって免疫記憶細胞懸濁
   液とすることを特徴とする免疫記憶細胞懸濁液の調製方
   法。
2. （２）前記所定の病因体に対して免疫感作した個体から
   採取した細胞群から免疫記憶細胞懸濁液を得るにあたっ
   ては、 所定の病因体に対して免疫感作した個体か ら採取した細胞群から実質的にＴ細胞のみからなる細胞
   集団を分離し、 この細胞集団に所定の組織適合抗原と特異 的に反応する抗体を加えて、該細胞集団中における前記
   組織適合抗原が陽性の表面抗原活性を示す細胞と反応さ
   せ、 この反応の結果形成された抗原抗体複合体 に適宜の補体を結合させることにより、前記組織適合抗
   原活性が陰性を示す免疫記憶細胞群のみを残留させ、 かくて得られた免疫記憶細胞群に該細胞に 特有の表面抗原に対抗する抗体を反応させ、該免疫記憶
   細胞群のうち前記表面抗原を有する細胞を分離、採取す
   ることとした前記特許請求の範囲第１項に記載の免疫記
   憶細胞懸濁液の調製方法。
3. （３）所定の病因体に対して免疫感作した個体から採取
   した細胞群から実質的にＴ細胞のみからなる細胞集団を
   分離し、 この細胞集団に所定の組織適合抗原と特異 的に反応する抗体を加えて、該細胞集団中における前記
   組織適合抗原が陽性の表面抗原活性を示す細胞と反応さ
   せ、 この反応の結果形成された抗原抗体複合体 に適宜の補体を結合させることにより、前記組織適合抗
   原活性が陰性を示す免疫記憶細胞群のみを残留させ、 かくて得られた免疫記憶細胞群に該細胞に 特有の表面抗原に対抗する抗体を反応させ、該免疫記憶
   細胞群のうち前記表面抗原を有する細胞を分離、採取し
   てこれを第１段階の免疫記憶細胞懸濁液とし、 前記個体から採取した細胞群と同系の正常 細胞に放射線を照射して分裂能を抑制した細胞群と、前
   記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液と、前記病因体と同種
   の病因体から採取した細胞群に放射線を照射して得た不
   活化抗原とを含む混合液をインキュベートすることによ
   り得た細胞をもってこれを第２段階の免疫記憶細胞懸濁
   液とすることを特徴とする免疫記憶細胞懸濁液の調製方
   法。
4. （４）前記免疫記憶細胞群のうち前記表面抗原を有する
   細胞を分離して採取するにあたっては、抗ＩｇＧ抗体を
   塗布した表面上の該抗ＩｇＧ抗体層に前記免疫記憶細胞
   群を接触・反応させることにより、該免疫記憶細胞群の
   うち前記表面抗原を有する細胞を前記表面に付着させ、
   しかる後この表面に対して付着性の細胞を採取してこれ
   を前記第１段階の免疫記憶細胞懸濁液とすることとした
   前記特許請求の範囲第３項に記載の免疫記憶細胞懸濁液
   の調製方法。
5. （５）所定の病因体に対して免疫感作した個体から採取
   した細胞群から得られた免疫記憶細胞懸濁液から培養さ
   れた実質的にＴ細胞のみからなり、これらのＴ細胞のう
   ちほぼ９８％の細胞が少なくとも１×１０＾３個の免疫
   記憶細胞を含むことを特徴とする免疫記憶細胞懸濁液。